NO166877B

NO166877B - Fremgangsmaate for fremstilling av et immobilisert lipasepreparat for omestring av fett.

Info

Publication number: NO166877B
Application number: NO843515A
Authority: NO
Inventors: Peter Eigtved
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1983-09-05
Filing date: 1984-09-04
Publication date: 1991-06-03
Also published as: BR8404421A; US4798793A; EP0140542B2; IS2939A7; CA1270781A; US4818695A; ES535602A0; EP0140542B1; IE842257L; AU570720B2; NO166877C; ES8506788A1; PH25330A; GR80282B; DK402583D0; JPS6098984A; EP0140542A1; ES535609A0; ES535608A0; DE3477935D1

Description

Preparater av immobilisert lipase for transforestring (omestring) av fett er kjent. Således er det i DK-patentsøknad nr. 563/77 (tilsvarende US-patent 4 275 081) beskrevet et immobilisert lipasepreparat, hvorved lipasen fremstilles ved fermentering av arter som tilhører slektene Rhizopus, Geotrichum eller Aspergillus, og hvorved lipasen festes på en inert partikkelformig bærer som kan være diatoméjord eller aluminiumoksyd, og som oppviser et meget høyt spesifikt overflateareal. Det har

vært ansett nødvendig å bruke et immobilisert lipasepreparat

med meget høyt spesifikt overflateareale (dvs. små og porøse bærerpartikler) for å oppnå den nødvendige høye enzymaktiviteten. Interforestring kan utføres satsvis uten et løsningsmiddel med dette immobiliserte lipasepreparatet. Med dette immobiliserte lipasepreparatet kan imidlertid kontinuerlig interforestring i en kolonne ikke utføres i industriell skala uten nærvær av et løsningsmiddel, som senere må fjernes, pga. det ovenfor angitte faktum at preparatet består av små partikler, som under kolonne-operasjonen ville forårsake et uakseptabelt høyt trykkfall. En plakat som ble presentert ved Enz. Eng. 6, Kashikojima, Japan,

20. - 25. september 1981 og artikkelen i European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, nr. 14, sider 1-5

(1982) angir også at et immobilisert lipasepreparat omfattende lipase fra Rhizopus delemar og en sterk anionvekslerharpiks (med kvaternære aminogrupper) kan anvendes for interforestring med n-heksan som et løsningsmiddel. Enzymgjenvinningen ifølge disse henvisninger er imidlertid meget lav. I EPO-patentsøknad publ.nr. 0069599 er det også beskrevet en enzymatisk omordning av fett, hvorved en lipase fra Aspergillus species, Rhizopus species, Mucor javanicus eller Mucor miehei anvendes som interforestringsenzym. Enzymet foreligger på en bærer, f.eks. Celite. I alle eksempler i denne europeiske patentsøknad som gjelder kontinuerlig interforestring i en kolonne, anvendes et løsningsmiddel.

I tidligere kjente fremgangsmåter på fagområdet anvendes således løsningsmidlet for å senke viskositeten til fettstart-materialet for å sikre en så glatt kolonneoperasjon som mulig.

Det har hittil vært ansett umulig i praksis å unngå løsnings-middel i disse kontinuerlige interforestringsfremgangsmåter i industriell skala, pga. det høye trykkfallet i kolonnen, selv om de tekniske fordeler som er forbundet med eliminasjonen av løsningsmiddel fra disse interforestringsfremgangsmåter er helt klare.

I EPO-patentsøknad publisert som nr. 35.883 er det beskrevet at et immobilisert lipasepreparat påtenkt for interforestring av fett kan fremstilles ved å bringe en vandig løsning av mikrobiell lipase i kontakt med en partikkelformig, inert bærer fulgt av tørking. Det således fremstilte immobiliserte lipasepreparatet kan anvendes for interforestring av fett, men bare dersom fettene blandes med de relativt dyre lavalkylestrene av fettsyrer, f.eks. metylpalmitat, som anvendes som tilleggsmidler for å unngå løsningsmidler, ellers oppstår løselighet-

og viskositets-problemer.

Formålet med oppfinnelsen er således å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av et immobilisert lipasepreparat som vil gjøre det mulig å utføre kontinuerlig interforestring uten et løsningsmiddel eller andre dyre tilleggsmidler på en økonomisk brukbar måte.

Ifølge oppfinnelsen er det nå overraskende funnet at en fremgangsmåte for fremstilling av et immobilisert lipasepreparat, som er meget lett å utføre, nemlig ved enkel blanding av en vandig løsning av lipase og en ionevekslerharpiks og som omfatter en spesifikk kombinasjon av en spesifisert kategori av ionevekslerharpikser og en spesifisert mengde vann i det ferdige immobiliserte lipasepreparatet gjør det mulig å utføre den kontinuerlige interforestringen uten et løsningsmiddel eller andre kostbare hjelpemidler på en økonomisk brukbar måte.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et immobilisert lipasepreparat for omestring av fett er således karakterisert ved at en vandig oppløsning av en mikrobiell lipase bringes i kontakt med en partikkelformig, makroporøs, svak anionbytterharpiks (i denne beskrivelse også kalt anionvekslerharpiks) som inneholder primære og/eller sekundære og/eller tertiære aminogrupper, og hvis partikler i en grad av mer enn 90 % har en partikkelstørrelse på mellom 100 og 1000 pm, fortrinnsvis mellom 200 og 400 pm, under slike betingelser at lipasen binder seg til anionbytteren, i et tidsrom som er tilstrekkelig langt til å binde den ønskede lipasemengde til anionbytteren, hvoretter den således dannede immobiliserte lipase separeres fra vannfasen og den separerte immobiliserte lipase tørkes til et vanninnhold på mellom 2 og 40 %.

