DE3800379A1

DE3800379A1 - Vorrichtung zum abwaschen der innenflaeche eines reaktionsgefaesses und/oder der aussenflaeche eines reagenzkugelkoerpers

Info

Publication number: DE3800379A1
Application number: DE3800379A
Authority: DE
Inventors: Wolf Dieter Dr Rer Nat Engel; Johann Dipl Chem Dr Rer N Karl; Friedrich Staebler
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1988-01-08
Filing date: 1988-01-08
Publication date: 1989-07-20
Also published as: US4913179A; JPH01223353A; EP0328859A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung nach dem Ober begriff des Anspruchs 1.

Bei chemischen Bindungs-Reaktionen, vor allem bei immunologischen Tests, bei denen Reaktionsgefäße ver wendet werden, deren Innenwände mit einem spezifisch bindefähigen Reagenz beschichtet sind, ist es nötig, nach Zugabe der in einer Flüssigkeit gelöst vorliegen den, zu bindenden Probe oder einer zu analysierenden flüssigen Probe nach einer Reaktionszeit die Flüssigkeit aus dem Röhrchen zu entfernen und dann die an die Innenwand des Reagenzgefäßes gebundene Schicht aus Reagenz und spezifisch bindenden Probenbestandteilen zu waschen, so daß nicht spezifisch gebundene Probenbestand teile entfernt werden.

Hierzu wurde bisher eine Vorrichtung verwendet, die das Absaugen der Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß durch ein Röhrchen erlaubt und es außerdem ermöglicht, nach dem Absaugen über einen Zuführungskanal eine Wasch flüssigkeit in das Reagenzgefäß einzubringen, wobei die zufließende Menge an Waschflüssigkeit über Elektroden, die an einen Flüssigkeitspegelfühler angeschlossen sind, automatisch reguliert werden kann. Als Ansaugmün dung der Vorrichtung diente hierbei das untere Ende des Röhrchens, dessen Öffnungsbreite dem Durchmesser des Röhrchens entspricht. Um die Flüssigkeit aus dem Reak tionsgefäß möglichst vollständig abzusaugen und so eine gründliche Waschung der beschichteten Wände des Reak tionsgefäßes zu erreichen, wurde die bisher verwendete Vorrichtung durch eine am oberen Ende der Vorrichtung angebrachten Feder gegen den Boden des Reaktionsgefäßes gedrückt. Damit auch bei Auflage des Röhrchens auf den Boden die Flüssigkeit abgesaugt werden konnte, war das als Ansaugmündung fungierende untere Ende des Röhrchens an zwei gegenüberliegenden Stellen eingekerbt.

Chemische Bindungsreaktionen und immunologische Tests werden aber heute oft automatisiert durchgeführt, wobei abwechselnd sowohl Reaktionsgefäße mit Reagenz-beschich teten Innenwänden, als auch Reaktionsgefäße, welche Reagenz-beschichtete Reagenzkugelkörper (sogenannte "beads") enthalten, verwendet werden. Auch die Verwen dung von Reagenzkugelkörpern enthaltenden Reaktionsge fäßen mit Reagenz-beschichteten Innenwänden ist üblich. Zum Entfernen der Probenflüssigkeit und zum Waschen von Reaktionsgefäßen, welche Reagenzkugelkörper enthalten, sind jedoch die bisher verwendeten Vorrichtungen zum Absaugen und Waschen nicht gut geeignet, da ihre Ansaug mündung oben an dem Reagenzkugelkörper aufliegt und sobald der Flüssigkeitspegel unter die Höhe der Ansaug mündung absinkt, ein Absaugen der den Reagenzkugelkörper umgebenden Flüssigkeit nicht möglich ist.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 anzugeben, die im gleichen Analysenautomaten sowohl bei Reaktionsgefäßen mit reagenzbeschichteten Innenflächen, als auch bei Reaktions gefäßen, welche einen Reagenzkugelkörper enthalten, ein vollständiges Entfernen der Flüssigkeit und gründliches Waschen der Flächen ermöglicht.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1.

