DE2927191C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Präparation einer aus Blut gewonnenen Zellprobe in Form einer einzelligen Schicht auf einem Mikroskop-Objektträger, wobei zunächst auf dem Objektträger eine Anfangsmenge der in einer Trägerflüssigkeit befindlichen Zellen aufgetragen und anschließend mit Hilfe von Zentrifugalkräften überflüssige Zellen samt Trägerflüssigkeit entfernt werden, bis eine einzellige Schicht auf dem Objektträger hergestellt ist, anschließend diese fixiert und dann getrocknet wird.

Ein Verfahren der vorgenannten Art ist bekannt aus der FR-A1 22 71 560. Bei dem bekannten Verfahren würden zur Vorbereitung und Fixierung einer Blutprobe auf einem Träger eine Menge feuchter Zellen aufgetragen und die Zellen mit dem Träger in einer Vorrichtung geschleudert, um eine einzellige Schicht vereinzelter Zellen auf dem Träger zu bilden. Überflüssige Zellen werden vom Träger herabgeschleudert. Dabei wird angenommen, daß eine Probe, die in der Vorrichtung behandelt wird, anschließend auch fixiert und getrocknet wird. Allerdings sind keine Aus­ sagen getroffen, ob das in derselben Vorrichtung geschieht.

Eine bei den bisherigen Verfahren zur Vorbereitung von Mikroskopie-Objektträgern auftretende Verfälschung ist eine Veränderung der Morphologie roter Blutkörper­ chen, die sich insbesondere darin äußert, daß bestimmte Zellen bzw. Blutkörperchen ihre zentrale Delle oder ihren "Pallor" verlieren, nämlich den flachen, einge­ drückten zentralen Bereich der Zelle, so daß die Zelle mehr rund wird und eher Sphärozyten oder anderen Zellen eines gleichen Durchmesser oder ähnlicher Form gleicht.

Die Diagnose verschiedener Arten von Anämie wird durch genaue Analyse der Größe der roten Blutkörperchen sowie durch Quantifizierung der Parameter der roten Blutkörper­ chen erleichtert, beispielsweise der Wintrobe-Indizes des mittleren Zellvolumens, des mittleren Zellhämoglobin­ gehaltes oder der mittleren Zellhämoglobinkonzentration. Derzeit werden diese Informationen typischerweise mit­ tels eines Coulter-Zählers ermittelt, der die Zahl von roten Blutkörperchen pro mm³, die Hämoglobinkonzentra­ tion und das mittlere Zellvolumen in einem Flüssigkeits­ strömungs-System mißt. Zusätzlich zu der durch diesen Zähler gelieferten Information wäre es sehr nützlich, eine genaue Auswertung der Art der in der Probe enthalte­ nen Zellen in Übereinstimmung mit bewährten hämatologi­ schen Klassifikationen zu erhalten, beispielsweise der Normozyten, Makrozyten, der scheibenförmigen Zellen, der Mikrozyten, der mit Nadeln versehenen Zellen, der hypo­ chromen länglichen Zellen, der Sphärozyten usw. Ein Ver­ fahren und eine Vorrichtung zur Einteilung einzelner Zel­ len nach dieser Klassifizierung, d. h. nach Untergrup­ pen, und zur Lieferung der Erythrozyten-Parameter für jede Untergruppe findet sich in der US-PS 40 97 845, auf die hiermit Bezug genommen wird.

Insbesondere für die Leukozytenanalyse ist ein Zentrifu­ gierverfahren entwickelt worden, bei dem eine einlagige Schicht von Zellen bzw. Blutkörperchen auf einem Objekt­ träger gebildet wird, der später für die automatisierte Analyse der Leukozyten benutzt werden kann. Mittels die­ ser Vorrichtung wird insbesondere ein Objektträger mit dem darauf aufgebrachten Blut in der Ebene der Oberflä­ che, welche das Blut einnimmt, geschleudert, wobei das überschüssige Blut nach außen von der Objektträgerober­ fläche abgeschleudert wird. Durch Oberflächenspannung und/oder andere Kräfte wird auf dem Objektträger eine einzellige Schicht des Blutes zurückgehalten. Bei der Leukozytenuntersuchung werden die Zellen in der einzelli­ gen Schicht getrocknet und sodann mit Wrightschem oder einem anderen Anfärbmittel angefärbt und automatisch ana­ lysiert (vgl. US-PS 38 83 852).