Det er generelt beskrevet i publiserte DE-patentsøknader nr. 2 905 671 og 2 805 950, publiserte JP-patentsøknader nr. 54-76892 og 57-152886, US-patent nr. 4 170 696 og Chem. Abs. Vol. 82, 27819d at enzymer, inkludert lipaser, kan immobilise-res ved hjelp av partikkelformige anionvekslerharpikser. For det første foreligger det imidlertid ingen universell immobili-seringsmetode som er egnet for alle enzymer og alle substrater, men en spesifikk immobiliseringsfremgangsmåte må oppfinnes for ethvert spesifikt enzym og ethvert spesifikt substrat, på hvilket enzymet antas å virke. For det andre er imidlertid lipaser helt ekstraordinære enzymer i den forstand at den enzymatiske aktiviteten fungerer på en interfase mellom to faser, hvilket betyr at immobiliseringen av lipasene er et meget vanskelig problem, som i stor grad begrenser anvendbarheten av kjente immobi-liseringsteknikker på området som omfatter lipaseimmobilisering, se J.Lavayre et al., Preparation and Properties of immobilized Lipases, Biotechnology and Bioengineering, vol. XXIV, sider 1007 - 1013 (1982), John Wiley & Sons. For det tredje er kombinasjonen av lipase og partikkelformig, makroporøs, svak anionvekslerharpiks ikke beskrevet i noe av den litteratur som er angitt i begynnelsen av dette avsnitt, og enda mindre at denne nye kombinasjon gir den overraskende tekniske effekt når det gjelder kontinuerlig interforestring uten løsningsmiddel eller andre kostbare hjelpemidler.

Fra en artikkel av Yoshiharu Kimura et al., "Application of Immobilized Lipase to Hydrolysis of Triacylglyceride" i Eur.J.Appl.Microbiol. Biotechnol. (1983) 17: 107 - 112 fremgår det også at et lipasepreparat som er immobilisert på en anionvekslerharpiks har vært brukt for hydrolyse av fett. For det første er hovedanvendelsen av det immobiliserte lipasepreparatet som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen interforestring, mens hydrolyse av fett og syntese av fett er mindre viktige anvendelser ifølge oppfinnelsen, hvilket skal forklares mer i detalj senere i denne beskrivelsen, og for det andre fremgår det av artikkelen at aktivitetsutbyttet er mindre enn 1%, se tabell 1 på side 109, sammenlignet med et aktivitets-utbytte som typisk er over 80% når det gjelder det immobiliserte lipase-preparatet som fremstilles ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Dette bekrefter det som tidligere er konstatert om at immobilisering av lipase er et meget vanskelig problem.

Det er meningen at uttrykket "relativt stor gjennomsnitt-lig partikkelstørrelse" angår den gjennomsnittlige partikkel-størrelsen til det produkt som er beskrevet i DK-patentsøknad nr. 563/77, og i hvilket majoriteten av partiklene har en par-tikkelstørrelse som er mindre enn ca. 50 ym. Det er funnet at temperaturen ikke har noen stor virkning på aktivitetsutbyttet, idet det er vist eksperimentelt at aktivitetsutbyttet er i det vesentlige temperaturuavhengig dersom temperaturen under immobiliseringen holdes mellom 5 og 35°C.

For ikke å inaktivere enzymet utføres kjente interforestringer ved en relativt lav temperatur. Dette gjøres mulig ved nærvær av løsningsmiddelet som er i stand til å oppløse fettet, som kan ha et relativt høyt smeltepunkt. Overraskende er det funnet at det immobiliserte lipasepreparatet som fremstilles ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har en tilstrekkelig stabilitet i det smeltede fettet ved en relativt høyere temperatur. Trykkfallet gjennom interforestringskolonnen som er fylt med det immobiliserte lipasepreparatet som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er også tilstrekkelig lavt til å tillate en glatt operasjon. Det er også overraskende funnet at den spesielle kombinasjon av kontaktbetingelser, ionevekslerharpiks og vanninnhold forårsaker en høy spesifikk lipa-seaktivitet i den smeltede fettblandingen i motsetning til alle tidligere forsøk på å tilveiebringe et immobilisert lipasepreparat som er tenkt brukt uten løsningsmiddel. Mens tidligere kjente fremgangsmåter av det slaget som er beskrevet i DK-patent-søknad nr. 563/77 dessuten har krevet en renset lipase for å tilveiebringe et brukbart immobilisert preparat, er det overraskende funnet at- det immobiliserte lipasepreparatet fremstilt ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på basis av et ganske

rått lipaseprodukt. Mens preparatet fra tidligere kjente fremgangsmåter av det slag som er beskrevet i DK-patentsøknad

nr. 563/77 også har omfattet anvendelsen av et organisk løsningsmiddel for å avsette lipasen på bæreren, er intet slikt organisk løsningsmiddel nødvendig ved fremgangs-

måten ifølge oppfinnelsen, som kan fremstilles meget lett

bare ved blanding av bærer og en vandig lipaseløsning. Mens li-paseaktiviteten relativt lett vaskes av eller på annen måte fjernes fra tidligere kjente preparater av det slag som er beskrevet i DK-patentsøknad nr. 563/77, er det dessuten funnet at lipasen i det immobiliserte lipasepreparatet som fremstilles

ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er praktisk talt umulig å fjerne fra preparatet, om det ikke underkastes uheldige kjemiske eller fysiske behandlinger, f.eks. uheldige pH- og temperatur-betingelser. Endelig er det funnet at det immobiliserte lipasepreparatet som fremstilles ved hjelp av fremgangsmåten

ifølge oppfinnelsen kan fremstilles med en høy enzymgjenvinning som muliggjør en billigere kontinuerlig interforestring enn tidligere kjente interforestringer.

