CN103732741A - 脂肪酶活性的恢复方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种脂肪酶活性的恢复方法，其包括将含脂肪酶的组合物与湿润气体接触的吸湿步骤。此外，本发明还提供一种活性被恢复的脂肪酶的制造方法，包括准备活性低下的脂肪酶的步骤，以及通过该恢复方法使活性低下的脂肪酶的活性恢复的步骤。进而，本发明还提供一种酯合成物的制造方法，其特征在于，使用该活性被恢复的脂肪酶进行酯化或酯交换。

Description

脂肪酶活性的恢复方法
技术领域
本申请是主张基于日本专利申请第2011-179720号的优先权的申请。日本专利申请第2011-179720号的所有内容作为参考并入本申请。
本发明涉及一种恢复含有特定的固定化脂肪酶或粉末脂肪酶的组合物的如各种酯化能力、酯交换能力等脂肪酶活性的方法，以及使用含有恢复了活性的固定化脂肪酶或粉体脂肪酶的组合物的酯化反应及油脂的酯交换方法。
背景技术
脂肪酶被广泛用于脂肪酸等各种羧酸与一元醇、多元醇等醇类间的酯化反应、多种羧酸酯间的酯交换反应等。其中，作为以动植物油脂类的改性为首的各种脂肪酸的酯、糖酯、甾醇酯的制造方法，酯交换反应是一种重要的技术。作为这些反应的催化剂，若使用油脂水解酶、即脂肪酶，则可以在室温～约90℃左右的温和条件下进行酯交换反应，与现有的化学反应相比，不仅抑制副反应、减少能源成本，且由于作为催化剂的脂肪酶是天然物质，因此安全性也高。此外，利用其基质特异性、位置特异性，能够高效生产目标物质。
作为这样的脂肪酶，考虑到活性维持、回收容易性、在原料中的均匀分散性等，近年来开始使用固定在阴离子交换树脂（专利文献1）、苯酚吸附树脂（专利文献2）等上的固定化脂肪酶，以及具有规定的细孔和粒径的粉末脂肪酶（专利文献3）。
但是，由于作为酶的脂肪酶价格昂贵，因此，会在反应结束后进行回收并反复使用，在脂肪酶活性降低到相当严重的程度时才会被废弃。另外，也会采取使降低了的脂肪酶活性恢复的措施。例如，提出了将活性低下的脂肪酶用甘油三酯洗涤来恢复脂肪酶活性的方法（专利文献4），以及通过添加水提高酯交换反应中的脂肪酶活性的方法（专利文献5）。但是，迄今为止已知的恢复方法中，活性的恢复不充分，或不能均一地恢复所有脂肪酶的活性。尤其是在添加水时，通过直接将水喷雾使脂肪酶与水接触，但由于水对于脂肪酶的接触不均匀，因此不仅脂肪酶活性的恢复不均一，而且如果水与脂肪酶的一部分过量接触，则还会发现该部分脂肪酶的活性降低的现象。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭60-98984号公报
专利文献2：日本特开昭61-202688号公报
专利文献3：日本专利第2668187号公报
专利文献4：日本特开2007-300855号公报
专利文献5：日本特开2006-325465号公报
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够使降低了的脂肪酶活性恢复的方法，以及该恢复活性的脂肪酶的制造方法。
本发明的目的还在于提供一种使用具有恢复了的脂肪酶活性的固定化脂肪酶或粉末脂肪酶的酯化方法及酯交换方法。
解决技术问题的手段：
本发明人为了解决上述问题，对能够使降低了的脂肪酶活性恢复的方法进行了研究。结果发现通过将含脂肪酶的组合物在一定条件下与湿润气体接触，能够将降低了的脂肪酶的活性充分恢复，从而完成了本发明。即，本发明可以为涉及以下方面的发明。
[1]、一种脂肪酶活性的恢复方法，其包括将含脂肪酶的组合物与湿润气体接触的吸湿步骤。
[2]、[1]中所述的方法，其中所述湿润气体的相对湿度为50～90%。
[3]、[1]或[2]中所述的方法，其中进行所述吸湿步骤直至含脂肪酶的组合物中含有的水分量为所述含脂肪酶的组合物中除油性成分外的成分中的8.5～20质量%为止。
[4]、[1]～[3]中任一所述的方法，其中所述吸湿步骤在满足相对湿度50～90%、温度30～60℃、保持时间0.5～36小时的条件下进行。
[5]、[1]～[4]中任一所述的方法，其特征在于，所述吸湿步骤为：使所述湿润气体在所述含脂肪酶的组合物中通气。
[6]、[1]～[5]中任一所述的方法，其中在所述吸湿步骤前，包括油性成分调节步骤，所述油性成分调节步骤为：将所述含脂肪酶的组合物中含有的油性成分的质量调节为所述含脂肪酶的组合物中除油性成分外的成分的质量的1.5倍以下。
[7]、[1]～[5]中任一所述的方法，其特征在于，所述吸湿步骤通过使所述湿润气体在所述含脂肪酶的组合物中通气，实现了在降低所述含脂肪酶的组合物中含有的油性成分量的同时，使所述含脂肪酶的组合物吸湿。
[8]、[1]～[7]中任一所述的方法，其中所述含脂肪酶的组合物含有粉末脂肪酶及过滤助剂。
[9]、[1]～[8]中任一所述的方法，其中所述脂肪酶为源自于米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶。
[10]、[8]中所述的方法，其中所述过滤助剂为纤维素。
[11]、一种活性被恢复的脂肪酶的制造方法，包括准备活性低下的脂肪酶的步骤，以及
