-
"Verfahren und Vorrichtung zur Vorbereitung von
-
Blutproben für die automatisierte Analyse
Die Erfindung
betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung oder Vorbereitung von
Blutzellenproben für die diagnostische Analyse bzw.
-
Untersuchung. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Fixierung
oder Konservierung der Morphologie von Zellen für die spätere automatisierte Analyse.
-
Die Erfindung befaßt sich speziell mit der Fixierung von Zellen bzw.
Blutkörperchen während eines präzisen und kritischen Schritts der Probenzubereitung,
so daß die Zellmorphologie für die spätere Untersuchung erhalten bleibt. Auf diese
Weise kann das Auftreten von Verfälschungen, wie sie bei anderen, bisherigen Verfahren
zur Probenvorbereitung mit auf einem Objektträger befindlichen Zellen vorkommen,
auf ein Mindestmaß herabgesetzt werden. Obgleich die Erfindung keineswegs auf eine
bestimmte Sorte von Zellen oder Proben beschränkt sein soll, ist sie im folgenden
in Verbindung mit der Vorbereitung von roten Blutzellen bzw. -körperchen für die
automatische Analyse in einem Schnellverfahren beschrieben. Eine der erwähnten,
bei den bisherigen Verfahren zur Vorbereitung von Nikroskopie-Objektträgern auftretenden
Verf älschungen ist eine Veränderung der Morphologie bestimmter
roter
Blutkörperchen, die sich insbesondere darin äußert, daß bestimmte Zellen bzw. Blutkörperchen
ihre zentrale Delle oder Vertiefung verlieren, nämlich einen flachen, eingedrückten
zentralen Bereich der Zelle, so daß die Zelle mehr rund wird und eher Sphärozyten
oder anderen Zellen eines gleichen Durchmessers oder ähnlicher Form gleicht.
-
Die Diagnose verschiedener Arten von Anämie wird durch genaue Analyse
der Größe der roten Blutkörperchen sowie durch Quantifizierung der Parameter der
roten Blutkörperchen erleichtert, beispielsweise der Wintrobe-Indizes des mittleren
Zellvolumens, des mittleren Zellhämoglobingehalts oder der mittleren Zellhämoglobinkonzentration.
Derzeit werden diese Informationen typischerweise mittels eines Coulter-Zählers
ermittelt, 3 der die Zahl von roten Blutkörperchen pro mm , die Hämoglobinkonzentration
und das mittlere Zellvolumen in einem Flüssigkeitsströmungs-System mißt. Zusätzlich
zu der durch diesen Zähler geiieferten Information wäre es sehr nützlich, eine genaue
Auswertung der Art der in der Probe enthaltenen Zellen in übereinstimmung mit bewährten
hämatologischen Klassifikationen zu erhalten, beispielsweise der Normozyten, Makrozyten,
der scheibenförmigen Zellen, der Mikrozyten, der mit Nadeln versehenen
Zellen,
der hypochromen länglichen Zellen, der Sphärozyten usw. Ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur Einteilung einzelner Zellen nach dieser Klassifizierung, d. h. nach Untergruppen,
und zur Lieferung der Erythrozyten-Parameter für jede Untergruppe findet sich in
der US-PS 4 097 845, auf die hiermit Bezug genommen wird.
-
Das älteste und üblichste Verfahren zur Vorbereitung von Mikroskopie-Objektträgern
für die manuelle Auswertung unter einem Mikroskop ist die sogenannte Keilstreich-Technik,
bei welcher eine auf einem Glasträger befindliche Blutmenge mittels eines zweiten
Objektträgers auf der Oberfläche des ersten Objektträgers verstrichen wird, um auf
letzterem eine dünne Blutschicht zu formen. Nach dem Auftrocknen dieser Schicht,
was nur kurze Zeit dauert, wird der Objektträger in ein Anfärbmittel getaucht, worauf
die Bedienungsperson den Objektträger unter einem Mikroskop betrachtet und durch
Sichtbetrachtung die Häufigkeit der roten Blutkörperchen auswertet. Dieses Vorgehen
ist nicht nur zeitraubend, vielmehr wird durch die physikalische Wirkung des zum
Aufstreichen benutzten Objektträgers die Morphologie zahlreicher Zellen gestört.
