DE102012210185A1

DE102012210185A1 - UV-härtbares Einbettmedium für die Mikroskopie

Info

Publication number: DE102012210185A1
Application number: DE201210210185
Authority: DE
Inventors: Hans-Joachim Weippert; Dr. Zölffel Michael
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2012-06-18
Publication date: 2013-12-19

Abstract

Es wird die Verwendung einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung als Einbettmedium für die Mikroskopie bereitgestellt, wobei die Zusammensetzung eine polymerisierbare organische Verbindung, ein Alkoxysilan, das eine polymerisierbare Gruppe aufweist, und einen Photoinitiator umfaßt und die Zusammensetzung weniger als 30 Gew.-% organisches Lösungsmittel enthält sowie einen pH-Wert von 5–9 aufweist. Ferner werden ein Verfahren zur Herstellung einer eingebetteten Probe für die Mikroskopie unter Verwendung der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung und eine nach dem Verfahren erhältliche, eingebetteten Probe bereitgestellt.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung als Einbettmedium für die Mikroskopie, wobei die Zusammensetzung eine polymerisierbare organische Verbindung, ein Alkoxysilan, das eine polymerisierbare Gruppe aufweist, und einen Photoinitiator umfaßt und die Zusammensetzung weniger als 30 Gew.-% organisches Lösungsmittel enthält sowie einen pH-Wert von 5–9 aufweist. Ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer eingebetteten Probe für die Mikroskopie unter Verwendung der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung und eine nach dem Verfahren erhältliche, eingebetteten Probe.
Zur mikroskopischen Untersuchung von Proben, beispielsweise Gewebeschnitten, ist es üblich, die Proben in ein transparentes Medium einzubetten. Das Einbettmedium, das auch als Einschlußmedium oder Einschlußmittel bezeichnet wird, schafft die optischen Voraussetzungen für die mikroskopische Untersuchung, schützt die Probe vor mechanischen Beschädigungen und dient der dauerhaften Haltbarmachung der Probe.
Für eine hohe Bildqualität sind die optischen Eigenschaften des Einbettmediums von entscheidender Bedeutung, insbesondere eine an die eingesetzte Mikroskopietechnik und die Art des zu untersuchenden Präparats anpaßbare Brechzahl und Dispersion sowie eine hohe Transmission und geringe Restfluoreszenz des Einbettmediums. Die Brechzahl des Einbettmediums sollte möglichst an die Brechzahl des Glases von verwendetem Objektträger und Deckglas oder, im Fall der Immersionsmikroskopie, an die Brechzahl des Immersionsmediums anpaßbar sein, um eine möglichst geringe sphärische Aberration zu erreichen. Da insbesondere biologische Proben vor der mikroskopischen Untersuchung häufig angefärbt werden, sollte das Einbettmedium zudem weder Farbstoffe lösen noch die Proben chemisch angreifen, beispielsweise durch enthaltene Säuren oder Basen.
Bekannte Einbettmedien weisen oft den Nachteil auf, daß sie sehr viel Lösungsmittel enthalten oder lösungsmittelartige Eigenschaften aufweisen und so Farbstoffe aus zu untersuchenden Proben herauslösen oder die Proben durch säure- oder basenhaltige Bestandteile ausbleichen. Lösungsmittel greifen Farbstoffe an und verändern die Brechzahl des Einbettmediums, insbesondere verändert sich die Brechzahl durch Abdunsten des Lösungsmittels über einen langen Zeitraum und ist somit nicht konstant. Nicht aushärtende Einbettmedien haben in der Regel ferner den Nachteil, daß sie keine ausreichende Härte für eine dauerhafte Haltbarmachung der mikroskopisch zu untersuchenden Proben aufweisen. So wird in der DE 10 2009 035 019 A1 ein histologisches Einbettmedium beschrieben, das eine Mischung aus Polyethylenglykolen mit mindestens zwei verschiedenen mittleren Molekulargewichten aufweist.