Das Röhrchen der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist gegenüber dem einer Vorrichtung nach dem Stand der Technik an seinem ansaugmündungsseitigen Ende um den Durchmesser des Reagenzkugelkörpers verkürzt und weist eine trichterförmige Ansaugmündung auf, deren Durchmes ser vorzugsweise mindestens so groß ist wie der Durch messer des Reagenzkugelkörpers.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird in das Reaktions gefäß vor oder nach Zugabe einer in einer Flüssigkeit gelöst vorliegenden Probe eingebracht und über die Feder an den Reagenzkugelkörper, falls vorhanden, angelegt. Enthält das Reaktionsgefäß keinen Reagenzkugel körper, so wird die Vorrichtung etwa ebenso tief in das Röhrchen eingetaucht, als wenn ein Reagenzkugelkörper vorhanden wäre, d.h. die Ansaugmündung der Vorrichtung sitzt nicht auf dem Boden des Reaktionsgefäßes auf. Über die Ansaugmündung des Röhrchens wird nach einer Reaktionszeit die Flüssigkeit abgesaugt und danach die Waschflüssigkeit über den Zuführungskanal in das Röhrchen gefüllt. Hierbei wird die Zugabe an Waschflüssigkeit unterbrochen, sobald der Flüssigkeitspegel in dem Röhr chen die beiden Elektroden berührt. Dies geschieht automatisch über einen Anschluß der Elektroden an einen elektrischen Flüssigkeitspegelfühler und einen damit verbundenen Schließmechanismus an der Waschflüssigkeit-Zu führungseinrichtung. Die Waschflüssigkeit wird dann, wie bereits für die Probenflüssigkeit beschrieben, entfernt. Durch die Trichterform der Ansaugmündung wird hierbei eine Verletzung der Reagenzschicht auf einem Reagenzkugelkörper vermieden und ein vollständiges Absaugen auch der einen Reagenzkugelkörper umgebenden Flüssigkeit ermöglicht. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung gelingt das Absaugen von Flüssigkeit und Waschen bei Reaktionsgefäßen mit Reagenzkugelkörper bes ser und überraschenderweise auch bei Reaktionsgefäßen ohne Reagenzkugelkörper genauso gut wie mit einer be kannten Vorrichtung (Beispiele 1 und 2).

Um die Ansaugmündung besonders gut an den Reagenzkugel körper anlegen zu können, wird die erfindungsgemäße Vorrichtung bevorzugt gemäß Anspruch 2 und besonders bevorzugt gemäß Anspruch 3 ausgebildet.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungs gemäßen Vorrichtung ist im Anspruch 4 dargestellt. In dieser Ausführungsform wird die Trichterform der Ansaug mündung durch einen am freien Ende des Röhrchens befe stigten Aufsatz gebildet. Dieser ist nach Anspruch 5 bevorzugt auf das freie Ende des Röhrchens aufgesteckt. Um verschiedene Größen von Aufsätzen mit verschiedenen trichterförmigen, bevorzugt konkav hohlkugelig gewölbten Innenflächen der Aufsätze an dem freien Ende des Röhrchens befestigen zu können und daher die Ansaugmündung der Vorrichtung an die jeweils verwendete Größe der Reagenz kugelkörper anzupassen, wird vorzugsweise eine Ausbildung gemäß Anspruch 6 vorgesehen.

Ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung wird im folgen den unter Hinweis auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben:

Fig. 1 zeigt einen Vertikalschnitt durch die Vorrich tung;

Fig. 2 zeigt eine Ansicht der Vorrichtung um ihre Vertikalachse gegenüber der Darstellung in Fig. 1 um 90° verdreht.

Die Vorrichtung nach dem Ausführungsbeispiel weist eine Ansaugmündung 2 auf, deren Innenfläche 18 im Achsschnitt konkav gewölbt und durch einen auf das freie Ende 20 des Röhrchens 6 gesteckten Aufsatz 22 begrenzt ist. Die Außenfläche des Röhrchens 6 und ein das Röhrchen 6 in axialem Abstand von seiner Ansaugmündung 2 mit radialem Abstand umschließender Mantel 8 begrenzen einen Wasch flüssigkeits-Zuführkanal 10, der in einem Innenraum 26 eines Kopfteils 24 mündet. Das Röhrchen 6 durchsetzt diesen Innenraum 26. Der Innenraum 26 des Kopfteils 24 ist über ein weiteres Röhrchen 28 an eine Waschflüssig keitszuführeinrichtung anschließbar. In dem der Ansaug mündung 2 zugewandten Ende des Mantels 8 befinden sich Löcher 12, durch die die Waschflüssigkeit aus dem Waschflüssigkeits-Zuführkanal 10 austritt.

Zwei durch das Kopfteil 24 geführte Elektroden 14 und 16 sind an einen elektrischen Flüssigkeitspegelfühler anschließbar. Bis zu freiliegenden Endabschnitten 30, 32 sind sie von Isolierstoffmänteln 34, 36 umschlossen. Eine das obere Ende des Röhrchens 6 umschließende Feder 4 drückt das Kopfteil 24 in Richtung zum Boden eines Reaktionsgefäßes.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Die Effektivität der Waschung mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Vergleich mit einer um den Durchmesser des Reagenzkugelkörpers verkürzten, bekannten Vorrich tung wurde in einem einen Reagenzkugelkörper ("bead", Polystyrolkugel mit Durchmesser 6,3 mm) enthaltenden Reaktionsgefäß überprüft.

Dazu wurde ein mit Rinderserumalbumin und einem Konju gat aus CEA (Carcino-embryonales Antigen) und Peroxidase beschichteter Kugelkörper in ein ebenfalls mit Rinder serumalbumin und CEA-Peroxidase beschichtetes Reaktions gefäß gegeben. Je effektiver die Waschung ist, um so mehr des adsorptiv gebundenen CEA-Konjugats müßte abgelöst werden. Damit müßte, wenn gut gewaschen wurde, in einer nachfolgenden Farbreaktion ein möglichst geringer Meßwert erhalten werden.

