CH624431A5

CH624431A5 -

Info

Publication number: CH624431A5
Application number: CH1053575A
Authority: CH
Inventors: Richard Antony Godwin Smith
Original assignee: Beecham Group Ltd
Priority date: 1974-08-13
Filing date: 1975-08-13
Publication date: 1981-07-31
Also published as: AT363889B; GB1463513A; SE8006247L; AU497573B2; AR218089A1; AR216891A1; ATA629375A; FI752275A; IL47893A; DE2535951A1; FR2288748B1; JPS5151582A; IL47893A0; NL7509667A; IE41894B1; DK143349C; IE41894L; US4267273A; SE7509008L; ES440240A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung enzymatischer Umsetzungen, wobei das Enzympräparat aus dem Reaktionsmedium zur Wiederverwendung-zurückgewonnen werden kann.

Enzymatisch katalysierte Umsetzungen stellen bei zahlreichen chemischen Verfahren wichtige Stufen dar. Als Beispiele seien genannt die Verseifung von Lipoiden unter Verwendung einer Hydrolase, wie Lipase, der Proteinabbau unter Verwendung eines proteolytischen Enzyms, wie Trypsin, die Erzeugung von Steroiden unter Verwendung einer Dehydrogenase, die Erzeugung von Glukosesirupen aus Stärke unter Verwendung von Hydrolase und die Erzeugung von 6-Aminopenicillan-säure aus Penicillinen, wie Benzylpenicillin oder Phenoxyme-thylpenicillinsäure unter Verwendung von Penicillin-Acylase.

Gewöhnlich werden die enzymatischen Umsetzungen mit dem Enzym in Lösung in einem solchen Medium durchgeführt, das ein Substrat enthält (der Ausdruck «Substrat» bedeutet bei vorliegender Erfindung eine Substanz, die vom Enzym umgewandelt wird, um das gewünschte Produkt zu liefern). Da das Enzym im Reaktionsmedium gelöst ist, ist es häufig sehr schwierig, das Enzym vom Substrat oder, wenn die Umsetzung beendet ist, vom Umsetzungsprodukt zu trennen. Wenn das Produkt aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird, führt das Trennverfahren gewöhnlich zu einer Desaktivierung des

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Enzyms. Dies beeinträchtigt natürlich das Enzym in einer nicht wiedergutzumachenden Weise.

Um diese Schwierigkeit einer Trennung zu beheben und ein Enzymsystem zu schaffen, das wiederverwendbar ist, ist es 5 bekannt, das Enzym an einen unlöslichen festen Trägerstoff entweder durch Adsorption (vgl. GB-PS 1 264147) oder durch kovalente Bindung entweder direkt oder indirekt über Brük-kenglieder zu binden (vgl. GB-PS 1 349 498,1 387 460 und 1 365 886). Derartige unlösliche Präparate zeigen jedoch ver-10 schiedene Nachteile. Zunächst sind sie, wenn es sich um Feststoffe handelt, einem mechanischen Zerfall und gegebenenfalls einem Auseinanderbrechen unterworfen. Zweitens ist das Aufbringen des Enzyms auf die Oberfläche des festen Trägerstoffes und somit die spezifische Aktivität des Präparats oft unge-15 nügend. Drittens ist die Zugänglichkeit des Substrats zur aktiven Stelle des Enzyms häufig gehindert. Versuche zur Verbesserung der spezifischen Aktivität derartiger unlöslicher Enzym-Polymerisat-Präparate durch Vergrössern des äusserlichen Oberflächenbereiches des Feststoffes erfordern eine Herabset-20 zung der Teilchengrösse der festen Präparate, was die Handhabung und insbesondere die Abtrennung durch Abfiltrieren schwieriger gestaltet, und erzeugt andererseits, wenn der innere Oberflächenbereich erhöht wird, indem die Teilchen stärker porös gemacht werden, Teilchen mit einer geringeren 25 mechanischen Festigkeit.

Des weiteren sind bestimmte wasserlösliche Enzym-Polymerisat-Komplexe gefunden worden (vgl. GB-PS 1 284 925 und die britischen Patentanmeldungen 53 822/72 und 44 542/ 73), wobei das Enzym entweder direkt oder indirekt über ein 30 Brückglied an einen wasserlöslichen polymeren Trägerstoff gebunden ist. Diese Enzym-Polymerisat-Komplexe kann man aus dem wässrigen Reaktionsmedium durch Ultrafiltration wiedergewinnen. Jedoch stellt die Ultrafiltration eine schwierige und kostspielige Technik dar, insbesondere im grossen 35 Massstab und ist aus diesem Grunde für eine industrielle Anwendung unerwünscht.

Es ist jetzt gefunden worden, dass bestimmte Enzyme an nicht-polare Gruppen gebunden werden können, um das Präparat aus wässrigen Medien dank seiner Affinität zu mit Wasser 40 nicht mischbaren Flüssigkeiten abtrennbar zu machen.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Enzympräparat, bestehend aus einer Acylase, gebunden oder absorbiert an einem polymeren 45 Trägerstoff in wässrigem Medium mit einem Substrat für das Enzym in Berührung bringt, danach das Enzympräparat aus dem wässrigen Reaktionsgemisch mittels In-Berührung-Brin-gen mit einer inerten mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit abtrennt und das Reaktionsprodukt aus der wässrigen Phase 50 gewinnt.

Der hierin verwendete Ausdruck «inerte, mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit» bedeutet, dass die Flüsigkeit mit dem Enzympräparat nicht reagiert und demzufolge auch nicht die Enzymaktivität wesentlich ändert.

55 Der weiterhin hier verwendete Ausdruck «assoziiert» umfasst jede Form einer Wechselwirkung zwischen den nichtpolaren Gruppen des Enzympräparats und den Molekülen der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, wobei die Form ausreichend stabil ist, um ein Mittel zur Abtrennung des Enzym-60 präparats aus dem wässrigen Medium zu schaffen.

Zur Einarbeitung in die erfindungsgemäss hergestellten Präparate sind alle bei Herstellungsverfahren verwendeten Enzyme geeignet. Beispiele derartiger Enzyme sind Amylase, Asparaginase, neutrale und alkalische Proteasen, Chymotryp-65 sin, Cellulase, Dextranase, Lipase, Oxynitrilase, Pepsin, Penicillin-Acylase und Trypsin.

Bevorzugt sind die Enzyme Lipase, Penicillin-Acylase und Trypsin.

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Geeignete nicht-polare Gruppen, die mit den Enzymen ver- charide und Saccharide, die mit Modifizierungsmitteln, wie bunden sein können, sind Kohlenwasserstoffreste mit minde- Epichlorhydrin, modifiziert worden sind, sowie Cellulose, die stens 6 Kohlenstoffatomen, zweckmässigerweise Alkylreste durch Einführen von Carboxymethyl- oder Aminoäthylgruppen mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, z. B. die n-Hexyl, n-Heptyl-, modifiziert worden ist.

n-Octyl-, n-Nonyl-, n-Decyl-, n-Dodecyl-, n-Octadecyl-, 4-Methyl- 5 Von den vorgenannten modifizierten Sacchariden und Oli-pentyl-, 4,4-Dimethyl-pentyl- und die 3-Äthylhexylgruppe, ferner gosacchariden ist festgestellt worden, dass Copolymerisate von Alkenylreste mit 6 bis 50 Kohlenstoffatomen, wie die Undeca- Epichlorhydrin und entweder Lactose, Dextrose oder Saccha-10-enyl-, Oleyl- oder die Linoleylgruppe, dann Cycloalkyl- und rose, besonders zweckmässig sind. Ein bevorzugtes Polymeri-Cycloalkenylreste mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, dann Aryl- sat ist ein Saccharose-Epichlorhydrin-Polymerisat, das unter und substituierte Arylreste, z. B. die Phenylgruppe, die gegebe- io dem Warenzeichen «Ficoll» bekannt ist und insbesondere ein nenfalls durch 1 bis 3 Alkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen solches mit einem Molekulargewicht von etwa 400 000. substituiert sein kann, sowie Aralkylreste, z. B. die Benzyl-, So gut wie die Polymerisate natürlichen Ursprungs ist es

2-Phenyläthyl-, 4-Phenylbutyl- und die 2-Tolyläthylgruppe. auch möglich, wasserlösliche synthetische Polymerisate zu ver-

Das Enzym kann entweder direkt mit der nicht-polaren wenden, wie Polymerisate von Polyvinylalkohol und Mischpo-Gruppe verbunden sein oder indirekt über ein Brückenglied. ts lymerisate von Maleinsäure- oder Acrylsäureanhydriden mit

Bei einigen Enzymen erzeugt die unmittelbare Verknüp- Äthylen, Styrol, Methylvinyläther, Divinyläther oder Vinylace-fung einer Anzahl nicht-polarer Gruppen an das Enzymmole- tat. Derartige Polymerisate sind z. B. in den DT-OS 1 948177 kül eine Änderung hinsichtlich der Conformation und eine und 1 948 298 und in den GB-PS 1 290 701 und 1 223 281

Änderung hinsichtlich der Aktivität des Enzyms. Deswegen beschrieben.

und auch in einigen Fällen wegen der Struktur des Enzyms ist 20 Eine zweckmässige Klasse von wasserlöslichen Mischpoes manchmal nicht möglich, geeignete nicht-polare Gruppen an lymeriaten sind die unter dem Warenzeichen «Gantrez AN» das Enzym zu binden, um das Präparat aus den wässrigen bekannten Methylvinyläther-Maleinsäureanhydrid-Mischpo-

Medien abtrennbar zu machen, ohne die Aktivität des Enzyms lymerisate.

in unannehmbarer Weise herabzusetzen. Das Enzym kann unmittelbar an das eine nicht-polare