Andere bekannte Einbettmedien, bei deren Verwendung ein Aushärten vorgesehen ist, werden als Mehrkomponentensysteme angeboten, die den Nachteil aufweisen, daß sie vom Präparator zunächst gemischt werden müssen, wobei häufig eine unvollständige Durchmischung zur Schlierenbildung führt oder Lufteinschlüsse die optischen Eigenschaften des Einbettmediums beeinträchtigen. Zudem können Wägefehler auftreten.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Einbettmedium für die Mikroskopie bereitzustellen, das die genannten Nachteile des Standes der Technik überwindet und eine dauerhaft hohe Bildqualität der eingebetteten Proben bei der mikroskopischen Untersuchung liefert.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung, umfassend eine polymerisierbare organische Verbindung, ein Alkoxysilan, das eine polymerisierbare Gruppe aufweist, und einen Photoinitiator, wobei die Zusammensetzung weniger als 30 Gew.-% organisches Lösungsmittel enthält und einen pH-Wert von 5–9 aufweist, als Einbettmedium für die Mikroskopie.
Die Aufgabe wird weiter gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer eingebetteten Probe für die Mikroskopie, umfassend die Schritte, daß eine Probe auf einem Träger mit der oben genannten Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird und die Zusammensetzung anschließend mit Licht einer Wellenlänge ≤ 450 nm bestrahlt wird, wobei die Zusammensetzung aushärtet. Ferner wird die Aufgabe gelöst durch eine nach diesem Verfahren erhältliche eingebettete Probe.
Überraschenderweise ist mit der erfindungsgemäß verwendeten Zusammensetzung eine dauerhafte Haltbarmachung mikroskopisch zu untersuchender Proben, insbesondere biologischer Proben möglich und es wird eine hervorragende Bildqualität bei der mikroskopischen Untersuchung dieser Proben erreicht, die zudem über einen langen Zeitraum erhalten bleibt. Dabei werden keine Farbstoffe aus den Proben herausgelöst und es findet kein Ausbleichen der Proben statt. So können dieselben Proben auch nach Jahren mit gleichbleibender Bildqualität erneut untersucht werden.
Die dauerhaft gute Bildqualität wird neben den fehlenden Löseeigenschaften und dem nicht vorhandenen Ausbleichen der Proben auch darauf zurückgeführt, daß das erfindungsgemäß verwendete Alkoxysilan für eine gute Haftung zwischen dem Einbettmedium und dem in der Regel verwendeten Glas in Form von Objektträger und Deckglas erreicht wird. Ferner wird so eine höhere Beständigkeit gegenüber Feuchtigkeit erreicht.
Durch die erfindungsgemäß verwendete UV-polymerisierbare Zusammensetzung werden Farbstoffe der zu untersuchenden Probe chemisch nicht angegriffen oder angelöst oder das Anlösevermögen ist so langsam, daß die UV-Polymerisation deutlich schneller ist und die ausgehärteten Zusammensetzungen sind nicht mehr fähig, Farbstoffe anzulösen. Des weiteren läßt sich der Brechwert der erfindungsgemäßen Zusammensetzung an die Art des zu untersuchenden Präparats und die Mikroskopiemethode anpassen.
Die erfindungsgemäß verwendete Zusammensetzung ist ein Einkomponentensystem, d.h. die Zusammensetzung läßt sich durch Licht unmittelbar polymerisieren und damit aushärten. Um das Herauslösen von Bestandteilen der Probe und einen chemischen Angriff auf die Probe zu vermeiden, enthält die erfindungsgemäß verwendete Zusammensetzung weniger als 30 Gew.-% organische Lösungsmittel und weist einen pH-Wert von 5,0 bis 9,0 auf. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung enthält die Zusammensetzung weniger als 10 Gew.-%, insbesondere weniger als 3 Gew.-%, besonders bevorzugt weniger als 1 Gew.-% organische Lösungsmittel, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung. Der pH-Wert der Zusammensetzung beträgt bevorzugt 6,0–8,0, besonders bevorzugt 6,5–7,5, insbesondere 6,8–7,2. Unter Licht- und Luftausschluß ist die erfindungsgemäß verwendete Zusammensetzung in der Regel länger als 6 Monate haltbar, d.h. stabil.
Unter einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung wird im Sinne der Erfindung eine Zusammensetzung verstanden, die durch Licht mit einer Wellenlänge ≤ 450 nm polymerisierbar ist, d.h. die in der Zusammensetzung enthaltenen Monomere oder Oligomere reagieren zu Polymeren. Bevorzugt wird zur UV-Polymerisation Licht mit einer Wellenlänge von 200–450 nm, bevorzugt 365–405 nm eingesetzt. Das vollständige Aushärten der Zusammensetzung durch UV-Licht läßt sich in der Regel in weniger als 250 Sekunden erreichen, wenn mit 30–50 mW/cm² bestrahlt wird.
Ein Photoinitiator im Sinne der Erfindung ist eine chemische Verbindung, die durch Absorbieren von Licht in reaktionsfähige Bruchstücke zerfällt, die in der erfindungsgemäß verwendeten Zusammensetzung eine Polymerisationsreaktion auslösen. Die Polymerisationsreaktion kann eine kationische oder radikalische Polymerisation sein.