In einer anderen bekannten Vorrichtung - vgl. US-PS Re. 28 585 - zum Schleudern und Färben eines Mikroskopträ­ gers wird die Blutprobe so geschleudert, daß eine gleichmäßige Feuchte erhalten bleibt. Das Einfärben geschieht in bekannter Weise. Bei den Zellen, die in der Zentrifugalvorrichtung bearbeitet werden, handelt es sich allerdings ausschließlich um Leukozyten (weiße Blutkörperchen). Leukozyten besitzen keine zentrale Delle, so daß die Übernahme der für sie entwickelten üblichen Verfahren auf das Gebiet der Erythrozyten zu Fehlresultaten führt.

Das Trocknen von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) führt zu unerwünschten Verfälschungen, insbeson­ dere zu einem Verlust der zentralen Delle zahlreicher roter Blutkörperchen während ihrer Trocknung. Obgleich die Ursachen für diese Formveränderung noch nicht voll­ ständig geklärt sind, werden sie anscheinend durch Ober­ flächenspannung, Aufladungen und/oder Trocknungseffekte hervorgerufen.

Beim Schleuderverfahren bildet sich die erwünschte ein­ zellige Schicht roter Blutkörperchen auf dem Objektträ­ ger, wobei die einzelnen Blutkörperchen voneinander ver­ einzelt sind, d. h. Abstand zueinander besitzen. Wenn nun ein solcher Objektträger in eine Fixier- oder Anfärb­ flüssigkeit getaucht wird, bevor die Zellen getrocknet sind, werden die roten Blutkörperchen vom Objektträger weggewaschen. Wenn die roten Blutkörperchen vor dem Auf­ tragen auf den Objektträger in Lösung fixiert werden, klumpen sie aufgrund der Fixierung zusammen, so daß keine einzellige Schicht vereinzelter Zellen erhalten werden kann. Aus diesem Grund ist es zweckmäßig, die Zel­ len bzw. Blutkörperchen im Zeitraum nach dem Ausbilden der einzelligen Schicht, aber vor dem Trocknen zu fixie­ ren.

Aufgabe der Erfindung ist damit, ein Präparatsverfahren für rote Blutkörperchen auf einem Objektträger nach der Ausbildung der einzelligen Schicht, aber vor dem Trock­ nen der Zeilen auf dem Objektträger zu schaffen, bei dem ihre kennzeichnenden Merkmale für die spätere Analyse bewahrt werden.

Diese Aufgabe wird gelöst bei einem Verfahren der eingangs genannten Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Präparation von Erythrozyten enthaltenden Zellproben, bei denen die ursprüngliche Form der Erythrozyten erhalten bleiben soll, die Zellproben während oder unmittelbar anschließend an die Zentri­ fugation, sobald eine einzellige Schicht gehildet ist, noch im feuchten Zustand und vor einer Erythrozyten-Form­ veränderung einem geeigneten dampfförmigen Fixiermittel ausgesetzt werden und anschließend getrocknet werden.

Die Merkmale der Unteransprüche 2 und 3 werden in der nachfolgenden Beschreibung erläutert.