Typischerweise eignet sich hierbei auch unter günstigsten Bedingungen nur ein
Bruchteil
der Oberfläche des Objektträgers für die Analyse. Aufgrund dieser Störung wird diese
Aufstreichtechnik für die automatisierte Auswertung oder Analyse der roten Blutkörperchen
ungeeignet.
-
insbesondere für die Leukozytenanalyse ist ein Schleuderverfahren
entwickelt worden, bei dem eine einlagige Schicht von Zellen bzw. Blutkörperchen
auf einem Objektträger gebildet wird, der später für die automatisierte Analyse
der Leukozyten benutzt werden kann. Mittels dieser Vorrichtung wird insbesondere
ein Objektträger mit dem darauf aufgebrachten Blut in der Ebene der Oberfläche,
welche das Blut einnimmt, geschleudert, wobei das überschüssige Blut nach außen
von der Objektträgeroberfläche abgeschleudert wird. Durch Oberflächenspannung und/oder
andere Kräfte wird auf dem Objektträger eine einzellige Schicht des Blutes zurückgehalten.
Bei der Leukozvtenuntersuchung werden die Zellen in der einwelligen Schicht getrocknet
und sodann mit Wrightschem oder einem anderen Anfärbmittel angefärbt und automatisch
aaalysXe1t (vgl. US-PS 3 883 852).
-
Obgleich sich durch das Trocknen der Leukozyten keine wesentliche
Verfälschung vom Standpunkt der Leukozytenanalyse ergibt, hat es sich herausgestellt,
daß das
Trocknen von roten Blutkörperchen bzw. Erythrozyten zu
unerwünschten Verfälschungen führt, insbesondere zu einem Verlust der zentralen
Delle zahlreicher roter Blutkörperchen während ihrer Trocknung. Obgleich die Ursachen
für diese Formveränderung noch nicht vollständig geklärt sind, werden sie anscheinend
durch Oberflächenspannung, Aufladungen und/oder Trocknungseffekte hervorgerufen.
-
Beim Schleuderverfahren bildet sich die bevorzugte einzellige Schicht
roter Blutkörperchen auf dem Objektträger, wobei die einzelnen Blutkörperchen voneinander
vereinzelt sind, d. h. Abstand zueinander besitzen.
-
Wenn nun ein solcher Objektträger in eine Fixier- oder Anfärbflüssigkeit
getaucht wird, bevor die Zellen getrocknet sind, werden die roten Blutkörperchen
vom Objektträger weggewaschen. Wenn die roten Blutkörperchen vor dem Auftragen auf
den Objektträger in Lösung fixiert werden, klumpen sie aufgrund der Fixierung zusammen,
so daß keine einzellige Schicht vereinzelter Zellen erhalten werden kann. Aus diesem
Grund ist es zweckmäßig, die Zellen bzw. Blutkörperchen im Zeitraum nach dem Ausbilden
der einzelligen Schicht, aber vor dem Trocknen zu fixieren.
-
Aufgabe der Erfindung ist damit insbesondere die Schaffung eines Verfahrens
und einer Vorrichtung zur Festlegung oder Fixierung der Zellmorphologie von Blutkörperchen
auf einem Objektträger nach der Ausbildung der einzelligen Schicht, aber vor dem
Trocknen der Zellen auf dem Objektträger, um ihre kennzeichnenden Merkmale für die
spätere Analyse zu bewahren.
-
Im folgenden ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung in
Verbindung mit der beigefügten Zeichnung näher erläutert. Es zeigen: Figur 1 eine
in vergrößertem Maßstab gehaltene, schematische Aufsicht auf einen Mikroskopie-Objektträger,
auf dem sich eine einzellige Schicht aus roten Blutkörperchen mit zentraler Delle
und aus einem roten Blutkörperchen ohne diese Delle befindet, Figur 2 eine Seitenansicht
des Objektträgers mit den Zellen gemäß Figur 1, Figur 3 eine perspektivische Darstellung
einer in der Offenstellung befindlichen Vorrichtung gemäß der Erfindung und
Figur
4 eine perspektivische Darstellung der Vorrichtung nach Figur 3 in geschlossenem
Zustand.