Erfindungsgemäß bevorzugte Photoinitiatoren für kationische Polymerisationen sind Triarylsulfonium-Hexafluoroantimonat, z.B. Cyracure UVI-6974, Triarylsulfonium-Hexafluorophosphat, z.B. Cyracure UVI-6990 und Ferrocenium-Salze, wie z.B. 2,4-Cyclopentadien-1-yl-(1-methylethyl)-benzol-Eisen-hexafluorophosphat, wie z.B. Irgacure 261. Zusätzlich kann noch ein Coinitiator eingesetzt werden, wie z.B. Cumolhydroperoxid. Zur Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit bei kationischen Polymerisationen kann ein Photosensibilisator wie z.B. 9,10-Dibutoxyanthracen verwendet werden. Für radikalische Polymerisationen sind erfindungsgemäß bevorzugte Photoinitiatoren α-Hydroxyketone, wie z.B. Irgacure 127, Irgacure 184, Irgacure 1116, Irgacure 1173 und Irgacure 2959, α-Aminoketone, wie z.B. Irgacure 369, Irgacure 379, Irgacure 907 und Irgacure 1300, Benzyldimetylketale, wie z.B. Irgacure 651, Phenylglyoxylate, wie z.B. Irgacure 754, Mono-Acylphosphine, wie z.B. Irgacure TPO und Bis-Acylphosphine, wie z.B. Irgacure 819 und Irgacure 2100.
Unter einer organischen Verbindung wird im Sinne der Erfindung wie üblich eine Kohlenstoff enthaltene chemische Verbindung verstanden. Ein organisches Lösungsmittel ist dementsprechend eine Kohlenstoff enthaltende Verbindung, die Gase, Flüssigkeiten oder Feststoffe lösen kann, ohne daß es dabei zu chemischen Reaktionen zwischen dem Lösungsmittel und dem gelösten Stoff kommt. Organische Lösungsmittel sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
Unter einer polymerisierbaren organischen Verbindung wird im Sinne der Erfindung eine Kohlenstoff enthaltene chemische Verbindung verstanden, die eine Polymerisationsreaktion eingehen kann. Die polymerisierbare organische Verbindung kann Monomere und/oder Oligomere umfassen. Ferner kann sie eine oder mehrere polymerisierbare organische Verbindungen enthalten.
Die erfindungsgemäß verwendete Zusammensetzung enthält neben der polymerisierbaren organischen Verbindung und dem Photoinitiator ein Alkoxysilan, das eine polymerisierbare Gruppe aufweist. Das Alkoxysilan trägt unter anderem zur Haftung zwischen dem Einbettmedium und dem regelmäßig verwendeten Glas des Objektträgers und des Deckglases bei. Indem das Alkoxysilan in das Einbettmedium einpolymerisiert wird, wird eine hohe Stabilität erreicht.
Ein Alkoxysilan im Sinne der Erfindung ist eine Verbindung der Form (R¹O)_nSiR² _3-nR³, worin n = 1–3 ist, vorzugsweise n = 3, R¹ und R² unabhängig voneinander aliphatische, cycloaliphatische oder aromatische Reste sind, mit 1-10 Kohlenstoffatomen, bevorzugt aliphatische Reste mit 1-4 Kohlenstoffatomen, d.h. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, iso-Butyl, sec-Butyl oder tert-Butyl, und R³ ein polymerisierbarer Rest ist. Bevorzugt für R³ sind organische Reste mit einer oder mehreren Epoxy-, Oxetan-, Vinylether-, Acryloxy-, Methacryloxy- oder Mercaptangruppen, insbesondere organische Reste mit Epoxy- oder Mercaptangruppe(n). Bevorzugte Alkoxysilane sind Trialkoxysilane, insbesondere solche der Formel (R¹O)₃SiR³. Besonders bevorzugt sind Trimethoxysilane. Das Alkoxysilan ist in der Zusammensetzung bevorzugterweise in einer Menge von 0,3–3 Gew.-%, insbesondere 0,5–2 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, enthalten.
Weiter bevorzugt wird für kationische Polymerisationen 3-Glycidyloxypropyl-trimethoxysilan und für radikalische Polymerisationen 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan oder Methacryloxypropyltrimethoxysilan eingesetzt.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung enthält die UV-polymerisierbare Zusammensetzung zusätzlich zum Silizium des Alkoxysilans mindestens 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, Heteroatome mit einer Ordnungszahl ≥ 9. Die Ordnungszahl, auch Atomnummer oder Kernladungszahl genannt, gibt die Anzahl der Protonen im Atomkern an. Beispielsweise ist die Ordnungszahl von Fluor 9. Unter einem Heteroatom wird wie in der organischen Chemie üblich ein Atom verstanden, das weder Kohlenstoff noch Wasserstoff ist. Diese Ausführungsform hat sich insbesondere bei Präparaten als vorteilhaft erwiesen, die zusätzlich oder alternativ zur Lichtmikroskopie durch Elektronenmikroskopie untersucht werden, da Heteroatome mit einer Ordnungszahl ≥ 9 bei elektronenmikroskopischen Aufnahmen für einen verbesserten Kontrast sorgen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit mehr als 1 Gew.