HU192642B

HU192642B - Process for the extraction of nucleinic acids and purine bases from gelatine

Info

Publication number: HU192642B
Application number: HU844730A
Authority: HU
Inventors: Miklos Szuecs; Jozsef Szejtli; Eva Fenyves; Istvanne Palotas
Original assignee: Forte Fotokemiai Ipar; Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1984-12-19
Filing date: 1984-12-19
Publication date: 1987-06-29
Also published as: GB8531230D0; FR2574808A1; HUT38639A; GB2169903B; DE3544842A1; US4772397A; GB2169903A; JPS61197599A

Description

A találmány tárgya eljárás nukleinsavak és purinbázisok kivonására zselatinból, ciklodextrin-gyöngypolimerek alkalmazásával.

A zselatinban részben eredendően, részben gyártástechnológiája következményeként nagyszámú szervetlen és szerves mikrökomponens fordul elő. Az utóbbiak közé tartoznak a nukleinsavak és purinbázisok, amelyek a zselatintartalmú ezüsthalogenid fotográfiai emulziókban mind a kristályok növekedését, mind a fényérzékenység kifejlődését visszatartják (T. H. James: The Theory of the Photographic Process, MacMillan, New York, 1977). E gátlóanyagok jelenléte sok esetben nem kívánatos, ezért a zselatingyártók régi törekvése, hogy a zselatinból ezeket eltávolítsák.

A nukleinsavak és származékaik kivonására általában ioncserélő gyantákat alkalmaznak. Elterjedten használják a polisztirol-divinilbenzol kationcserélő gyantákat (például Amberlite típusok). Ezeknek az a hátránya, hogy csak az adenint és a guanint távolítják el, a nukleinsavak a zselatinban visszamaradnak (T. Ohno—H. Irie: J. Soc. Phot. Sci. Techn. Japan,

39, (T976/146). Újabban különböző felépítésű dextránszármazékokat is kipróbáltak (például Sephadex típusok). Ezek segítségével a nukleinsavaknak mintegy 75%-a vonható ki a zselatinból (N. Masuda—H. Kimura: J. Phot. Sci. 30, (1982/124). Az összes gátlóanyag eltávolítására az a lehetőség kínálkozik, hogy a nukleinsavakat nukleázzal alkotóelemeire bontjuk, majd a pürinbázísökat kationcserélővei kivonjuk; e 30 módszer azonban költséges. A nukleinsavakat sósavas kezeléssel is hidrolizálhatjuk, ekkor azonban a zselatin is lebomlik, így ennek az eljárásnak az alkalmazása a zselatingyártásban nem lehetséges.

A találmány célja olyan eljárás megvalósítása, 35 amellyel mind a nukleinsavak, mind a purinbázisok maradéktalanul és gazdaságosan kivonhatok a zselatin károsodása nélkül. A találmány szerinti eljárásban erre a célra ciklodextrin-gyöngypolimert alkalmazunk. 40

A ciklodextrinek 6, 7 vagy 8 glükopiranóz egységéből felépülő, ciklikus, nem redukáló oligoszacharidok, amelyeket keményítő enzimatikus lebontásával állítanak elő. Gyakorlati felhasználásuk főként zárványkomplexképző képességükön alapul (Szejtli J.: Cyc- 45 lodextrins and Their Inclusion Complexes, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1982).

Korábbi vizsgálatokban (Hoffmann, J. L. -- Bock,

R. M.: Biochemistry, 9, (1970) 3542; Formoso, C.: Biopolymers, 13, (1974/909) differenciál IJV-spekt- 50 roszkópiával megállapították, hogy a-ciklodextrinnel nem reagál többek között az adenozin-, citozin-, guanin-, uridin-monofoszfát, és )3-ciklodextrinneI is csak az adenozin- és az inozin-monofoszfát lép kölcsönhatásba. Dinukleetidokkal a kölcsönhatás gyen- 55 gébb, a polinukleotidok pedig semmiféle kölcsönhatást sem mutattak a ciklodextrinekkel. Ezért meglepő az a tapasztalatunk, hogy a polimerizált ciklodextrin híg vizes oldatokból olymértékben képes megkötni a nukleinsavakat és a purinbázisokat, hogy azok szelek- 50 tív eltávolítására alkalmas.

A találmány alapja az a felismerés, hogy a ciklodextrin-gyöngypolimer mind zárványkomplexképzőként, mind adszorbensként képes működni, így a kismolekulatömegű purinbázisok és a nukleinsav-makro- 65 molekulák kivonására egyaránt alkalmas.