Im folgenden ist eine bevorzugte Ausführungsform der Er­ findung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 eine in vergrößertem Maßstab gehaltene, schemati­ sche Aufsicht auf einen Mikroskopie-Objektträ­ ger, auf dem sich eine einzellige Schicht aus roten Blutkörperchen mit zentraler Delle und aus einem roten Blutkörperchen ohne diese Delle be­ findet,

Fig. 2 eine Seitenansicht des Objektträgers mit den Zel­ len gemäß Fig. 1,

Fig. 3 eine perspektivische Darstellung einer in der Of­ fenstellung befindlichen Vorrichtung zur Prä­ paration einer aus Blut gewonnenen Zellprobe,

Fig. 4 eine perspektivische Darstellung der Vorrichtung nach Fig. 3 in geschlossenem Zustand.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Blutproben­ menge auf einen Mikroskopie-Objektträger aufgetragen, der dann in einer Zentrifuge geschleudert wird. Durch das Schleudern werden alle Blutkörperchen, bis auf eine einzellige Schicht, vom Objektträger herabgeschleudert. Bevor die Probe bis zu dem Grad getrocknet worden ist, bei dem die roten Blutkörperchen normalerweise einer Verformung unterliegen, wird ein geeignetes dampfförmiges Fixiermittel auf die einzellige Schicht aufgebracht, um die Form der roten Blutkörperchen zu kon­ servieren, so daß bei der weiteren Trocknung die Zell­ morphologie nicht in dem Maß beeinträchtigt wird, daß die Zellen ihre Konfiguration mit der zentralen Delle (Pallor) verlieren.

Eine in Fig. 3 dargestellte Vorrichtung zur Durchfüh­ rung des Verfahrens umfaßt eine Zentrifuge 10 mit einem Gehäuse 12, das eine oberseitige offene, innere Kammer 14 festlegt, in welcher eine Scheibe 16 drehbar am oberen Ende einer Welle 18 montiert ist. Die Scheibe 16 nimmt auf ihrer flachen, waagerechten Oberseite einen Objektträger 20 zum Schleudern desselben in einer waagerechten Ebene auf. Die Halterung des Objektträgers 20 auf der Scheibe erfolgt dabei mit Hilfe geeigneter Mittel 22, etwa mittels Laschen oder dergleichen, die auf der Scheibenoberfläche in einem für die Einspannung des Objektträgers geeigneten Abstand voneinander angeordnet sind. Die Welle 18 wird durch einen nicht dargestellten Motor in Drehung versetzt, wobei die Größe und Dauer der Schleuderwirkung durch eine an sich bekannte Einrichtung geregelt werden. Geeignete Zentrifu­ gen bzw. Schleudervorrichtungen sind im Handel erhält­ lich.

Die oberseitige Öffnung der Kammer der Zentrifuge ist mittels einer Abdeckhaube oder eines Deckels 24 ver­ schließbar, der über der oberseitigen Öffnung auf das Gehäuse 12 aufsetzbar ist. Bei der dargestellten Ausführungsform ist der Deckel über eine Leitung 26 mit einem Vorrat eines dampfförmigen Fixiermittels verhunden, d. h. mit einem Kanister oder Behälter 28, welcher dieses Fixiermittel enthält. Eine in die Leitung 26 eingeschaltete Ventileinrichtung 30 ermöglicht eine Steuerung der Dampfströmung zwischen dem Vorrat und dem Innenraum 14 der Zentrifuge. Bei der dargestellten Ausführungsform umfaßt die Ventileinrichtung 30 eine halbkreisförmige Platte 31, die im Mittelpunkt auf einem am Deckel befestigten Stift oder Zapfen 33 schwenkbar gelagert ist. Die Ventilplatte wird zum Verschließen oder Öffnen der Auslaßöffnung der Leitung 26 verdreht, wenn ein nach oben ragender Griffzapfen 35 erfaßt und über einen Kreisbogen geführt wird. Um das dampfförmige Fixiermittel in die Kammer zu drücken, wird der Behälter 28 beispielsweise mittels eines in ihn eingebauten Gebläses 32 oder mittels einer den Behälter 28 mit Luft beschickenden Luftpumpe 34 unter einem höheren Druck gehalten als das Innere der Zentrifugenkammer.