-% an Heteroatomen, zusätzlich zum Silizium des Alkoxysilans, wird daher bevorzugt in der Elektronenmikroskopie verwendet. Bevorzugt enthält die erfindungsgemäße UV-polymerisierbare Zusammensetzung mindestens 2 Gew.-%, besonders bevorzugt 2–20 Gew.-%, insbesondere 3–10 Gew.-% Heteroatome, zusätzlich zum Silizium des Alkoxysilans, mit einer Ordnungszahl ≥ 9. Die angegebenen Gewichtsprozente beziehen sich auf Heteroatome mit einer Ordnungszahl ≥ 9, ausgenommen das Silizium des Alkoxysilans, relativ zum Gesamtgewicht der Zusammensetzung. Wenn die erfindungsgemäß verwendete Zusammensetzung beispielsweise 3 Gew.-% Difluorethylenglycol enthält (C₂H₄F₂O₂), enthält die Zusammensetzung 1,16 Gew.-% des Heteroatoms Fluor.
Das Heteroatom mit einer Ordnungszahl ≥ 9 kann beispielsweise in der UV-polymerisierbaren organischen Verbindung enthalten sein, z.B. in Form eines Mercaptans bei radikalischen Polymerisationen oder eines fluorhaltigen Epoxids bei kationischen Polymerisationen, oder es kann die Zusammensetzung eine zusätzliche Komponente enthalten, die das Heteroatom trägt. Bevorzugte Heteroatome sind Fluor, Phosphor, Silizium und Antimon, insbesondere für die sauerstoffhaltigen, kationisch polymerisierbaren Zusammensetzungen. So können beispielsweise fluororganische Verbindungen, z.B. polyfluorierte Diole wie polyfluorierte Polyetherdiole, z.B. polyfluorierte Ethylenglycole oder phosphorhaltige organische Verbindungen, z.B. Phosphorsäureester oder nanoskalige Siliziumdioxidpartikel oder Triphenylantimon zugesetzt werden. Besonders bevorzugt ist es, fluororganische (fluorhaltige organische) Verbindungen einzusetzen, da diese das Einbettmedium hydrophobieren und dies zu einer verbesserten Handhabbarkeit bei der Erzeugung von Mikrotom- bzw. Ultramikrotomschnitten führt.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfaßt die polymerisierbare organische Verbindung eine Sauerstoff oder Schwefel enthaltende Verbindung. Die polymerisierbare organische Verbindung ist vorzugsweise eine kationisch polymerisierbare, sauerstoffhaltige organische Verbindung, beispielsweise ein Epoxid oder eine radikalisch polymerisierbare organische Verbindung mit Mercaptangruppen.
Bevorzugt wird erfindungsgemäß eine Zusammensetzung verwendet, umfassend (a) als polymerisierbare organische Verbindung ein Epoxid, ein Oxetan oder einen Vinylether, (b) ein Trialkoxysilan, vorzugsweise ein Trialkoxysilan, das eine Epoxidgruppe aufweist, insbesondere 3-Glycidyloxypropyl-trimethoxysilan, und (c) einen Photoinitiator, insbesondere einen Photoinitiator der eine kationische Polymerisation induzieren kann. Die Zusammensetzung enthält bevorzugt zusätzlich einen Alkohol. Der Alkohol kann eine Hydroxygruppe oder mehrere Hydroxygruppen enthalten. Bevorzugt sind Alkohole mit zwei oder mehreren Hydroxygruppen. Wenn ein Alkohol mit zwei oder mehreren Hydroxygruppen zugesetzt wird, reagiert er mit dem Epoxid, Oxetan oder Vinylether in der Polymerisationsreaktion und bewirkt eine zusätzliche Vernetzung der Polymerstruktur. Ferner enthält die Zusammensetzung bevorzugt keine Acrylate oder Methacrylate.
Weiter wird erfindungsgemäß bevorzugt eine Zusammensetzung verwendet, umfassend (a) als polymerisierbare organische Verbindung ein Mercaptan mit einer oder mehreren Mercaptangruppe(n) und eine Verbindung mit einer oder mehreren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung(en), (b) ein Trialkoxysilan, vorzugsweise ein Trialkoxysilan, das eine Mercaptogruppe (Mercaptangruppe, Thiolgruppe, -SH) aufweist, insbesondere 3-Mercaptopropyl-trimethoxysilan, oder vorzugsweise ein Trialkoxysilan, das eine Acryloxy-, Methacryloxy- oder Vinyloxygruppe aufweist, beispielsweise Methacryloxypropyl-trimethoxysilan und (c) einen Photoinitiator, insbesondere einen Photoinitiator der eine radikalische Polymerisation auslösen kann. Die Verbindung mit einer oder mehreren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung(en) ist vorzugsweise eine Verbindung mit einer oder mehreren Allyl-, Vinyl- oder Vinyloxygruppe(n).