I en foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er lipasen en varmestabil lipase. Herved gjøres det mulig å anvende en høyere interforestringstemperatur, og således en høyere produktivitet. Ved hjelp av denne utførelses-formen er det videre mulig å fremstille et immobilisert lipase-preparat som er vel egnet for interforestring av høyeresmeltede fett.

I en foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppnås den mikrobielle lipasen fra en termofil Mucor-art, spesielt Mucor miehei. Mucor miehei er en god frem-bringer av 1,3-spesifikk lipase, og således kan det oppnås et billig produkt.

Som nevnt har mer enn 90% av partiklene i den makro-porøse, svake anionvekslerharpiksen en partikkelstørrelse på mellom 100 og 1000 pm, og den er fortrinnsvis mellom 200 og 400 pm. I dette partikkelstørrelseintervall oppnås et godt kompromiss mellom høy interforestringsaktivitet og lavt trykkfall.

I en foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilsvarer forholdet mellom mengden av den vandige løsningen av den mikrobielle lipasen og vekten av svak anionvekslerharpiks 5 000 - 50 000 LU/g ionevekslerharpiks (tørr vekt). På denne måte tilveiebringes tilstrekkelig lipase for ionevekslerharpiksen.

I en foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppnås den mikrobielle lipasen fra en termofil

Mucor-art, spesielt Mucor miehei, og pH under kontakten mellom ionevekslerharpiks. og vandig løsning er mellom 5 og 7. På denne måten sikres det en sterk binding mellom lipase og ionevekslerharpiks såvel som en god stabilitet og aktivitet.

I en foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kontakttiden mellom 0,5 og 8 timer. På denne måten oppnås eller tilnærmes en metningstilstand med lipase.

I en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres separasjonen ved enkel filtrering. Denne fremgangsmåte er enkel og kan vel tilpasses til industriell praksis.

I en foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres tørkingen til et vanninnhold mellom 5

og 20% vann. Tørkeoperasjonen kan utføres i vakuum, i fluidi-

sert lag eller ved andre tørkemetoder, som er egnet for opera-

sjon i stor skala. Herved oppnås et endelig lipasepreparat med en høy interforestringsaktivitet.

I en foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen bringes den partikkelformige, makroporøse, svake anionvekslerharpiksen sammen med en vandig løsning av et tverr-bindingsmiddel, fortrinnsvis en vandig glutaraldehydløsning i en konsentrasjon mellom 0,1 og 1,0% vekt/vekt, før, under eller etter kontakten mellom den partikkelformige, makroporøse, svake anionvekslerharpiksen og den vandige løsningen av den mikrobi-

elle lipasen, hvoretter den gjenværende løsning av tverrbindings-middel fraskilles. Selv om en mindre reduksjon av enzymaktiviteten kan observeres pga. tverrbindingsmiddelet, er det funnet at en slik behandling kan øke stabiliteten til lipasepreparatet i vandige media for en spesiell anvendelse. Når det gjelder bruken av det immobiliserte lipasepreparatet som et interfor-estringsmiddel er det intet behov for noen forbedring av stabiliteten av lipasepreparatet, idet denne stabiliteten er utmer-

ket i det lipasepreparat som er fremstilt ifølge oppfinnelsen for denne anvendelse. Det er imidlertid funnet at det immobiliserte lipasepreparatet som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med fordel kan anvendes for hydrolyse av fett også, og for denne anvendelse er en forbedring av stabiliteten til lipasepreparatet ønskverdig, sannsynligvis pga. kombinasjonen av relativt høy vannkonsentrasjon og høye

temperaturer i reaksjonsblandingen, som er nødvendig for en industrielt utført fetthydrolysefremgangsmåte.

Det immobiliserte lipasepreparat som er fremstilt ved

hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan anvendes ved en fremgangsmåte for interforestring av fett, hvor smeltet fett, eventuelt blandet med oppløst fri fettysre, bringes i kontakt med det immobiliserte lipasepreparat som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, uten, eller i hovedsak uten, noe løsningsmiddel eller andre kostbare hjelpemidler. De frie fettsyrene, som fettene eventuelt kan blandes med ifølge oppfinnelsen, skål ikke anses som kostbare hjelpemidler. Med fett menes enten et rent triglycerid eller en blanding av triglycerider fra én eller flere kilder.

Det kan også nevnes en annen anvendelse av det immobiliserte lipasepreparatet som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, nemlig en fremgangsmåte for hydrolyse av fett, hvor en emulsjon av triglycerid og vann bringes i kontakt med det immobiliserte lipasepreparatet som er fremstilt ifølge oppfinnelsen, uten, eller i hovedsak uten, noen løsningsmidler eller andre kostbare hjelpemidler.

Det skal også nevnes en annen anvendelse av det immobiliserte lipasepreparat som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, nemlig en fremgangsmåte for syntese av fett hvor en blanding av glycerol og frie fettsyrer bringes i kontakt med det immobiliserte lipasepreparatet som er fremstilt ifølge oppfinnelsen, uten, eller i hovedsak uten, noen løsnings-midler eller andre kostbare hjelpemidler.

Oppfinnelsen skal illustreres ved hjelp av følgende eksempler.

Den Mucor miehei-lipase som anvendes i de følgende eksemplene kan på anmodning oppnås fra NOVO Industri A/S, Novo Allé, 2880 Bagsværd, Danmark, (som enzymprodukt SP 225). Denne Mucor miehei-lipase kan oppnås som angitt i DK-patentsøknad nr. 4234/77.

Lipaseaktivitetsenheten (LU) som er angitt i eksemplene bestemmes som beskrevet i publikasjonen AF 95.1/2-GB fra 83-01-03, som kan oppnås fra NOVO Industri A/S, Novo Allé, 2880 Bagsværd, Danmark.