通过[1]～[10]中任一所述的方法恢复所述活性低下的脂肪酶的活性的步骤。
[12]、一种酯合成物的制造方法，其特征在于，使用通过[11]所述的方法制得的活性被恢复的脂肪酶进行酯化或酯交换。
根据本发明，能够提供一种将在酯化方法及酯交换方法中反复使用导致活性低下的脂肪酶的活性优异地恢复的方法。
特别地，根据本发明，与迄今为止那样的将液态水直接喷雾到脂肪酶上的情况相比，不会出现喷雾不均的情况，能够可靠地提高脂肪酶的活性。
此外，根据本发明，能够提供活性被恢复的脂肪酶的制造方法。
进而，根据本发明，能够提供通过使用活性被恢复的上述脂肪酶进行酯化反应或酯交换反应来制造酯合成物的方法。
具体实施方式
本发明的一个方面为脂肪酶活性的恢复方法，其包括将含脂肪酶的组合物与湿润气体接触的吸湿步骤。以下对该方法进行详细说明。
＜吸湿步骤＞
本发明包括吸湿步骤，其用来恢复由于在酯化方法及酯交换方法等中反复使用导致活性低下的脂肪酶的活性。吸湿步骤通过将含脂肪酶的组合物保持在湿润气体中等措施，将含脂肪酶的组合物与湿润气体接触来进行。
湿润气体与其说是具有通常湿度的大气，不如说指的是强制控制相对湿度或水蒸气量的气体。作为用于湿润气体的气体，例如优选为空气、氮气、二氧化碳、氩气等，其中，优选为空气或氮气，尤其优选为空气。这些气体中，相对湿度为例如50～90%、优选为60～80%、更优选为60～70%的气体可适合用作湿润气体。相对湿度不足时，可以在吸湿步骤的中途，将水蒸气等导入体系内，补充相对湿度。
吸湿步骤进行至含脂肪酶的组合物中除油性成分外的成分中含有的水分量为例如8.5～20质量%、优选为10～18.5质量%、更优选为12～18质量%、进一步优选为13～18质量%为止是恰当的。这里，所谓油性成分是指油脂等在含脂肪酶的组合物中含有的除水性成分外的全体油溶性成分，可以根据后述的基准油脂分析试验法的油分进行测定。作为在本发明的含脂肪酶的组合物中含有的油性成分，可举出如甘油酯、游离的脂肪酸、脂肪酸酯等。
吸湿步骤在满足例如为50～90%、优选为60～80%、更优选为60～70%的相对湿度，例如为30～60℃、优选为40～60℃、更优选为50～60℃，以及例如为0.5～36小时、优选为1～24小时的条件下进行是恰当的。优选的吸湿步骤的条件的组合为：（a）在70～90%的相对湿度、30～60℃保持1天，或（b）在50～90%的相对湿度、40～50℃保持1天的情况中的任一种。
通过经过这样的本发明的吸湿步骤，含脂肪酶的组合物中的脂肪酶的活性能够优异地恢复或能够抑制活性降低。脂肪酶活性的恢复或活性降低的程度可以通过比较在酯化反应或酯交换反应的反应中途阶段中的成分量来进行评价。该成分量可以用通过反应而发生巨大变化的成分进行比较，例如原料或主反应产物。例如在OOO（甘油三油酸酯）与棕榈酸乙酯/硬脂酸乙酯的酯交换反应时，生成POS（1-硬脂酰基-2-油酰基-3-棕榈酰基甘油或1-棕榈酰基-2-油酰基-3-硬脂酰基甘油）及SOS（1,3-二硬脂酰基-2-油酰基甘油），通过比较甘油三酯中的POS和SOS的合计质量，能够得出脂肪酶活性的恢复或活性降低的程度。具体地，本发明的情况下，在使用吸湿步骤前的含脂肪酶的组合物的酯交换反应中，将反应1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%设为100时，将所述吸湿步骤前的含脂肪酶的组合物变为本发明的吸湿步骤后的含脂肪酶的组合物，同样进行1小时酯交换反应后求出得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%（相对量：POS＋SOS值），从而能够比较脂肪酶活性。使用吸湿步骤后的含脂肪酶的组合物时的POS和SOS的合计质量%的比值（相对量：POS＋SOS值）优选为100以上或超过100、例如为150以上、优选为200以上、更优选为200～250的情况是恰当的。
＜油性成分调节步骤＞
优选在上述吸湿步骤前包含油性成分调节步骤，其用来减少含脂肪酶的组合物中含有的上述油性成分。通过在吸湿步骤前除掉含脂肪酶的组合物中的油性成分，可期待脂肪酶的吸湿效果的提高。具体地，在吸湿步骤前、即与湿润气体接触之前，优选将含脂肪酶的组合物中含有的油性成分油脂的质量调节为含脂肪酶的组合物中除油性成分油脂外的成分的质量的1.5倍以下。更优选为1倍（即，含脂肪酶的组合物中的油性成分油脂的质量与含脂肪酶的组合物中除油性成分油脂外的成分的质量相等）以下，最优选为0.1～0.7倍。
＜脂肪酶＞
本发明的含脂肪酶的组合物含有脂肪酶、或脂肪酶与助剂。
作为可在本发明中使用的脂肪酶，可举出脂蛋白脂肪酶、单酰甘油脂肪酶、二酰甘油脂肪酶、三酰甘油脂肪酶、半乳糖脂肪酶、磷脂酶等。其中，优选三酰甘油脂肪酶。