-
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird im allgemeinen eine Blutprobenmenge
auf einen Mikroskopie-Objektträger aufgetragen, der dann in einer Zentrifuge geschleudert
wird. Durch das Schleudern werden alle Blutkörperchen, bis auf eine einzellige Schicht
vom Objektträger herabgeschleudert. Bevor die Probe bis zu dem Grad getrocknet worden
ist, bei dem die roten Blutkörperchen normalerweise einer Verformung unterliegen,
wird ein geeignetes Fixiermittel auf die einzellige Schicht aufgebracht, um die
Form der roten Blutkörperchen zu konservieren, so daß bei der weiteren Trocknung
die Zellenmorphologie nicht in dem Maße beeinträchtigt wird, daß die Zellen ihre
Konfiguration mit der zentralen Delle verlieren.
-
Die in Figur 3 dargestellte Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens umfaßt eine Zentrifuge 10 mit einem Gehäuse 12, das eine oberseitige
offene, innere Kammer 14 festlegt, in welcher eine Scheibe 16 drehbar am oberen
Ende einer Welle 18 montiert ist. Die Scheibe 16 nimmt auf ihrer flachen, waagerechten
Oberseite einen Objektträger 20 zum Schleudern desselben in einer waagerechten Ebene
auf. Die Halterung des Objektträgers
20 auf der Scheibe erfolgt
dabei mit Hilfe geeigneter Mittel 22, etwa mittels Laschen oder dergleichen, die
auf der Scheibenoberfläche in einem für die Einspannung des Objektträgers geeigneten
Abstand voneinander angeordnet sind. Die Welle 18 wird durch einen nicht dargestellten
Motor in Drehung versetzt, wobei die Größe und Dauer der Schleuderwirkung durch
eine an sich bekannte Einrichtung geregelt werden. Geeignete Zentrifugen bzw. Schleudervorrichtungen
sind im Handel erhältlich und können z. B. den in den US-PSen 3 853 092 und 3 906
890 beschriebenen Zentrifugen entsprechen.
-
In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die oberseitige Öffnung
der Kammer der Zentrifuge beispielsweise mittels einer Abdeckhaube oder eines Deckels
24 verschließbar, der über der oberseitigen Öffnung auf das Gehäuse 12 aufsetzbar
ist. Bei der dargestellten Ausführungsform ist der Deckel beispielsweise über eine
Leitung 26 mit einem Vorrat eines dampfförmigen Fixiermittels verbunden, beispielsweise
mit einem Kanister oder Behälter 28, welcher dieses Fixiermittel enthält.
-
Eine in die Leitung 26 eingeschaltete Ventileinrichtung 30 ermöglicht
eine Steuerung der Dampfströmung zwischen dem Vorrat und dem Innenraum 14 der Zentrifuge.
Bei der
dargestellten Ausführungsform umfaßt die Ventileinrichtung
30 eine halbkreisförmige Platte 31, die im Mittelpunkt auf einem am Deckel befestigten
Stift oder Zapfen 33 schwenkbar gelagert ist. Die Ventilplatte wird zum Verschließen
oder Öffnen der Auslaßöffnung der Leitung 26 verdreht, wenn ein nach oben ragender
Griffzapfen 35 erfaßt und über einen Kreisbogen geführt wird. Um das dampfförmige
Fixiermittel in die Kammer zu drücken, wird der Behälter 28 beispielsweise mittels
eines in ihn eingebauten Gebläses 32 oder mittels einer den Behälter 28 mit Luft
beschickenden Luftpumpe 34 unter einem höheren Druck gehalten als das Innere der
Zentrifugenkammer.