A ciklodextrin-gyöngypolimerek ciklodextrinnek alkalmas bifunkciós keresztkötő ágenssel (például epiklór-hidrinnel vagy etilénglikoi-di (epoxi-propil)éterrel) történő térhálósításával, poli (vinil-acetát) jelenlétében készülnek (177 419 lajstromszámú magyar szabadalom, 1978); ciklodextrin tartalmuk 30-70 tömeg% közötti, előnyösen 50—60 tömeg% közötti, poli (vinil-alkohol) tartalmuk 0,3—0,5 tömeg% közötti, részecskeméretük 20-600 μ között, előnyösen 90—300 μ között változik.

A találmány szerint úgy járunk el, hogy a zselatin-oldathoz 20-600 μ részecskeméretű, 30-70 tömeg% ciklodextrintartalmú és 0,3-0,5 tömeg% poli (vinil-alkohol)-tartalmú ciklodextrin-gyöngypolimert adunk a zselatin tömegére számítva 1:1 és 10:1 közötti tömegarányban, majd a ciklodextrin-gyöngypolimert kiszűrjük vagy a zselatin oldatot ciklodextrin-gyöngypolimer oszlopon vezetjük át, amikoris a zselatin mennyisége az oszloptöltet száraz tömegének 5—50%-a, majd a ciklodextrin-gyöngypolimerből a nukleinsavakat és purinbázisokat eluáljuk.

A találmány szerinti eljárásban a zselatin kezelésének befejeztével az oldatból szűréssel különítjük el a gyöngypolimert. A gátlóanyagoktól mentesített zselatinoldat további feldolgozása a szokásos módon történik.

A találmány szerint úgy is eljárhatunk, hogy a gyöngypolimert nem a kezelendő zselatin oldatához adagoljuk, hanem oszloptöltetként használjuk. Ilyenkor az 5 — 10 tömeg%-os zselatinoldatot 40—60 °C hőmérsékletű oszlopon folyatjuk át, miközben az oszlopon kezelt száraz zselatin mennyisége az oszloptöltet száraz tömegének 5—50%-a, előnyösen 10—30%-a.

A kezeléssel mind a nukleinsavakat, mind a purinbázisokat kivonjuk a zselatinból. Ezt a folyamatot nefelometriás vizsgálattal követhetjük. Ez azon alapul, hogy a kisebb méretű kristályok kevésbé szórják a fényt, mint a nagyobb méretűek, így az utóbbiak vizes, zselatinos szuszpenziója zavarosabb (aX = 546 nmmél mért optikai denzitása nagyobb). A gátlóanyagot tartalmazó zselatinnal készített szuszpenzióban a kristályok alig növekszenek, így meghatározott idejű hőkezelés (Ostwald-érlelés) után kis denzitást kapunk, a gátlóanyagok kivonása után azonban a kristályok megnőnek, így azonos idő elteltével a szuszpenzió nagyobb denzitású lesz.

Az 1. táblázatban látható, hogy a viszonylag nagy gátlóanyagtartalmú (700 ppm DNS, 60 ppm adenin) aktív zselatin erősen visszatartja a kristályok növekedését, kezelése után azonban azok majdnem olyan gyorsan nőnek, mint a gátlóanyagot nem tartalmazó inért zselatin esetén.

1. Táblázat

Hőkezelés ideje, 60 °C-on, perc	°_λ546
Aktív zselatin	Inért zselatin
kezelés előtt	kezelés után
5	0,13	0,40	0,51
10	0,20	0,68	0,80
20	0,27	0,97	1,11
40	0,33	1,18	1,30
80	034	1,19	1,32

192 642

A találmány szerint alkalmazott ciklodextringyöngypolimer regenerálása céljából a nukleinsavakat és purinbázisokat eluálással távolítjuk el; vagy úgy, hogy a gyöngypolimert mintegy ötszörös mennyiségű eluens oldatban néhányszor elkeverjük, majd leszűrjük, vagy úgy, hogy ugyanezt a mennyiségű eluenst átfolyatjuk az oszlopon. Az eluensből 1 óra alatt az oszloptöltet-térfogat 20—40%-ának megfelelő menynyiséget áramoltatunk keresztül.

Eluensként 7,5-10,5 pH-értékű pufferoldatot használunk, amely 0,1-0,2 mol/liter NaCl-t is tartalmazhat.

A polimerrészecskéken adszorbeálódott zselatint forró vizes mosással és/vagy enzimes kezeléssel (proteáz) távolítjuk el. Az utóbbi művelet után vizes mosást alkalmazunk.