Um diese Schwierigkeit zu umgehen, bevorzugt man häufig, 25 Gruppe tragende Polymerisat gebunden sein. Gegebenenfalls ein Enzympräparat herzustellen, bei dem das Enzym an einen kann es auch an einen polymeren Trägerstoff mit Brückenglie-polymeren Trägerstoff gebunden oder adsorbiert ist. Letzterer dem, an die das Enzym geknüpft sein kann, gebunden werden, kann dann die nicht-polaren Gruppen anstelle derjenigen des Geeignete Brückenglieder sind aliphatische a, (»-Diamine mit 2 Enzyms selbst oder zusätzlich zu denjenigen des Enzyms tra- bis 10 Kohlenstoffatomen, wie das 1,3-Diaminopropan oder das gen. Darüber hinaus schafft dies einen einfachen Weg zur 30 1,6-Diaminohexan. Die eine Aminogruppe des Brückengliedes Regulierung der relativen Anteile von nicht-polaren Gruppen ist an das Polymerisat gebunden und das andere ist frei zur zum Enzym in dem Präparat. Es ist natürlich auch möglich, ein Kupplung mit dem Enzym, z. B. über einen wasserlöslichen bereits zum Abtrennbarmachen aus wässrigen Medien genü- Dialdehyd, wie Glyoxal oder Glutaraldehyd. Die Verwendung gend nicht-polare Gruppen tragendes Enzym an einen polyme- derartiger bifunktioneller Brückenglieder ergibt auch eine ren Trägerstoff zu binden, der gegebenenfalls weitere nicht- 35 gewisse Vernetzung zwischen den Enzym-Polymerisat-Einhei-polare Gruppen tragen kann. ten. Die Brückenglieder können zwischen Enzym und Träger-

Gegenstand der Erfindung ist deshalb ferner ein Enzymprä- Stoff oder zwischen Enzym und nicht-polarer Gruppe (mit oder parat wie vorstehend definiert, bei dem das Enzym an einen ohne zusätzlichem Vorliegen eines Trägerstoffes) oder zwi-polymeren Trägerstoff gebunden ist. sehen Trägerstoff und nicht-polarer Gruppe angewendet wer-

Die Bindung des Enzyms an das Polymerisat schliesst 40 den.

gemäss vorliegender Erfindung sowohl eine kovalente Bindung Die Anzahl der nicht-polaren Gruppen, die in die Präparate als auch eine Adsorption an den polymeren Trägerstoff ein, vorliegender Erfindung eingearbeitet werden, hängt von einer sofern die Adsorption ausreichend stark genug ist, um das Anzahl Faktoren ab. Ein Verknüpfen der nicht-polaren Grup-

Enzym auf dem Trägerstoff zurückzuhalten, wenn das Präparat pen an ein Polymerisat und/oder ein Enzym ruft eine hydro-mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit zusammenge- 45 phobe Umgebung in der unmittelbaren Nähe des Enzyms herbracht wird. vor. Bei einigen Enzymen ergibt sich bei einem zu hohen

Der zur Verwendung in den vorgenannten Präparaten ge- Hydrophobizitätsgrad eine Desaktivierung des Enzyms infolge eignete Trägerstoff kann in Wasser löslich oder unlöslich sein. gleichzeitiger Änderung bei der Conformation.

Wenn ein in Wasser unlösliches polymeres Material bei den Es ist ein Gleichgewicht zwischen der Verknüpfung der Präparaten vorliegender Erfindung angewendet wird, liegt es 5.0 geringsten Anzahl von erforderlichen nicht-polaren Gruppen, vorzugsweise in feinteiliger Form vor, so dass es einen grossen um eine Abtrennung aus wässrigen Medien zu gestatten, und Oberflächenbereich für die Bindung des Enzyms darstellt und der grösstmöglichen Anzahl, die mit der Stabilität des Enzyms somit dem Präparat eine hohe spezifische Aktivität verleiht. verträglich ist, erforderlich. Die Bestimmung dieses Gleichge-

Beispiele von geeigneten, in Wasser unlöslichen Materia- wichts muss notgedrungen eine Routineangelegenheit von Ver-lien sind Cellulosepulver und Cellulose-Derivate, wie Carboxy- 55 suchen und Fehlern bleiben. Die Kriterien, durch die das methylcellulose-Ionenaustauscherharze, Polyamide, hochmole- Gleichgewicht bestimmt werden kann, sind folgende :

kulare Polysaccharide, wie Agarose und vernetzte Dextrane, 1. das Molekulargewicht des polymeren Trägerstoffes ;

ferner solche Polysaccharide, die mit Modifizierungsmitteln, 2. das Molekulargewicht der Monomeren-Einheiten ; wie Epichlorhydrin, oder durch Einarbeiten von Carboxyme- 3. der prozentuale Anteil an Monomer-Einheiten in dem durch thyl- oder Aminoäthylgruppen modifiziert sind, sowie Polyacry- «> nicht-polare Gruppen substituierten Polymerisat;

late und Polymethacrylate. Besonders bevorzugt sind Agarose 4. die Grösse der nicht polaren Gruppen ;

und makrorektikular vernetzte Polyacrylate und Polymetha- 5. die Identität des Enzyms und crylate. 6. der Substitutionsgrad des Polymerisats durch das Enzym.

Beispiele von wasserlöslichen Materialien sind Polymeri- Wenn z. B. der Trägerstoff «Gantrez AN 119» (Polymerisat sate natürlichen Ursprungs, z. B. Polysaccharide, wie Dextran, es mit einem Molekulargewicht von 230 000 und Monomer-EinDextrine oder Stärke, sowie solche Polymerisate natürlichen heiten vom Molekulargewicht 156) verwendet wird, wobei 1 Ursprungs, die modifiziert worden sind, wie teilweise abge- Mol dieses Trägerstoffes durch 1 Mol Penicillin-Acylase substi-baute Stärke oder Cellulose, ferner Polysaccharide, Oligosac- tuiert ist, tritt die geringstmögliche Substitution, die zur wirksa-

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men Abtrennung aus wässrigen Medien erforderlich ist, auf,

wenn etwa 25% der Monomer-Einheiten durch n-Decylgruppen substituiert sind. Andererseits tritt die grösstmögliche Substitution zur Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität auf, wenn etwa 50 % der Monomer-Einheiten durch n-Octadecyl- 5 gruppen substituiert sind.

Die Gruppe X der Verbindung I, mit der nach dem erfin-dungsgemässen Verfahren das Enzym in Berührung gebracht wird, kann beispielsweise eine Amino-, Carboxyl-, Aldehyd-, Hydroxy-, Thiol- oder Azogruppe sein. Die Gruppe X kann sich io auch von reaktionsfähigen Vernetzungsgruppen ableiten, z. B. von Dialdehyden, wie Glyoxal oder Glycerinaldehyd, und/oder Diaminen, wie 1,6-Hexamethylendiamin oder Äthylendiamin, und/oder aliphatischen a, co-Diaminocarbonsäuren, wie Glycin oder Lysin, oder einem polymeren Trägerstoff, der derartige funktionelle Gruppen enthält. Vorzugsweise ist X die Amino-gruppe oder ein Rest mit einer Aminogruppe.

Die an das Enzym gebundene und zur Umsetzung mit der Gruppe X befähigte aktive Gruppe kann eine im Enzym vorhandene Gruppe sein, die entweder von Anfang an vorliegt oder durch Modifikation entstanden ist, wie beispielsweise die Carboxyl-, Amino-, Thiol- oder die phenolische Hydroxylgruppe, oder Anhydridbindungen oder ein derartiger aktive Gruppen enthaltender polymerer Trägerstoff oder ein reaktionsfähiges Brückenglied, wie es hinsichtlich der Gruppe X vorstehend beispielhaft erläutert worden ist.

Die Umsetzung zwischen einer Verbindung der allgemeinen Formel I und dem Enzym wird am vorteilhaftesten bei einem im wesentlichen neutralen pH-Wert, zweckmässigerweise im Bereich von pH 4 bis pH 9, und bei einer Temperatur im Bereich von -4 °Cbis +40 °C je nach dem verwendeten Enzym durchgeführt. Vorzugsweise liegt der pH-Wert bei etwa 7,0 und die Temperatur im Bereich von 0 bis 5 °C.

Wenn das Enzympräparat im wesentlichen nur aus dem Enzym und nicht-polaren Gruppen besteht, ist es vorteilhaft,

dass sich die Gruppe X von einem Dialdehyd und/oder einem a, (O-Diamin ableitet, so dass die nicht-polaren Gruppen an das Enzym über ein Brückenglied gebunden sind.

Beim Herstellen eines Enzympräparats, das auch einen polymeren Trägerstoff enthält, ist es vorteilhaft, dass das Trägermaterial zuerst modifiziert wird, um eine nicht-polare

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Gruppe zu erhalten, und sofern erforderlich, ein Brückenglied, bevor die Verbindung mit dem Enzym erfolgt. Bei dieser Ausführungsform stellt die Gruppe X in der allgemeinen Formel 1 den polymeren Trägerstoff dar, der an die nicht-polare Grappe R und an eine funktionelle Gruppe gebunden ist.

Die enzym-modifizierten Polymerisat-Präparate können dann nach an sich bekannten Verfahren zur Bindung von Enzymen an Polymerisate hergestellt werden. Derartige Verknüpfungsverfahren sind beschrieben, z. B. in der GB-PS 1 325 912, und umfassen das Kuppeln des Enzyms an das Polymerisat unter Verwendung von Reagentien, wie Cyanhalogeniden, ins* besondere Cyanbromid, s-Triazinen, insbesondere 2-Amino-4,6-dichlor-s-triazin, Acylaziden, Diazoniumverbindungen,4. B. 2-Hydroxy-3-(p-diazophenyl)-propyläther, organischen Cyana-ten, wie Phenylcyanat, und Carbodiimiden. Häufig werden derartige Verknüpfungsmittel zuerst zur Umsetzung mit dem Polymerisat verwendet, um reaktionsfähige Gruppen am Polymerisat zu schaffen, wobei diese Gruppen dann zur Umsetzung mit dem Enzym dienen. In einigen Fällen können die Enzyme unmittelbar mit dem Polymerisat reagieren, z. B. wenn dieses aktive Gruppen, wie Anhydridbindungen oder Säure-azidgruppen, enthält oder durch Modifizieren erhalten hat

Es wird deshalb als vorteilhaft angesehen, dass die zur Herstellung der modifizierten Polymerisate und zu deren Bindung an die Enzyme angewendeten Umsetzungsverfahren und -bedingungen je nach der Art des Enzyms und des polymeren Trägerstoffes variieren.