作为产生这些脂肪酶的微生物，并不特别限于细菌、酵母、丝状菌、放线菌等，可举出产碱菌属（Alcaligenes sp.）、假单胞菌属（Pseudomonassp.）、节杆菌属（Arthrobacter sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、球拟酵母属（Torulopsis sp.）、埃希氏菌属（Escherichia sp.）、日本假丝酵母属（Mycotorula sp.）、丙酸杆菌（Propionibacterum sp.）、色杆菌属（Chromobacterum sp.）、黄单胞菌属（Xanthomonas sp.）、乳酸杆菌属（Lactobacillus sp.）、核菌属（Clostridium sp.）、假丝酵母属（Candida sp.）、地霉属（Geotrichum sp.）、复膜孢酵母属（Sacchromycopsis sp.）、诺卡氏菌属（Nocardia sp.）、镰刀菌属（Fuzarium sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、根毛霉菌属（Rhizomucorsp.）、毛霉菌属（Mucor sp.）、嗜热真菌属（Thermomyces sp.）、根霉属（Rhizopus sp.）、青霉属（Penicillium sp.）、须霉属（Phycomycessp.）、柄锈菌属（Puccinia sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、链霉菌属（Streptmyces sp.）等。
本发明中，其中优选源自产碱菌属、假单胞菌属、根毛霉菌属、毛霉菌属、嗜热真菌属、根霉属或青霉属的脂肪酶。其中，更优选为源自产碱菌属的Alcaligenes sp.的脂肪酶、源自根毛霉菌属的米赫根毛霉菌（Rhizomucor miehei）的脂肪酶、源自嗜热真菌属的疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）的脂肪酶、源自根霉属的代氏根霉（Rhizopusdelemar）的脂肪酶、以及源自根霉属的米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶。特别优选为源自米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶。
作为本发明的含脂肪酶的组合物中使用的脂肪酶，可以是将经培养而含有脂肪酶的培养基成分等的含脂肪酶的水性液体进行干燥而得到的含脂肪酶的组合物，但优选为不含有这些，即实质上由脂肪酶自身构成的含脂肪酶的组合物。作为本发明的含脂肪酶的组合物，更优选在脂肪酶的培养后，除去菌体并固定化的含脂肪酶的组合物，或进一步进行粉末化的含脂肪酶的组合物。
本发明中使用的脂肪酶，可以具有位置特异性，也可以不具有。在具有位置特异性时，优选为1,3-特异性。
作为在脂肪酶的培养中使用的脂肪酶培养液，可举出如含有大豆粉、胨、玉米浆、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O等的水溶液。作为它们的浓度，大豆粉为0.1～20质量%，优选为1.0～10质量%；胨为0.1～30质量%，优选为0.5～10质量%；玉米浆为0.1～30质量%，优选为0.5～10质量%；K2HPO4为0.01～20质量%，优选为0.1～5质量%。此外，（NH4）2SO4为0.01～20质量%，优选为0.05～5质量%；MgSO4·7H2O为0.01～20质量%，优选为0.05～5质量%。培养条件可以为：培养温度为10～40℃，优选为20～35℃；通气量为0.1～2.0VVM，优选为0.1～1.5VVM；搅拌旋转数为100～800rpm，优选为200～400rpm；pH为使用NaOH、氨来控制为3.0～10.0，优选为4.0～9.5，更优选为7.0～8.0。
菌体的分离优选用离心分离、膜过滤等来进行。此外，盐类、糖等低分子成分的去除可以通过UF膜处理来进行。具体来说，通过反复进行1～5次“进行UF膜处理、将含有脂肪酶的水溶液浓缩至1/2量的体积后添加与浓缩液等量的磷酸缓冲液”这样的操作，可以得到去除了低分子成分的含脂肪酶的水性液体。
离心分离优选控制为200～20，000×g，膜过滤优选用MF膜、压滤机等将压力控制在3.0kg/m2以下。菌体内酶的情况下，优选用均质器、高速组织捣碎机、超声波破碎、弗氏细胞压碎器、球磨机等进行细胞破碎，用离心分离、膜过滤等将细胞残片除去。均质器的搅拌旋转数为500～30，000rpm，优选为1，000～15，000rpm；高速组织捣碎机的旋转数为500～10，000rpm，优选为1，000～5，000rpm。搅拌时间可以为0.5～10分钟，优选为1～5分钟。超声波破碎可以在1～50KHz，优选10～20KHz的条件下进行。球磨机可以使用直径0.1～0.5mm左右的玻璃制小球。
本发明中，作为含脂肪酶的水性液体，优选使用含有5～30质量%固体成分的含脂肪酶的水性液体。
含脂肪酶的水性液体的干燥以及粉末化通过例如喷雾干燥、冷冻干燥（冻干）以及溶剂沉淀后进行干燥的方法等来进行。
喷雾干燥可以使用例如喷嘴对流式、盘对流式、喷嘴并流式、盘并流式等喷雾干燥机进行。更优选为盘并流式，喷雾器旋转数优选设为4，000～20，000rpm。喷雾干燥将含脂肪酶的水性液体的温度调整为10～60℃，优选调整为20～40℃来进行是恰当的。喷雾干燥时送风（干燥气氛）的温度设为入口温度80～200℃、出口温度30～100℃，优选40℃以上小于70℃，更优选40℃～65℃、进一步优选50℃～60℃是恰当的。脂肪酶不耐温，通过使其为低温可抑制酶活性的降低。