-
Wie erwähnt, wird bei der Vorbereitung einer Blutprobe für die Analyse
eine bestimmte Menge der Blutprobe 36 auf den Objektträger 20 aufgetragen, der dann
auf der Schleuderscheibe 16 in der Zentrifugenkammer 14 montiert wird. Der Objektträger
wird dabei mit einer solchen Drehzahl und so lange geschleudert, bis sich eine gleichmäßig
verteilte einzellige Schicht roter Blutkörperchen auf seiner Oberfläche gebildet
hat. Üblicherweise wird die Schleuderdrehzahl zwischen 4000 und 10000 U/min konstant
gehalten, während die eigentliche Schleuderperiode vergleichsweise kurz ist, beispielsweise
weniger als
1 bis 2,5 Sekunden beträgt, bis eine zufriedenstellende
einzellige Schicht gebildet worden ist.
-
Wie in dem Artikel von James W. Bacus "Erythocyte Morphology and Centrifugal
'Spinner' Blood Film Preparations", The Journal of Histochemistry and Cytochemistry,
22:7:506-516, 1974, beschrieben ist, werden die Blutproben vorzugsweise verdünnt,
um ihre Plasmaviskositäten so einzustellen, daß die einzelnen Proben mit konstanter
Schleuderzeit und konstanter Drehzahl geschleudert werden können, um die einzellige
Schicht der gut auf Abstand verteilten bzw. vereinzelten und noch die zentrale Delle
besitzenden Zellen zu bilden. Beispielsweise wurde eine gründlich gemischte Gesamtblutprobe
mit einer Serum-Albuminlösung mit der relativen Viskosität von 1,3 verdünnt, um
jede Probe auf 18 % Hämatokrit einzustellen. Die Viskosität betrug 1,0 gegenüber
H20; ein typischer Bereich relativer Viskositäten für Blutplasma liegt bei 1,2 bis
1,8.
-
Wahlweise kann eine isotonische Standard-Salzlösung in einem geeigneten
Verhältnis, z. B. 1 : 1, für die meisten Blutsorten als Verdünnungsmittel benutzt
werden. Wenn die Schleuderzeit zu kurz ist, klumpen die Blutzellen, wie auf diesem
Fachgebiet bekannt ist, zusammen, so daß es unmöglich wird, sie voneinander zu
isolieren
und einzeln zu klassifizieren. Im Fall einer zu langen Schleuderzeit tritt dagegen
eine unzulässige Verformung der Zellkonfiguration auf.
-
Anstatt, wie bevorzugt, die Plasmaviskosität einzustellen und eine
konstante Schleuderzeit vorzusehen, kann eine Schleudervorrichtung benutzt werden,
welche die Schleuderzeit selbsttätig regelt. Eine derartige Vorrichtung (vgl. US-PS
3 827 805) arbeitet mit einem Lichtstrahl, welcher während des Schleudervorgangs
durch den Objektträger und die Probe hindurchfällt.
-
Durch Messung des Grads der durch die Blutkörperchen bewirkten Streuung
des Lichtstrahls kann der Schleudervorgang beendet werden, wenn eine vorbestimmte
Zellenverteilung erreicht ist. Eine andere Vorrichtung mit Regelung oder Einstellung
der Schleuderzeit ist in der US-PS 3 906 890 beschrieben. Bei dieser Vorrichtung
bestimmt die Bedienungsperson die ungefähre Blutzellenkonzentration der Probe, um
dann die Schleuderzeit entsprechend einzustellen. Die Erfindung ist auf jede dieser
bisherigen Vorrichtungen anwendbar, jedoch nicht darauf beschränkt.
-
Vorteilhaft wird die einzellige Schicht der roten Blutzellen bzw.
-körperchen auf dem Objektträger fixiert
und so weit getrocknet,
daß eine mechanische Handhabung des Objektträgers ohne Ablösung oder Verschiebung
der Blutzellen möglich ist. Typischerweise trocknet eine einzellige Schicht aus
Blutkörperchen auf einem Objektträger innerhalb von 10 bis 15 Sekunden nach Beendigung
des Schleudervorgangs, wobei die genaue Zeitspanne von der Luftfeuchtigkeit und
anderen Bedingungen abhängt.