Die Farbreaktion erfolgt in der Weise, daß 500 ml eines Reagenzes, bestehend aus ABTS (2,2′-Azino-di-[3-ethyl benzthiazolinsulfonsäure(6)]-diammoniumsalz und Natri umperborat), zugegeben wurden und nach 45 min die Ex tinktion bei 422 nm bestimmt wurde.

Das Ergebnis zeigt Tabelle I. Dort sind die Anzahl der Waschschritte sowie die Größe des Meßsignals bei 422 nm in mE angegeben. Es zeigte sich, daß mit einer erfin dungsgemäßen Vorrichtung, deren Ansaugmündung als Kunststoffaufsatz auf das freie Ende des Röhrchens ausgebildet war, wesentlich geringere Meßsignale und damit eine bessere Waschung erreicht wurde. Außerdem war der Variationskoeffizient (VK), welcher ein Maß für die Genauigkeit darstellt, mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kleiner.

Tabelle I

Optimierung der Waschung bei 6,3-mm-Beads

Beispiel 2 TSH Immunobestimmung

Es wurde ein TSH-Enzymuntest ® TSH (Thyroid-stimulierendes Hormon) mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung im Ver gleich mit einer bekannten Vorrichtung durchgeführt, wobei die Röhrchenwand beschichtet war. Das Röhrchen enthielt keine Reagenzkugelkörper. Die verwendeten Lösungen, beschichteten Röhrchen und Standards entstam men dem Enzymuntest ® TSH (Boehringer Mannheim GmbH, Bestellnummer 7 36 083). Die Durchführung der Bestimmung erfolgt analog der Vorschrift des Herstellers.

In mit Anti-TSH-Antikörpern beschichtete Röhrchen wurde 1 ml Lösung 1:

Phosphatpuffer: 15 mMol/l, pH 6,9
Rinderserumalbumin: 0,2 Gew.-%
Merathiolat: 0,01 Gew.-%

und 200 µl TSH-Standard gegeben und 60 Minuten bei 20 bis 25°C inkubiert. Nach 6maligem Aussaugen und Spülen (?) wird 1 ml einer Lösung aus 40 U/l Anti-TSH-Peroxidase-Konjugat in oben genannten Puffer zugegeben und 60 Minuten bei 20 bis 25°C inkubiert. Die Röhrchen wurden 6- mal ausgesaugt und gespült . Danach wurde 1 ml einer Lösung, bestehend aus

Phosphat-Citrat-Puffer: 95 mMol/l, pH 4,4
Natrium-Perborat: 3,1 mMol/l
2,2′-Azino-di-[3-Ethyl-Benzthiazolin-Sulfonsäure(6)]-Diamoniumsalz: 1,9 mMol/l

zugegeben und 45 Minuten bei 20 bis 25°C inku biert. Danach wurde gegen letztgenannte Lösung als Leerwert eine photometrische Bestimmung bei λ= 422 nm durchgeführt. Tabelle II zeigt die mit verschiedenen Standards erhaltenen Meßergebnisse. Daraus ergibt sich, daß mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung vergleichbar gute Ergebnisse wie mit einer bekannten Vorrichtung für wandbeschichtete Immunoassays erhalten werden können.

Tabelle II

Claims

1. Vorrichtung zum Abwaschen der Innenfläche eines Reaktionsgefäßes und/oder der Außenfläche wenig stens eines in dem Reaktionsgefäß befindlichen Reagenzkugelkörpers, mit einem an eine Waschflüs sigkeit-Absaugeinrichtung anschließbaren, eine Ansaugmündung (2) aufweisenden, mittels einer Feder (4) in Richtung zum Boden des Reaktionsge fäßes zu drückenden Röhrchen (6), mit einem das Röhrchen (6) in axialem Abstand von seiner Ansaug mündung (2) mit radialem Abstand umschließenden Mantel (8), der zwischen seiner Innenfläche und der Außenfläche des Röhrchens (6) einen an eine Waschflüssigkeits-Zuführungseinrichtung anschließ baren Waschflüssigkeits-Zuführungskanal (10) begrenzt, mit in einem der Ansaugmündung (2) zugewandten Endabschnitt des Mantels (8) vorge sehenen Löchern (12) zum Austritt der Waschflüssig keit und mit zwei außerhalb des Mantels (8) in Abstand voneinander, axial weiter entfernt von der Ansaugmündung (2) als die Löcher (12) im Mantel (8) angeordneten, an einen elektrischen Flüssigkeits pegelfühler anschließbaren Elektroden (14, 16), dadurch gekennzeichnet, daß die Innenfläche (18) der Ansaugmündung (2) trichterförmig ausgebildet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Innen fläche (18) der Ansaugmündung (2) im Achsschnitt konkav gewölbt ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Innen fläche (18) der Ansaugmündung (2) der Außenfläche des Reagenzkugelkörpers angepaßt hohlkugelig gewölbt ist.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ansaugmündung (2) in einem gesonderten, am freien Ende (20) des Röhrchens (6) befestigten Aufsatz (22) ausgebildet ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufsatz (22) auf das freie Ende (20) des Röhrchens (6) aufgesteckt ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufsatz (22) mit dem freien Ende des Röhr chens (6) lösbar verbunden ist.