冷冻干燥（冻干）优选例如通过试验室规模的少量冻干机、板式冻干来进行。进而，还可以进行减压干燥。
作为溶剂沉淀后干燥的方法，可举出如使用乙醇、丙酮等进行溶剂沉淀后，进行减压干燥的方法。
在将要进行喷雾干燥等干燥、粉末化步骤之前，优选使用NaOH、氨，将含脂肪酶的水性液体的pH调整为6～8.5。尤其优选将pH调整至8.0以下，进一步优选将pH调整为7.5～8.0的范围。pH调整可以在喷雾干燥等干燥、粉末化步骤前的任一步骤中进行，也可以预先调整含脂肪酶的水性液体的pH，以使在干燥、粉末化步骤之前的pH在上述范围内。pH调整中可以使用各种碱剂、酸，但优选使用氢氧化钠等碱金属氢氧化物。
此外，在干燥、粉末化步骤前的中间步骤中，还可以将含脂肪酶的水性液体进行浓缩。浓缩方法没有特别限定，但可举出蒸发器、闪蒸器、UF膜浓缩、MF膜浓缩、使用无机盐类的盐析、使用溶剂的沉淀法、使用离子交换纤维素等的吸附法、使用吸水性凝胶的吸水法等。其中，优选UF膜浓缩、蒸发器。作为UF膜浓缩用组件，优选分离分子量3，000～100，000、优选6，000～50，000的平膜或中空纤维膜，材质优选为聚丙烯腈系、聚砜系等。
＜脂肪酶的形态＞
本发明的脂肪酶可以为固定化脂肪酶或粉末脂肪酶的形态。
固定化脂肪酶优选为将上述脂肪酶固定在二氧化硅、Celite硅藻土、硅藻土、珍珠岩、聚乙烯醇、阴离子交换树脂、苯酚吸附树脂、疏水性载体、阳离子交换树脂、螯合树脂等载体上。这样的固定化脂肪酶可以例如作为核酶TL-IM，从Novozymes A/S公司购得。
固定化脂肪酶可以直接使用，或者也可以将该固定化脂肪酶粉碎后使用。固定化脂肪酶的粉碎品可以使用通常的粉碎机进行粉碎，以使平均粒径为1μm以上小于300μm，优选平均粒径1～200μm，更优选平均粒径1～100μm、尤其优选平均粒径20～100μm。这里，作为粉碎机，可举出研钵、剪切摩擦式粉碎机、切割式粉碎机、石磨（Mycolloider、mass-colloider）、咖啡豆研磨机、大功率粉碎机、棒磨机（pin mill）、冲击式粉碎机（锤式粉碎机、球磨机）、辊式粉碎机以及气流式粉碎机、均质器、超声波破碎机等。并且，平均粒径可以使用例如株式会社堀场制作所的粒度分布测定装置（LA-500）进行测定。
粉末脂肪酶例如其总质量的90质量%以上为平均粒径1～100μm，优选10～80μm，更优选20～50μm的粉末状的脂肪酶。该粉末粒子优选为球形，粒子表面例如具有3，000～40，000个/mm2、优选3，000～20，000个/mm2、更优选3，000～10，000个/mm2的直径0.5μm～6μm的细孔是恰当的。
粒子表面的细孔数量可以使用电子显微镜容易地进行测定。
粉末脂肪酶可以以脂肪酶粉末制剂的形式来使用。
脂肪酶粉末制剂例如通过使脂肪酶与谷物粉末和/或糖类粉末在水性液体中溶解和/或分散，将得到的含脂肪酶的水性液体进一步干燥并粉末化而得到。
作为水性液体优选水。关于含脂肪酶的水性液体中的水量，相对于脂肪酶的质量，水的质量优选为2.0～1，000倍，更优选为2.0～500倍，最优选为3.0～100倍。
作为含脂肪酶的水性液体，可举出除去菌体的脂肪酶培养液、纯化培养液、将由它们得到的脂肪酶粉末再次在水中溶解·分散的含脂肪酶的水性液体、将市售的脂肪酶粉末再次在水中溶解?分散的含脂肪酶的水性液体、市售的液态脂肪酶等。进而，为了更加提高脂肪酶活性，更优选除去了盐类等低分子成分的含脂肪酶的水性液体，此外，为了更加提高粉末性状，更优选除去了糖等低分子成分的含脂肪酶的水性液体。
作为脂肪酶，在上述列举的脂肪酶中，尤其适合使用日本DSM株式会社的商品：Pikantaze R8000、天野酶株式会社的商品：脂肪酶F-AP15等。作为最适合的粉末脂肪酶，可举出源自米根霉（Rhizopus oryzae）的、天野酶株式会社的商品：脂肪酶DF“Amano”15-K（也称为脂肪酶D）、脂肪酶D“Amano”Conch。并且，关于该脂肪酶D，以往表述为源自代氏根霉（Rhizopus delemar）。
作为谷物粉末和/或糖类粉末，可举出如全脂大豆粉末、脱脂大豆粉末等大豆粉末、小麦粉、米粉、糊精。谷物粉末和/或糖类粉末，相对于脂肪酶例如为250～1000质量%，优选为500～1000质量%，更优选为500～750质量%是恰当的。
＜助剂＞
作为可在本发明中使用的助剂，可以使用不会对使用脂肪酶进行的酯化反应或酯交换反应带来恶劣影响的助剂。尤其优选过滤助剂。作为过滤助剂，可举出如Celite等无机过滤助剂及纤维素等纤维、其碎粉物等有机过滤助剂。作为过滤助剂，优选有机过滤助剂，尤其优选有机高分子过滤助剂，其中，优选纤维素粉末等。过滤助剂优选为粉状。粉状的过滤助剂的平均粒径例如为10～90μm，更优选为20～80μm是恰当的。
上述固定化脂肪酶或粉末脂肪酶与过滤助剂的质量比，例如优选为1/10～10/1，尤其优选为1/7～2/1。
＜活性被恢复的脂肪酶的制造方法＞
本发明的另一方面在于提供一种活性被恢复的脂肪酶的制造方法。
＜准备活性低下的脂肪酶＞