-
Wie eingangs erwähnt, führte das Trocknen der einzelligen Schicht
bisher zu einer nachteiligen Verformung der roten Blutkörperchen, so daß eine genaue
Identifizierung von Zellen mit der zentralen Delle nicht mehr möglich war und sich
eine Fehlbestimmung mißgebildeter Zellen ergab. Beispielsweise sind in Figur 1 rote
Blutkörperchen 40 und 42 mit jeweils einer zentralen Delle 44 dargestellt, die durch
ein durch die Pfeile in Figur 2 angedeutetes Fixiermittel fixiert wird, um ihren
Verlust beim anschließenden Antrocknen der Blutkörperchen zu verhindern. Ohne Fixierung
der Blutkörperchen 40 und 42 vor dem Trocknen erfahren die Blutkörperchen eine Abflachung
auf die in Figur 2 bei 40a und 42a in gestrichelten Linien eingezeichnete Form.
Die abgeflachten Zellen 40a und 42a, deren zentrale Delle verformt oder verschwunden
ist, sind in einer automatischen Analysevorrichtung schwierig von einer echten Sphärozytenzelle
46 zu unterscheiden, die nie eine zentrale Delle besessen
hat (vgl.
Figur 1).
-
Beim erfindungsgemäßen Verfahren hat es sich herausgestellt, daß die
roten Blutkörperchen ohne Änderung der Zellmorphologie ausreichend getrocknet werden
können, indem sie während des Schleudervorgangs oder unmittelbar danach fixiert
werden, sobald die Blutkörperchen eine einzellige Schicht mit gegenseitiger Vereinzelung
gebildet haben, jedoch vor dem Zeitpunkt, zu welchem die Trocknung so weit fortgeschritten
ist, daß sich die Zellmorphologie unzulässig geändert hat. Es hat sich gezeigt,
daß durch dieses Fixieren die physikalische Geometrie der Zellen festgelegt wird,
so daß das Trocknen der einzelligen Schicht ohne die bisher zu beobachtende Zellenverformung
vor sich gehen kann. In bevorzugter Ausführungsform wird die Fixierung durchgeführt,
wenn die einzellige Schicht gebildet und die Schleuderwirkung aufgehoben worden
ist, d. h. das Fixieren erfolgt vor einer zu starken Trocknung. Erfindungsgemäß
geschieht dieses Fixieren dadurch, daß in die Kammer, in welcher der Objektträger
geschleudert wird, ein Fixiermittel in Dampfform eingeleitet wird, so daß seine
Gegenwart keinen ungünstigen Einfluß auf die Blutprobe hat. Durch diese Fixierung
wird die Zellmorphologie praktisch festgelegt.
-
Wie sich erwiesen hat, wird bei der Fixierung der Blutkörperchen vor
dem Schleudern die Verteilung der Blutkörperchen oder Zellen in der angestrebten
einzelligen Schicht verhindert, so daß sich beim anschließenden Schleudern eher
Klumpen oder Streifen der Blutkörperchen bilden. Weiterhin hat es sich gezeigt,
daß durch das Aufbringen eines flüssigen Fixiermittels auf den Objektträger nach
dem Schleudern, aber vor dem Trocknen die Zellenverteilung gestört wird, und zwar
sogar bis zu dem Punkt, an welchem die Blutprobe vom Objektträger herabgespült wird.
-
Ein Fixiermittel, das sich als besonders günstig erwiesen hat, ist
Formaldehyd, der bei normaler Raumtemperatur als Gas vorliegt. Bei der dargestellten
Vorrichtung enthält der Behälter 28 Formalin (eine wässrige Lösung aus etwa 37 bis
50 Vol.-% Formaldehyd und etwa 15 Vol.-% Methanol). Der Formaldehyd verflüchtigt
sich aus der Lösung und wird über die Leitung 26 der Kammer 14 der Zentrifuge 10
zugeleitet. Wahlweise kann der die einzellige Blutkörperchen-Schicht tragende Objektträger
20 (nach dem Schleudern) schnell aus der Schleuderkammer entnommen und in eine Atmosphäre
dampfförmigen Formaldehyds eingebracht werden. Diese Abwandlung ist jedoch im Hinblick
auf die ziemlich kurze Zeitspanne, d. h.