Interforestringsaktiviteten til de immobiliserte lipasepreparatene bestemmes ved hjelp av et satsforsøk basert på føl-gende reaksjoner:

hvor 0 = oljesyre, P = palmitinsyre, og 000, POO og POP er fett som inneholder de angitte fettsyrer i den angitte rekkefølge, idet 000 således er triolein.

250 mg immobilisert lipasepreparat blandes med 600 mg triolein (0,68 mmol) og 174 mg palmitinsyre (0,68 mmol) oppløst i 12 ml petroleter (temp. 80 - 100°C) i et 20 ml glassrør med en skrukork. Rørene inkuberes i et vannbad ved 4 0°C og rystes i

1 eller 3 timer.

Reaksjonsblandingen avkjøles, filtreres og inndampes. Den relative mengde av 000, POO og POP bestemmes ved hjelp av HPLC, og prosentinnholdet av innblandet P beregnes som

Likevektssammensetningen av den ovenfor angitte satsreak-sjonsblandingen er ca. 43% POO og 10% POP eller 21% innblandet

P.

I noen av de følgende eksemplene utføres interforestringen som en satsoperasjon med eller uten løsningsmiddel. Ved hjelp av sammenligningstester er det fastslått at et immobilisert* lipasepreparat, som har en tilfredsstillende interforestringsaktivitet og stabilitet, slik det vises ved hjelp av sats-interforestringstesten, og som har en partikkelstørrelseforde-ling og en fysisk styrke som er nødvendig for tilfredsstillende kolonneoperasjon, vil virke tilfredsstillende ved kontinuerlig operasjon i kolonne også, med eller uten løsningsmiddel. En tilfredsstillende satstest under disse omstendigheter er således et bevis på at en tilfredsstillende kontinuerlig kolonnetest kan utføres med det aktuelle immobiliserte lipasepreparatet. ;EKSEMPEL 1 ;Dette eksempel illustrerer virkningen av pH under absorp-sjon av Mucor miehei-lipase på interforestringsaktiviteten. ;2,0 g Mucor miehei-lipase, 93 000 LU/g, ble oppløst i ;20 ml vann, og 10 g vannvasket "Duolite" ES 562 anionvekslerharpiks, tørr vekt 8,5 g, ble suspendert deri. ;Tre slike porsjoner ble justert til henholdsvis pH 5,0, 6,0 og 7,0 og ble omrørt med magnetisk omrøring i 4 timer ved ca. 5°C. ;De tre porsjonene ble filtrert. Etter filtrering var mengden hydrolytisk aktivitet (LU) i de tre filtratene (før vasking) mellom 10 og 17% av de totale, opprinnelige mengdene ;(186 000 LU). Deretter ble det utført en vannvasking med en li-ten mengde vann, og deretter ble preparatene tørket over natten i vakuum ved romtemperatur. ;Resultatene er oppsummert i tabellen nedenfor. ;;EKSEMPEL 2 ;Tre 10 g porsjoner av fuktig ionevekslerharpiks, "Duolite" ES 562 (tørrvekt 8,3 5 g) ble suspendert i 50 ml vann, og 4 N NaOH ble tilsatt inntil pH stabiliserte seg ved 6,0. De ble så vasket med mye vann og tørket på en Buchner-trakt, tørket vekt ca. 16 g. ;Til hver av to 10 g porsjoner ble det tilsatt en løsning av 2,5 g Mucor miehei-lipase (aktivitet 93 000 LU/g) i 25 ml vann og pH ble justert til 6,0. ;Til den tredje porsjon ble det tilsatt en løsning av 2,5 g av den ovenfor angitte Mucor miehei-lipase i. 50 ml vann, og pH ble justert til 6,0. ;Blandingen ble langsomt agitert ved romtemperatur (25 ) ;i 2 timer. Deretter ble væsken filtrert på en Biichner-trakt. ;En av porsjonene med 25 ml lipaseløsning ble ytterligere vasket med 2 x 2 5 ml vann. De immobiliserte preparatene ble tørket i vakuum. ;For interforestringsforsøket ble 250 mg (tørr vekt) av de immobiliserte lipasepreparatene fuktet med 20 yl vann før blanding med substratet. ;Dette eksempel viser at etterfølgende vannvasking for å fjerne ubundet lipase er avgjørende for å oppnå en høy interforestringsaktivitet, mens mengden vann som lipasen er oppløst i under immobiliseringen, er av mindre betydning. ;EKSEMPEL 3 ;50 g fuktig ionevekslerharpiks "Duolite" ES 562 (tørr vekt ;41,8 g) ble justert til pH 6,0 og vasket som i eksempel 2. ;10,6 g porsjoner av denne fuktige ionevekslerharpiks ;5 g tørr vekt) ble blandet med forskjellige mengder av en 10% løsning av Mucor miehei-lipase (81 000 LU/g) ifølge tabellen. ;Etter reaksjonen ble væsken frafiltrert på en Buchner-trakt og lipasepreparatet ble vasket med 2 x 25 ml vann og tør-ket i vakuum til ca. 97% tørrstoff. ;Prøvene på 2 50 mg tørr vekt av immobilisert preparat for forsøksformål ble fuktet med 20 yl vann før forsøket. ;Dette eksempel viser at den optimale dosering av lipase avhenger av reaksjonstiden. ;EKSEMPEL 4 ;To av preparatene fra eksempel 3 ble undersøkt på nytt med forskjellige mengder vann, dvs. prøven med 12,5 g lipaseløsning og den med 25 g lipaseløsning, begge med en reaksjonstid på ;2 timer. Virkningen av fuktighetsinnholdet på interforestringsaktiviteten fremgår av den følgende tabell. ;Dette eksempel viser at det optimale fuktighetsinnholdet er ca. 10%. ;EKSEMPEL 5 ;Ett av preparatene fra eksempel 3 ble undersøkt på nytt med forskjellige mengder tilsatt vann. Prøven med 25 g lipase-løsning og 4 timers reaksjonstid ble brukt. ;EKSEMPEL 6 ;22,8 g fuktig ionvekslerharpiks "Duolite" A 561 (88,2% tørr substans) ble justert til pH 6,0 og vasket. ;En annen 22,8 g prøve av "Duolite" A 561 ble delvis knust i en morter før pH-justering og vasking. ;Til hver av disse porsjoner ble det tilsatt en løsning av 10 g Mucor miehei-lipase (93 000 LU/g) i 200 g vann justert til pH 6. Reaksjonen fant sted i 2 timer ved romtemperatur. ;De immobiliserte enzymene ble vasket med 1 liter vann og tørket i vakuum. ;Etter tørking ble den uknuste prøven knust i en morter, og . begge prøver siktet. ;Det fremgår klart at det er