Erfindungsgemäß bevorzugte Epoxide sind ringepoxidierte Verbindungen, wie 3,4-Epoxycyclohexylmethyl-3,4-epoxycyclohexancarboxylat, z.B. Cyracure Resin UVR 6110, Bis-[(3,4-epoxycyclohexyl)-methyl]-adipat, z.B. Cyracure Resin UVR 6128, 1,4-Cyclohexandimethanol-bis-(3,4-epoxycyclohexancarboxylat), 3,3’-(1-Methylethyliden)-bis-7-oxabicyclo-[4.1.0]-heptan, Dicyclopentadiendioxid, 2-(3,4-Epoxycyclohexyl-5,5-spiro-3,4-epoxy)-cyclohexan-metadioxan, Vinylcyclohexendioxid, 3,4-Epoxycyclohexan-methylcarboxylat und 1,2,5,6-Diepoxycyclooctan, aromatische Epoxide wie Bisphenol-A-diglycidether, z.B. Rütapox 0162, Bisphenol-F-diglycidether, z.B. Rütapox 0158, Bisphenol-A-ethoxylatdiglycidether, Bisphenol-A-propoxylatdiglycidether, Phenylglycidether, o-Kresylglycidether, p-tert.Butylphenylglycidether und Tris-(4-hydroxyphenyl)-methan-triglycidether, cycloaliphatische Epoxide, wie Bisphenol-A-[hydriert]-diglycidether, z.B. Epalloy 5000, 1,4-Cyclohexandimethanol-diglycidether, Hexahydrophthalsäure-diglycidester, Tetrahydrophthalsäure-diglycidester und 4,5-Epoxy-tetrahydrophthalsäure-diglycidester und aliphatische Epoxide wie 1,4-Butandiol-diglycidether, 1,6-Hexandiol-diglycidether, Neopentylglycol-diglycidether, Propylenglycol-diglycidether, Dipropylenglycol-diglycidether, Polypropylenglycol-diglycidether, Polyethylenglycol-diglycidether, Trimethylolpropan-triglycidether, Pentaerythrit-tetraglycidether, Glycerintriglycidether, Glycerindiglycidether, Glycerinpropoxylat-triglycidether, Butylglycidether und 2-Ethylhexylglycidether.
Bevorzugte Oxetane sind 3-Ethyl-3-[[(3-ethyloxetan-3-yl)-methoxy]-methyl]-oxetan und 3-Ethyl-3-oxetanmethanol. Als Vinylether lassen sich erfindungsgemäß bevorzugt Bis-(4-vinyloxybutyl)-adipat, Bis-(4-vinyloxybutyl)-isophthalat, Tris-(4-vinyloxybutyl)-trimellitat, 1,4-Cyclohexandiemethanol-divinylether, Triethylenglycol-divinylether und (4-Hydroxybutyl)-vinylether einsetzen.
Als Mercaptane eignen sich erfindungsgemäß insbesondere Trimethylolpropan-tris-mercaptoacetat [TPMA], Trimethylolpropan-tris-(3-mercaptopropionat) [TPMP], Pentaerythrit-tetra-mercaptoacetat, Pentaerythrit-tetra-(3-mercaptopropionat), Ethylenglycol-bis-mercaptoacetat, Ethylenglycol-bis-(3-mercaptopropionat), MR 7B (Mitsui Toatsu Chemicals), trifunktioneller Mercaptothioether, 4-Mercaptomethyl-3,6-dithia-1,8-octan-dithiol und MR 10B (Mitsui Toatsu Chemicals), ein tetrafunktioneller Mercaptothioether.
Als Alkohole, die bevorzugt in Kombination mit Epoxiden, Oxetanen und Vinylethern eingesetzt werden, eignen sich insbesondere Ethylenglycol, Diethylenglycol, Triethylenglycol, Polyethylenglycol, Propylenglycol, Dipropylenglycol, Polypropylenglycol, 1,4-Butandiol, 1,5-Pentandiol, 1,6-Hexandiol, 2-Ethylhexan-1,3-diol, Neopentylglycol, Glycerin, Glycerinethoxylat, Glycerinethoxylat-propoxylat, Glycerinpropoxylat, Trimethylolpropan, Trimethylolethan, Trimethylolpropan-ethoxylat, Trimethylolpropan-propoxylat, Trimethylolpropan-ethoxylat-propoxylat, Pentaerythrit-ethoxylat, Pentaerythrit-ethoxylat-propoxylat, Pentaerythrit-propoxylat, Bisphenol-A-ethoxylat, Bisphenol-A-propoxylat, Polytetrahydrofuran, Tone Polyole (Union Carbide): Caprolacton basierte di-/trifunktionelle Polyole, TCD-Alkohol DM: 3(4),8(9)-Bis-(Hydroxymethyl)-tricyclo-[5.2.1.0^2,6]-decan, TCD-Alkohol M: 8- Hydroxymethyl-tricyclo-[5.2.1.0^2,6]-decan, 5-Norbornen-2,2-dimethanol und Poly bd 605E, ein epoxidiertes hydroxylterminiertes Polybutadien, Molekulargewicht M_n ca. 1450 (Hersteller: Sartomer).
Bevorzugte Verbindungen mit einer oder mehreren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung(en), die gemeinsam mit dem Mercaptan mit einer oder mehreren Mercaptangruppe(n) eingesetzt werden, sind Allylverbindungen, Vinyl- und Vinyloxyverbindungen, insbesondere Phthalsäurediallylester, Isophthalsäurediallylester, Bisphenol-A-diallylether, Adipinsäurediallylester, Diallylmalonsäure-diethylester, Diallylcarbonat, Diethylenglycol-bis-(allylcarbonat), 1,1,1-Tris-(hydroxymethyl)-propan-monoallylether, 1,1,1-Tris-(hydroxymethyl)-propandiallylether, Pentaerythrit-triallylether und 1,3,5-Triallyl-s-triazin-2,4,6-trion.