Für die meisten Enzym-Polymerisat-Präparate ist ein zweckmässiges Verfahren im Schema I veranschaulicht. Bei der ersten Stufe wird das Polymerisat (a) an die nicht-polaren Gruppen, vorzugsweise über ein primäres oder sekundäres Amin R • NHz oder R2 • NH und (b) an Brückenglieder, wie a, co-Diamine, für eine anschliessende Verknüpfung des Enzyms über Dialdehydgruppen gebunden. Diese Reaktionen werden zweckmässigerweise in wässriger Lösung oder Suspension bei einem alkalischen pH-Wert, zweckmässigerweise bei pH 8 bis 12, und bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Dialdehydgruppen tragende Enzym kann dann mit dem modifizierten Polyme; risat in wässrigen Medien bei im wesentlichen neutralen pH-Werten gebunden werden.

Schema I

Polymer

\

~7

RNHp or RpNH +

NH2(CH2)xNH2

cho(ch2) cho

1—

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wobei Rdie vorstehend beschriebene, nicht-polare Gruppe ist, NH2(CH2)xNH2 ein a, co-Diamin bedeutet und CHO(CH2)yCHO einen Dialdehyd darstellt.

Es ist häufig erforderlich, die Gruppen am Polymerisat zu aktivieren, vorzugsweise mit Cyanbromid, bevor eine Bindung an die nicht-polaren Gruppen möglich ist.

Andererseits weisen einige-Polymerisate Gruppen auf, die zur Verbindung mit nicht-polaren Gruppen und/oder Enzymen gegebenenfalls ohne Zwischenschalten von Brückengliedern verwendet werden können. Den auf diese Weise hergestellten erfindungsgemässen Enzympräparaten fehlt dann die mit der Verwendung von Brückengliedern verbundene Vernetzung. Häufig besitzen derartige Enzympräparate vorteilhafte Eigenschaften, wie nachstehend noch beschrieben wird.

Bei auf Maleinsäureanhydrid-Monomeren beruhenden Polymerisaten, wie beispielsweise den «Gantrez»-Polymerisa-ten, können die entlang der Hauptkette befindlichen Anhydridgruppen zur Bindung sowohl nicht-polarer Gruppen als auch der Enzyme verwendet werden. Zweckmässigerweise wird das Polymerisat zuerst durch Bindung nicht-polarer Gruppen modifiziert. Dann werden die restlichen Anhydridgruppen im Polymerisat unmittelbar mit dem Enzym gebunden. Dieses Verfahren ist im Schema II veranschaulicht:

Schema II

OCH,

i 5

CHo-CH-CH-CH-

2 I I C C

//\ /w

0 0 0

n

+ m RNH,

och,

I 3

■ch0-ch-ch-ch—

2 I !

hgpc c=0 i nhr m

OCH,

I 3

-ch0-ch»ch-ch«

2 1 l c c /A / W 0 0 0

x EW2-KH-

n-m h2o och,

I 5

ch--ch-ch-ch—

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h0oc c=0

2 i

NH I

en2

och,

I 3

ch«-ch-ch-ch—

2 I I

h02c c02h n-(m+x)

Bei diesem Schema II stellt der Rest R die vorgenannte nicht-polare Gruppe dar, während der Rest ENZ-NH2 ein eine Aminogruppe tragendes Enzym bedeutet.

«Gantrez»-Polymerisate, z. B. «Gantrez AN 119» und «Gantrez AN 149», haben weiterhin den Vorteil, dass sie sich ohne Reaktion in bestimmten aprotonischen, nicht-wässrigen Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid, lösen, die ebenfalls gute Lösungsmittel für die Amine RNH2 und R2NH sind. Ein homogenes Reaktionsgemisch ist möglich, und deshalb schaffen derartige Lösungsmittel vorteilhafte Reaktionsmedien für eine Verknüpfung der nicht-polaren Gruppen an diese Polymerisate, wenn die Enzympräparate vorliegender Erfindung hergestellt werden.

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Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden die Enzym-Polymerisat-Präparate vorliegender Erfindung durch Umsetzen eines Polymerisats mit Anhydridgruppen an der Hauptkette mit einem Amin der allgemeinen Formeln RNH2 60 oder R2NH in einem aprotonischen nicht-wässrigen polaren Lösungsmittel hergestellt, wobei R die nicht-polare Gruppe ist. Anschliessend wird das modifizierte Polymerisat an das Enzym gebunden.

Bevorzugt wird das Amin mit dem Polymerisat in Gegen-65 wart einer tertiären Base, z. B. Pyridin, umgesetzt. Der hier verwendete Ausdruck «tertiäre Base» bedeutet ein tertiäres Amin oder ein aromatisches heterocyclisches Amin.

Vorzugsweise ist das nicht-wässrige aprotonische Lösungs

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mittel N,N-Dimethylformamid oder die tertiäre Base selbst. Die Temperatur, bei der die Reaktion durchgeführt wird, hängt von der Identität des polymeren Trägerstoffes und des Amins ab. Im allgemeinen wird die Reaktion jedoch bei Temperaturen zwischen Raumtemperatur und 100 °C durchgeführt.

Der modifizierte polymere Trägerstoff kann auch aus dem Medium, in dem er hergestellt wird, durch Ausfällen mit einem weniger polaren Lösungsmittel, am zweckmässigsten Diäthyl-äther, oder durch Zugeben der Lösung zu Wasser, wenn ein Aufquellen und eine Anhydridhydrolyse auftritt, und durch Isolieren des hydrolysierten modifizierten Polymerisats aus dem wässrigen Medium unter Verwendung einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, oder durch Zentrifugieren isoliert werden.

Das Enzym wird dann an den vorstehend genannten isolierten modifizierten Trägerstoff durch In-Berührung-Bringen dieses modifizierten Trägerstoffes mit dem Enzym in wässriger Lösung, gegebenenfalls mit einem Kupplungsmittel, z. B. einem substituierten Carbodiimid, verknüpft. Gegebenenfalls kann das nicht hydrolysierte Reaktionsgemisch oder das nicht hydrolysierte modifizierte Polymerisat, das in einem geringen Volumen eines polaren nicht-wässrigen Lösungsmittels gelöst ist, unmittelbar zu einer wässrigen Lösung des Enzyms gegeben werden.

Gegebenenfalls kann das Kupplungsmittel dadurch erhalten werden, dass man zuerst den vorgenannten nicht hydrolysierten Trägerstoff durch Behandeln mit Hydrazinhydrat in Dimethylformamid-Lösung anpasst. Ein derartig angepasster Trägerstoff, der dann hydrolysiert und aus dem wässrigen Medium durch Zentrifugieren isoliert wird, kann mit dem Enzym in wässrigen Medien unter Verwendung von Natriumnitrit als Aktivator gekuppelt werden.

Weiterhin ist Gegenstand vorliegender Erfindung ein Verfahren zur Durchführung der enzymatischen Umsetzung,

wobei man in einem wässrigen Medium das zuvor beschriebene Enzympräparat mit einem Substrat für das Enzym in Berührung bringt, danach dieses Enzympräparat aus dem wässrigen Reaktionsgemisch mittels In-Berührung-Bringen mit einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit auftrennt, das Reaktionsprodukt aus der wässrigen Phase gewinnt und gegebenenfalls das abgetrennte Enzympräparat durch In-Berüh-rung-Bringen mit weiterem Substrat wiederverwendet.

Es können zahlreiche, mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeiten zur Abtrennung des Enzympräparats aus dem wässrigen Medium verwendet werden. Beispiele geeigneter Flüssigkeiten sind Alkane, wie Heptan, Octan, Nonan, Decan, Hexadecan, aromatische Kohlenwasserstoffe, höhere aliphatische Ester, wie Glycerin-trioleat, sowie aliphatische Alkohole mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie n-Decanol.

Bei der Berührung mit solch einer Flüssigkeit bildet das Enzympräparat eine Oberflächenschicht im dazwischen liegenden Berührungsbereich aus. Um einen möglichst grossen Berührungsbereich zu haben, wird bei dieser Berührungsstufe gewöhnlich eine Bewegung angewendet, z. B. durch Rühren oder Schütteln, um die mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit in kleinste Tröpfchen zu überführen. Jedes Tröpfchen wird dann von dem Enzympräparat umhüllt, das an der Oberfläche haftet

Diese Berührung des Enzympräparats mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit kann vor, während oder nach der Durchführung der enzymatischen Reaktion erfolgen. Vorzugsweise wird sie vor der enzymatischen Reaktion durch Disper-gieren mittels Bewegen des Enzympräparats mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit in einem das Substrat enthaltenden wässrigen Medium durchgeführt. Während der enzymatischen Reaktion wird somit das Präparat mit Tröpfchen der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, die als Emulsion in den wässrigen Medien vorliegt, assoziiert, und die Dispersion wird während der Reaktion mittels Bewegen aufrecht erhalten. Wenn eine Abtrennung des Enzympräparats gewünscht wird, unterbricht man das Bewegen und lässt die Phasen sich vereinigen.

Gegebenenfalls kann das Enzympräparat in dem wässrige!» Reaktionsgemisch als Lösung oder Suspension vorliegen und nach der Reaktion mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit in Berührung gebracht werden, wenn eine Abtrennung des Enzympräparats gewünscht wird.

Die Art der Assoziation des Enzympräparats zur mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit variiert je nach dem polymeren Material und/oder den in das Enzympräparat eingebrachten nicht-polaren Gruppen. Bei den Enzym-Polymerisat-Präparaten, die im wesentlichen vernetzt sind, bilden sich z. B. feste Aggregate aus, und diese Teilchen haften an den Tröpfchen der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit. Bei nicht-vernetzten Präparaten jedoch, wie sie sich mit den vorgenannten «Gan-trez»-Trägermaterialien bilden (und auch bei keine Polymerisate enthaltenden Präparaten), tritt gewöhnlich keine grosse Haftung von Feststoffen an die Tröpfchen auf, und es bildet sich auf den Tröpfchen eine monomolekulare Schicht des Enzympräparates aus. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn die Enzymreaktion nach dem ersten In-Berührung-Bringen des Enzympräparates mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, um ein solches System zu erzeugen, durchgeführt wird.