Wie erwähnt, wird bei der Vorbereitung einer Blutprobe für die Analyse eine bestimmte Menge der Blutprobe 36 auf den Objektträger 20 aufgetragen, der dann auf der Schleuderscheibe 16 in der Zentrifugenkammer 14 montiert wird. Der Objektträger wird dabei mit einer solchen Dreh­ zahl und so lange geschleudert, bis sich eine gleich­ mäßig verteilte einzellige Schicht roter Blutkörperchen auf seiner Oberfläche gehildet hat. Üblicherweise wird die Schleuderdrehzahl zwischen 4000 und 10000 U/min kon­ stant gehalten, während die eigentliche Schleuderperiode vergleichsweise kurz ist, beispielsweise weniger als 1 bis 2,5 Sekunden beträgt, bis eine zufriedenstellende einzellige Schicht gebildet worden ist.

Wie in dem Artikel von James W. Bacus "Erythrozyte Mor­ phology and Centrifugal ′Spinner′ Blood Film Prepara­ tions", The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 22 : 7 : 506-516, 1974, beschrieben ist, werden die Blutpro­ ben vorzugsweise verdünnt, um ihre Plasmaviskositäten so einzustellen, daß die einzelnen Proben mit konstanter Schleuderzeit und konstanter Drehzahl geschleudert wer­ den können, um die einzellige Schicht der gut auf Ab­ stand verteilten bzw. vereinzelten und noch diezentrale Delle besitzenden Zellen zu bilden. Beispielsweise wurde eine gründlich gemischte Gesamtblutprobe mit einer Se­ rum-Albuminlösung mit der relativen Viskosität von 1,3 verdünnt, um je Probe auf 18% Hämatokrit einzustellen. Die Viskosität betrug 1,0 gegenüber H₂O; ein typischer Bereich relativer Viskositäten für Blutplasma liegt bei 1,2 bis 1,8. Wahlweise kann eine isotonische Standard- Salzlösung in einem geeigneten Verhältnis, z. B. 1 : 1, für die meisten Blutsorten als Verdünnungsmittel benutzt werden. Wenn die Schleuderzeit zu kurz ist, klumpen die Blutzellen, wie auf diesem Fachgebiet bekannt ist, zusam­ men, so daß es unmöglich wird, sie voneinander zu isolie­ ren und einzeln zu klassifizieren. Im Fall einer zu lan­ gen Schleuderzeit tritt dagegen eine unzulässige Verfor­ mung der Zellkonfiguration auf.

Vorteilhaft wird die einzellige Schicht der roten Blut­ zellen bzw. -körperchen auf dem Objektträger fixiert und so weit getrocknet, daß eine mechanische Handhabung des Objektträgers ohne Ablösung oder Verschiebung der Blut­ zellen möglich ist. Typischerweise trocknet eine einzel­ lige Schicht aus Blutkörperchen auf einem Objektträger innerhalb von 10 bis 15 Sekunden nach Beendigung des Schleudervorgangs, wobei die genaue Zeitspanne von der Luftfeuchtigkeit und anderen Bedingungen abhängt. Wie eingangs erwähnt, führte das Trocknen der einzelligen Schicht bisher zu einer nachteiligen Verformung der ro­ ten Blutkörperchen, so daß eine genaue Identifizierung von Zellen mit der zentralen Delle nicht mehr möglich war und sich eine Fehlbestimmung mißgebildeter Zellen ergab. Beispielsweise sind in Fig. 1 rote Blutkörper­ chen 40 und 42 mit jeweils einer zentralen Delle 44 dar­ gestellt, die durch ein durch die Pfeile in Fig. 2 ange­ deutetes Fixiermittel fixiert wird, um ihren Verlust beim anschließenden Antrocknen der Blutkörperchen zu ver­ hindern. Ohne Fixierung der Blutkörperchen 40 und 42 vor dem Trocknen erfahren die Blutkörperchen eine Abflachung auf die in Fig. 2 bei 40a und 42a in gestrichelten Li­ nien eingezeichnete Form. Die abgeflachten Zellen 40a und 42a, deren zentrale Delle verformt oder verschwunden ist, sind in einer automatischen Analysevorrichtung schwierig von einer echten Sphärozytenzelle 46 zu unter­ scheiden, die nie eine zentrale Delle besessen hat (vgl. Fig. 1).