首先，准备活性低下的脂肪酶。活性低下的脂肪酶是通过反复进行酯化反应、酯交换反应而得到的。例如，在酯交换反应时，相对于原料基质，加入质量为0.05～10质量%、优选为0.1～5质量%、更优选为1～2质量%的含脂肪酶的组合物，在20～80℃下边搅拌边进行10～50小时酯交换反应。通过反复进行10～50次、优选20～50次、更优选30～50次该反应，能够得到活性低下的脂肪酶。此外，也可以使1～10次、优选1～5次左右的酯化反应或酯交换反应与本发明的脂肪酶活性的恢复方法交替进行，以持续维持脂肪酶的良好活性。
＜吸湿步骤＞
该活性低下的脂肪酶，通过经过将上述的含脂肪酶的组合物与湿润气体接触的吸湿步骤，从而恢复活性，能够制造活性优异地恢复了的脂肪酶。具体地，脂肪酶的制造，例如，通过将活性低下的脂肪酶静置于托盘等容器中，暴露于上述那样的湿润气体气氛中来进行。此时，置于容器中的活性低下的脂肪酶的厚度，例如为厚度5cm以下，优选为3cm以下，更优选为0.1～1cm是恰当的。
此外，由于使湿润气体在含脂肪酶的组合物中通气能够有效地恢复活性，因此优选。例如，优选将含脂肪酶的组合物保持在柱、过滤器中，强制地使湿润气体在含脂肪酶的组合物中通气。该强制通气中使用的湿润气体，可以使用与在上述吸湿步骤中使用的湿润气体相同的气体。湿润气体的强制通气例如设为10分钟以下，优选为7分钟以下，更优选为1分钟以上5分钟以下是恰当的。
＜油性成分调节步骤＞
脂肪酶的吸湿效果，由于受到含脂肪酶的组合物中油性成分量的影响，因此优选减少含脂肪酶的组合物中含有的油性成分量。此时，在吸湿步骤前，即与湿润气体接触前，优选使含脂肪酶的组合物中含有的油性成分的质量为含脂肪酶的组合物中除油性成分外的成分的质量为1.5倍以下。更优选为1倍（即，含脂肪酶的组合物中的油性成分的质量与含脂肪酶的组合物中除油性成分外的成分的质量相等）以下，最优选为0.1～0.7倍。为了减少含脂肪酶的组合物中的油性成分量，可以在柱、过滤器中使气体在含脂肪酶的组合物中通气，降低含脂肪酶的组合物中的油性成分量后，使上述湿润气体在含脂肪酶的组合物中通气。用来减少油性成分量的通气中使用的气体，可以使用空气、氮气、二氧化碳、氩气等，尤其优选干燥氮气。通气例如设为10分钟以下、优选为7分钟以下、更优选为5分钟以下是恰当的。
进而，也可以通过使湿润气体在含脂肪酶的组合物中通气，在降低含脂肪酶的组合物中含有的油性成分量的同时使含脂肪酶的组合物吸湿。该通气中使用的湿润气体，可以使用与上述吸湿步骤中使用的湿润气体相同的气体。湿润气体的通气例如设为10分钟以下、优选为7分钟以下、更优选1分钟以上5分钟以下是恰当的。并且，优选将含脂肪酶的组合物中含有的油性成分的质量降低至含脂肪酶的组合物中除油性成分外的成分的质量的1.5倍以下为止。更优选为1倍（即，含脂肪酶的组合物中的油性成分的质量与含脂肪酶的组合物中除油性成分外的成分的质量相等）以下，最优选为0.1～0.7倍。
＜利用脂肪酶的反应＞
本发明的另一方面在于通过使用活性被恢复的脂肪酶进行酯化反应或酯交换反应得到的酯合成物（酯化物或酯交换物）的制造方法。
本发明的使用活性被恢复的脂肪酶进行的酯化反应，可举出如脂肪酸的部分酯与脂肪酸间的酯化反应、或一元或多元醇与脂肪酸间的酯化反应。优选可举出甘油与脂肪酸的酯化反应等。
此外，本发明的使用活性被恢复的脂肪酶进行的酯交换反应为选自脂肪酸酯、脂肪酸及醇中的一种以上与油脂间的酯交换反应。作为优选的酯交换反应，可举出如使用常规方法进行的油脂与油脂间的酯交换反应、脂肪酸酯与油脂间的酯交换反应、醇解或酸解的酯交换反应。其中，作为酯交换反应的原料基质，优选脂肪酸酯及油脂。
作为脂肪酸酯，例如优选为碳原子数6～30、优选8～22的、直链或支链的、饱和或不饱和的脂肪酸酯。这里，脂肪酸可举出如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、以及山嵛酸等。作为尤其优选的脂肪酸酯，可举出棕榈酸乙酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸乙酯、硬脂酸甲酯、山嵛酸乙酯、山嵛酸甲酯。
作为油脂，例如优选构成脂肪酸的碳原子数为8～24的甘油三酯，尤其优选植物油，例如选自由菜籽油、大豆油、葵花籽油、红花油、玉米油组成的组中的植物油。
在脂肪酸酯与油脂间进行酯交换反应的情况下，原料基质中的脂肪酸酯与油脂的质量比例如为9：1～1：9，优选为8：2～2：8，更优选为7：3～5：5是恰当的。此外，原料基质中还可以含有水。原料基质中含有的水量，相对于原料基质整体的质量，例如为10～1000ppm，优选为100～500ppm，更优选为200～400ppm是恰当的。
此外，作为使用基于油脂和脂肪酸的酸解的酯交换反应，可以充分利用脂肪酶所具有的1，3-特异性脂肪酶进行结构油脂的制造。即，在甘油骨架的2位残留特定的脂肪酸，将1，3位的脂肪酸置换为目的脂肪酸。得到的产物可以应用到巧克力等使用的油脂中，此外，可以应用到具有特定的营养效果的油脂中。
对于本发明的使用活性被恢复的脂肪酶的酯化反应、酯交换反应的条件没有特别限定，可以通过常规方法进行。
一般，在避免混入造成水解的水分的同时，在常压或减压下进行。作为反应温度，虽然也取决于使用的各原料基质的凝固点，但优选在20～80℃左右进行；如果不受凝固点的限制，则更优选在40～60℃下进行。