Was auch immer die Art der Assoziation betrifft, so befähigt die Berührung zwischen dem Enzympräparat und der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit (gewöhnlich in Form von Tröpfchen) die Abtrennung des Enzympräparats vom wässrigen Medium. Die mit dem Enzympräparat überzogenen Tröpfchen haben annähernd die gleiche Dichte wie diejenige der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit. Wenn man die Tröpfchen stehenlässt, so sammeln sie sich entweder an der Oberfläche des wässrigen Mediums (für Flüssigkeiten einer geringeren Dichte als Wasser) an oder sinken zu Boden (bei Flüssigkeiten mit höherer Dichte als Wasser). Somit wird eine gesonderte Schicht erzeugt, die aus der mit dem Enzympräparat vergesellschafteten mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit besteht, und die in einfacher Weise aus dem wässrigen Medium gewonnen werden kann.

Bei Flüssigkeiten, die auf den wässrigen Medien nicht rasch genug obenauf schwimmen oder sich davon absetzen, können andere Trennverfahren angewendet werden. Beispielsweise seien genannt Zentrifugieren oder das Filtrieren des Gemisches durch ein wasserabweisendes Filter, das das wässrige Medium durchlaufen lässt und die mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit (zusammen mit dem Enzympräparat) zurückbehält und dadurch abtrennt. Ein bevorzugtes enzymatisches Verfahren vorliegender Erfindung ist die Herstellung von 6-Aminope-nicillansäure aus Penicillin unter Verwendung eines Präparats, das auf dem Enzym Penicillin-Acylase basiert. In diesem Fall wird das Enzym-Acylase vorzugsweise aus Bakterien erhalten, z. B. Stämmen von Escherichia coli, wenn es zur Aufspaltung von Benzylpenicillin eingesetzt wird, oder Fungi von Actino myceten, wenn es zur Aufspaltung von Phenoxymethylpenicillin verwendet wird. Derartige Enzyme sind allgemein bekannt Sie werden zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure innere halb eines pH-Bereiches von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise von 7,0 bis 8,5, verwendet. Da die Desacylierung eines Penicillins zu einer Freisetzung einer freien Säure aus der Penicillin-Seitenkette führt, ist es erforderlich, den vorgenannten pH-Bereich während des Verfahrens zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch die Zugabe einer erforderlichen Menge Alkali, wie einer Lösung von Natrium- oder Ammoniumhydroxid oder Triäthylamin, aufrecht zu erhalten.

Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung der Enzympräparate vorliegender Erfindung besteht in der einfachen Anwendung auf ein kontinuierliches Verfahren einer enzymatischen

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Reaktion, die in einer Vorrichtung durchgeführt werden kann, die in der Zeichnung in Fig. 3 dargestellt ist, die ein schemati-sches Diagramm eines geeigneten Reaktionsgefässes zeigt.

Unter Bezugnahme auf Fig. 3 ist das Reaktionsgefäss 1 mit Mitteln zum Bewegen in Form eines Rührers 2, Einleitungsroh-ren 3,4 und 5 für Substrat, Alkali und die Enzymphase und einem Auslass 6 versehen. Das Reaktionsgefäss 1 enthält weiterhin eine Sonde 7 zur Feststellung des pH-Wertes, die ein Ventil 8 steuert, das in Verbindung mit dem Alkali-Einlassrohr 4 steht. Aus dem Auslass 6 wird das Reaktionsgemisch über die Pumpe 9 und das Einleitungsrohr 11 in ein gesondertes Gefäss 10 geleitet. Das Gefäss 10 hat einen oberen Auslass 12, der in Verbindung steht mit dem Einlassrohr 5 des Reaktionsgefässes, einen unteren Auslass 13, um das Reaktionsprodukt mittels einer Pumpe 14 zu entfernen, und ein Filter in Form einer Sinterglasplatte 15, die oberhalb des unteren Auslasses 13 angeordnet ist. Das Substrat wird durch das Einleitungsrohr 3 über eine Pumpe 16 geführt, die mit der gleichen Fliessgeschwindigkeit wie die Pumpe 14 betrieben wird und auch verbunden ist.

Bei der Arbeitsweise wird das Reaktionsgefäss 1 durch das Einleitungsrohr 3 mit dem Substrat in einem wässrigen Medium zusammen mit dem Enzympräparat vorliegender Erfindung und der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit beschickt. Das Gemisch wird mittels des Rührers 2 dispergiert, so dass eine Emulsion entsteht. Das Reaktionsgefäss 1 kann auf einer konstanten Temperatur gehalten werden, z. B. mittels eines (hier nicht gezeigten) Wassermantels, um das Reaktionsgefäss herum. Alkali wird der Emulsion in den Tank durch das Einleitunsrohr 4 zugegeben. Die Zuführgeschwindigkeit wird durch das Ventil 8 bestimmt, das durch die Sonde 7 gesteuert wird, so dass der pH-Wert des Reaktionsgemisches im erforderlichen pH-Bereich für eine bestmögliche Umsetzung gehalten wird. Im Verlauf der Reaktion wird die Pumpe 9 betrieben und das Gemisch aus dem Auslass 6 abgezogen und durch das Einleitungsrohr 11 in das getrennte Gefäss 10 überführt. Im Gefäss 10 bildet die mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit (in diesem Fall mit einer geringeren Dichte als Wasser) eine gesonderte obere Schicht 17, die das Enzympräparat mit enthält. Die untere wässrige Schicht 18 mit dem Gehalt an dem Reaktionsprodukt wird durch das Filter 15 und danach durch den Auslass 13 mittels der Pumpe 14 abgezogen. Die obere Schicht 17 mit einem Gehalt an dem Enzympräparat assoziiert mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit wird durch den Auslass 12 fliessen gelassen und kehrt somit durch das Einleitungsrohr 5 in das Reaktionsgefäss 1 zurück. In dem Masse, wie das Produkt durch den Auslass 13 abgezogen wird, wird weitere Substratlösung dem Reaktionsgefäss 1 durch das Einleitungsrohr 3 mittels der Pumpe 16 zugeführt. Die Pumpen 14 und 16 sind koordiniert, so dass die Einleitungsgeschwindigkeit des Substrats gleich der Ausflussgeschwindigkeit des Produkts ist.

Die Fliessgeschwindigkeiten, die Verweilzeit im Reaktionsgefäss und andere Parameter der Reaktion hängen von den betreffenden einzelnen Enzympräparat-Substrat-Systemen ab. Aus Vorversuchen war ersichtlich, dass ein 10 000-Liter-Reak-tionsgefäss unter Verwendung von 1000 kg eines Enzympräparats auf Basis von einer an «Gantrez AN 149»-Trägerstoff gebundenen Penicillin-Acylase täglich etwa 2000 kg Penicillin G in einer Konzentration von 5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen, bei 22 °C und einem pH-Wert von 7,8 liefern konnte, obwohl dieser Zahlenwert mit Enzympräparaten höherer spezifischer Aktivität verbessert werden konnte.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Bei diesen Beispielen werden die folgenden Abkürzungen zur Bezeichnung der Polymerisate und modifizierten Polymerisate, der Enzyme, der Brückenglieder, der nicht-polaren Gruppen und der Verbindungssubstanzen angewendet:

624431

Enzyme:

L: Lipase PA: Penicillin-Acylase T: Trypsin

Trägerstoffe:

F: «Ficoll»

GAN: «Gantrez»

SR: «Sepharose»

T2000: «Dextran T.2000»

Enzym und Trägerstoff verknüpfende Gruppe: HD: 1,6-Diaminohexan nicht polare Gruppen:

D: n-Decylaminogruppe DD: n-Dodecylaminogruppe OD: n-Octadecylaminogruppe

Verbindungssubstanzen und Aktivierungsmittel und aktivierte Gruppen:

CMC: l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl>carbodiimidme-

thano-p-toluolsulfonat G: Glutaraldehyd A: Hydrazid

Die Zahl hinter der Bezeichnung gibt die Ansatznummer wieder.

Beispielsweise wird das Enzympräparat des Beispiels 1 mit PAFHDDG bezeichnet. Das Enzym ist demnach die Penicillin-Acylase (PA). Der Trägerstoff ist «Ficoll» (F), der Hexamethy-lendiamingruppen (HD) zur Verknüpfung des Enzyms und weiterhin Decylgruppen (D) als nicht polare Gruppen trägt. Die Verknüpfung zwischen der freien Aminogruppe des Hexame-thylendiaminrestes und des Enzyms wird unter Verwendung von Glutaraldehyd (G) durchgeführt.

Des weiteren bezeichnet «CAN 149 HDOD» einen modifizierten Trägerstoff, der aus einem mit 1,6-Diaminohexan und Octadecylamin modifizierten «Gantrez 149» hergestellt worden ist, und die Bezeichnung «PAGAN 149 HDOD-G» den vorgenannten modifizierten Trägerstoff, an den in Gegenwart von Glutaraldehyd Penicillin-Acylase geküpft ist.

Beispiel 1

a) n-Decylamino-(6-aminohexylamino)-Ficoll (FHDD-1)

5 g «Ficoll» werden in 300 ml Wasser gelöst und auf einen pH-Wert von 11,0 eingestellt. Dann wird 1 g Cyanbromid zugegeben. Während der Reaktion wird der pH-Wert mittels 2-n Natronlauge aufrecht erhalten. Die Reaktion ist nach 20 Minuten bei Raumtemperatur beendet, und es werden 4 g n-Decyl-amin und 0,5 g 1,6-Diaminohexan, das in 10 ml Methanol gelöst ist, zugegeben. Der pH-Wert wird mittels 2-n Salzsäure auf 9,5 eingestellt. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 4 °C gerührt. Die erhaltene kolloidale Lösung wird bei 22 000 g/Stunde zentrifu-giert. Man erhält ein weisses Sediment (35 g Feuchtgewicht), das aufgehoben wird. Die trübe überstehende Flüssigkeit wird verworfen.

b)

PeniciIlin-Acylase-[n-decylamino-(6-aminohexylamino)-Ficoll] (PAFHDDG-1)

21,6 g FHDD-1 (Feuchtgewicht) werden mit 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 vermischt. Der pH-Wert wird mit 2-n Salzsäure auf 6,2 eingestellt. Dann wird eine Lösung von Escherichia coli-Penicillin-Acylase (50 ml, 340 mg teilweise gereinigtes Protein) auf pH 6,2 bei 0 °C eingestellt und mit 5 ml einer 25gewichtsprozentigen wässrigen Lösung von Glutaraldehyd versetzt. Nach 30minütigem Rüh7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

624431

8

ren bei 0 °C wird die FHDD-l-Suspension zugegeben. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 0 °C und dann 4 Stunden bei 4 °C gerührt und dann 16 Stunden bei -20 °C eingefroren. Nach dem Auftauen wird die Suspension 45 Minuten bei 4 °C mit 20 000 g zentrifugiert. Man erhält ein braunes gelartiges Sedi- 5 ment. Das Gel wird in 30 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert und dann 30 Minuten bei 4 °C bei 20 000 g zentrifugiert. Die überstehenden Lösungen werden vereinigt, und das braune Sediment (Feuchtgewicht an etwa 6,3 g) wird in 0,1 -m Natriumphosphat-Pufferlösung vom i o pH 7,0 suspendiert und dann bei 4 °C gelagert. Die Sediment- * Suspension schwimmt, wenn sie schliesslich mit dem gleichen Gewicht n-Decanol vermischt wird, zusammen mit dem Deca-nol auf der Oberfläche der wässrigen Lösungen, wobei diese darunter schwimmenden Lösungen frei von den Enzymteilchen is sind. Die Enzymaktivität des Sediments, der überstehenden Lösung und des gelagerten Enzyms sind in Tabelle I angegeben. Annähernd 43% der ursprünglichen Enzymaktivität werden wiedergewonnen und tatsächlich alles in der Verbindung.