en fordel å bruke de fraksjo-ner som er siktet fint for å oppnå maksimal interforestringsaktivitet, men behovet for en kolonne med lavt trykkfall gjør et kompromiss nødvendig. ;EKSEMPEL 7 ;Dette eksempel illustrerer virkningen av forskjellige ka-tegorier av makroporøse, svake anionvekslerharpikser (matriks-type, funksjonelle grupper, partikkelstørrelse) på satsinterforestringsaktiviteten til det immobiliserte lipasepreparatet. ;Ved anvendelse av "Duolite" ES 562, "Duolite" A 561, "Duolite" A 7, "Amberlite" IRA 93 og "Amberlyst" A 21 ble 4,25 g tørrstoff av harpiks vasket med vann, blandet med 1 g Mucor miehei-lipase (93 000 LU/g) i 20 ml vann, blandingen justeres til pH 6,0 og roteres langsomt i 2 timer ved romtemperatur. Etter filtrering ble hvert preparat vasket med 250 ml vann. Når det gjelder "Duolite" A 378 ble 8,5 g blandet med 2 g lipase og til slutt vasket med 250 ml vann. Alle ble tørket i vakuum ved romtemperatur. Når det gjelder "Duolite" A 365, "Duolite" S 587 og "Dowex" MWA-1 ble 4,25 g harpiks tørrvekt blandet med 1 g Mucor miehei-lipase (124 000 LU/g) i ca. 10 ml vann i 2 timer ved rotasjon ved romtemperatur (når det gjelder "Lewatit", ble 0,5 g lipase anvendt). Etter filtrering og vasking med 2 volu-mer vann, ble preparatene tørket i vakuum ved romtemperatur. Karakterisering av de immobiliserte preparatene er vist i tabellen nedenfor. ;;EKSEMPEL 8 ;30 g "Duolite" ionvekslerharpiks av typen ES 562 ble suspendert i ca. 75 ml vann og pH ble justert til 6,0 med 4 N NaOH. Ionevekslerharpiksen ble vasket med vann på et sugefilter, og overskudd vann ble suget vekk. Den fuktige ionevekslerharpiksen (ca. 45 g) ble delt i tre like deler. ;Den første tredjedelen ble blandet med en løsning av 1 g av Mucor miehei-lipase (210 000 LU/g) i 20 ml vann justert til pH 6,0. Etter blanding ble pH igjen justert til 6,0 og blandingen fikk reagere i 4 timer ved 5°C med magnetomrøring. Under denne perioden falt pH til 5,45. Blandingen ble overført til en Buchner-trakt med noen få ml vann og så mye som mulig av løsnin-gen ble suget vekk (14 ml). Harpiksen ble tørket ytterligere i vakuum til et vanninnhold på 10,0%. Utbytte 8,27 g. ;Den andre tredjedelen av den fuktige harpiksen ble blandet med en løsning av 1 g av den tidligere angitte lipase i 20 ml 0,1 M natriumacetatbuffer (pH 6,0). pH i blandingen ble justert tilbake til 6,0 og blandingen fikk reagere i 4 timer ved 5°C med magnetomrøring. I denne perioden falt pH til 5,83. Den videre fremgangsmåte ble utført som angitt for den første tredjedelen av den fuktige ionevekslerharpiksen, og ga 21 ml filtrat og 9,10 g tørket preparat med et fuktighetsinnhold på 9,5%. ;Den tredje tredjedelen av harpiksen ble blandet med lipase-løsning som foran, men pH ble holdt konstant på 6,0 i den 4 timers koblingsperioden ved 5°C ved tilsetning av 0,58 ml 1 N NaOH. Blandingen ble opparbeidet som de andre tredjedelene, og ga 28 ml filtrat og 8,95 g tørket preparat med 8,9% fuktighet. De tre filtratene inneholdt mellom 1 og 5% av den opprinnelige, totale aktiviteten. ;Interforestringsaktiviteten med 250 mg immobilisert lipase-preparat etter en reaksjonstid på 30 min ved 40°C er angitt i den følgende tabellen. ;Som det fremgår av tabellen er det bare små forskjeller mellom preparatene. ;EKSEMPEL 9 ;Dette eksempel illustrerer virkningene av nærværet av to salter i konsentrasjonsområdet 0 - 0,5 M under immobilisering på interforestringsaktiviteten. ;Fem 1,00 g porsjoner av Mucor miehei-lipase, diafiltrert og frysetørket, med en aktivitet på 93 000 LU/g, ble oppløst i 20 ml av: ;1) demineralisert vann ;2) 0,05 M natriumfosfat, pH 6,0 ;3) 0,5 M natriumfosfat, pH 6,0 ;4) 0,05 M natriumklorid ;5) 0,05 M natriumklorid ;Fem andre 5,25 g porsjoner (tørrvekt 4,25 g) av "Dulite" ES 562 ionevekslerharpiks ble ekvillibrert med 20 ml av 1) - ;5) ovenfor. Etter dekantering ble de tilsvarende lipaseløsnin-ger tilsatt til de fuktige ionevekslerharpikspartikler som er justert til pH 6,0, og beholderne ble rotert langsomt i 2 timer ved 25°C. Preparatene ble så oppsamlet ved filtrering og hver ble vasket med 2 50 ml demineralisert vann fulgt av tørking i vakuum ved 2 5°C (64 timer). Resultatene av bestemmelsen av interforestringsaktiviteten er vist nedenfor: ;EKSEMPEL 10 ;Dette eksempel viser virkningene av høye konsentrasjoner av natriumacetat under lipaseimmobilisering på preparatenes in-terf orestringsaktivitet . ;Fem 1,00 g porsjoner av Mucor miehei-lipase, diafiltrert og frysetørket, 93 000 LU/g, ble separat oppløst i 20 ml av de følgende væsker: ;1) demineralisert vann ;2) 0,5 M natriumacetat, pH 6,0 ;3) 1,0 M natriumacetat, pH 6,0 ;4) 2,0 M natriumacetat, pH 6,0 ;5) 4,0 M natriumacetat, pH 6,0 ;Fem 4,25 g (tørrvekt) porsjoner av "Duolite" ES 562 ionevekslerharpiks ble vasket og ekvilibrert ved blanding mod de fem ovenfor angitte løsninger 1) - 5) ved rysting i 15 min. Tilsvarende lipaseløsninger og vaskede ionevekslerharpikser ble blandet, justert til pH 6,0 og rotert langsomt i 2 timer ved romtemperatur. Hvert preparat ble filtrert, vasket med 250 ml vann og tørket i vakuum ved romtemperatur. Preparatene ble undersøkt på satsinterforestringsaktiviteter, og resultatene er vist i den følgende tabell. ;;EKSEMPEL 11 ;Dette eksempel illustrerer immobilisering av andre mikrobielle lipaser enn Mucor-miehei-lipase: Fusarium oxysporum-lipase fremstilt som beskrevet i DK-pa-tentsøknad nr. 2999/84, eksempel 23, ble immobilisert ved blanding av 6,72 g lipase på 88 000 LU/g og 4,25 g tørrstoff av "Duolite" ES 562 ionevekslerharpiks, vasket og pH-justert, i 25 ml vann ved pH 6,0 og ved rotasjon ved romtemperatur i 2 timer. Så ble vasking utført med 2 x 25 ml vann og ved vakuumtørking ble det oppnådd 4,93 g preparat med et vanninnhold på 8,1%. Den aktivitet som fantes i totalfiltratet tilsvarte 18% av den opprinnelige aktiviteten. ;Aspergillus niger-esterase ble oppnådd ved ultrafiltrering av det kommersielle produktet "Palatase". 