此外，作为含有活性被恢复的脂肪酶的含脂肪酶的组合物向原料基质中的添加量，相对于含脂肪酶的组合物与原料基质的合计质量，优选为0.05～10质量%，更优选为0.1～5质量%。最适当的量根据反应温度、设定的反应时间、活性被恢复的脂肪酶的活性等来决定。反应结束后，脂肪酶通过过滤和/或离心分离等被除去，反复使用直至活性降低至不能进行制造为止。活性低下的脂肪酶可以通过本发明方法进行再活化。
因此，一般情况下，昂贵的脂肪酶通过本发明方法可以反复恢复活性。
此外，得到的酯化物或酯交换物没有特别限定，甚至也可用作食品领域中使用的酯交换油脂或酯化油脂。
以下通过制造例及实施例对本发明进行更详细地说明。
实施例
[含脂肪酶的组合物的制作]
作为粉末脂肪酶，准备了天野酶株式会社的商品：脂肪酶DF“Amano”15-K（也称为脂肪酶D）的酶溶液（150000U/ml）。
该酶溶液中的水量相对于脂肪酶D的质量为15倍。此外，作为谷物粉末，准备了脱臭全脂大豆粉末（商品名：ALPHA PLUSHS-600、日清奥利友集团株式会社制）的10质量%水溶液。上述脱臭全脂大豆粉末的质量，相对于上述脂肪酶D的质量为500质量%。向上述脂肪酶D的酶溶液中，边搅拌该溶液边加入上述脱臭全脂大豆粉末。向得到的混合溶液中加入1mL的0.5N NaOH溶液，将混合溶液整体调整为pH7.8后，进行喷嘴并流型的喷雾干燥（喷雾干燥，上述混合溶液的温度30℃，送风的入口温度100℃，出口温度50℃，东京理科器械株式会社，SD-1000型），得到脂肪酶粉末制剂。向该脂肪酶粉末制剂中加入作为过滤助剂的纤维素粉末（平均粒径30μm），得到含脂肪酶的组合物。平均粒径使用株式会社堀场制作所的粒度分布测定装置（LA-500）进行测定。得到的含脂肪酶的组合物中含有的粉末脂肪酶与过滤助剂的质量比为1/1。
[失去活性的含脂肪酶的组合物（脂肪酶滤饼）的制作]
为了使上述那样得到的含脂肪酶的组合物的活性失去，使用得到的含酯的组合物反复进行酯交换反应。
酯交换反应，首先，在上述那样得到的含脂肪酶的组合物中混合酯交换反应中使用的原料基质。使用以下的原料基质：将硬脂酸乙酯（商品名：硬脂酸乙酯，株式会社井上香料制造所制）及高油酸葵花籽油（日清奥利友集团株式会社制）以6：4的质量比混合，原料基质整体中的水分调整为以质量计300ppm。
向这样得到的原料基质中加入含脂肪酶的组合物，使得相对于原料基质，含脂肪酶的组合物为1质量%，在50℃下边搅拌边进行16小时反应。
反应结束后，通过过滤回收含脂肪酶的组合物。回收的含脂肪酶的组合物再次应用到反应中。反复进行30次上述反应操作后，将过滤?回收的含脂肪酶的组合物（脂肪酶滤饼A）用于以下的实施例及比较例中。[酯交换反应的活性：POS＋SOS值]
通过比较甘油三酯中的POS与SOS的合计质量来评价脂肪酶活性的恢复或活性的程度。具体地，在使用比较对照的未处理（吸湿步骤前）的含脂肪酶的组合物的酯交换反应中，相对于1小时反应后得到的甘油三酯的质量，将该甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%设为100时，求出在使用处理后（吸湿步骤后）的含脂肪酶的组合物样品的酯交换反应中，1小时反应后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%的相对量：（POS＋SOS值）。
（POS+SOS值）＝（相对于含脂肪酶的组合物样品的1小时酯交换反应后的甘油三酯的质量，该甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%）/（相对于比较对照含脂肪酶的组合物的1小时酯交换反应后的甘油三酯的质量，该甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%）×100
若（POS＋SOS值）高于100，则可以评价为脂肪酶活性恢复，若低于100的话，则可以评价为脂肪酶活性降低。
并且，在实施例及比较例中，甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%的相对量（POS＋SOS值）使用气相色谱进行测定。具体地，取7.5μl反应溶液，将其用1.5ml己烷稀释，过滤含有脂肪酶粉末制剂等的固体物质，将得到的滤液用气相色谱（GC）进行测定。作为气相色谱，使用安捷伦科技株式会社制，产品编号6890N；和柱65TG（株式会社岛津GLC制）。气相色谱的条件设为，柱温：350℃、升温：1℃/分钟、最终温度：365℃。
[水分量、油性成分量比]
将含脂肪酶的组合物使用基准油脂分析试验法（Standard Methodsfor Analysis of Fats,oils and Related Materials），测定该试验法的1.4.1-1996水分Moisture（加热干燥法Air oven）（以下，记为a（%））及1.5-1996油分(Oil content)（以下，记为b（%）），根据以下的计算式，计算出含脂肪酶的组合物中含有的水分量与油性成分量比。