Beim erfindungsgemäßen Verfahren hat es sich herausge­ stellt, daß die roten Blutkörperchen ohne Änderung der Zellmorphologie ausreichend getrocknet werden können, indem sie während des Schleudervorgangs oder unmittelbar danach fixiert werden, sobald die Blutkörperchen eine einzellige Schicht mit gegenseitiger Vereinzelung gebil­ det haben, jedoch vor dem Zeitpunkt, zu welchem die Trocknung so weit fortgeschritten ist, daß sich die Zellmorphologie unzulässig geändert hat. Es hat sich ge­ zeigt, daß durch dieses Fixieren die physikalische Geome­ trie der Zellen festgelegt wird, so daß das Trocknen der einzelligen Schicht ohne die bisher zu beobachtende Zellenverformung vor sich gehen kann. In bevorzugter Ausführungsform wird die Fixierung durchgeführt, wenn die einzellige Schicht gebildet und die Schleuderwirkung aufgehoben worden ist, d. h. das Fixieren erfolgt vor einer zu starken Trocknung. Erfindungsgemäß geschieht dieses Fixieren dadurch, daß in die Kammer, in welcher der Objektträger geschleudert wird, ein Fixiermittel in Dampfform eingeleitet wird, so daß seine Gegenwart kei­ nen ungünstigen Einfluß auf die Blutprobe hat. Durch diese Fixierung wird die Zellmorphologie praktisch fest­ gelegt.

Wie sich erwiesen hat, wird bei der Fixierung der Blut­ körperchen vor dem Schleudern die Verteilung der Blutkör­ perchen oder Zellen in der angestrebten einzelligen Schicht verhindert, so daß sich beim anschließenden Schleudern eher Klumpen oder Streifen der Blutkörperchen bilden. Weiterhin hat es sich gezeigt, daß durch das Auf­ bringen eines flüssigen Fixiermittels auf den Objektträ­ ger nach dem Schleudern, aber vor dem Trocknen die Zel­ lenverteilung gestört wird, und zwar sogar bis zu dem Punkt, an welchem die Blutprobe vom Objektträger herab­ gespült wird.

Ein Fixiermittel, das sich als besonders günstig erwie­ sen hat, ist Formaldehyd, der bei normaler Raumtempera­ tur als Gas vorliegt. Bei der dargestellten Vorrichtung enthält der Behälter 28 Formalin (eine wässrige Lösung aus etwa 37 bis 50 Vol.-% Formaldehyd und etwa 15 Vol.-% Methanol). Der Formaldehyd verflüchtigt sich aus der Lö­ sung und wird über die Leitung 26 der Kammer 14 der Zen­ trifuge 10 zugeleitet. Wahlweise kann der die einzellige Blutkörperchen-Schicht tragende Objektträger 20 (nach dem Schleudern) schnell aus der Schleuderkammer entnom­ men und in eine Atmosphäre dampfförmigen Formaldehyds eingebracht werden. Diese Abwandlung ist jedoch im Hin­ blick auf die ziemlich kurze Zeitspanne, d. h. etwa fünf Sekunden, innerhalb welcher die Überführung erfolgen muß, wenn die Fixierung vor dem Auftreten eines schädli­ chen Antrocknens stattfinden soll, weniger vorteilhaft. Darüber hinaus ist das "geschlossene" System bei der dar­ gestellten Ausführungsform als Möglichkeit zur Steuerung des dampfförmigen Formaldehyds zu bevorzugen, weil die­ ser Stoff in Konzentrationen von mehr als 5 ppm giftig ist und in höheren Konzentrationen eine Gefahr für das Personal darstellt. Eine etwa 5 Minuten lange Einwirkung einer dampfförmigen Formaldehyd-Atmosphäre auf die ein­ zellige Schicht gewährleistet die gewünschte Fixierung der roten Blutkörperchen.