20

Die Aktivität des Komplexes kann im wesentlichen aus den . Penicillinlösungen entweder durch Aufschwimmen oder übliches Zentrifugieren wiedergewonnen werden.

Tabelle I

Penicillin-Acylase-Aktivität von PAFHDDG-1

Versuchsverlauf: Das Natriumsalz des Penicillins G wird in einer geeigneten Konzentration in 20 ml 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,8 bei 37 °C gelöst. Dann wird die Enzymprobe zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,1-n oder 0,5-n Natronlauge aufrecht erhalten. Die Aktivität wird ausgedrückt als Anfangsgeschwindigkeit der 6-Aminope-nicillansäure-Erzeugung. Beim Wiederholungsversuch 1 werden 2 ml n-Decanol zu dem gerührten Reaktionsgemisch gegeben. Nach der Bestimmung lässt man die Suspension sich in zwei Schichten trennen. Die obere Schicht wird mit einem Spritzgerät entfernt und wiederverwendet. Beim Wiederholungsversuch 2 wird die Endsuspension 15 Minuten bei 2000 g zentrifugiert und das Sediment wiederverwendet.

Tabelle I

Material Menge Gewichts- Anfangsgeschwindigkeit prozent der 6-APS-Erzeugung Penicillin Mole/min • 10-4 G im Versuch

Ausgangsenzym

1 ml

5

0,885

PAFHDDG-1

1 ml

5

0,008

Überstehendes

PAFHDDG-1

0,5 g

5

1,500

PAFHDDG-1

1.

0,5 g

5

0,860

(Wiederholungen)

Verfahren 1:

2.

0,5 g

5

0,550

3.

0,5 g

5

0,500

Verfahren 2:

1.

0,5 g

5

1,300

2.

0,5 g

5

1,210

3.

0,5 g

5

1,110

4.

0,5 g

5

1,030

Beispiel 2 7,0 suspendiert und dann bei 4 °C gelagert. Die Suspension wird a) n-Octadecylamino-(6-aminohexylamino)-Ficoll (FODHD-1) 45 mittels n-Decanol wirksam aufschwimmen gelassen. Die Aktivi-

5 g «Ficoll» werden in 300 ml Wasser gelöst. Die Lösung tät ist in Tabelle II angegeben. Die Wiedergewinnung der Akti-wird mit 1 g Cyanbromid bei pH 11,0 wie vorstehend beschrie- vität beträgt annähernd 60 %.

ben behandelt. Nach 20 Minuten wird die Lösung mit 2-n Salzsäure auf pH 10,0 eingestellt. Dann wird die Lösung mit 5 g n-Octadecylamin und 0,5 g 1,6-Diaminohexan in 20 ml Metha- 50 Tabellen noi versetzt. Der pH-Wert wird mittels 2-n Salzsäure wieder auf pH 10,0 eingestellt. Das Gemisch wird 72 Stunden bei 4 °C Aktivität des PAFODHDG-1

gerührt. Das Produkt wird 45 Minuten bei 4 °C bei 20 000 g zentrifugiert. Es bilden sich ein freies weisses Sediment (25 ml) und eine klare überstehende Lösung mit einem oberflächlichen Schaum (Octadecylamin).

b) PenicilIin-Acylase-[n-octadecylamino-(6-aminohexylamino)-Ficoll] (PAFODHDG-1)

25 ml Penicillin-Acylase (170 mg Protein) werden bei Raumtemperatur auf einen pH 6,2 eingestellt und dann mit 2,5 ml einer 25prozentigen Lösung von Glutaraldehyd versetzt. Das Gemisch wird 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann werden 10 ml FODHD-1 zugegeben. Die Suspension wird mittels 2-n Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,2 eingestellt. Nach 3stündigem Rühren bei 4 °C wird das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei 4 °C mit 20 000 g zentrifugiert. Das rosafarbene Sediment wird in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH

Versuchsverlauf: wie bei Tabelle I angegeben. Es werden insgesamt 5 Gewichtsprozent Penicillin G, bezogen auf das 55 Volumen, eingesetzt.

Material

Menge Anfangsgeschwindigkeit der 6-APS-Erzeugung Mole/min-10~4

b5

Ausgangsenzym 1 ml 0,885

PAFODHDG-1 0,5 g 0,940 Wiederholungen

(Verfahren 2) 1. 0.5 g 0,800

2. 0,5 g 0,585

Beispiel 3

a) n-Decylamino-(6-aminohexylamino)-Dextran T2000) (T2000HDD-1)

10 g Dextran vom mittleren Molekulargewicht 2 000 000 werden in 800 ml Wasser gelöst und wie zuvor beschrieben mit 2,5 g Cyanbromid aktiviert. Nach 20 Minuten werden 5 g n-Decylamin und 1,0 g 1,6-Diaminohexan zugegeben. Der pH-Wert wird auf 10,0 eingestellt. Die Lösung wird 16 Stunden bei 4 °C gerührt und dann 90 Minuten bei 4 °C mit 20 000 g zentrifugiert. Das gebildete Sediment wird in 100 ml 0,1-n Salzsäure nochmals suspendiert und 1 Stunde bei 20 000 g zentrifugiert. Das zweite Sediment (50 g Feuchtgewicht) wird aufbewahrt.

b) Penicillin-Acylase-[n-decylamino-(6-aminohexylamino)-Dex-tran T2000] (PAT2000HDDG-1)

10 gT2000HDD-l (Feuchtgewicht) werden in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 homogenisiert. Die Suspension wird auf pH 6,2 eingestellt. Dann werden 50 ml Penicillin-Acylase (340 mg Protein) auf pH 6,2 eingestellt und mit 5 ml einer 25gewichtsprozentigen Glutaraldehydlösung versetzt. Die Lösung wird 45 Minuten bei 4 °C gerührt und dann mit T2000HDD versetzt. Das Gemisch wird weitere 30 Minuten bei 4 °C gerührt und dann 16 Stunden bei -20 °C gelagert. Nach dem Auftauen wird die Suspension 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann 30 Minuten bei 22 °C mit 6000 g zentrifugiert. Das Überstehende wird aufbewahrt, und das Sediment wird in 75 ml 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert und homogenisiert. Dann wird wie zuvor beschrieben zentrifugiert, dann wiederum suspendiert und nochmals zentrifugiert. Man erhält 8,0 g eines braunen Sediments (Feuchtgewicht), das wirksam durch n-Decanol und weniger wirksam durch n-Heptan aufschwimmen gelassen wird. Die Aktivität dieses Präparats ist in Tabelle III angegeben. Annähernd 10 % der ursprünglichen Enzymaktivität liegen in der Verbindung vor.

Tabelle III Aktivität von PAT2000HDDG-1 Versuchsanordnung: wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 5 Gewichtsprozent Penicillin G, bezogen auf das Volumen.

Material

Menge

Anfangsgeschwindigkeit der

6-APS-Erzeugung Mole/min-10-4

Ausgangsenzym

1 ml

0,875

PAT2000HDDG-1

1 ml

0,022

Überstehendes

PAT2000HDDG-1

0,5 g

0,270

Wiederholungen

0,5 g

0,155

(Verfahren 2)

Beispiel 4

a) n-Decylamino-(6-aminohexylamino)-Sepharose 4B (SRHDD-1)

2 g einer mit Cyanbromid aktivierten «Sepharose 4B» (Trockengewicht) werden 15 Minuten bei 4 °C in 50 ml einer 10-3-n Salzsäure angequollen und dann auf einem Sinterglas 2 mal mit je 100 ml 10~3-n Salzsäure gewaschen. Das Gel wird zu 20 ml einer 0,1-m Natriumbicarbonatlösung, 5 ml Äthanol, 0,5 g n-Decylamin und 0,1 g 1,6-Diaminohexan gegeben. Das Gemisch wird langsam 16 Stunden bei 4 °C gerührt und dann an einer Glasfritte filtriert. Das Gel wird unter Absaugen 4 mal mit je 20 ml 10~3-n Salzsäure, 4 mal mit je 20 ml Äthanol und 4 mal mit je 50 ml Wasser gewaschen und dann in Wasser suspendiert und bei 4 °C gelagert.

624431

b) Penicillin-Acylase-[n-decylamino-(6-aminohexylamino)-Sepharose4B](PASRHDDG-l)

1,5 g trockengesaugtes Gel von SRHDD-1 werden in 5 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 suspendiert und dann mit 0,5 ml einer 25gewichtsprozentigen Glutaraldehydlösung, bezogen auf das Volumen, versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann auf einer Glasfritte trockengesaugt. Das Gel wird dann zu einem Gemisch von 2 ml Penicillin-Acylase (13,6 mg) und 3 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 gegeben. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4 °C gerührt, trockengesaugt und auf der Glasfritte 5 mal mit je 20 ml einer 0,1-m Natri-umphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 gewaschen. Dann wird das Produkt in 5 ml der gleichen Pufferlösung suspendiert. Die erhaltenen Perlchen werden mit n-Decanol aufschwimmen gelassen, im Gegensatz zur nicht modifizierten «Sepharose», die sich aus wässrigen Suspensionen mit einem Gehalt an n-Decanol absetzt. Die Aktivität dieses Präparats ist in Tabelle IV angegeben. Annähernd 72% der ursprünglichen Aktivität sind in der Verbindung vorhanden.