15 ml "Pala- ;tase" på 2790 LU/ml ble immobilisert på 4,25 g ES 562 som beskrevet ovenfor, hvorved 4,77 g immobilisert preparat med 7,6% vann ble oppnådd. Filtratet inneholdt 13% av den opprinnelige LU-aktiviteten. ;Candida cylindracea-lipase fra Amano (type OF) ble på lignende måte immobilisert ved å blande 4,25 g ES 562 med 1,40 g Amano-lipase OF i 15 ml vann, pH 6,0. Utbyttet var 4,62 g immobilisert preparat med 6,5% vann og med 0,2% aktivitet bibeholdt i filtratet. ;De tre preparatene ble karakterisert som følger: ;1) Ved standard satsforsøket ved 40°C ;2) Ved en triolein (000)/dekansyre (D) satsinterfor-estring uten løsningsmiddel ved 60°C ved bruk av 3,0 g 000, 0,600 g D og 250 mg tørt lipasepreparat som var hydratisert til ca. 10% vann. ;For sammenligningsforsøk er det også oppført resultatene for et Mucor miehei-lipase-preparat som beskrevet i eksempel 13: ;For å gi en bedre oversikt over de forangående eksempler henvises det til følgende tabell. ;Dette (disse) eksempel (eksempler) illustrerer innvirknin-gen av interforestringsaktiviteten på de immobiliserte lipasepreparatene som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som stammer fra ;For å vise anvendbarheten av det immobiliserte lipasepreparatet som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble et immobilisert lipasepreparat som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, som angitt senere, brukt i en kontinuerlig interforestring av fett uten bruk av noe løsningsmiddel eller andre kostbare hjelpemidler, som beskrevet i det følgende eksempel 12. ;EKSEMPEL 12 ;Dette eksempel illustrerer kontinuerlig interforestring av fett uten løsningsmiddel eller andre kostbare hjelpemidler ved bruk av et immobilisert lipasepreparat som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i en reaktor med hakket lag. ;Immobilisering ;2,20 g Mucor miehei-lipase (81 000 LU/g) ble oppløst i ;20 ml vann, blandet med 10 g vasket (8,5 g tørr vekt) "Duolite" ES 562 ionevekslerharpiks med mer enn 80% av partiklene mellom 200 og 4 00 ym. Blandingen ble justert til pH 5,0 og magnetom-rørt i 4 timer ved 5°C. Etter filtrering og vasking med en li-ten mengde vann ble preparatet tørket i vakuum ved romtemperatur. Utbyttet var 9,05 g, inneholdende 9,3% vann. Den aktivitet som var igjen i filtratet var 8% av den totale, opprinnelige mengden. Satsinterforestringsaktiviteten var 30,6% POO, 7,7% POP ved h time eller 15,3% innblandet P. ;Test i kolonne ;2 g av dette immobiliserte lipasepreparatet ble plassert ;i en kolonne og et løsningsmiddel-fritt substrat bestående av olivenolje/palmitinsyre i forholdet 2,5 : 1 vekt/vekt ble kontinuerlig matet gjennom ved 60°C. Ytelsen til lipasepreparatet er vist i tabellen nedenfor. ;;Tegnforklaring: TG: Triglycerider, g enz. = gram immobilisert ;lipase. ;% innblandet P bestemmes ved hjelp av GLC av fettsyremetylestere. j Omdannelse x = (% P <-><%><P>Q)</>(<%><P>ekv <-><%> PQ, <p>ekv er % innblandet P i olivenoljesubstratet (Pg) og i TG-blandingen ved likevekt (Pt,). ;ekv ;Kommentarer ;Basert på data etter 208^ og 475 timer indikerer ekstra-polering til start i semilogaritmisk avsetning en opprinnelig aktivitet (strøm) på 3,2 g TG/h/g enzym med en tilsvarende om-dannelsesgrad x = 28%. Et anslag på halv-tiden er 500 - 600 timer ved 60°C uten løsningsmiddel og olivenolje/P = 2\ : 1 (vekt/ vekt). Det har ikke oppstått noen trykkfallsproblemer. Et tidligere forsøk på å føre et lignende substrat gjennom "Celite"-adsorbert lipase av den type som er beskrevet i DK-patentsøknad nr. 563/77 i en kolonne var umulig. ;EKSEMPEL 13 ;Dette eksempel illustrerer fremstilling i et forsøksanlegg av et immobilisert lipasepreparat i en kolonne og anvendelse av dette preparat for kontinuerlig interforestring i en kolonne med substrat ved 60 og 70°C uten løsningsmiddel. ;Immobilisering ;6,0 kg (81% tørrstoff) "Duolite" ES 562 ionevekslerharpiks ble kondisjonert ifølge informasjon fra produsenten (Duolite Technical Information 0110A). Dette innebærer syre-base-behand- ;ling og i dette tilfelle også en etanolrensing (for å sikre maksimal renhet ved næringsmiddelbehandling). pH ble justert til 6,0 i 0,1 M acetatbuffer. Suspensjonen ble fylt på en kolonne og den avsatte harpiksen (18 1) ble vasket med 72 1 vann. 18 1 Mucor miehei-lipase (10 100 LU/ml) justert til pH 6,0 ble resirkulert med 30 l/time i 6 timer med pH-regulering. Etter forflytning med 20 1 vann inneholdt et kombinert volum på 37 1 126 LU/ml tilsvarende 97% immobiliseringsutbytte. Kolonnen ble vasket med ytterligere 20 1 vann og preparatet ble vakuum-tørket ved romtemperatur hvorved 6,0 kg (97% tørrstoff) immobilisert lipasepreparat ble oppnådd. Satsinterforestringsaktiviteten var 30,2% POO, 6,9% POP ved \ time eller 14,7% P innblandet. ;ANVENDELSESFORSØK NR. 1 ;4,0 g av det immobiliserte lipasepreparatet