相对于含脂肪酶的组合物中含有的除油性成分外的成分的质量的水分量（质量%）＝（a/（100-b））×100
相对于含脂肪酶的组合物中含有的除油性成分的成分的质量的油性成分量比（质量比）＝b/（100-b）
[实施例1]
将10g脂肪酶滤饼A（相对于含脂肪酶的组合物中含有的除油性成分外的成分的质量的水分量为8质量%）铺在玻璃皿上，在温度60℃、相对湿度70%的湿润气体（湿润空气）气氛下保持1天。保持后的脂肪酶滤饼的水的吸收量，相对于脂肪酶滤饼A的质量为10质量%（相对于含脂肪酶的组合物中含有的除油性成分外的成分的质量的水分量为18质量%），含脂肪酶的组合物中的油性成分量没有变化。然后，使用得到的脂肪酶滤饼，进行1次前述的酯交换反应。此外，为了调查脂肪酶活性的恢复或活性的程度（POS＋SOS值），使用吸湿保持前的脂肪酶滤饼A，与上述同样地实施了酯交换反应（试行1-1～试行1-5）。将在使用吸湿保持前的脂肪酶滤饼A的酯交换反应进行1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%设为100，在此情况下，在使用吸湿保持后的脂肪酶滤饼的酯交换反应进行1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%的相对量（POS＋SOS值）示于表1中。
表1
POS+SOS值
比较对照 100
试行1-1 207
试行1-2 211
试行1-3 200
试行1-4 200
试行1-5 211
[比较例1]
将10g脂肪酶滤饼A铺在玻璃皿上，用喷雾器来均匀地喷雾水。水的喷雾量相对于脂肪酶滤饼（含脂肪酶的组合物）的质量为10质量%（相对于含脂肪酶的组合物中含有的除油性成分外的成分的质量的水分量为18质量%）。喷雾后，将脂肪酶滤饼充分混合并与水相融后，静置1小时。然后，使用得到的脂肪酶滤饼，进行1次前述的酯交换反应。此外，为了调查脂肪酶活性的恢复或活性的程度（POS＋SOS值），使用吸湿保持前的脂肪酶滤饼，与上述同样地实施了酯交换反应（试行1-6～试行1-10）。将在使用吸湿保持前的脂肪酶滤饼A的酯交换反应进行1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%设为100，在此情况下，在使用吸湿保持后的脂肪酶滤饼的酯交换反应进行1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%的相对量（POS＋SOS值）示于表2中。
表2
POS+SOS值
比较对照 100
试行1-6 65
试行1-7 136
试行1-8 52
试行1-9 55
试行1-10 139
在表1所有的试行1-1～1-5中，可观察到脂肪酶活性（POS＋SOS值）的升高。虽然比较例的试行1-7与1-10中被活化，但其他的试行1-6、1-8及1-9中，通过喷雾水，活性反而降低。在试行1-1～1-5中，反应率比比较例的试行1-7和1-10的反应率大。可知实施例的试行1-1～1-5的结果偏差少，通过自然吸湿而稳定地再活化。
[实施例2]
将10g脂肪酶滤饼A铺在玻璃皿上，在30℃、40℃、50℃及60℃的各温度；50%、70%及90%的相对湿度的湿润气体（湿润空气）气氛下保持1小时或1天。将相对于含脂肪酶的组合物中含有的除油性成分外的成分的质量的水分量（质量%）示于表3中。然后，回收脂肪酶滤饼，进行1次上述的酯交换反应。将在使用此时的吸湿保持前的脂肪酶滤饼A的酯交换反应进行1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%设为100，在此情况下，在使用吸湿保持后的脂肪酶滤饼的酯交换反应进行1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%的相对量（POS＋SOS值）示于表4中。
表3
Figure BDA0000466885670000181
＊值为相对于含脂肪酶的组合物中含有的除油性成分外的成分的质量的水分量（质量%）
表4
Figure BDA0000466885670000182
＊值为含脂肪酶的组合物的POS＋SOS值
得到的结果是，在50℃、相对湿度70%下放置1天时最有效。虽然在60℃、相对湿度70%下放置1天时，可以不依赖于含脂肪酶的组合物的容器内的厚度而得到良好的活性，但在其他情况下可观察到受厚度的影响。可知为了在1小时的放置时间下得到良好的效果，优选设为60℃、相对湿度90%。
[实施例3]
将4g脂肪酶滤饼A添加到400g前述的反应基质（硬脂酸乙酯：高油酸葵花籽油＝6：4（质量比））中，在50℃下反应18小时。反应结束后，使用加压过滤器（Advantec KST-142-JA），用干燥氮气进行加压过滤（加压条件0.1MPa），得到反应后滤饼（比较对照的滤饼）。进而，通气干燥氮气（最多5分钟），除去反应后滤饼中的油性成分，得到试行3-1～3-6的通气后滤饼。以通气后滤饼（含脂肪酶的组合物）中含有的油性成分的质量相对于该滤饼中的除油性成分外的成分的质量的倍数作为基准，测定该通气后滤饼的油性成分量。此外，以相对于吸湿后滤饼（含脂肪酶的组合物）中含有的除油性成分外的成分的质量的水分的质量（质量%）作为基准，测定该通气后滤饼的水分量。将用上述方法进行油性成分量调整的通气后滤饼分别铺在玻璃皿上，在50℃、相对湿度70%（湿润空气）的气氛下保管1天。将在使用吸湿保持前的通气后滤饼的酯交换反应进行1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%设为100，在此情况下，在使用吸湿保持后的脂肪酶滤饼的酯交换反应进行1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%的相对量（POS＋SOS值）示于表5中。