Tabelle IV

Penicillin-Acylase-Aktivität von PASRHDDG-1 Versuchsanordnung: wie in Beispiel 1, unter Verwendung von 5 Gewichtsprozent Penicillin G, bezogen auf das Volumen

Material

Menge

Anfangsgeschwindigkeit der

6-APS-Erzeugung Mole/min* 10-4

Ausgangsenzym

1 ml

0,885

PASRHDDG-1

2 ml

0,505

Wiederholungen

Verfahren 2.

1.

2 ml

0,410

2.

2 ml

0,375

Verfahren 1.

3.

2 ml

0,270

Beispiel 5

n-Decylaminogiutaral-Penicillin-Acylase (PADDG-1 )

40 ml Penicillin-Acylase (272 mg) werden auf pH 6,2 eingestellt und dann mit 4 ml einer 25gewichtsprozentigen Glutaraldehydlösung, bezogen auf das Volumen, versetzt. Nach 20minü-tigem Rühren bei 0 °C werden 6 ml n-Decanol und 0,6 ml n-Decylamin zugegeben. Das Gemisch wird weitere 6 Stunden bei 0 °C und dann 1 Stunde bei Raumtemperatur lebhaft gerührt. Dann wird das Gemisch 10 Minuten bei 22 °C mit 2000 g zentrifugiert. Man erhält 30 ml einer in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendierten braunen überstehenden Lösung, die entfernt und gelagert wird. Das Material schwimmt spontan an die Oberfläche wässriger Suspensionen auf, doch ist es etwas weniger dispergierbar als die Polymerisatverbindungen und neigt auch zur Bildung grösserer Aggregate. 1 ml der Suspension zeigt, entsprechend der Bestimmung nach Beispiel 1, eine Aktivität von 0,49 • 10-4 Mol/ Minute, was eine 42prozentige Retention der Acylase-Aktivität in der Verbindung anzeigt.

Beispiel 6

Trypsin-[n-octadecylamino-(6-aminohexylamino>Ficoll] (TFODHDG-1)

50 mg salzfreies Trypsin werden bei 0 °C in 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 gelöst. Dann wird 1 ml einer 25gewichtsprozentigen Lösung von Glutaraldehyd, bezogen auf das Volumen, zugegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten bei 0 °C gerührt. Dann werden 10 ml FODHD-1, hergestellt nach Beispiel 2a), zugegeben, und die Lösung wird mittels 2-n Salzsäure auf einen pH von 6,2 eingestellt. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 4 °C gerührt und dann 30 Minu9

5

!0

15

20

t

25

30

35

40

45

53

h"

6:5

624431

10

ten bei 4 °C mit 20 000 g zentrifugiert. Das Sediment wird in 20 ml Wasser suspendiert und unter Verwendung eines «What-man IPS»-Phasentrennpapiers filtriert. Der Rückstand wird in 20 ml einer 10-3-m Salzsäure suspendiert und nochmals filtriert. Dann wird 2 mal eine nochmalige Suspension mit 10_3-m Salzsäure und 20minütiges Zentrifugieren bei 14 °C mit 10 000 g durchgeführt. Man erhält 2,65 g eines braunen Gels. Dieses Material schwimmt sowohl mit n-Decanol als auch mit n-Hep-tan auf. Die Aktivität der Verbindung ist in Fig. 1 angegeben. Die Versuchsanordnung war wie folgt:

N-a-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid wird in 5 ml Dimethyl-formamid gelöst und mit 45 ml einer 0,05-m Tris-Pufferlösung vom pH 8,3 mit einem Gehalt von 10 mMol CaCk versetzt. Man erhält eine 2- 10_3-m-Lösung eines chromogenen Substrats. Dann werden 5 ml Heptan zugegeben. Das Gemisch wird bei 22 °C kräftig gerührt. Das Enzymgemisch wird zugesetzt, und 5 ml aliquote Anteile des Gemischs werden in bestimmten Zeitintervallen entnommen. Beim kurzzeitigen Stehenlassen oder schwachen Zentrifugieren trennt sich die Heptanschicht unter Mitnahme von TFODHDG-1 ab. Man entfernt die untere wässrige Phase und misst ihre optische Dichte in einer Schichtdicke von 1 cm und bei 400 nm, um das freigesetzte p-Nitroanilid zu bestimmen. Heptan-Tröpfchen liefern einen bemerkenswerten Absorptions-Blindwert. In einigen Fällen wird die untere Schicht verdünnt, um die Absorptionsablesungen zu erleichtern. Nach der Ablesung werden sowohl die Heptan- als auch die wässrigen Schichten dem gerührten Reaktionsgemisch zugegeben. Die durch die Verbindung beibehaltene Gesamtaktivität beträgt 17 % der ursprünglichen amidolytischen Aktivität.

Figur 1 gibt die Freisetzung von p-Nitroanilin aus N-a-Ben-zoyl-DL-arginin-p-nitroanilid wieder: A) Trypsin (1 mg). B) Trypsin-KomplexTFODHG-1 (0,1 g) gemäss Beispiel 6.

Beispiel 7

Lipase-[n-decylamino-(6-aminohexylamino)-DextranT2000] (LT2000HDDG-1)

200 mg Lipase von Candida cylindracea werden in 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 gelöst. Die Lösung wird auf pH 6,2 eingestellt und dann mit 2 ml einer 23gewichtsprozentigen Glutaraldehydlösung, bezogen auf das Volumen, versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird aus einer Suspension mittels Äthanol T2000HDD-1 (vgl. Beispiel 3) ausgefällt und die Ausfällung in Wasser aufgequollen. 10 g des erhaltenen Gels werden in 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 homogenisiert und mit dem Enzym-Glutaraldehyd-Gemisch versetzt. Der pH-Wert wird auf 6,2 eingestellt. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 4 °C gerührt. Dann wird die Suspension 30 Minuten bei 4 °C mit 20 000 g zentrifugiert. Das Sediment wird in 50 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert und dann nochmals zentrifugiert. Das Verfahren wird zwei weitere Male wiederholt. Das endgültige Sediment mit einem Feuchtgewicht von 8,4 g wird in 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert. Die Suspension ist sowohl mit n-Decanol als auch mit n-Heptan flo-tierbar. Die Aktivität der Verbindung ist in Fig. 2 gezeigt. Die Versuchsanordnung war wie folgt:

5 ml p-Nitrophenyl-laurat (10~2-m in n-Heptan) werden bei Raumtemperatur mit 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Puf-ferlösung vom pH 8,0 rasch verrührt. Unter diesen Bedingungen ist über 1 Stunde und mehr keine nicht enzymatische Esterhydrolyse feststellbar. Nach der Zugabe des Enzyms werden 5 ml aliquote Anteile in bestimmten Zeitintervallen entnommen, die 90 Sekunden mit 4000 g zentrifugiert werden. Die untere (wässrige) Schicht wird entfernt. Genau 3 Minuten nach dem Entfernen des ursprünglichen aliquoten Anteils wird die optische Dichte in einer Schichtdicke von 1 cm und bei 400 nm bestimmt. Die wässrigen und Heptan-Schichten werden dann zu dem gerührten Gemisch gegeben (da das Substrat bei diesem Versuch in einer nicht wässrigen Phase vorliegt, muss die Rührgeschwindigkeit, d. h. das Ausmass der Dispersion, wäh-5 rend des Versuchs konstant gehalten werden).

Annähernd 1 % der ursprünglichen Lipase-Aktivität liegt in der Verbindung vor.

Fig. 2 gibt die Freisetzung von p-Nitrophenyllaureat wieder, katalysiert durch: A) Lipase (0,1 g) B) Lipase-Komplex LT2000 io HDDG-1 (420 mg) gemäss Beispiel 7.

Beispiel 8

a) GAN149HDOD-1

1 g n-Octadecylamin und 0,2 g 1,6-Diaminohexan werden in 15 10 ml Methanol suspendiert und mit 200 ml einer 0,2-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 8,0 mit einem Gehalt von 40 ml Methanol versetzt. Dann werden unter lebhaftem Rühren und in kleinen Anteilen 2 g «Gantrez 149» zugegeben. Das Gemisch wird 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und 20 dann 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 12 000 g zentrifugiert Schaum und überstehende Lösung werden verworfen. Das Sediment wird in 100 ml 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert und wie vorstehend angegeben nochmals zentrifugiert. Das gelähnliche Sediment (80 g) wird bei 25 4 °C gelagert.

b) PAG AN 149HDOD-1 -G

20 ml einer Penicillin-Acylase-Lösung (1,36-10~7 Einheiten; 136 mg Protein) werden auf pH 6,2 eingestellt und dann mit 2 ml einer 25gewichtsprozentigen wässrigen Glutaraldehydlö-3o sung, bezogen auf das Volumen, versetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 10 g einer Suspension von GAN149HDOD-1 in 12 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 versetzt. Der pH-Wert wird auf 6,2 gehalten und das Rühren 2 Stunden bei Raumtemperatur fort-35 gesetzt. Die Suspension wird 1 Stunde bei 4 °C mit 20 000 g zentrifugiert. Man erhält ein Sediment von 14 g. Das Sediment wird in 10 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert und wiederholt zentrifugiert. Das endgültige Sediment wird bei 4 °C gelagert.

4o Spezifische Aktivität: 3 • 10~5 Mol 6-APS min"1 (5 % Penicillin G, pH 7,8,22 °C);

Wiedergewonnene Aktivität: 21 %. Flotierbar mit n-Decanol oder n-Decan.