ble fylt på en kolonne med vannampel med en indre diameter på 1,5 cm. Temperaturen i kolonnen ble holdt ved 60°C. Et olivenolje/dekansyre-substrat med en sammensetning på 2,5/1 (vekt/vekt) ble pumpet gjennom en forkolonne inneholdende 30 g "Duolite" S 561 mettet med 21 ml av ionvekslet vann og ytterligere gjennom hovedkolon-nen som inneholdt det immobiliserte lipasepreparatet. Strøm-ningshastigheten ble regulert for å holde sammensetningen av ut-løpet på en verdi som tilsvarer ca. 65% omdannelse, dvs. 23% ;DOO i det endelige triglyceridet (DOO betyr et triglycerid med en dekansyreenhet (i ytre stilling) og to oljesyreenheter). ;Med den antagelsen at minskning i aktiviteten til den immobiliserte lipasen følger en reaksjon av første orden, kan halv-tiden anslås til 3200 timer. Med en opprinnelig aktivitet på 2,4 g triglycerid/time/gram enzympreparat er produktiviteten ca. 8,3 tonn triglycerid/kg enzympreparat forutsatt en forsøkstid på to halvtider. I fig. 1 er logaritmen av strømningshastigheten avsatt mot tiden. ;ANVENDELSESFORSØK NR. 2 ;Det samme forsøk som nr. 1 ble utført ved 70°C istedenfor ved 60°C. ;Halvtiden ble funnet å være 1300 timer og den opprinnelige aktiviteten 2,3 g triglycerid/time/gram enzympreparat tilsvarende en produktivitet på 3,2 tonn triglycerid/kg enzympreparat. ;Logaritmen for strømningshastigheten er avsatt mot tid i fig. 2. ;EKSEMPEL 14 ;Dette eksempel illustrerer styrken til et immobilisert lipasepreparat fremstilt ifølge oppfinnelsen for kontinuerlig interforestring av en høytsmeltende triglyceridblanding bestående av oksetalg og soyabønneolje uten løsningsmiddel eller andre hjelpemidler. Lignende fremgangsmåter kan være nyttige for fremstilling av spesielle fett uten bruk av hydrogenering og kjemisk interforestring og egnet for margarin eller beslektede produkter. ;Immobilisering ;19,8 g fuktig (86,0% tørrstoff) "Duolite" A 561 ionevekslerharpiks, hvor mer enn 80% av partiklene er mellom 400 og 850 ym, ble justert til pH 6,0 i vandig suspensjon og vasket med vann. 50 ml Mucor miehei-lipase (7400 LU/ml, 8% tørrstoff) ble blandet med harpiksen og pH ble justert tilbake til 6,0. Etter omrøring i 2 timer ved romtemperatur, filtrering og vasking med 2 x 50 ml vann, ble preparatet tørket i vakuum ved romtemperatur. Utbyttet var 19,2 g inneholdende 8,5% vann. Aktiviteten i filtratet var 34% av den totale, opprinnelige mengde. Satsinterforestringsaktiviteten var 25,4% POO, 6,0% POO ved ;time eller 12,5% innblandet P. ;Analyse av interforestringsreaksjonen ;Hvit oksetalg og ny, raffinert soyabønneolje ble oppnådd på det lokale marked. Substratet besto av 1,5 deler oksetalg og 1 del soyabønneolje som ble blandet ved 70°C. BHT-antioksy-dant ble tilsatt i en konsentrasjon på 0,1%. For å karakteri-sere de enkelte bestanddelene og følge interforestringsreaksjonen, ble HPLC brukt for å analysere triglyceridsammensetningen av substratbestanddelene, den opprinnelige blanding og den interforestrede blanding. En opprinnelig satsreaksjon med 2,75 g immobilisert Mucor miehei-lipase-preparat, 24 g talg og 16 g soyabønneolje ble kjørt i 16,5 timer ved 65°C. HPLC viste at forholdet mellom LPO- og LLL-triglycerid (L: Linol, P: Palmitin, 0: olje) i blandingen økte fra 0,62 til 1,16, idet det siste tallet antagelig er nær likevektsforholdet. ;Smelteegenskaper for den interforestrede blandingen ;Forandringen av smelteegenskaper pga. interforestringen ;ble analysert ved dilatasjon ifølge den offisielle IUPAC-metoden (IUPAC: standardmetoder for analyse av oljer, fett og derivater, 6. utgave, metode nr. 2.141 (1979)). Resultatene fremgår av den nedenstående tabell, med en tilsvarende ikke-interforestret ;blanding av oksetalg og soyabønneolje (1,5 : 1) som referanse. ;;Test i kolonne ;Et lite kolonnesystem med termostat ble operert i 2 dager for å illustrere en kontinuerlig prosess. 4,0 g av det be-skrevne immobiliserte lipasepreparatet ble plassert i en kolonne. Det ble også brukt en for-kolonne inneholdende 5 g fuktig "Duolite" A 561 harpiks (50% tørrstoff). Oksetalg/soya-bønneolje i forholde 1,5 : 1 vekt/vekt ble kontinuerlig matet gjennom kolonnesystemet ved 67°C. Ytelsen til det immobiliserte lipasepreparatet er vist i tabellen nedenfor: ;EKSEMPEL 15 ;Dette eksempel illustrerer anvendelsen av immobilisert lipase ifølge oppfinnelsen for fetthydrolyse. ;Til en 1 : 1-blanding av ren oksetalg og vann, 40 g av hver, ble det tilsatt immobilisert lipase, fremstilt som beskrevet i-eksempel 13, i en mengde tilsvarende 100 LU/g fett, eller 0,13 g immobilisert lipasepreparat, antatt en ladning på 30 000 LU/g av immobilisert lipase. En effektiv blanding ble oppnådd ved magnetomrøring ved 48°C. Den opprinnelige pH-verdi i vannfasen ble justert til 8,0. Etter 4 dager ble enzymet pre-parert og fettfasen analysert på hydrolysegrad (DH). Det ble utført dobbelttester. Det gjenvundne immobiliserte enzymet ble anvendt for et 2'-forsøk og et sammenligningsforsøk med løselig lipase, også tilsatt i en mengde tilsvarende 100 LU/g fett, ble utført. I dette tilfelle ble den vandige fasen brukt for 2'-forsøket. Tre tester ble utført med løselig lipase. ;Resultatene var som følger: ;;pH-verdien falt til ca. 6,8 med den immobiliserte lipasen og til ca. 6,3 i 1<*->forsøket og til ca. 7,4 i 2'-forsøket med den løselige lipasen. %DH ble beregnet som syreverdien (AV) di-vidert med forsåpningsverdien (SV).