表5
Figure BDA0000466885670000191
＊油性成分量的值表示为比较对照及试行3-1～3-6的滤饼（含脂肪酶的组合物）中含有的油性成分的质量相对于该滤饼中的除油性成分外的成分的质量的倍数
含脂肪酶粉末制剂的滤饼中的油性成分量少的情况下，通过吸湿的再活化程度高。
[实施例4]
将6g脂肪酶滤饼Aを添加到300g前述的反应基质（硬脂酸乙酯：高油酸葵花籽油＝6：4（质量比））中，在50℃下反应16小时。反应结束后，使用加压过滤器（Advantec KST-90），用干燥氮气进行加压过滤（加压条件0.1MPa），得到反应后滤饼（比较对照的滤饼）。将得到的反应后滤饼铺在玻璃皿上，在25℃、相对湿度50%（湿润空气）的气氛下保管1小时（试行4-1），或在过滤器上连接真空泵，在反应后滤饼中通气10分钟的25℃、相对湿度50%的湿润空气（试行4-2），或通气10分钟的30℃、相对湿度70%的湿润空气（试行4-3）。以吸湿后滤饼（含脂肪酶的组合物）中含有的油性成分的质量相对于该滤饼中的除油性成分外的成分的质量的倍数作为基准，测定该吸湿后滤饼的油性成分量。此外，以相对于吸湿后滤饼（含脂肪酶的组合物）中含有的除油性成分外的成分的质量的水分的质量（质量%）作为基准，测定该吸湿后滤饼的水分量。将在使用吸湿保持前的反应后滤饼的酯交换反应进行1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%设为100，在此情况下，在使用吸湿保持后的脂肪酶滤饼的酯交换反应进行1小时后得到的甘油三酯中的POS和SOS的合计质量%的相对量（POS＋SOS值）示于表6中。
表6
Figure BDA0000466885670000211
＊油性成分量的值表示为比较对照及试行4-1～4-3的滤饼（含脂肪酶的组合物）中含有的油性成分的质量相对于该滤饼中的除油性成分外的成分的质量的倍数
通过通气加湿了的空气得到的吸湿效果与放置相比可在更短时间内观察到，此外，其程度通过使温度、湿度升高而进一步升高。

Claims (12)

1.一种脂肪酶活性的恢复方法，其包括将含脂肪酶的组合物与湿润气体接触的吸湿步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述湿润气体的相对湿度为50～90%。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将所述吸湿步骤进行至含脂肪酶的组合物中含有的水分量为所述含脂肪酶的组合物中除油性成分外的成分中的8.5～20质量%为止。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述吸湿步骤在满足相对湿度50～90%、温度30～60℃、保持时间0.5～36小时的条件下进行。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述吸湿步骤是使所述湿润气体在所述含脂肪酶的组合物中通气。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，在所述吸湿步骤前，还包括油性成分调节步骤，所述油性成分调节步骤为：将所述含脂肪酶的组合物中含有的油性成分的质量调节为所述含脂肪酶的组合物中除油性成分外的成分的质量的1.5倍以下。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述吸湿步骤通过使所述湿润气体在所述含脂肪酶的组合物中通气，从而在降低所述含脂肪酶的组合物中含有的油性成分量的同时，使所述含脂肪酶的组合物吸湿。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述含脂肪酶的组合物含有粉末脂肪酶及过滤助剂。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶为源自于米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述过滤助剂为纤维素。
11.一种活性被恢复的脂肪酶的制造方法，其特征在于，包括准备活性低下的脂肪酶的步骤，以及
通过权利要求1～10中任一项所述的方法使所述活性低下的脂肪酶的活性恢复的步骤。
12.一种酯合成物的制造方法，其特征在于，使用通过权利要求11所述的方法制得的活性被恢复的脂肪酶进行酯化或酯交换。
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