45 Beispiel 9

a) GAN 149HDOD-2

5 g n-Octadecylamin werden in 50 ml Äthanol gelöst und zu 1 Liter einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 9,0 mit einem Gehalt von 200 ml Äthanol gegeben. Dann werden m 5 g «Gantrez 149» in kleinen Anteilen während 45 Minuten unter Rühren zugegeben. Mittels 2-n Natronlauge wird der pH-Wert zwischen 8 und 9 aufrecht erhalten. Nach der Zugabe von «Gantrez 149» werden 5 g 1,6-Diaminohexan zugesetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. 55 Der pH-Wert wird dann mittels konzentrierter Salzsäure auf 3,0 herabgesetzt, und die Suspension wird 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 12 000 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird verworfen. Das Sediment wird in 550 ml Wasser suspendiert und nochmals zentrifugiert. Man erhält schliesslich bo ein weisses Sediment von 150 g, das bei 4 °C gelagert wird.

b) PAGAN149HDOD-2-G

100 ml einer Penicillin-Acylase-Lösung (9,8 • 106 Einheiten, 88 mg Protein) werden mit 15 g GAN149HDOD-2,20 ml einer 65 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 und 1 ml einer 2gewichtsprozentigen Natriumazidlösung, bezogen auf das Volumen, gemischt. Das Gemisch wird kurzzeitig bei 0 °C homogenisiert und dann für 4,5 Stunden bei 0 °C auf einem pH .

6,8 eingestellt und schliesslich 1 Stunde bei 4 °C mit 20 000 g zentrifugiert. Das Sediment wird in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert und nochmals zentrifugiert. Diese Arbeitsweisen werden wiederholt. Man erhält ein endgültiges Sediment vom Gewicht 1 1,2 g, das bei 4 °C gelagert wird.

Spezifische Aktivität: Î,B-10-5 Mole 6-APS-min-1 -g"1.

Wiedergewonnene Aktivität: 55 %. Flotierbar mit n-Decanol oder n-Decan.

Beispiel 10

T rypsin-(n-decylamino-Gantrez AN 119) (TG AN 119D)

1 g «Gantrez AN 119» wird unter kräftigem Rühren in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Dann werden 0,3 g n-Decylamin in 1 ml Dimethylformamid zugegeben. Die Lösung wird viskoser. Nach lOminütigem Rühren wird die Lösung zu 300 ml einer Lösung von Rindertrypsin in 60 ml einer 0,1-m Natriumphos-phat-Pufferlösung vom pH 8,0 bei 22 °C zugetropft. Der pH-Wert wird mittels 2-n Natriumhydroxidlösung aufrecht erhalten. Wenn keine weitere Änderung auftritt, werden 4 g Natriumchlorid zugegeben. Die erhaltene Suspension wird in 175 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,6 gegossen und das Gemisch auf 4 °C gekühlt. Dann werden 50 g Ammoniumsulfat zugegeben. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 4 °C gerührt, dann 1 Stunde bei 4 °C mit 25 000 g zentrifugiert und das gelähnliche Sediment in 30 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,6 homogenisiert. Das Zentrifugieren wird wiederholt mit anschliessendem zweimaligen Homogenisieren und Zentrifugieren, so dass man schliesslich ein lockeres Gel von 7,5 g erhält. Die Herstellung wird spektrophotometrisch unter Verwendung von 2 mMol N-Ben-zoyl-L-arginin-p-nitroanilid in einer 0,1-m Veronal-Pufferlö-sung vom pH 8,3 bei 22 °C untersucht. Eine Einheit ist ein Anstieg bei der optischen Dichte von 0,001 je Minute bei 400 nm. Da das Gel eine bemerkenswerte Lichtstreuung verursacht, ist es erforderlich, die Cuvette (1 cm Weglänge) intermittierend zu schütteln.

Gelaktivität: 168 Einheiten/mg Feuchtgewicht, 2000 Einhei-tçn/mg Trockengewicht (lyophilisiertes Gel).

Wiedergewonnene Aktivität: 24,2 %.

Die Immobilisierung der Enzymverbindung auf den Lösungsmitteltröpfchen wird durch folgenden Versuch veranschaulicht:

1 g des Gels (Feuchtgewicht) wird in einer kleinen Gewebemahlvorrichtung mit 2,5 ml n-Decan und 10 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 8,0 5 Minuten bei 0 °C mit 4000 UpM homogenisiert. Die milchige Suspension teilt sich in eine obere Schicht aus dichtgepackten Decantröpfchen und eine untere wässrige Schicht innerhalb von 3 Stunden bei 0 °C auf. Beide Schichten werden unter Anwendung der vorgenannten spektrophotometrischen Methode untersucht. Wieder wird die Cuvette in regelmässigen Zeitabständen geschüttelt, wenn die obere Schicht untersucht und die Durchschnittsgeschwindigkeit des Anwachsens der optischen Dichte gemessen wird.

Aktivität der oberen Phase: 2280 Einheiten/ml;

Aktivität der unteren Phase: 57 Einheiten/ml.

Da die scheinbare Aktivität der oberen Phase wahrscheinlich viel geringer als die wirkliche Aktivität infolge der angewendeten Methode ist, zeigt das Ergebnis an, dass mindestens 90 % der Trypsin-Aktivität mit den Lösungsmitteltröpfchen vergesellschaftet sind.

Beispiel 11

Penicillin-Acylase-(n-octadecylamino-Gantrez AN 119) (PAGANI 190D)

0,5 g «Gantrez AN 119» werden in 2,5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf dem Wasserbad auf 80 °C

624431

erwärmt. Dann werden 0,28 g Octadecylamin in 2,5 ml Dimethylformamid bei 80 °C gelöst und rasch zu der «Gantrez»-Lösung gegeben, während sie noch warm ist. Das Gemisch wird gerührt und mit 0,1 ml Pyridin versetzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur innerhalb 1 Stunde wird die Gesamtlösung zu 175 mg Penicillin-Acylase in 30 ml Wasser bei pH 7,0 gegeben und kurz bei 0 °C homogenisiert.

Die rosafarbene Mischung wird dann 3 Stunden bei 0 °C gerührt. Der pH-Wert wird 16 Stunden bei 4 °C aufrecht erhalten. Dann werden 5,8 g Natriumchlorid in der Suspension gelöst. Das Gemisch wird danach 1 Stunde bei 0 °C mit 25 000 g zentrifugiert. Das erhaltene rosafarbene Sediment wiegt 4,0 g und wird in 20 ml 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 wiederum suspendiert.

Unter Verwendung von 5 Gewichtsprozent Penicillin G, bezogen auf das Volumen, in 20 ml einer 0,02-m Natriumphos-phat-Pufferlösung vom pH 7,8 bei 25 °C besitzt die Suspension eine spezifische Aktivität von 4,0- x 10~5 Mol/min/ml. Dies bedeutet annähernd 70 % wiedergewonnene Aktivität in der Verbindung. Die vorgenannte Suspension (4,0 ml) wird mit 20 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung und mit 5 ml n-Decanol vermischt und dann 5 Minuten bei 0 °C mit etwa 4000 UpM homogenisiert. Dann wird die Emulsion 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 g zentrifugiert und in eine obere organische Emulsion und in eine untere wässrige Schicht aufgetrennt. Die untere Schicht wird beibehalten und die obere wird wiederum in 20 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung suspendiert und nochmals zentrifugiert. Die ursprüngliche untere Schicht enthält eine Gesamtaktivität von 1,25-10~5 Mol/min und die gewaschene obere Schicht eine solche von 9,5-10-5 Mol/min. Das Verhältnis der spezifischen Aktivitäten (auf das Volumen bezogen) beträgt 21,6 (obere zu unterer Schicht). Nach der Aktivitätsbestimmung nach dem vorgenannten Verfahren wird die organische Schicht durch schwaches Zentrifugieren rückgeführt. Das Entfernen der wässrigen Schicht ist in Tabelle V gezeigt.

Tabelle V

Prozentuale ursprüngliche Aktivität der PAGANI 190D-n-Decanol-Phase auf die nachfolgenden Flotations-Wiederverwendungszyklen

Zyklus Nr.

% Aktivität

Zyklus Nr.

% Aktivität

1

80

7

46

2

86

8

46

3

93

9

44

4

73

10

42

5

64

11

45

6

47

12

43

Beispiel 12

Penicillin-Acylase-(n-Dodecylamino-Gantrez AN 119) (PAGANI 19DD)

0,25 g n-Dodecylamino-Gantrez AN 119 werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und zu einer Lösung von Penicillin-Acylase gegeben ( 100 mg in 14 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0).

Nach einer kurzzeitigen Homogenisierung bei 0 °C wird die Suspension 16 Stunden bei 4 °C gerührt. Dann werden 7,8 g Ammoniumsulfat bei 4 °C zu der nunmehr homogenen Lösung gegeben. Der pH-Wert wird mit 1-m Natriumcarbonatlösung auf 7,0 gehalten. Nach dem Lösen des Ammoniumsulfats bildet sich eine trübe Suspension. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 0 °C mit 25 000 g zentrifugiert. Das Sediment wird in einer Lösung von 7,8 g Ammoniumsulfat in 30 ml Wasser nochmals suspendiert und dann bei pH 7,0 nochmals zentrifugiert. Das endgültige Sediment wiegt 1,36 g und wir din 10 ml Wasser nochmals

11

5

;o r>

20

25

30

35

40

45

t"

b >

624431

12

gelöst. Man erhält eine viskose Lösung. Die Aktivität des Sediments (Versuch wie zuvor) beträgt 1,62> 10~4 Mol/min/g (Feuchtgewicht), was einer 80prozentigen wiedergewonnenen Aktivität entspricht. Die Immobilisierung der wasserlöslichen Verbindung an n-Decanol-Tröpfchen wird durch den folgenden 5 Versuch veranschaulicht:

1 ml der vorgenannten Lösung wird in 20 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung gelöst und 3 Minuten bei 0 °C mit 10 ml n-Decanol bei 4000 UpM homogenisiert. Die Emulsion trennt sich nach lOminütigem Zentrifugieren mit 300 g in 10 zwei Schichten auf. Die obere Schicht hat eine Gesamtaktivität von 1,14* 10-5 Mol/min. Die Aktivität bei den anschliessenden Zyklen ist in Tabelle VI gezeigt.

Bei einem zweiten Versuch werden 2 ml der Lösung der Enzymverbindung unter den gleichen Bedingungen mit 2,5 ml 15 n-Decanol und 10 ml 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren und Waschen mit 20 ml der gleichen Pufferlösung besitzt die obere Schicht eine Aktivität von 1,8 • 10-5 Mol/min und die ursprüngliche untere Schicht eine Aktivität von 8,0 • 10-6 Mol/min. Das Verhältnis 20 der spezifischen Aktivität (obere zu unterer Schicht, bezogen auf das Volumen) ist etwa 7,5.