etwa fünf Sekunden, innerhalb
welcher die Uberführung erfolgen muß, wenn die Fixierung vor dem Auftreten eines
schädlichen Antrocknens stattfinden soll, weniger vorteilhaft. Darüber hinaus ist
das "geschlossene" System bei der dargestellten Ausführungsform als Möglichkeit
zur Steuerung des dampf förmigen Formaldehyds zu bevorzugen, weil dieser Stoff in
Konzentrationen von mehr als 5 ppm giftig ist und in höheren Konzentrationen eine
Gefahr für das Personal darstellt. Eine etwa 5 Minuten lange Einwirkung einer dampf
förmigen Formaldehyd-Atmosphäre auf die einzellige Schicht gewährleistet die gewünschte
Fixierung der roten Blutkörperchen.
-
Beim Schleudern der Blutprobe wird der allergrößte Teil derselben
vom Objektträger gegen die Innenwände des Zentrifugengehäuses 12 geschleudert. Dieses
Blut kann eine Vielfalt schädlicher Organismen enthalten, so daß bei einigen Zentrifugen
eine Flüssigkeit, üblicherweise Wasser, während des Schleudervorgangs gegen die
Innenwände des Gehäuses 12 gespritzt wird, um eine Sicherheitsschranke gegen ein
Entweichen solcher Organismen aus der Kammer zu bilden. Das weggeschleuderte Blut
wird dabei über einen Abfluß im Boden der Zentrifugenkammer herausgespült. In praktischer
Ausführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens kann dieses Sprühwasser durch Formalin ersetzt
werden. Dabei werden die Formaldehyd-Dämpfe vom Beginn des Schleudervorgangs an
in der Zentrifuge erzeugt. Bei diesem Verfahren erfolgen das Schleudern und die
Bildung einer einzelligen Schicht ausreichend schnell, d. h. innerhalb von 0,5 Sekunden,
so daß unabhängig davon, daß dampfförmiger Formaldehyd von Anfang an in der Zentrifugen-
bzw. Schleuderkammer vorhanden ist, die Fixierung erst dann stattfindet, wenn sich
die Zellen bzw. Blutkörperchen in der einzelligen Schicht verteilt haben.
-
Nach dem Fixieren und Trocknen der Probe wird der Objektträger 20
aus der Zentrifuge bzw. der Fixierkammer entnommen und mittels einer automatisierten
Vorrichtung analysiert. Es hat sich gezeigt, daß die auf die beschriebene Weise
fixierten roten Blutkörperchen 40 und 42 ihre charakteristische zentrale Delle 44
sowie andere physikalische Merkmale und Eingeschaften beibehalten, so daß die auf
diese Weise vorbereiteten Proben eine wahre und genaue Darstellung der Morphologie
der Zellen bzw. Blutkörperchen bei der Analyse in einer automatischen Analysiervorrichtung
bieten.
-
Obgleich das bevorzugte Fixiermittel, nämlich Formaldehyd,
erfolgreich
angewandt worden ist, kann angenommen werden, daß andere Fixiermittel, wie Methyl-,
Äthyl- oder kurzkettige Alkohole anstelle von Formaldehyd eingesetzt werden können
oder daß auch andere Fixiermöglichkeiten, etwa durch Erwärmung z. B. durch Mikrowellen,
oder mit anderen physikalischen oder chemischen Mitteln gegeben sind. Die Erfindung
soll daher keinesfalls auf ein bestimmtes Fixiermittel beschränkt sein.
-
Obgleich vorstehend nur eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
im einzelnen dargestellt und beschrieben ist, ist die Erfindung keineswegs hierauf
beschränkt, da dem Fachmann selbstverständlich innerhalb des Rahmens der Erfindung
zahlreiche Änderungen und Abwandlungen möglich sind.