A találmány szerinti eljárás előnyei a következők:

1. A ciklodextrin-gyöngypolimerrel mind a nukleinsavak, mind a purinbázisok egy műveletben eltávolíthatók.

2. A ciklodextrin-gyöngypolimer DNS és purinbázis megkötő képessége nagyobb a dextránalapú gyantákénál.

3. A ciklodextrin-gyöngypolimer alkalmazása gazdaságosabb a dextránalapuakénál.

A találmány szerinti eljárást a következő kiviteli példákkal szemléltetjük.

i. példa

Vízköpennyel ellátott, ultratermosztáttal 45 °C hőmérsékleten tartott, 300 ml térfogatú edénybe bemérünk 15 g szárazanyagot tartalmazó, nátrium-ace5 tát/ecetsav pufferben (pH = 3,4) előduzzasztott β-ciklodex trin-gyöngypolimert (részecskeméret d 90-300 μ, ciklodextrintartalom 56%, poli (vinilalkohol)-tartalom 0,4%, majd hozzáöntünk 100 ml, 0,025 g/1 koncentrációjú DNS-oldatot és a reakció10 elegyet 1 órán át keverjük.

A bemérést úgy is elvégezzük, hogy 15 g szárazanyagot tartalmazó, KH₂P0₄-pufferben (pH = 7,5) előduzzasztottt Molselect G-50 (d = 100-320 p) illetve Sephadex G—50 (d = 50—150 μ) gyöngypoli15 mert alkalmazunk.

A diszperzióból mindhárom esetben szűréssel eltávolítjuk a polimerrészecskéket, s azokat eluálás céljából 5x100 ml KH₂PO₄ (NaOH-pufferrel/pH= 10,5/, amely 0,2 mol/liter NaCl-ot tartalmaz, 30-30 percen át keverjük, majd szűrjük. Az eluátumok gátlóanyagtartalmát spektrofotometriásán mérjük.

A vizsgálatot ezután a három gyöngypolimerrel az előzőekhez hasonló módon újból elvégezzük, le azzal a különbséggel, hogy a DNS-oldat

2θ helyett 100 ml 0,015 g/liter koncentrációjú adeninoldatot alkalmazunk.

__Az eredményeket a 2. táblázat mutatja be.

2. táblázat

Gátló- anyag	Gátlóanyagtartalom, mg
Ciklodextrin	Molselect Β K -1-	Sephadex	K B
B		B	K ·
DNS	2,5	2,3 0,92	2,5 1,57 0,63	2,5	1,8	0,72
AD	1,5	1,35 0,91	1,5 1,07 0,71	1,5	1,14	0,76

Megjegyzés: B = bevitt anyag, K = kivont anyag

Az adatokból kitűnik, hogy a ciklodextrin polimer mind a DNS-t, mind az adenint jobb hatásfokkal köti meg, mint a dextránalapú anyagok.

2. példa

Az 1. példában leírt feltételek mellett lOOmlnátrium-acetát (ecetsav pufferben/pH = 3,4) feloldunk

2,5 mg DNS-t és 5 g gátlóanyagot nem tartalmazó, inért zselatint. Az oldathoz hozzáadunk 15 g szárazanyagot tartalmazó, nátrium-acetát/ecetsav pufferben 55 /pH = 3,4) előduzzasztott 0-ciklodextrin-gyöngypolimert (d = 90-300 μ ciklodextrintartalom 59%, poli (vinil-alkohol)-tartalom 0,3% s a diszperziót 3 órán át keverjük.

A bemérést úgy is elvégezzük, hogy Molselect θθ G—50 gyöngypolimert (d = 100—320 μ) és KH₂PO₄puffért (pH = 7,5) alkalmazunk.

A diszperzióból mindkét esetben szűréssel eltávolítjuk a polimerrészecskéket, s azokat eluálás céljából 5x100 ml KH₂P0₄ (NaOH pufferrel (pH = 10,5), 65 amely 0,2 mol/liter NaCl-ot tartalmaz, 30—30 percen 45 át keverjük, majd szűrjük. Az eluátumok gátlóanyagtartalmát spektrofotometriásán mérjük.

A vizsgálatot ezután a két gyöngypolimerrel az előbbiek szerint újból elvégezzük, de azzal a különbséggel, hogy DNS helyett 1,5 mg adenint mérünk be. 50 Az eredményeket a 3. táblázat mutatja be.

3. táblázat

Gátló- anyag		Gátlóanyagtartalom, mg
Ciklodextrin	Molselect
B	K κ B“	Β K	-L- B
DNS AD	2.50 1.50	2,30 0,92 1,36 0,91	2.50 1,80 1.50 1,00	0,72 0,66

Megjegyzés: B = bevitt anyag, K = kivont anyag

-3192 642

Az adatokból kitűnik, hogy a ciklodextrin-polimer a zselatinoldatból is jobb hatásfokkal távolítja el a gátlóanyagokat, mint a dextrán alapú.

3. példa

Vízköpennyel ellátott, ultratermosztáttal 55 °C-on 5 tartott, 30 cm magas, 3 cm átmérőjű ciklodextringyöngypolimer oszlopba (részecskeméret 90—300 pm, ciklodextrintartalom 57,2% pol( (vinil-alkohol)tartalom 0,4%) 30 g szárazanyagot tartalmazó, nátriumacetát/ecetsav pufferben (pH = 3,4) előduz- 10 zasztott β-ciklodextrin-gyöngypolimert töltünk.