Tabelle VI Prozentuale ursprüngliche Aktivität der PAGAN119DD-n-Decanol-Phase auf die anschliessenden Flotations-Wiederverwendungszyklen Wiederverwendungszyklen

Zyklus Nr.

% Aktivität

1

96

2

66

3

66

4

53

25

30

35

Beispiel 13 40

Trypsin-(hydrolysiertes n-Octadecylamino-Gantrez AN 149) (TGAN149DCMC)

15 g eines angequollenen Polymerisatgels wird mit 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 vermischt. Der pH-Wert wird mit 2-n Salzsäure auf 4,7 eingestellt. Dann wer- 45 den 0,5 g l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (CMC) zugegeben. Der pH-Wert wird mittels 2-n HCl auf 4,7 gehalten. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur werden 75 mg Rindertrypsin in 2 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 gegeben. Der pH-Wert 50 des Gemisches wird auf 5,9 eingestellt und während der nächsten Stunde mittels 2-n Natriumhydroxidlösung aufrecht erhalten. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wird das Gel 30 Minuten bei 4 °C mit 25 000 g zentrifugiert. Das Sediment wird in 40 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 55 nochmals suspendiert und danach zentrifugiert. Das Endsediment wird mit 15 ml der vorgenannten Pufferlösung und 10 ml n-Decan vermischt und kurzzeitig homogenisiert. Dieses Verfahren liefert eine unvollständige Dispersion, und das Gemisch wird deshalb mit Ultraschall bei 20 kHz in 5 Stössen zu 5 Minu- 60 ten mit intermittierendem Kühlen in Eis behandelt. Die Endemulsion wird 15 Minuten mit 100 g zentrifugiert. Die obere Schicht wird 3 mal mit je 25 ml Phosphat-Pufferlösung gewaschen. Das endgültige Volumen der oberen Schicht beträgt 11 ml. Diese obere Schicht hat eine Aktivität (Untersuchung wie 65 in Beispiel 3) von 1050 BANA-Einheiten/ml (BANA = N-Ben-zoyl-L-arginin-p-nitroanilid). Die scheinbare wiedergewonnene Aktivität beträgt etwa 5 %.

Beispiel 14

a) Hydrolysiertes n-Octadecylamino-Gantrez AN 119-Hydra-zid (GAN 1190DH)

5 g «Gantrez AN 119» werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und auf dem Wasserbad auf 60 °C erwärmt. Eine Lösung von 2,8 g n-Octadecylamin in 30 ml auf 80 °C erwärmtem Dimethylformamid wird zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde auf etwa 60 °C gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Lösung zu einem Gemisch von 10 ml Hydrazinhydrat und 50 ml Dimethylformamid bei Raumtemperatur gegeben. Es bildet sich ein schwachbrauner Niederschlag. Das Gemisch wird 10 Minuten gerührt und dann mit 500 ml Wasser versetzt. Es bildet sich eine seifige grüne Lösung. Nach 15 minütigem Rühren wird der pH-Wert mittels konzentrierter Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Dann werden 50 g Natriumchlorid zugesetzt. Es tritt eine Ausflockung auf, und die Suspension wird 30 Minuten bei 4 °C mit 10 000 g zentrifugiert. Das erhaltene Sediment wird in 400 ml Wasser nochmals suspendiert und dann 16 Stunden bei 4 °C gerührt und anschliessend wie vorstehend angegeben zentrifugiert. Man erhält ein blaugraues Sediment von 39 g (Feuchtgewicht).

b) Penicillin-Acylase-(n-Octadecylamino-Gantrez AN 119> hydrazid (PAGANI 190DH)

6 g GAN 1190DH (Feuchtgewicht) werden in 50 ml 2-n Salzsäure suspendiert und 15 Minuten bei 0 °C gerührt. Dann wird eine Lösung von 0,5 g Natriumnitrit in 5 ml Wasser zugegeben und das Gemisch 10 Minuten bei 0 °C gerührt und dann 30 Minuten bei 0 °C mit 25 000 g zentrifugiert. Das Sediment wird bei 0 °C in 50 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 8,0 nochmals suspendiert. Diese Suspension wird zu einer Lösung von 100 ml Penicillin-Acylase (mit einem Gehalt von 55 mg Protein) gegeben. Das Gemisch wird auf einen pH 8,0 eingestellt. Die Suspension wird 72 Stunden bei

4 °C gerührt und dann 1 Stunde bei 0 °C mit 25 000 g zentrifugiert. Anschliessend wird das Sediment in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert und nochmals zentrifugiert. Das Gewicht des endgültigen Sediments beträgt 3,74 g. Die spezifische Aktivität (Untersuchung wie zuvor) beträgt 5,2-10-5 Mol/min/g. Die wiedergewonnene Aktivität beträgt 32,5%.

Eine Suspension der vorgenannten Verbindung in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 (0,29 g/ml; 2,5 ml) wird mit 20 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,8 vermischt und 2 Minuten und 5000 UpM bei 0 CC mit 7,5 ml n-Decanol homogenisiert. Ein lOminütiges Zentrifugieren mit 100 g ergibt zwei Schichten. Die untere Schicht hat eine Gesamtaktivität von 1,8-10~6 Mol/min und die obere Schicht nach dem Waschen mit 20 ml der vorgenannten Pufferlösung eine Aktivität von 1,9« 10~5 Mol/min. Das Verhältnis der spezifischen Aktivitäten (untere zu oberer Schicht, bezogen auf das Volumen) beträgt etwa 30. Die Ergebnisse der Rückführung der oberen Phase sind in der Tabelle VII angegeben.

Tabelle VII Prozentuale ursprüngliche Aktivität der PAGANI 190DH-n-Decanol-Phase auf die nachfolgenden Flotations-Wiederverwendungszyklen

Zyklus Nr.

% Aktivität

1

90

2

84

3

74

Beispiel 15

Enzymatische Spaltung von Benzylpenicillin zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure

13 624431

1,0 g «Gantrez AN 119» werden in 10 ml Dimethylforma- siert. Das Homogenisat wird zu 250 ml destilliertem Wasser mid gelöst und mit 0,56 g Octadecylamin versetzt. Das gegeben. Das Gesamtgemisch wird auf 37 °C erwärmt, dann

Gemisch wird über Nacht bei Raumtempertur gerührt. auf einen pH 7,8 eingestellt und mit 21,8 g Kalium-benzylpeni-

48 ml einer teilweise gereinigten Zubereitung von Penicil- cillin versetzt. Das Gemisch wird 5 Stunden gerührt und der lin-Acylase werden mittels 1 -m Natriumcarbonatlösung auf s pH-Wert durch Zugabe von 4gewichtsprozentiger Natriumhy-

einen pH 9,0 eingestellt. Die Lösung des «Gantrez»-Harzes droxidlösung, bezogen auf das Volumen, auf 7,8 gehalten. Nach wird dann in zwei gleichen Anteilen unter Homogenisieren und Beendigung der Reaktion wird das Gemisch in einen Scheide-

einem pH-Einsteilen zwischen den beiden Zugaben zugegeben. trichter gegeben. Dann lässt man das Enzym von der wässrigen

Danach wird das Gemisch 3 Stunden gerührt, wobei der Phase sich abtrennen. Dies dauert etwa 30 Minuten. Die wäss-

pH-Wert durch Zugabe von 1-m Natriumhydroxidlösung auf io rige Schicht wird dann entfernt, und die 6-Aminopenicillan-

9,0 gehalten wird. säure wird in der nachfolgenden Weise extrahiert. Die Flüssig-

Das Enzym-Harz wird dann durch Zentrifugieren wiederge- keit wird auf ein Viertel des ursprünglichen Volumens ein-

wonnen, in 120 ml einer 0,1-m Phosphat-Pufferlösung vom pH geengt, auf 5 °C gekühlt und dann mit den gleichen Volumen

7,0 suspendiert und dann 30 Sekunden homogenisiert. Das Isobutylketon unter Rühren versetzt. Der pH-Wert wird durch Enzym-Harz wird durch Zentrifugieren und wiederholtes « Zugabe von konzentrierter Salpetersäure auf 4,3 herabgesetzt,

Waschen wiedergewonnen. woraufhin die 6-Aminopenicillansäure ausfällt. Der Feststoff wird abfiltriert, mit Wasser und Aceton gewaschen und über

20 g des Enzym-Gels werden mit 80 ml n-Decan und 20 ml Nacht bei 40 °C getrocknet. Man erhält 7,65 g 6-Aminopenicill-

0,02-m Phosphat-Pufferlösung vom pH 7,8 1 Minute homogeni- ansäure.

G

3 Blatt Zeichnungen

Claims

624431 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Enzympräparat, bestehend aus einer Acylase, gebunden oder adsorbiert an einen polymeren Trägerstoff, in wässrigem Medium mit einem Substrat für das Enzym in Berührung bringt, danach das Enzympräparat aus dem wässrigen Reaktionsgemisch mittels In-Berührung-Bringen mit einer inerten mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit abtrennt und das Reaktionsprodukt aus der wässrigen Phase gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man auf Penicillin-Acylase beruhendes Enzympräparat verwendet.

3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als polymeren Trägerstoff ein Polymerisat verwendet, das in der Weise hergestellt wird, dass man ein Polymer mit Anhydridgruppen an der Hauptkette mit einem Amin der Formel RNH2 oder R2NH, worin R eine nicht-polare Gruppe ist, in einem aprotischen, nicht-wässerigen polaren Lösungsmittel umsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der polymere Trägerstoff ein Polysaccharid ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der polymere Trägerstoff Dextran oder Sepharose ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der polymere Trägerstoff ein Mischpolymerisat eines Oligosaccharids und eines Epichlorhydrins ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Trägermaterial ein Mischpolymerisat von Saccharose und Epichlorhydrin ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Trägermaterial Anhydridgruppen an der Hauptkette des Polymerisats aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Trägermaterial ein Mischpolymerisat von Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid ist.

10. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym direkt oder über ein Brückenglied an den Trägerstoff gebunden ist.