Beim Schleudern der Blutprobe wird der allergrößte Teil derselben vom Objektträger gegen die Innenwände des Zen­ trifugengehäuses 12 geschleudert. Dieses Blut kann eine Vielfalt schädlicher Organismen enthalten, so daß bei ei­ nigen Zentrifugen eine Flüssigkeit, üblicherweise Was­ ser, während des Schleudervorgangs gegen die Innenwände des Gehäuses 12 gespritzt wird, um eine Sicherheits­ schranke gegen ein Entweichen solcher Organismen aus der Kammer zu bilden. Das weggeschleuderte Blut wird dabei über einen Abfluß im Boden der Zentrifugenkammer heraus­ gespült. In praktischer Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann dieses Sprühwasser durch Formalin er­ setzt werden. Dabei werden die Formaldehyd-Dämpfe vom Be­ ginn des Schleudervorgangs an in der Zentrifuge erzeugt. Bei diesem Verfahren erfolgen das Schleudern und die Bil­ dung einer einzelligen Schicht ausreichend schnell, d. h. innerhalb von 0,5 Sekunden so daß unabhängig davon, daß dampfförmiges Formaldehyd von Anfang an in der Zen­ trifugen- bzw. Schleuderkammer vorhanden ist, die Fixie­ rung erst dann stattfindet, wenn sich die Zellen bzw. Blutkörperchen in der einzelligen Schicht verteilt ha­ hen.

Nach dem Fixieren und Trocknen der Probe wird der Objekt­ träger 20 aus der Zentrifuge bzw. der Fixierkammer ent­ nommen und mittels einer automatisierten Vorrichtung ana­ lysiert. Es hat sich gezeigt, daß die auf die beschriebe­ ne Weise fixierten roten Blutkörperchen 40 und 42 ihre charakteristische zentrale Delle 44 sowie andere physika­ lische Merkmale und Eigenschaften beibehalten, so daß die auf diese Weise vorbereiteten Proben eine wahre und genaue Darstellung der Morphologie der Zellen bzw. Blut­ körperchen bei der Analyse in einer automatischen Ana­ lysiervorrichtung bieten.

Obgleich das bevorzugte Fixiermittel, nämlich Formalde­ hyd, erfolgreich angewandt worden ist, kann angenommen werden, daß andere in Dampfform überführbare Fixiermit­ tel, wie Methyl-, Äthyl- oder kurzkettige Alkohole anstelle von Formaldehyd eingesetzt werden können. Die Erfindung soll daher keinesfalls auf ein bestimmtes Fixiermittel beschränkt sein.

Claims (3)

1. Verfahren zur Präparation einer aus Blut gewonnenen Zellprobe in Form einer einzelligen Schicht auf einem Mikroskop-Objektträger, wobei zunächst auf dem Objekt­ träger eine Anfangsmenge der in einer Trägerflüssig­ keit befindlichen Zellen aufgetragen und anschließend mit Hilfe von Zentrifugalkräften überflüssige Zellen samt Trägerflüssigkeit entfernt werden, bis eine ein­ zellige Schicht auf dem Objektträger hergestellt ist, anschließend diese fixiert und dann getrocknet wird, dadurch gekennzeichnet, daß zur Präparation von Erythrozyten enthaltenden Zellproben, bei denen die ursprüngliche Form der Erythrozyten erhalten bleiben soll, die Zellproben während oder unmittelbar an­ schließend an die Zentrifugation, sobald eine einzel­ lige Schicht gebildet ist, noch im feuchten Zustand und vor einer Erythrozyten-Formveränderung einem ge­ eigneten dampfförmigen Fixiermittel ausgesetzt werden und anschließend getrocknet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixiermittel, vorzugsweise Formaldehyd, in Dampfform einwirkt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Formaldehyd-Dampf bei Zimmertemperatur mindestens fünf Minuten lang zur Fixierung einwirkt.