Az eredményeket a 4. táblázat mutatja be.

Az oszlopon átáramoltatjuk a kezelendő zselatin oldatát. (Ez úgy készül, hogy 100 ml nátrium-acetát/ ecetsav pufferben (pH = 3,4) feloldunk 2,5 ing DNS-t és 5 g (A példa), 2 g (B példa) illetve 15 g (C példa) gátlóanyagot nem tartalmazó, inért zselatint). Ezután a töltetet 500 ml KH₂P0₄ (NaOH-pufferrel (pH = 10,5) eluáljuk, amely 0,2 mol/liter NaCl-ot tartalmaz (átfolyási sebesség 100 ml/óra).

A vizsgálatot úgy is elvégezzük, hogy DNS helyett

1,5 mg adenint mérünk be, majd pedig úgy, hogy ciklodextrin polimer helyett Molselect-et használunk mindkét gátlóanyaggal.

4. táblázat

A példa jele	Gátló- anyag	Gátlóanyagtartalom, mg
Ciklodextrin	Molselect
Β K	K B	B	K	K B
' A	DNS	2,50 2,35	0,94	2,50	1,00	0,40
A	AD	1,50 1,46	0,97	1,50	0,96	0,64
B	DNS	2,50 2,40	0,96
	AD	1,50 1,46	0,97
C	DNS	2,50 2,31	0,93
	AD	1,50 1,42	0,95

Megjegyzés:B = bevitt anyag, K = kivonat

Látható, hogy a ciklodextrin polimer oszloptöltetként is hatásosabban működik a dextrán alapúnál.

4. példa

Vízköpennyel ellátott, ultratermosztáttal 45 °C hőmérsékleten tartott, 300 ml térfogatú edénybe bemérünk 20 g szárazanyagot tartalmazó, nátriumacetát-ecetsav pufferben (pH = 3,4) előduzzasztott β-ciklodextrín gyöngypolimert (részecskeméret d = 90—300 pm, ciklodextrintartalom 56 tömeg%, poli (vinil-alkohol)-tartalom 0,4 tömeg%), majd hozzáöntjük 100 ml kezelendő zselatin 45 °C hőmérsékletű 10 tömeg%-os oldatát, s az elegyet 3 órán át keverjük.

Zselatinként a Nemzetközi Zselatin Munkabizottság (IAG) DGF 66481 sz. mintáját alkalmazzuk, amely 920 ppm DNS-t és 131 ppm adenint tartalmaz (A).

A vizsgálatot úgy is elvégezzük, hogy 100 ml 5 40 tömeg%-os zselatin-oldatot használunk s az elegyet

2,5 óráig keverjük (B), ill. 100 ml 2 töme^o-os oldatot alkalmazunk, s a keverést 2 órán át folytatjuk (C).

Az elegyböl mindhárom esetben szűréssel eltávo45 htjuk a polimer részecskéket, s azokat az 1. példában említett módon eluáljuk. Az eredményeket az

5. táblázat szemlélteti.

5. táblázat

Min- ta	Poli- mer/ zsela- tin tömegarány	Gátlóanyagtartalom, ppm	Kezelés után, adenin egyenér- tékben	A kivonás mértéke%
DNS	kezelés előtt Ade- nin	Összesen, egyenér- tékben
(A)	2	920	131	223	211	94,6
(B)	4	920	131	223	214	96
(C)	10	920	131	223	218	98

192 642

Az eredmények megmutatják, hogy a ciklodextringyöngypolimerrel a nagy gátlóanyagtartalmú zselatinból is igen nagy hatásfokkal kivonható a DNS és az adenin.

Claims

1. Eljárás nukleinsavak és purinbázisok kivonására zselatinból, azzal jellemezve, hogy

a) a zselatin-oldathoz 80—400 μ részecskeméretű, 40-70 tömeg% ciklodextrintartalmú és 0,3-0,5% poli (vinil-alkohol)-tartalmú ciklodextrin-gyöngypolimert adunk a zselatin tömegére számítva 1 :1 és 10:1 közötti tömegarányban, majd a ciklodextrin-gyöngypolimert kiszűrjük vagy

b) a zselatin oldatot ciklodextrin-gyöngypolimer oszlopon vezetjük át, amikor is a zselatin mennyisége

5 az oszloptöltet száraz tömegének 5—50%-a, majd a ciklodextrin-gyöngypolimerből a nukleinsavakat és purinbázisokat eluáljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy 90—300 μ részecskeméretű és 50—60

10 tömeg% ciklodextrintartalmú ciklodextrin-gyöngypolimert alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy a zselatin mennyisége az oszloptöltet száraz tömegének 10—30%-a.

ábra nélkül