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et immobilisert lipase-preparat for omestring av fett, karakterisert ved at en vandig oppløsning av en mikrobiell lipase bringes i kontakt med en partikkelformig, makroporøs, svak anionbytterharpiks som inneholder primære og/eller sekundære og/eller tertiære aminogrupper, og hvis partikler i en grad av mer enn 90 % har en partikkelstørrelse på mellom 100 og 1000 pm, fortrinnsvis mellom 200 og 400 pm, under slike betingelser at lipasen binder seg til anionbytteren, i et tidsrom som er tilstekkelig langt til å binde den ønskede lipasemengde til anionbytteren, hvoretter den således dannede immobiliserte lipase separeres fra vannfasen og den separerte immobiliserte lipase tørkes til et vanninnhold på mellom 2 og 40 %.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som lipase anvendes en varmestabil lipase.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den mikrobielle lipasen oppnås fra en termofil Mucor-art, spesielt Mucor miehei.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at forholdet mellom mengden vandig løsning av den mikrobielle lipase og vekten av svak anionebytter tilsvarer 5 000 - 50 000 LU/g ionebytter (tørrvekt).

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at pH-verdien under kontakten mellom ionebytteren og den vandige oppløsning holdes på mellom 5 og 7.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1-5, karakterisert ved at det anvendes en kontakttid på mellom 0,5 og 8 timer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1-6, karakterisert ved at separasjonen utføres ved enkel filtrering.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at tørkingen utføres til et vanninnhold mellom 5 og 20 %.