Weiter kann die erfindungsgemäß verwendete UV-polymerisierbare Zusammensetzung zusätzlich Weichmacher, Festweichmacher (Schmelzpunkt ≥ 40 °C) oder Kunstharze enthalten, um die Viskosität an den gewünschten Einsatzzweck anzupassen. Mit Vorteil können als Weichmacher Phthalsäurepolyester, Adipinsäurepolyester und Phosphorsäureester, als Festweichmacher Phenylbenzoat, Glycerintribenzoat, 1,4-Cyclohexandimethanoldibenzoat, Pentaerythritol-tetrabenzoat, Bis(2-hydroxyethyl)terephthalat, und Triphenylphosphat und als Kunstharze Ketonharze, Aldehydharze, Acrylharze, Polyterpenharze und modifizierte Phenolharze eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen Zusammensetzung als Einbettmedium für die Mikroskopie, insbesondere die Licht- und Elektronenmikroskopie. Unter einer Verwendung als Einbettmedium für die Mikroskopie wird im Sinne der Erfindung insbesondere die Verwendung der Zusammensetzung zum Einbetten von mikroskopisch zu untersuchenden Proben, insbesondere biologischen Proben bzw. Präparaten verstanden.
Die Brechzahl und die Dispersion (Abbezahl) des ausgehärteten Einbettmediums lassen sich über die eingesetzten Komponenten, insbesondere deren Reste auf den gewünschten Zweck einstellen. So läßt sich die Brechzahl des ausgehärteten Einbettmediums, beispielsweise an die Brechzahl von Deckglas, Objektträger oder Immersionsöle (ISO 8036) oder an den mittleren Brechwert des Probenmaterials anpassen. Bei bestimmen Präparationstechniken und mikroskopischen Untersuchungsmethoden ist wiederum ein deutlicher Brechzahlunterschied zwischen zu untersuchender Probe und Einbettmedium wünschenswert, um kontrastreiche Bilder zu erhalten, die mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ebenfalls eingestellt werden können. Die Brechzahl n_e des ausgehärteten Einbettmediums bei 23°C und 546,1 nm liegen für die erfindungsgemäßen Epoxy-, Oxetan- und Vinylethersysteme bei n_e = 1,49–1,58, insbesondere n_e = 1,50–1,54. Die Abbezahl ν_e liegt bevorzugt bei ν_e = 35–62, insbesondere ν_e = 42–58. Für die Anpassung an Immersionsöle nach ISO 8036 ist ein n_e = 1,518 (±0,002) sowie ν_e = 50–56 bevorzugt. Für die Thiol-En-Systeme sind unabhängig voneinander n_e = 1,52–1,65 und ν_e = 35–48 bevorzugt, insbesondere n_e = 1,54–1,56 und ν_e = 42–45. Brechwerte n_e > 1,58 sind in der Regel für Sonderanwendungen. Ferner lassen sich über die eingesetzten Komponenten und deren Konzentration das Elastizitätsmodul und der Glasübergangsbereich des ausgehärteten Einbettmediums auf den gewünschten Zweck hin einstellen.
Eine hohe Transmission zwischen etwa 350–1000 nm und eine geringe Restfluoreszenz können durch zusätzliche Aufreinigung der eingesetzten Komponenten verbessert werden, beispielsweise durch eine Kurzweg- oder Dünnschichtdestillation im Vakuum, eine Kolonnendestillation im Vakuum, eine Aufreinigung über Aktivkohle oder über aktiviertem Aluminiumoxid.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer eingebetteten Probe für die Mikroskopie, umfassend die Schritte, daß eine Probe auf einem Träger mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird und die Zusammensetzung anschließend mit Licht einer Wellenlänge ≤ 450 nm bestrahlt wird, wobei die Zusammensetzung zu einem Polymer aushärtet. Die im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung beschriebenen Merkmale und Ausführungsformen können ebenso beim erfindungsgemäßen Verfahren verwirklicht werden. Weiter betrifft die Erfindung eine eingebettete Probe für die Mikroskopie, d.h. eine eingebettete, mikroskopisch zu untersuchende Probe, erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Die Brechzahl wurde mit einem Abbe-Refraktometer (Fa. Zeiss) bei einer Wellenlänge von 546,1 nm gemessen. Das Licht der genannten Wellenlänge wurde mit Hilfe einer Quecksilbercadmiumspektrallampe und einem Interferenzfilter (546,1 nm) erzeugt.
Die nachfolgend aufgeführten Zusammensetzungen wurden durch Mischen der Komponenten in der genannten Reihenfolge bei Raumtemperatur hergestellt. Anschließend wurde mit UV-A-Licht einer Wellenlänge von etwa 365–400 nm, erzeugt mit Hilfe eines Hg-Hochdruckstrahlers, zwei Minuten bei 30–50 mW/cm² (Milliwatt pro Quadratzentimeter) bestrahlt. Als alternative Lichtquelle lassen sich auch UV-LEDs mit Wellenlängen von 365 nm, 375 nm, 385 nm, 395 nm oder 405 nm einsetzen.
Beispiel 1

100 Gew.Teile Cyracure Resin UVR 6128
10 Gew.Teile Poly bd 605E
12 Gew.Teile Diethylenglycol
1 Gew.Teil 3-Glycidyloxypropyl-trimethoxysilan (Glymo)
4 Gew.Teile Cyracure UVI-6974

Kationische Polymerisation
Brechwert (ausgehärtet): n_e = 1,518 (bei 23°C)

Beispiel 2

60 Gew.Teile Cyracure Resin UVR 6128
80 Gew.Teile Cyracure Resin UVR 6110
20 Gew.Teile Poly bd 605E
10 Gew.Teile 2-Ethylhexan-1,3-diol
30 Gew.Teile Tone Polyol 305
1,5 Gew.Teil Glymo
15 Gew.Teile Cyracure UVI-6974 in Tone Polyol 305

Kationische Polymerisation
Brechwert (ausgehärtet): n_e = 1,518 (bei 23°C), Anpassung an Immersionsöle nach ISO 8036

Beispiel 3

60 Gew.Teile Cyracure Resin UVR 6110
40 Gew.Teile Rütapox 0162 (Bisphenol-A-diglycidether)
15 Gew.Teile Tone Polyol 305
15 Gew.Teile TCD-Alkohol DM
1 Gew.Teil Glymo
10 Gew.Teile Cyracure UVI-6974 in Tone Polyol 305

Kationische Polymerisation
Brechwert (ausgehärtet): n_e = 1,544 (bei 23°C)

Beispiel 4

60 Gew.Teile Cyracure Resin UVR 6128
40 Gew.Teile Cyracure Resin UVR 6110
60 Gew.Teile Polypropylenglycol 400
2 Gew.Teile Glymo
10 Gew.Teile Cyracure UVI-6974 in Tone Polyol 305

Kationische Polymerisation
Brechwert (ausgehärtet): n_e = 1,498 (bei 23°C)

Beispiel 5

50 Gew.Teile Cyracure Resin 6128
50 Gew.Teile Cyracure Resin 6110
22 Gew.Teile Tone Polyol 305
8 Gew.Teile 2-Ethylhexan-1,3-diol
20 Gew.Teile Tetrahydrofurfurylalkoholpolyethylenglycolether (Glycofurol)
2 Gew.Teile Glymo
10 Gew.Teile Cyracure UVI 6974 in Tone Polyol 305

Kationische Polymerisation
Brechwert (ausgehärtet): n_e = 1,511 (bei 23 °C)

Beispiel 6

60 Gew.Teile Cyracure Resin UVR 6110
40 Gew.Teile Nanopox C 620
10 Gew.Teile Poly bd 605E
20 Gew.Teile Tone Polyol 305
10 Gew.Teile TCD-Alkohol DM
1 Gew.Teil Glymo
10 Gew.Teile Cyracure UVI-6974 in Tone Polyol 305

Kationische Polymerisation, enthält 4,9 Gew.-% Silizium
Brechwert (ausgehärtet): n_e = 1,520 (bei 23°C)

Beispiel 7

100 Gew.Teile Cyracure Resin 6128
15 Gew.Teile 2-Ethylhexan-1,3-diol
15 Gew.Teile Tridecafluoro-1,2-nonandiol
5 Gew.Teile Trimethyolpropanpropoxylat
1 Gew.Teil Glymo
8 Gew.Teile Cyracure UVI 6974 in Tone Polyol 305

Kationische Polymerisation, enthält 6,5 Gew.-% Fluor
Brechwert (ausgehärtet): n_e = 1,497 (bei 23 °C)

Beispiel 8

100 Gew.Teile Präpolymer TPMP / NBDI (100+26)
40 Gew.Teile Triallyl-s-triazin-trion
2 Gew.Teile 3-Mercaptopropyl-trimethoxysilan (MTMO)
1 Gew. Teil 2,6-Di-tert.butyl-4-methylphenol (BHT)
3 Gew.Teile Irgacure 1173

Radikalische Polymerisation
Brechwert (ausgehärtet): n_e = 1,556 (bei 23°C)

Beispiel 9

100 Gew.Teile Präpolymer MR 7B / XDI (100+25)
57 Gew.Teile Triallyl-s-triazin-trion
2 Gew.Teile 3-Mercaptopropyl-trimethoxysilan (MTMO)
1 Gew. Teil 2,6-Di-tert.butyl-4-methylphenol (BHT)
3 Gew.Teile Irgacure 1173

Radikalische Polymerisation
Brechwert (ausgehärtet): n_e = 1,630 (bei 23°C)

Die Beispiele 1–5 und 8–9 wurden lichtmikroskopisch und die Beispiele 6 und 7 sowohl lichtmikroskopisch als auch elektronenmikroskopisch untersucht. Mit den oben beschriebenen Einbettmedien ließen sich hervorragende Bildqualitäten bei der mikroskopischen Untersuchung eines Gewebeschnitts erreichen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 2009035019 A1 [0004]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

ISO 8036 [0033]
ISO 8036 [0033]
ISO 8036 [0039]

Claims

Verwendung einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung, umfassend eine polymerisierbare organische Verbindung, ein Alkoxysilan, das eine polymerisierbare Gruppe aufweist, und einen Photoinitiator, wobei die Zusammensetzung weniger als 30 Gew.-% organisches Lösungsmittel enthält und einen pH-Wert von 5–9 aufweist, als Einbettmedium für die Mikroskopie.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung, zusätzlich zum Silizium des Alkoxysilans mindestens 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, Heteroatome mit einer Ordnungszahl ≥ 9 enthält.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung 0,3–3 Gew.-% Trialkoxysilan, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung weniger als 10 Gew.-% organisches Lösungsmittel enthält und einen pH-Wert von 6–8 aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung (a) ein Epoxid, ein Oxetan oder einen Vinylether, (b) ein Trialkoxysilan, das eine Epoxidgruppe aufweist und (c) einen Photoinitiator umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung zusätzlich einen Alkohol mit einer oder mehreren Hydroxygruppe(n) umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung (a) ein Mercaptan mit einer oder mehreren Mercaptangruppe(n) und eine Verbindung mit einer oder mehreren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung(en), (b) ein Trialkoxysilan, das eine Mercaptangruppe aufweist und (c) einen Photoinitiator umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung mit einer oder mehreren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung(en) eine oder mehrere Allyl-, Vinyl- oder Vinyloxygruppe(n) enthält.
Verfahren zur Herstellung einer eingebetteten Probe für die Mikroskopie, umfassend die Schritte, daß eine Probe auf einem Träger mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–8 in Kontakt gebracht wird und die Zusammensetzung anschließend mit Licht einer Wellenlänge ≤ 450 nm bestrahlt wird, wobei die Zusammensetzung aushärtet.
Eingebettete Probe für die Mikroskopie, erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch