KR102360582B1 - 치료법을 위한 개선된 특성을 지니는 베타-락타마제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부분적으로 베타-락타마제의 조성물 및 예를 들어, 위장관(GI관) 장애, 예컨대 클로스트리듐 디피실 감염(CDI)에서 이들 효소를 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

치료법을 위한 개선된 특성을 지니는 베타-락타마제{BETA-LACTAMASES WITH IMPROVED PROPERTIES FOR THERAPY}

관련 출원

본 출원은 2014년 4월 17일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/980,844호, 및 2014년 9월 5일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/046,627호의 우선권의 유익을 주장하며, 이들 기초출원은 둘 다 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 포함된다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 부분적으로, 베타-락타마제의 조성물 및 예를 들어, 위장관(GI관) 장애, 예컨대 클로스트리듐 디피실 감염(Clostridium difficile infection: CDI)에서 이들 효소를 이용하는 방법에 관한 것이다.

인간은 포유류 및 미생물 세포의 집합체인 "초유기체"인 것으로 고려될 수 있으며, 미생물 세포는 십중팔구 포유류 세포보다 수적으로 우세한 것으로 추정된다. 이 미생물 성분 및 그의 미생물 유전자 레퍼토리, 즉, 마이크로바이옴(microbiome)은 인간 숙주보다 거의 100배 더 크다. 두드러지게, 외래 유기체의 이 거대한 다양성에도 불구하고, 인간 면역계는 일반적으로 상승효과 상태를 유지한다. 이는 특히 1000종까지의 별도의 박테리아 종 및 과량의 1×10¹⁴개로 추정되는 미생물을 수용하는 원위 GI관에 대해 적용되며, 인간 숙주 건강 상태를 정함에 있어서 중심이 되는 것으로 나타난다. 특히 GI관에서 마이크로바이옴의 철저한 균형 상실은 다양한 질환을 야기할 수 있다.

그러나, 질환의 특정 양상을 치료하는데 필요한 항생제 의학적 치료는 GI관 내를 포함하는 마이크로바이옴에서 파괴를 유도할 수 있고, 추가 질환을 야기할 수 있다. 예를 들어, 암피실린, 세프트리악손, 세포페라존 및 피페라실린과 같은 특정 비경구 투여된 베타-락탐은 부분적으로 소장(십이지장)의 근위 부분 내로 담즙 배설을 통해 제거된다. 장관 내의 잔여 비흡수 베타-락탐은, 예를 들어, CDI, 항생제-관련 설사, 반코마이신 내성 장알균(vancomycin resistant enterococci: VRE), 광범위 베타-락타마제 생성 그램-음성 바실리(extended-spectrum beta-lactamase producing Gram-negative bacilli: ESBL) 및 진균과 같은 병원성 박테리아의 과성장, 및 정상 장 미생물상과 잠재적 병원균 박테리아 둘 다 중에서의 항생제-내성 균주의 선택을 초래하는 정상 장 미생물상의 생태학적 균형에 대해 바람직하지 않은 효과를 야기할 수 있다.

정상 장 미생물상의 생태학적 균형을 회피하거나 재균형화하기 위한 한 가지 접근은 베타-락타마제, 예를 들어, GI관 내 배설 또는 비흡수 항생제를 불활성화시킴으로써, 정상 장 미생물상을 유지하고, 잠재적으로 병원성인 미생물에 의한 그의 과성장을 방지하는 베타-락타마제의 치료적 용도이다.

이들 용도에 가장 적합한 효소적 특성을 갖는 위장관(GI관) 장애, 예컨대 클로스트리듐 디피실 감염(CDI)의 치료를 위한 제제 및 의약에 대한 필요가 남아있다.

따라서, 본 발명은 P1A 베타-락타마제에 기반한 아미노산 서열을 포함하지만, 예를 들어 기질 특이성 및/또는 활성을 변화시키고, 치료적 이점을 제공하는 유리한 돌연변이를 함유하는 베타-락타마제를 제공한다. 예를 들어, 이러한 돌연변이체는 서열번호 1과 적어도 70% 서열 동일성을 가질 수 있고, 앰블러(Ambler) 분류 위치 F33, Q135, G156, A232, A237, A238, S240, T243, R244, S266 및 D276 다음에 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 이러한 베타-락타마제는 페니실린과 세팔로스포린을 둘 다 가수분해하는 능력을 가지며, 항생제 기질을 선택하기 위한 효소적으로 바람직한 특징, 예컨대 낮은 K_M 및/또는 높은 V_max을 지닌다.

이들 개선된 베타-락타마제는 CDI 및/또는 클로스트리듐 디피실-관련 질환 또는 GI관에서의 다른 항생제-유도 부작용의 예방 또는 치료를 포함하는 다수의 치료에서의 용도를 발견한다. 예를 들어, 베타-락타마제는 환자가 항생제 요법을 겪게 함에 있어서의 용도를 발견하는 한편, 마이크로바이옴에 부정적으로 영향을 미치는 과량의 항생제로부터 초래될 수 있었던 질환에 대해 보호함에 있어서의 용도를 발견한다. 이러한 용도는 항생제의 전신 효용을 방해하지 않는다. 오히려, 베타-락타마제는 GI관 부분에 존재할 수 있는 과량의 항생제를 없애버리고, 그렇게 하면서, 본 명세서에 기재된 다양한 질환 상태와 관련된 미생물상의 파괴를 방지한다.

도 1은 10g/ℓ 글루코스 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 성장으로부터 농축된 샘플(겔 오른쪽의 샘플 표지를 참조)을 지니는 12% 비스-트리스 크리테리온(Bis-Tris Criterion) XT SDS-PAGE(바이오라드)(BioRad)를 도시한 도면. MWM = 분자량 마커 정밀도 플러스(Precision Plus)(바이오라드), RS310 = P1A 바실러스 서브틸리스 균주 및 P1A A18K31 = P1A 기준 물질. "P1A→"는 P1A의 정확한 크기 및 돌연변이체 단백질을 의미한다.
도 2는 5g/ℓ 글루코스 바실러스 서브틸리스 성장으로부터 상청액 샘플(겔 우측의 샘플 표지 참조)을 지니는 12% 비스-트리스 크리테리온 XT SDS-PAGE (바이오라드) 겔을 도시한 도면. 14㎕의 각각의 상청액을 겔 상에 적용하였다. MWM = 분자량 마커 정밀도 플러스(바이오라드), RS310 = P1A 바실러스 서브틸리스 균주 및 "P1A→"는 P1A의 정확한 크기 및 돌연변이체 단백질을 의미한다.
도 3은 HIC 실행으로부터의 용리 다이어그램을 도시한 도면. 수집한 용리 분획 장소를 화살표 및 검정색 파선(오른쪽에서 가장 먼 파선)으로 표시하고, 둘 다 X-축에 수직이다. 통과액 분획 A7 내지 B8을 다이어그램 상에서 용이하게 볼 수 있다. A₂₈₀ 그래프는 실선(제일 위의 선)으로 나타내며, 용리 용액의 전도도를 실선(위로부터 두 번째 선)으로 나타낸다. 샘플 주입을 파선(왼쪽에서 가장 먼 파선)으로 표시하고, 분획을 다수의 실선으로 나타내며, 둘 다 X-축에 대해 수직이다.
도 4는 HIC 실행으로부터의 용리 다이어그램을 도시한 도면. 수집한 용리 분획 장소를 화살표 및 검정색 파선(우측에서 가장 멀리있는 파선)으로 표시하며, 둘 다 X축에 대해 수직이다. 통과액 분획 A1 내지 A8은 다이어그램 상에서 용이하게 볼 수 있다. A₂₈₀ 그래프는 실선(위에서부터 두 번째 선)으로 나타내고, 용리 용액의 전도도를 실선(제일 위의 선)으로 나타낸다. 샘플 주입을 파선(좌측에서 가장 멀리있는 파선)으로 표시하고, 분획을 다수의 실선으로 나타내며, 둘 다 X-축에 대해 수직이다.
도 5는 HIC 실행으로부터의 용리 다이어그램을 도시한 도면. 수집한 용리 분획 장소를 화살표 및 검정색 파선(우측에서 가장 먼 파선)으로 표시하고, 둘 다 X축에 대해 수직이다. 통과액 분획 A1 내지 B1을 다이어그램 상에서 용이하게 볼 수 있다. A₂₈₀ 그래프는 실선(위로부터 두 번째 선)으로 나타내며, 용리 용액의 전도도를 실선(상부선)으로 나타낸다. 샘플 주입을 파선으로 표시하고(좌측에서 가장 먼 파선) 및 분획을 다수의 실선으로 나타내며, 둘 다 X-축에 대해 수직이다. X-축에서 0 앞의 부문은 완충제 A를 이용하는 칼럼 평형을 나타낸다.
도 6은 도 3 내지 도 5에 나타낸 3개의 HIC 정제 분획의 SDS-PAGE 겔을 도시한 도면. AS-sup = 특정 정제에서 사용한 황산암모니아 여과액, 즉, 정제를 위한 출발 물질. B1 161008, B7 161008, B8 161008, A2 041108, A7 041108 및 B1 121108: 각각의 정제의 통과액 분획. C3-C8 161008, C9-D1 161008, D2-D8 161008, B2-B10 041108 및 B8-C3 121108: 용리된 단백질 피크, 풀링한 분획. A18K31 P1A: 기준 물질, 0.64㎍/레인.
도 7은 SOE(스플라이싱된 중복 연장(spliced overlap extension)) 기법을 보여주는 도면. P1A의 B3 β-가닥의 표적 아미노산은 서로 매우 가깝게 놓여있으며, SOE 기법을 이용하여 모두 4의 아미노산이 교환될 수 있다. 교환을 포함하는 영역은 24개 뉴클레오타이드(8개 아미노산 코돈)를 함유하고, 두 PCR 프라이머의 중복 연장 부분에 포함된다. 돌연변이된 penP 유전자는 프라이머 A+B 및 C+D를 이용하여 두 부분에서 PCR에 의해 처음 증폭시킨다. 이어서 두 PCR 산물을 합하고 나서, penP 유전자의 5' 및 3' 부분에 상보성인 프라이머 A 및 D를 이용하여 증폭시킨다. 클로닝 부위를 프라이머 A 및 D에 포함시킨다. 일단 작제물이 준비되면, 다중 키트를 이용하여 추가 돌연변이를 첨가할 수 있다. 중복 프라이머(B 및 C)에 의해 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8은 P1A(좌측 막대) 및 P4A(우측 막대)의 항생제 분해 활성을 보여주는 도면. 10 또는 100ng/㎖의 효소 농도를 표시한 항생제에 대해 사용한다. 데이터를 표시한 베타-락타마제에 의해 분해된 가장 높은 항생제 농도로서 플롯팅한다(사용한 항생제 농도는 10, 100 또는 1000㎍/㎖였음).

본 발명은, 예를 들어, 페니실린 및 세팔로스포린 중 하나 이상을 가수분해시키는 능력을 포함하는 요법에서 사용하기 위한 바람직한 특징을 갖는 특정 돌연변이체 베타-락타마제 효소의 발견에 부분적으로 기반한다.

일부 양상에서, 본 발명은 베타-락타마제, 및 이들 베타-락타마제의 약제학적 조성물을 제공한다. 다양한 양상에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 서열번호 1로부터의 돌연변이(바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) PenP, 즉, P1A)에 의해 유래된다. 따라서, 다양한 양상에서, 본 발명은 베타-락타마제, 및/또는 P1A 유도체인 약제학적 조성물을 제공한다.

P1A는 담도계를 통해 배설되는 베타-락타마제 저해제(예를 들어, 타조박탐, 설박탐, 클라불란산)와 함께 또는 베타 락타마제 저해제 없이 비경구로 투여되는 페니실린 그룹 베타-락탐(예를 들어, 페니실린, 아목시실린, 암피실린 및 피페라실린)을 불활성화시키도록 설계되었다(국제 특허 공개 WO 1993/013795 및 WO 2008/065247; 문헌[Tarkkanen, A.M. et al., Antimicrob Agents Chemother. 53: 2455] 참조, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참조로 포함됨). P1A 효소는 분류 A에 속하고 기능성 분류에서 하위그룹 2a로 그룹화된 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis) 749/C 작은 엑소 베타-락타마제의 재조합체 형태이다(WO 2008/065247). 바실러스 리체니포미스 베타-락타마제 및 그의 P1A 유도체는, 예를 들어, 페니실린, 암피실린, 아목시실린 또는 피페라실린을 분해하는 높은 가수분해 능력을 갖는 페니실리나제로서 고려되며, 그들은 일반적으로 활성 부위 지정 베타-락타마제 저해제, 예컨대 클라불란산, 설박탐 또는 타조박탐에 의해 저해된다. 그러나, P1A 효소는 세팔로스포린 또는 카바페넴 그룹에 속하는 베타-락탐 항생제를 불활성화시키는 제한된 능력을 가진다. 사용된 베타-락타마제는 세팔로스포린에 대해 불량한 활성을 갖기 때문에, 그들은 소장관 내 비흡수 베타-락탐의 불활성화를 위한 비경구 세팔로스포린 치료법과 함께 적용될 수 없다. 따라서, 일부 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 P1A의 특성을 개선시킨다.

다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는, 예를 들어, 광범위 항생제를 효율적으로 표적화하는 능력을 갖는 것을 포함하여, 바람직한 특징을 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 바람직한 효소 역학 특징을 가진다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 베타-락타마제는, 예를 들어, 약 500μM, 또는 약 100μM, 또는 약 10μM, 또는 약 1μM, 또는 약 0.1μM(100nM), 또는 약 0.01μM(10nM), 또는 약 1nM 미만의 K_M을 포함하는, 적어도 하나의 세팔로스포린에 대한 낮은 K_M을 가진다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 베타-락타마제는, 예를 들어, 약 500μM, 또는 약 100μM, 또는 약 10μM, 또는 약 1μM, 또는 약 0.1μM(100nM), 또는 약 0.01μM(10nM), 또는 약 1nM 미만의 K_M을 포함하는, 적어도 하나의 페니실린에 대해 낮은 K_M을 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는, 예를 들어, 약 100s-1, 또는 약 1000s-1, 또는 약 10000s-1, 또는 약 100000s-1, 또는 약 1000000 s-1 초과의 V_max를 포함하는, 적어도 하나의 세팔로스포린에 대한 높은 V_max를 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는, 예를 들어, 약 100s-1, 또는 약 1000s-1, 또는 약 10000s-1, 또는 약 100000s-1, 또는 약 1000000 s-1 초과인 V_max를 포함하는, 적어도 하나의 페니실린에 대한 높은 V_max를 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 적어도 하나의 세팔로스포린에 대해 약 10⁶ M^{- 1} s^-1 초과인 촉매 효율을 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 적어도 하나의 페니실린에 대해 약 10⁶ M^-1 s^-1인 촉매 효율을 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 세팔로스포린 및 페니실린 중 하나 또는 둘 다 중 적어도 하나에 대해 바람직한 효소 역학 특징을 가진다. 다양한 실시형태에서, 구체적 항생제(예를 들어, 세팔로스포린 및 페니실린)가 본 명세서에 기재되어 있다.

P1A 효소의 263개의 아미노산 서열이 본 명세서에 제공된다(N 말단에서 31개의 아미노산 신호 서열 및 QASKT(Gln-Ala-Ser-Lys-Thr) 펜타펩타이드의 제거 후, 서열번호 3 참조). 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 베타-락타마제를 생성하기 위해 이 서열에 대해 돌연변이가 이루어질 수 있다.

서열번호 1

일부 실시형태에서, 서열번호 1은 상기 서열의 제1 잔기 앞에 Met 및/또는 Thr을 가질 수 있다. 다양한 실시형태에서, Met은 절단될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 베타-락타마제를 생성하기 위해 제1 잔기 앞에 Met 및/또는 Thr을 포함하는 서열에 대해 돌연변이가 이루어질 수 있다.

또한 31개 아미노산 신호 서열 및 N 말단에서 QASKT(Gln-Ala-Ser-Lys-Thr) 펜타펩타이드의 제거 전 P1A의 299개 아미노산 서열을 서열번호 3으로서 본 명세서에 제공한다:

서열번호 3

추가로, 본 발명은 또한 서열번호 1의 제1 잔기로부터 추가적인 상류의 잔기를 제공한다(예를 들어, 문헌[JBC 258 (18): 11211, 1983] 참조, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨 - penP 및 penP1의 엑소-라지(exo-large) 및 엑소-스몰(exo-small) 형태를 포함함). 추가로, 본 발명은 또한 서열번호 1의 마지막 잔기로부터 추가적인 하류 잔기를 제공한다.

P1A의 폴리뉴클레오타이드 서열(N 말단에서 31개의 아미노산 서열 및 QAKST 펜타펩타이드의 제거 후)을 또한 서열번호 2로서 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 베타-락타마제(유전자 암호의 축중(degeneracy)을 고려하는 것을 포함)를 생성하기 위해 이 서열에 대해 돌연변이가 이루어진다.

서열번호 2

또한 N 말단에서 31개의 아미노산 서열 및 QASKT 펜타펩타이드의 제거 전에 P1A의 폴리뉴클레오타이드 서열이 서열번호 4로서 제공된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 베타-락타마제를 생성하기 위해 이 서열에 대해 돌연변이가 이루어질 수 있다(유전자 암호의 축중을 고려하는 것을 포함함).

서열번호 4

일부 실시형태에서, 본 발명은 유리한 효소(예를 들어, 광범위 항생제를 표적화할 수 있는 것)를 유도하기 위한 베타-락타마제(예를 들어, 클래스 A 베타-락타마제)의 돌연변이유발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 부위-지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발 및/또는 유도 진화 접근을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이 설계는, 특히 다음의 구조적 데이터(예를 들어, 결정 구조 데이터, 상동체 모델 등)에 기반한다: P1A 결정 구조(Knox and Moews, J. Mol Biol., 220, 435-455 (1991)), CTX-M-44(1BZA (Ibuka et al. Journal of Molecular Biology Volume 285, Issue 5 2079-2087 (1999), 1IYS(Ibuka et al. Biochemistry, 2003, 42 (36): 10634-43), 1IYO, 1IYP 및 1IYQ(Shimamura et al. 2002 　J. Biol . Chem.　277:46601-08), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) K1(1HZO, Nugaka et al. J Mol Biol . 2002 Mar 15;317(1):109-17) 및 프로테우스 펜네리(Proteus penneri) HugA(Liassine et al. Antimicrob Agents Chemother. 2002 Jan;46(1):216-9. 2002), 및 문헌[Bonnet, Antimicrob . Agents Chemother 48(1): 1-14 (2004)(CTM-X에 대해)]에서 검토됨, 모든 이들 문헌의 내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 일부 실시형태에서, 본 돌연변이는 다음의 베타-락타마제 중 어느 하나의 구조적 데이터(예를 들어, 결정 구조 데이터, 상동체 모델 등)의 분석에 의해 알려진다: P1A(예를 들어, 미국 특허 제5,607,671호 참조, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨), P2A(예를 들어, WO 2007/147945 참조, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨), P3A(예를 들어, WO 2011/148041 참조, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨), CTX-M-3, CTX-M-4, CTX-M-5, CTX-M-9, CTX-M-10, CTX-M-14, CTX-M-15, CTX-M-16, CTX-M-18, CTX-M-19, CTX-M-25, CTX-M-26, CTX-M-27, CTX-M-32, CTX-M-44, CTX-M-45, 및 CTX-M-54. 이러한 정보는 공지된 데이터베이스, 예를 들어, 스위스-프롯 단백질 서열 데이터 뱅크(Swiss-Prot Protein Sequence Data Bank), NCBI 및 PDB에서 당업자가 이용가능하다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 대해 하나 이상의(예를 들어, 약 1, 또는 약 2, 또는 약 3, 또는 약 4, 또는 약 5, 또는 약 6, 또는 약 7, 또는 약 8, 또는 약 9, 또는 약 10, 또는 약 15, 또는 약 20, 또는 약 30, 또는 약 40, 또는 약 50, 또는 약 60, 또는 약 70, 또는 약 80, 또는 약 90, 또는 약 100, 또는 약 110, 또는 약 120, 또는 약 130, 또는 약 140, 또는 약 150) 돌연변이 또는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 대해 적어도 30, 35, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9% 동일성을 지니는 서열(또는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 대해 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90, 또는 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 동일성)에 관한 것이다. 다양한 실시형태에서, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 하나 이상의 아미노산은 천연 유래 아미노산, 예컨대 친수성 아미노산(예를 들어, 극성 및 양으로 하전된 친수성 아미노산, 예컨대 알기닌(R) 또는 라이신(K); 극성 및 중성의 전하 친수성 아미노산, 예컨대 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C), 극성 및 음으로 하전된 친수성 아미노산, 예컨대 아스팔테이트(D) 또는 글루타메이트(E), 또는 방향족, 극성 및 양으로 하전된 친수성 아미노산, 예컨대 히스티딘(H)) 또는 소수성 아미노산(예를 들어, 소수성, 지방족 아미노산, 예컨대 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 또는 발린(V), 소수성, 방향족 아미노산, 예컨대 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 또는 타이로신(Y) 또는 비 분류 아미노산(예를 들어, 일반적으로 셀레노시스테인, 피롤라이신, N-폼일메티오닌 β-알라닌, GABA 및 δ-아미노레불린산으로 치환된다. 4-아미노벤조산(PABA), 통상적인 아미노산의 D-이성질체, 2,4-다이아미노뷰티르산, α-아미노 아이소뷰티르산, 4-아미노뷰티르산, Abu, 2-아미노 뷰티르산, γ-Abu, ε-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 아이소뷰티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코스메, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테산, t-뷰틸글리신, t-뷰틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예컨대 β 메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체).

예시적인 실시형태에서, 본 발명의 돌연변이는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 대해 다음의 돌연변이 중 하나 이상의(예를 들어, 약 1, 또는 약 2, 또는 약 3, 또는 약 4, 또는 약 5, 또는 약 6, 또는 약 7, 또는 약 8, 또는 약 9, 또는 약 10, 또는 약 15, 또는 약 20, 또는 약 30, 또는 약 40, 또는 약 50, 또는 약 60, 또는 약 70, 또는 약 80, 또는 약 90, 또는 약 100, 또는 약 110, 또는 약 120, 또는 약 130, 또는 약 140, 또는 약 150) 또는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 대해 적어도 30, 35, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9% 동일성을 지니는 서열(또는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 대해 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90, 또는 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 동일성)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:

일부 실시형태에서, 서열번호 1은 서열의 제1 잔기 앞의 Met 및/또는 Thr을 가질 수 있다. 이들 잔기는 상기와 유사하게 돌연변이될 수 있다.

모든 이들 돌연변이체에서, 잔기의 넘버링은 서열번호 1에 대응한다. 이들 잔기 번호는, 예를 들어 BLAST(기본적 국소 정렬 검색 툴(Basic Local Alignment Search Tools) 또는 FASTA(FAST-AII)를 이용함으로써, 임의의 전통적인 생체정보학적 방법의 사용을 통해 앰블러 번호(문헌[Ambler et al., 1991, A standard numbering scheme for the Class A β-lactamases, Biochem . J. 276:269-272], 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)로 전환될 수 있다. 예를 들어, 잔기 244는 앰블러 276에 대응한다. 예를 들어, 다음의 전환이 사용될 수 있다:

더 나아가, 백분율 동일성은 또한 이들 전통적인 생체정보학 방법에 의해 평가될 수 있다.

일 양상에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 70%(예를 들어, 약 70%, 또는 약 71%, 또는 약 72%, 또는 약 73%, 또는 약 74%, 또는 약 75%, 또는 약 76%, 또는 약 77%, 또는 약 78%, 또는 약 79%, 또는 약 80%, 또는 약 81%, 또는 약 82%, 또는 약 83%, 또는 약 84%, 또는 약 85%, 또는 약 86%, 또는 약 87%, 또는 약 88%, 또는 약 89%, 또는 약 90%, 또는 약 91%, 또는 약 92%, 또는 약 93%, 또는 약 94%, 또는 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 및 다음의 앰블러 분류 돌연변이(F33X, Q135X, G156X, A232X, A237X, A238X, S240X, T243X, R244X, S266X 및 D276X) 중 하나 이상을 포함하는 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물에 관한 것이되, X는 임의의 천연 유래 아미노산이고, 단, D276X는 단일 돌연변이체 상황에서 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, X는 천연 유래 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기 또는 비-고전적 아미노산이다.

다른 양상에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 70% 서열 동일성 및 다음의 앰블러 분류 돌연변이(위치 33에서 페닐알라닌(F) 이외의 소수성 잔기; 위치 135에서 글루타민(Q) 이외의 소수성 잔기; 위치 156에서 글리신(G) 이외의 친수성 잔기; 위치 232에서 알라닌(A) 이외의 소수성 잔기; 위치 237에서 알라닌(A) 이외의 친수성 잔기; 위치 238에서 알라닌(A) 이외의 소수성 또는 친수성 잔기; 위치 240에서 세린(S) 이외의 친수성 잔기; 위치 243에서 트레오닌(T) 이외의 소수성 잔기; 위치 244에서 알기닌(R) 이외의 소수성 잔기; 위치 266에서 세린(S) 이외의 친수성 잔기; 및 위치 276에서 아스팔테이트(D) 이외의 친수성 잔기) 중 하나 이상을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물에 관한 것이며, 단, 위치 276에 대응하는 위치에서 아스팔트산(D) 이외의 친수성 아미노산 잔기는 단일 돌연변이체 상황에서 존재하지 않는다.

전체적으로 사용되는 바와 같은, 친수성 아미노산 잔기는 알기닌(R) 및 라이신(K)으로부터 선택된 극성 및 양으로 하전된 친수성 잔기, 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된 극성 및 중성의 전하 친수성 잔기, 아스팔테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기 또는 히스티딘(H)을 포함하는 방향족, 극성 및 양으로 하전된 친수성 잔기를 포함할 수 있다. 전체적으로 사용되는 바와 같은, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 또는 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 또는 타이로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산을 포함할 수 있다.

돌연변이는 코돈 축중을 고려하는 것을 포함하여, 유전자 암호를 참조하여 베타-락타마제(예를 들어, 서열번호 3 및 4)의 유전자 서열로 이루어질 수 있다.

일부 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 앰블러 분류의 위치에서 다음의 돌연변이 중 하나 이상(F33Y, Q135M, G156R, A232G, A237S, A238G 또는 T, S240P 또는 D, T243I, R244T, S266N, D276N 또는 R 또는 K)을 포함하고, 단, D276N 또는 R 또는 K는 단일 돌연변이체 상황에 있지 않다. 일 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 Q135M을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 G156R 및 A238T를 포함한다. 다른 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 F33Y 및 D276N을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 F33Y, S240P 및 D276N을 포함한다. 일 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 F33Y, A238T 및 D276N을 포함한다. 다른 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 A232G, A237S, A238G 및 S240D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 A232G, A237S, A238G, S240D 및 R244T를 포함한다. 다른 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 A232G, A237S, A238G, S240D 및 D276R을 포함한다. 일 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 A232G, A237S, A238G, S240D 및 D276K를 포함한다. 일 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 A232G, A237S, A238G, S240D 및 Q135M을 포함한다. 일 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 A238T를 포함한다. 일 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 T243I, S266N 및 D276N을 포함한다. 일 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 A232G, A237S, A238G, S240D 및 D276N을 포함한다.

다른 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 서열번호 2와 적어도 70% 서열 동일성 및 다음의 앰블러 분류를 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 위치 232에서 알라닌(A) 이외의 소수성 잔기; 위치 237에서 알라닌(A) 이외의 친수성 잔기; 위치 238에서 알라닌(A) 이외의 소수성 잔기; 위치 240에서 세린(S) 이외의 친수성 잔기; 및 위치 276에서 아스팔테이트(D) 이외의 친수성 잔기. 일부 실시형태에서, 위치 232에서 알라닌(A) 이외의 소수성 잔기는 글리신(G)이다. 일부 실시형태에서, 위치 237에서 알라닌(A) 이외의 친수성 잔기는 세린(S)이다. 일부 실시형태에서, 위치 238에서 알라닌(A) 이외의 소수성 잔기는 글리신(G)이다. 일부 실시형태에서, 위치 240에서 세린(S) 이외의 친수성 잔기는 아스팔테이트(D)이다. 일부 실시형태에서, 위치 276에서 아스팔테이트(D) 이외는 아스파라긴(N)이다. 일부 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 A232G, A237S, A238G, S240D 및 D276N 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물은 A232G, A237S, A238G, S240D 및 D276N 모두를 포함하며, 이들 서열은 서열번호 5일 수 있다:

서열번호 5

서열번호 6: 신호 및 QASKT 아미노산의 첨가를 포함하는 서열번호 5(암호 영역은 밑줄 표시되어 있음):

본 발명은 또한, 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는, 본 발명의 임의의 베타-락타마제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 베타-락타마제에 추가로 하나 이상의 발현 제어 구성요소를 암호화하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 발현 제어 구성요소로서 하나 이상의 프로모터 또는 전사 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 및 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 발현을 위한 임의의 적합한 숙주 세포 내에 함유될 수 있는 임의의 적합한 벡터 내에 삽입될 수 있다. 본 발명의 예시적인 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7이다:

서열번호 7

A232G, A237S, A238G, S240D 및 D276N 돌연변이체, Hind III 부위(AAGCTT-볼드체) 및 추가적인 K 및 T 아미노산의 전체 뉴클레오타이드 서열. 리더 및 추가적인 뉴클레오타이드(Hind III 부위 및 K 및 T 아미노산―아미노산 서열 QASKT의 첨가를 위해)는 밑줄 표시되어있다.

일부 실시형태에서, 치료제를 암호화하는 삽입물이 전사될 수 있다면, 벡터는 에피솜을 남길 수 있거나 또는 염색체로 통합될 수 있다. 벡터는 표준 재조합 DNA 기법에 의해 구성될 수 있다. 벡터는 원핵 또는 진핵 세포(예를 들어, 아데노바이러스; 레트로바이러스; 렌티바이러스; scAAV; pGEX 벡터; pET 벡터; 및 pHT 벡터)에서의 복제 및 발현을 위해 사용되는, 예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 파지플라스미드 복합체(phagemid), 바이러스 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 유형일 수 있다. 당업계에 공지된 매우 다양한 구성성분(예컨대 발현 제어 구성요소)은 매우 다양한 전사 신호를 포함하는 이러한 벡터, 예컨대 프로모터 및 프로모터 상에 RNA 중합효소의 결합을 조절하는 다른 서열에 포함될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 벡터가 발현될 세포에서 효과적인 것으로 알려진 임의의 프로모터는 치료제의 발현을 개시시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 프로모터는 유도성 또는 구성적일 수 있다. 적합한 프로모터의 예는 pET 시스템(INVITROGEN), lac 프로모터, tac, trc, T7, T7A3 프로모터, PhoA, 플럭스 및 파지 람다 pR, 람다 pL 프로모터를 포함한다(예를 들어, 문헌[J Ind Microbiol Biotechnol (2012) 39:383-399; Curr Opin Biotech 2001, 12: 195], 이의 내용은 본 명세서에서 참고로 포함됨). 프로모터는 (예를 들어, IPTG, 대사물질, 온도를 통해) 유도성일 수 있다. 적합한 프로모터의 예는 SV40 초기 프로모터 영역, 라우스 육종 바이러스의 3' 길이 말단 반복체에 함유된 프로모터, HSV-1 티미딘 키나제 프로모터, 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 등뿐만 아니라 조직 특이성을 나타내고 유전자이식 동물에서 이용된 다음의 동물 전사 제어 영역을 포함한다: 췌장 선포세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역; 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역, 림프 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역, 고환, 유방, 림프성 및 비만세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역, 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역, 간에서 활성인 알파-태아단백질 유전자 제어 영역, 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 제어 영역, 적혈구 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역, 뇌의 희돌기교세포에서 활성인 수초 염기성 단백질 유전자 제어 영역, 골격근에서 활성인 마이오신 경쇄-2 유전자 제어 영역, 및 시상하부에서 활성인 생식선 자극 호르몬 방출호르몬 유전자 제어 영역.

본 발명은 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 베타-락타마제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 본 발명의 베타-락타마제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 추가적인 제어 구성요소(들), 예컨대 프로모터 구성요소 및/또는 다른 전사 또는 발현 관련 신호를 추가로 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 박테리아 및 진핵 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포에서 치료제의 생성을 위해 유용할 수 있는 다양한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 본 발명의 베타-락타마제는 공지된 재조합 발현 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 베타-락타마제를 재조합적으로 생성하기 위해, 본 발명의 이러한 베타-락타마제를 암호화하는 핵산 서열이 숙주 세포에서 전사 및/또는 번역되도록 각각의 유전자를 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 예시적인 프로모터는 다양한 시스템, 예컨대 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 T7 프로모터, Pspac, PgroES, Pgsi 및 플럭스(Plux) 및 amyQ 프로모터 및/또는 amyQ 신호 펩타이드에서의 발현에 유용한 것이다(비제한적 예로서 젠뱅크(Gen Bank) 식별 번호 J01542.1, 이의 내용은 본 명세서에서 참고로 포함됨). 진핵 또는 원핵 시스템을 포함하는 임의의 통상적으로 사용되는 발현 시스템이 사용될 수 있다. 구체적 예는 효모(예를 들어, 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 피키아 종(Pichia spp.)), 바큘로바이러스, 포유류 및 박테리아계, 예컨대 이콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스, 및 카울로박터(Caulobacter)를 포함한다.

본 발명의 숙주 세포는, 예를 들어, 원핵, 진핵, 박테리아, 효모, 조류, 식물, 곤충, 및/또는 포유류 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 본 발명과 관련된 유전자를 재조합적으로 발현시키는 임의의 유형의 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 박테리아 세포, 예를 들어, 에스케리키아 종(Escherichia spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.), 자이모나스 종(Zymonas spp.), 아세토박터 종(Acetobacter spp.), 시트로박터 종(Citrobacter spp.), 시네코시스티스 종(Synechocystis spp.), 리조비움 종(Rhizobium spp.), 클로스트리듐 종(Clostridium spp.), 코리네박테리움 종(Corynebacterium spp.), 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp.), 잔토모나스 종(Xanthomonas spp.), 락토바실러스 종(Lactobacillus spp.), 락토코커스 종(Lactococcus spp), 바실러스 종(Bacillus spp.), 알칼리게네스 종(Alcaligenes spp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 에어로모나스 종(Aeromonas spp.), 아조박터 종(Azotobacter spp.), 코마모나스 종(Comamonas spp.), 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.), 로도코커스 종(Rhodococcus spp.), 글루코노박터 종(Gluconobacter spp.), 랄스토니아 종(Ralstonia spp.), 애시디티오바실러스 종(Acidithiobacillus spp.), 마이크로루나투스 종(Microlunatus spp.), 게오박터 종(Geobacter spp.), 게오바실러스 종(Geobacillus spp.), 아르트로박터 종(Arthrobacter spp.), 플라보박테리움 종(Flavobacterium spp.), 세라티아 종(Serratia spp.), 사카로폴리스포라 종(Saccharopolyspora spp.), 써무스 종, 스테노트로포모나스 종(Stenotrophomonas spp.), 크로모박테리움 종(Chromobacterium spp.), 시노리조비움 종(Sinorhizobium spp.), 사카로폴리스포라 종(Thermus spp.), 아그로박테리움 종(Agrobacterium spp.) 및 판토에아 종(Pantoea spp.)이다. 박테리아 세포는 그램-음성 세포 예컨대 에스케리키아 콜라이(이콜라이) 세포, 또는 그램-양성 세포, 예컨대 바실러스(Bacillus) 종일 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포는 진균 세포, 예를 들어, 효모 세포, 예를 들어, 사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 피키아 종, 파피아 종(Paffia spp.), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces spp.), 칸디다 종(Candida spp.), 탈라로마이세스 종(Talaromyces spp.), 브레타노마이세스 종(Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종(Pachysolen spp.), 데바리오마이세스 종, 야로이야 종(Yarrowia spp.) 및 산업적 배수체 효모 균주이다. 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 또는 야로이야 종 균주일 수 있다. 진균의 다른 예는, 예를 들어, 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 페니실리움 종(Pennicilium spp.), 푸사리움 종(Fusarium spp.), 리조푸스 종(Rhizopus spp.), 아크레모늄 종(Acremonium spp.), 네우로스포라 종(Neurospora spp.), 소르다리아 종(Sordaria spp.), 마그나포르테 종(Magnaporthe spp.), 알로마이세스 종(Allomyces spp.), 유스틸라고 종(Ustilago spp.), 보트리티스 종(Botrytis spp.,) 및 트리코데마 종(Trichoderma spp.)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포는 조류 세포 또는 식물 세포(예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana), 클라미도모나스 레인하르티(C. reinhardtii), 아르트로스피라(Arthrospira), 파에오닥틸룸 트리코르누툼(P. tricomutum), 테트라셀미스 수에시카(T. suecica), 플레우로크리시스 카르테라에(P. carterae), 파에오닥틸룸 트리코르누툼, 클로렐라 종(Chlorella spp.), 예컨대 클로렐라 불가리스)이다. 표적 세포는 유전자이식 및 재조합체 세포주를 포함할 수 있다. 추가로, 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 이종성 세포주가 사용될 수 있다. 숙주 세포는 단세포 숙주 세포 또는 다세포 숙주 세포일 수 있다.

다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 그들을 치료적 용도를 포함하는 다양한 용도에 바람직하게 만드는 기능적 특징을 가진다. 베타-락타마제를 특성규명하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[O'Callaghan, et al. Antimicrob . Agents Chemother , 1 :283-288; the various methods of Viswanatha et al. Methods Mol Med . 2008;142:239-60]에 기재된 바와 같은 니트로세핀 분석).

일 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 페니실린 및 세팔로스포린 중 하나 이상의 가수분해한다. 전체적으로 사용되는 바와 같은, 페니실린은, 예를 들어, 아목실린(예를 들어, 노바목스(NOVAMOX), 아목실(AMOXIL)); 암피실린(예를 들어, 프린시펜(PRINCIPEN)); 아즐로실린; 카르베니실린(예를 들어, 제오실린(GEOCILLIN)); 클록사실린(예를 들어, 테고펜(TEGOPEN)); 디클록사실린(예를 들어, 다이나펜(DYNAPEN)); 플루클록사실린(예를 들어, 플록사펜(FLOXAPEN)); 메즐로실린(예를 들어, 메즈린(MEZLIN)); 메티실린(예를 들어, 스타프실린(STAPHCILLIN)); 나프실린(예를 들어, UNIPEN); 옥사실린(예를 들어, 프로스타필린(PROSTAPHLIN)); 페니실린 G(예를 들어, 펜티즈(PENTIDS) 또는 프피제르펜(PFIZERPEN)); 페니실린 V(예를 들어, 비티즈(VEETIDS)(PEN-VEE-K)); 피페라실린(예를 들어, 피프라실(PIPRACIL)); 테모실린(예를 들어, 네가반(NEGABAN)) 및 티카르실린(예를 들어, 티카르(TICAR))를 포함한다. 전체적으로 사용되는 바와 같은, 세팔로스포린은, 예를 들어, 제1 세대 세팔로스포린(예를 들어, 세파드록실(예를 들어, 듀리세프(DURICEF)); 세파졸린(예를 들어, 안세프(ANCEF)); 세프톨로잔, 세팔로틴(Cefalotin)/세팔로틴(Cefalothin)(예를 들어, 케플린(KEFLIN)); 세팔렉신(예를 들어, 케플렉스(KEFLEX)); 제2 세대 세팔로스포린(예를 들어, 세파클로르(예를 들어, 디스타클로르(DISTACLOR)); 세파만돌(예를 들어, 만돌(MANDOL); 세폭시틴(예를 들어, 메폭신(MEFOXIN)); 세프프로질(Cefprozil)(예를 들어, 세프질(CEFZIL)); 세푸록심(예를 들어, 세프틴(CEFTIN), 진나트(ZINNAT)); 제3 세대 세팔로스포린(예를 들어, 세픽심(예를 들어, 수프락스(SUPRAX)); 세프디니르(예를 들어, 옴니세프(OMNICEF), 세프디엘(CEFDIEL)); 세프디토렌(예를 들어, 스펙트라세프(SPECTRACEF)); 세포페라존(예를 들어, 세포비드(CEFOBID)); 세포탁심(예를 들어, 클라포란(CLAFORAN)); 세프포독심(예를 들어, 반틴(VANTIN)); 세프타지딤(예를 들어, 포르타즈(FORTAZ)); 세프티부텐(예를 들어, 세닥스(CEDAX)) 세프티족심(예를 들어, 세피족스(CEFIZOX)); 및 세프트리악손(예를 들어, ROCEPHIN)); 제4 세대 세팔로스포린(예를 들어, 세페핌(예를 들어, 막시핌(MAXIPIME))); 또는 제5 세대 세팔로스포린(예를 들어, 세프타롤린 포사밀(예를 들어, 테플라로(TEFLARO)); 세프토비프롤(예를 들어, 제프테라(ZEFTERA)))을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 세팔로스포린은, 예를 들어, 세포페라존, 세프트리악손 또는 세파졸린을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 서열번호 1에 비해 세팔로스포린에 대해 개선된 촉매 효율을 가진다.

다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 바람직한 효소 역학 특징을 가진다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 베타-락타마제는, 예를 들어, 약 500μM, 또는 약 100μM, 또는 약 10μM, 또는 약 1μM, 또는 약 0.1μM(100nM), 또는 약 0.01μM(10nM), 또는 약 1nM 미만의 K_M을 포함하는 적어도 하나의 세팔로스포린에 대해 낮은 K_M을 가진다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 베타-락타마제는, 예를 들어, 약 500μM, 또는 약 100μM, 또는 약 10μM, 또는 약 1μM, 또는 약 0.1μM(100nM), 또는 약 0.01μM(10nM), 또는 약 1 nM 미만의 K_M을 포함하는, 적어도 하나의 페니실린에 대해 낮은 K_M을 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는, 예를 들어, 약 100s-1, 또는 약 1000s-1, 또는 약 10000s-1, 또는 약 100000s-1, 또는 약 1000000 s-1 초과의 V_max를 포함하는 적어도 하나의 세팔로스포린에 대해 높은 V_max를 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 약 100s-1, 또는 약 1000s-1, 또는 약 10000s-1, 또는 약 100000s-1, 또는 약 1000000 s-1 초과의 V_max를 포함하는 적어도 하나의 페니실린에 대해 높은 V_max를 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 적어도 하나의 세팔로스포린에 대해 약 10⁶ M^{- 1} s^-1 초과의 촉매 효율을 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 적어도 하나의 페니실린에 대해 약 10⁶ M^{- 1} s^-1의 촉매 효율을 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 세팔로스포린 및 페니실린 중 하나 또는 둘 다 중 적어도 하나에 대해 바람직한 효소 역학 특징을 가진다.

다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 GI관에서, 예를 들어, 구강, 식도, 위, 십이지장, 소장, 십이지장, 공장, 회장, 대장, 횡행결장, 하행결장, 상행결장, S상 결장, 맹장 및 직장 중 하나 이상에서 안정하고/하거나 활성이다. 구체적 실시형태에서, 베타-락타마제는 횡행결장, 하행결장, 상행결장, S상 결장 및 맹장 중 하나 이상으로부터 선택적으로 선택된 대장에서 안정하다. 구체적 실시형태에서, 베타-락타마제는 십이지장, 공장 및 회장 중 하나 이상으로부터 선택적으로 선택된 소장에서 안정하다. 일부 실시형태에서, 베타-락타마제는, 예를 들어, 소장을 포함하는 GI관에서 프로테아제에 대해 내성이 있다. 일부 실시형태에서, 베타-락타마제는 약 6.0 내지 약 7.5, 예를 들어, 약 6.0, 또는 약 6.1, 또는 약 6.2, 또는 약 6.3, 또는 약 6.4, 또는 약 6.5, 또는 약 6.6, 또는 약 6.7, 또는 약 6.8, 또는 약 6.9, 또는 약 7.0, 또는 약 7.1, 또는 약 7.2, 또는 약 7.3, 또는 약 7.4, 또는 약 7.5(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 제형을 통하는 것을 포함)의 pH에서 실질적으로 활성이다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제는 아비박탐, 타조박탐, 설박탐 및 클라불란산으로부터 선택적으로 선택된 하나 이상의 베타-락타마제 저해제에 대해 내성이 있다. 일부 실시형태에서, 안정한은 충분히 긴 반감기를 가지며 치료적 유효성을 위한 충분한 활성을 유지하는 효소를 지칭한다.

다양한 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 베타-락타마제 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 구체적 실시형태에서, 약제학적 조성물은 경구 투여를 위해, 예를 들어 정제로서 또는 다중 미립자 스프링클(multi-particulate sprinkle) 또는 다중-미립자 캡슐로서 제형화된다. 그러나, 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 투여 경로 및 제형이 또한 제공된다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 추가적인 제제와 함께 사용될 수 있거나 또는 추가적인 제제와 공동 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가적인 제제는 추가적인 항생제 분해 효소, 예를 들어, 분류 EC 3.5.2.6의 베타-락타마제이다. 일부 실시형태에서, 항생제 분해 효소는 기능성 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3, 또는 그룹 4 베타-락타마제(예를 들어, 문헌[Bush et al., Antimicrob . Agents Chemother, 39: 1211] 참조, 이의 내용은 본 명세서에서 참고로 포함됨)(이론에 의해 구속되는 일 없이, 그룹 1은 클라불란산에 의해 제대로 저해되지 않는 세팔로스포리나제로 이루어지고; 그룹 2는 페니실리나제, 세팔로스포리나제 및 활성 부위 지정 베타-락타마제 저해제에 의해 일반적으로 저해되는 광범위 베타-락타마제로 이루어지며; 그룹 3은 페니실린, 세팔로스포린 및 카르바페넴을 가수분해시키고, 거의 모든 베타-락탐-함유 분자에 의해 불량하게 저해되는 메탈로-베타-락타마제로 이루어지고; 그룹 4는 클라불란산에 의해 제대로 저해되지 않는 페니실리나제로 이루어짐) 및/또는 분자/앰블러 클래스 A, 또는 클래스 B, 또는 클래스 C, 또는 클래스 D 베타-락타마제(예를 들어, 문헌[Ambler 1980, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci . 289: 321] 참조, 이의 내용은 본 명세서에서 참고로 포함됨)(이론에 의해 구속되는 일 없이: 클래스 A, C 및 D는 세린 베타-락타마제 효소, 및 클래스 B 아연-의존적("EDTA-저해") 베타-락타마제 효소의 진화적으로 별도의 그룹을 모은다(문헌[Ambler R.P. et al., 1991 , Biochem J. 276: 269-270] 참조, 이의 내용은 본 명세서에서 참고로 포함됨))로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항생제 분해 효소는 세린 베타-락타마제 또는 아연-의존적(EDTA-저해) 베타-락타마제이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 베타-락타마제는 P1A, P2A 또는 P3A 중 하나 이상이다. 추가로, 베타-락타마제는 TEM, SHV, CTX-M, OXA, PER, VEB, GES 및 IBC 베타-락타마제로부터 선택적으로 선택된 광범위 베타-락타마제(ESBL)일 수 있다. 추가로, 베타-락타마제는 β-락타마제, 선택적으로 AmpC-형 β-락타마제, 카르바페네마제, IMP-형 카르바페네마제(메탈로-β-락타마제), VIM(베로나 인테그론-암호화된 메탈로-β-락타마제), β-락타마제의 OXA(옥사실리나제) 그룹, KPC(클렙시엘라 뉴모니아(K. pneumonia) 카르바페네마제), CMY(클래스 C), SME, IMI, NMC 및 CcrA, 및 NDM(뉴델리 메탈로-β-락타마제, 예를 들어, NDM-1) 베타-락타마제로부터 선택된 저해제-내성 β-락타마제일 수 있다.

일부 실시형태에서, 추가적인 제제는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 CDI에서 사용되는 보조 치료법이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 제제는 메트로니다졸(예를 들어, 프래길(FLAGYL)), 피닥소미신(예를 들어, 디피시드(DIFICID)) 또는 반코마이신(예를 들어, 반코신(Vancocin)), 리팍시민, 분변 박테리아요법, 차콜계 결합제(예를 들어, DAV132), 프로바이오틱스 치료법(예를 들어, 문헌[Intnat'l J Inf Dis, 16 (11): e786], 이의 내용은 본 명세서에서 참고로 포함됨)이며, 예시적인 프로바이오틱스는 사카로마이세스 보우라르디(Saccharomyces boulardii); 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG); 락토바실러스 플란타룸 299v(Lactobacillus plantarum 299v); 클로스트리듐 부티리쿰 M588(Clostridium butyricum M588); 클로스트리듐 디피실 VP20621(Clostridium difficile VP20621)(비-독소 발생성 클로스트리듐 디피실　균주); 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)의 조합, 락토바실러스 악시도필루스(Lactobacillus acidophilus)(Bio-K

+

CL1285); 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus)(악티멜)의 조합; 락토바실러스 악시도필루스, 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)(플루라젠3)의 조합; 락토바실러스 악시도필루스, 락토바실러스 불가리쿠스 델부루에키 아종 불가리쿠스(delbrueckii subsp bulgaricus), 락토바실러스 불가리쿠스 카제이(Lactobacillus bulgaricus casei),　락토바실러스 불가리쿠스 플란타룸(Lactobacillus bulgaricus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 스트렙토코커스 살바리우스 아종 써모필루스(Streptococcus salivarius　subsp.thermophilus)(VSL#3))의 조합 및 항체 또는 다른 생물학적 치료법(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 문헌[N Engl J Med. 2010;362(3):197]에 기재된 바와 같은 클로스트리듐 디피실 독소 A 및 B에 대한 단클론성 항체; 예를 들어, 미국 특허 공개 제2013/0058962호에 인용된 서열번호 중 하나 이상과 관련된 다량체로서 배열된 중화 결합 단백질(예를 들어, 서열번호 59, 60, 95, 67, 68 및 87 중 하나 이상), 이의 내용은 본 명세서에서 참고로 포함됨); 또는 클로스트리듐 디피실 2성분 독소와 관련된 임의의 중화 결합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 페니실린 및 세팔로스포린은 추가적인 제제일 수 있다.

모든 추가적인 제제 조성물 및 방법에 대해, GI관의 다양한 부분에 대해 표적화하는 것은 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 공유적 부착이 조성물의 활성을 방해하지 않도록 변형된, 즉, 임의의 유형의 분자의 조성물에 대한 공유 결합에 의한 유도체를 포함한다. 예를 들어, 이하로 제한하지 않고, 유도체는, 특히, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아마이드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 보호적 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 결합 등에 의해 변형된 조성물을 포함한다. 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포밀화, 투리카마이신의 대사적 합성 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 수많은 화학적 변형이 수행될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 효과기 모이어티, 예컨대 화학적 링커, 검출가능한 모이어티, 예컨대 형광 염료, 효소, 기질, 생발광 물질, 방사성 물질 및 화학발광 모이어티, 또는 기능성 모이어티, 예컨대 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 사이토톡신, 세포독성제 및 방사성 물질을 첨가하기 위해 변형될 수 있다.

본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)는 약제학적으로 허용가능한 염을 형성하기 위해 무기 또는 유기산, 또는 카복실기와 반응할 수 있고, 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는 충분히 염기성인 작용기를 가질 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 산 부가 염은 당업계에 잘 공지된 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 산으로부터 형성된다. 이러한 염은, 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) 및 The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.), Verlag, Zurich (Switzerland) 2002]에 열거된 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

약제학적으로 허용가능한 염은, 비제한적 예로서, 황산염, 시트르산염, 아세트산염, 옥살산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 질산염, 중황산염, 인산염, 산 인산염, 아이소니코틴산염, 락트산염, 살리실산염, 산 시트르산염, 타르타르산염, 올레산염, 타닌산염, 판토텐산염, 중타르타르산염, 아스코르브산염, 숙신산염, 말레산염, 겐티신산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 글루카론산염, 당산염, 폼산염, 벤조산염, 글루탐산염, 메탄설폰산염, 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염, 캠퍼설폰산염, 파모산염, 페닐아세트산염, 트라이플루오로아세트산염, 아크릴산염, 클로로벤조산염, 다이나이트로벤조산염, 하이드록시벤조산염, 메톡시벤조산염, 메틸벤조산염, o-아세톡시벤조산염, 나프탈렌-2-벤조산염, 아이소뷰티르산염, 페닐뷰티르산염, α-하이드록시뷰티르산염, 뷰틴-1,4-다이카복실레이트, 헥신-1,4-다이카복실레이트, 카프르산염, 카프릴산염, 신남산염, 글리콜산염, 헵탄산염, 히푸르산염, 말산염, 하이드록시말레산염, 말론산염, 만델산염, 메실산염, 니코틴산염, 프탈산염, 테라프탈산염, 프로피올산염, 프로피온산염, 페닐프로피온산염, 세바스산염, 수베르산염, p-브로모벤젠설폰산염, 클로로벤젠설폰산염, 에틸설폰산염, 2-하이드록시에틸설폰산염, 메틸설폰산염, 나프탈렌-1-설폰산염, 나프탈렌-2-설폰산염, 나프탈렌-1,5-설폰산염, 자일렌설폰산염, 및 타르타르산염을 포함한다.

용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 또한 산성 작용기, 예컨대 카복실산 작용기와 염기를 갖는 본 발명의 조성물의 염을 지칭한다. 적합한 염기는 알칼리 금속, 예컨대 나트륨, 칼륨 및 리튬의 수산화물; 알칼리토금속, 예컨대 칼슘 및 마그네슘의 수산화물; 기타 금속, 예컨대 알루미늄 및 아연의 수산화물; 암모니아, 및 유기 아민, 예컨대 비치환 또는 하이드록시-치환 모노-, 다이- 또는 트라이-알킬아민, 다이사이클로헥실아민; 트라이뷰틸 아민; 피리딘; N-메틸, N-에틸아민; 다이에틸아민; 트라이에틸아민; 모노-, 비스- 또는 트리스-(2-OH-저급 알킬아민), 예컨대 모노-; 비스- 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민, 2-하이드록시-tert-뷰틸아민, 또는 트리스-(하이드록시메틸)메틸아민, N,N-다이-저급 알킬-N-(하이드록실-저급 알킬)-아민, 예컨대 N,N-다이메틸-N-(2-하이드록시에틸)아민 또는 트라이-(2-하이드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 및 아미노산, 예컨대 알기닌, 라이신 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 약제학적으로 허용가능한 염의 형태이다.

추가로, 본 명세서에 기재된 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클을 포함하는 조성물의 성분으로서 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 선택적으로 포함할 수 있다.

약제학적 부형제는 석유, 동물, 식물성 또는 합성 유래의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 오일 및 물과 같은 액체일 수 있다. 약제학적 부형제는, 예를 들어, 식염수, 아카시아검, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드 실리카, 유레아 등일 수 있다. 추가로, 보조제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 대상체에게 투여될 때 멸균이다. 본 명세서에 기재되는 임의의 제제가 정맥내로 투여될 때 물은 유용한 부형제이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 구체적으로 주사용액에 대한 액체 부형제로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 또한 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원한다면 본 명세서에 기재된 임의의 제제는 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다.

본 발명은 다양한 제형에서 기재된 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 포함한다. 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 용액, 현탁액, 에멀전, 점적, 정제, 알약, 펠렛, 캡슐, 액체를 함유하는 캡슐, 분말, 지속 방출 제형, 좌약, 에멀전, 에어로졸, 스프레이, 현탁액의 형태 또는 사용에 적합한 임의의 다른 형태를 취할 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 캡슐 형태이다(예를 들어, 미국 특허 제5,698,155호 참조). 적합한 약제학적 부형제의 다른 예는 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995)]에 기재되어 있다.

필요한 경우, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 또한 가용화제를 포함할 수 있다. 또한, 제제는 당업계에 공지된 바와 같은 적합한 비히클 또는 전달 장치를 이용하여 전달될 수 있다. 투여를 위한 조성물은 선택적으로 국소 마취제, 예를 들어, 주사 부위에서 통증을 줄이기 위한 리그노카인을 포함할 수 있다. 본 명세서에 약술된 병용요법은 단일 전달 비히클 또는 전달 장치에서 공동전달될 수 있다.

본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 포함하는 제형은 단위 제형으로 편리하게 제공될 수 있고, 약학 분야에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 치료제를 하나 이상의 부속 성분을 구성하는 담체 내에 넣는 단계를 포함한다. 전형적으로, 제형은 균일하게 그리고 직접적으로 치료제를 액체 담체, 미세하게 분할된 고체 담체 또는 둘 다에 넣음으로써, 이어서, 필요하다면, 생성물을 목적으로 하는 제형(예를 들어, 습식 또는 건식 과립, 분말 배합 등, 다음에 당업계에 공지된 전통적인 방법을 이용하는 정제화)의 투약 형태로 성형함으로써 제조된다.

일 실시형태에서, 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 본 명세서에 기재된 투여 방식에 적합한 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다.

일부 실시형태에서, 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 투여는 경구, 정맥내 및 비경구 중 임의의 하나이다. 일부 실시형태에서, 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 투여는, 예를 들어, 전신으로 투여된 항생제에 의한 간섭을 막기 위해 정맥내가 아니다. 다른 실시형태에서, 투여 경로는 특히 귀, 코, 눈 또는 피부에 대한, 예를 들어: 경구, 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 설하, 비강내, 대뇌내, 질내, 경피, 직장, 흡입 또는 국소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여는 경구로 또는 비경구 주사에 의해 달성된다. 투여 방식은 실행자의 자유 재량으로 남을 수 있으며, 의학적 병태 부위에 부분적으로 의존한다. 대부분의 예에서, 투여는 본 명세서에 기재된 임의의 제제의 혈류 내로의 방출을 초래한다.

임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 경구로 투여될 수 있다. 이러한 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 또한 임의의 다른 편리한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 피부 내벽(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 추가적인 제제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는, 예를 들어, 감염 부위에서 항생제의 가수분해를 회피하기 위해 감염 부위에서 투여되지 않는다. 다양한 전달 시스템, 예를 들어 리포좀, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 캡슐 등에서의 캡슐화가 공지되어 있으며, 투여를 위해 사용될 수 있다.

구체적 실시형태에서, 치료가 필요한 면적에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.

일 실시형태에서, 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 인간에 대한 경구 투여에 적합한 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 경구 전달을 위한 조성물은, 예를 들어 정제, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 과립, 분말, 스프링클, 에멀전, 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르의 형태일 수 있다. 경구로 투여된 조성물은 약제학적으로 맛 좋은 제제를 제공하기 위해 하나 이상의 제제, 예를 들어, 감미제, 예컨대 프럭토스, 아스팔탐 또는 사카린; 향미제, 예컨대 페퍼민트, 동록유 또는 체리; 착색제; 및 보존제를 포함할 수 있다. 게다가, 정제 또는 알약 형태의 경우에, 조성물은 장기간의 시간에 걸쳐 지속 작용을 제공하기 위해 붕괴를 지연시키도록 코팅될 수 있다. 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 유발하는 삼투적으로 활성인 제제를 둘러싸는 선택적 침투성 막은 또한 경구로 투여되는 조성물에 적합하다. 이들 후자의 플랫폼에서, 캡슐을 둘러싸는 환경으로부터의 유체는 틈을 통해 제제 또는 제제 조성물을 대체하기 위해 팽창하는 유발 화합물에 의해 흡입된다. 이들 전달 플랫폼은 즉시 방출 제형의 스파이킹된 프로파일과 대조적으로 본질적으로 0차 전달 프로파일을 제공할 수 있다. 시간 지연 물질, 예컨대 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 스테아레이트가 또한 유용할 수 있다. 경구 조성물은 표준 부형제, 예컨대 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 에타크릴산 및 이들의 유도체 중합체 및 탄산마그네슘을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 부형제는 약제학적 등급을 가진다. 활성 화합물에 추가적으로 현탁액은, 예를 들어, 에톡실화된 아이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 및 솔비탄 에스터, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타사이드록사이드, 벤토나이트, 한천-한천, 트래거캔스 등 및 이들의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.

비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 및 관절내 주사 및 주입)에 적합한 제형은, 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀전 등을 포함한다. 그들은 또한 사용 직전에 멸균 주사용 매질에서 용해 또는 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물(예를 들어, 동결건조된 조성물)의 형태로 제조될 수 있다. 그들은, 예를 들어 당업계에 공지된 현탁제 또는 분산제를 함유할 수 있다.

본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은, 예를 들어, 위장관의 점막 조직과 직접적으로 또는 간접적으로 접촉함으로써 대상체에게 투여될 수 있다. 위장관은 소화계 기관, 예컨대 구강, 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장 및 직장을 포함하고, 이들의 모든 하위부문을 포함한다(예를 들어, 소장은 십이지장, 공장 및 회장을 포함할 수 있고; 대장은 횡행결장, 하행결장, 상행결장, S상 결장 및 맹장을 포함할 수 있다). 다양한 방법은 관심 대상의 위치에 본 명세서에 기재된 제제를 전달하고/하거나 제형화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 위, 소장, 대장 및 직장 중 하나 이상의 전달을 위해 제형화될 수 있고, 이들의 모든 하위부문(예를 들어, 십이지장, 공장 및 회장, 횡행결장, 하행결장, 상행결장, S상 결장 및 맹장)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 상부 또는 하부 GI관에 전달되도록 제형화될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 장용 전달을 위해 제형화된다. 예를 들어, 조성물은 경구 전달을 위한 캡슐 또는 정제로서 제형화될 수 있고, 하나 이상의 장용 제제를 함유하는 지연 방출 코팅을 포함할 수 있다. 지연-방출 코팅은 위액 중에서 실질적으로 안정하며, 장액 중에서 실질적으로 불안정하여(예를 들어, 빠르게 용해하거나 또는 생리적으로 불안정함), 따라서 소장, 예를 들어, 십이지장, 공장 및/또는 회장 또는 대장, 예를 들어, 횡행결장, 하행결장, 상행결장, S상 결장 및 맹장의 병에 걸린 영역에서 조성물로부터의 활성제의 실질적인 방출을 제공한다.

본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 일반적으로 위액 또는 인공 장액(simulated intestinal fluid) 중에서 안정하며, 즉, 조성물은 산성 환경에서 안정하다. 따라서, 조성물은 대략 120분에 pH 5 이하의 위액 중에서 또는 pH 5 이하의 인공 위액 중에서 활성제의 30중량% 미만을 방출한다. 본 발명의 조성물은 대략 120분에 pH 5 이하의 위액 중에서 또는 pH 5 이하의 인공 위액 중에서 활성제의 약 0중량% 내지 약 25중량%, 또는 약 0중량% 내지 약 10중량%를 방출할 수 있다. 특정 실시형태에서 본 발명의 조성물은 대략 120분에 pH 5 이하로 위액 또는 인공 위액 중에서 활성제의 약 1중량%, 약 2중량%, 약 3중량%, 약 4중량%, 약 5중량%, 약 6중량%, 약 7중량%, 약 8중량%, 약 9중량% 또는 약 10중량% 이하를 방출한다. 약제학적 조성물은 일반적으로 소장 또는 대장의 영역에서 국소적으로 작용하는 활성제를 방출한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 약 120분 내에 소장 또는 대장에서 활성제의 약 70중량% 이상을 방출한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 약 90분 내에 또는 약 120분 내에 소장 또는 대장 내에서 활성제의 80% 이상, 또는 90% 이상을 방출한다. 특정 실시형태에서, 소장 또는 대장에서 이런 방출은 위액 또는 인공 위액의 pH에 의해 매개된다-예를 들어, pH가 약 5 이상일 때의 방출(예를 들어, 십이지장에서의 방출을 위해 pH 약 5.5 내지 6.5, 상행결장 또는 공장에서의 방출을 위해 pH 약 6 내지 7 또는, 회장에서의 방출을 위해 pH 약 6.5 내지 7, 하행결장에서의 방출을 위해 pH 약 7 내지 7.5).

약제학적 조성물은 위액 중에서 본질적으로 무결함으로 남아있고/있거나 본질적으로 불용성 일 수 있는 하나 이상의 지연-방출 코팅(들)을 통해 활성제의 장 방출을 제어할 수 있다. 지연-방출 코팅의 안정성은 pH 의존적일 수 있다. pH 의존적인 지연-방출 코팅은 산성 환경(pH 5 이항)에서 실질적으로 안정할 것이고, 거의 중성 내지 알칼리 환경(pH 5 초과)에서 실질적으로 불안정하다. 예를 들어, 지연-방출 코팅은 소장 또는 대장에서 발견되는 것과 같은 거의 중성 내지 알칼리 환경에서 본질적으로 붕괴하거나 용해됨으로써, 질환 조직 또는 병에 걸린 조직에 활성제는 국소적으로 방출할 수 있다.

인공 위액 및 인공 장액의 예는 시험 용액 중의 2005 약전 23NF/28USP, 페이지 2858에 개시된 것 및/또는 다른 인공 위액 및 당업자에게 공지된 인공 장액, 예를 들어, 효소 없이 제조된 인공 위액 및/또는 장액을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

대안적으로, 지연-방출 코팅의 안정성은 효소-의존적일 수 있다. 효소 의존적인 지연-방출 코팅은 특정 효소를 함유하지 않는 유체 중에서 실질적으로 안정하고, 효소를 함유하는 유체 중에서 실질적으로 불안정할 것이다. 지연-방출 코팅은 적절한 효소를 함유하는 유체 중에서 본질적으로 붕괴되거나 또는 용해될 것이다. 효소-의존적 제어는, 예를 들어 갈락토만난과 같은 장 내 효소에 대한 노출 시에 만 활성 성분을 방출하는 물질을 사용함으로써, 초래될 수 있다.

일부 실시형태에서, 위 내성 캡슐 또는 정제를 포함하는 본 발명의 조성물로부터 활성제를 방출하기 위한 표적 기관은 소장, 예컨대 십이지장 및 공장 또는 대장, 예를 들어, 횡행결장, 하행결장, 상행결장, S상 결장 및 맹장이다. 예를 들어 이러한 정제 또는 캡슐의 제조의 예에 대해 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Eds. Osol, Mack Publishing Co., Chapter 89 (1980); 다이genis et al., J. Pharm . Sci., 83:915-921 (1994); Vantini et al., Clinica Terapeutica, 145:445-451 (1993); Yoshitomi et al., Chem . Pharm . Bull., 40:1902-1905 (1992); Thoma et al., Pharmazie, 46:331-336 (1991); Morishita et al., Drug Design and Delivery, 7:309-319 (1991); 및 Lin et al., Pharmaceutical Res., 8:919-924 (1991)] 참조한다(상기 문헌의 내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨).

일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 바와 같은 EUDRAGIT 시스템을 이용하여 제형화될 수 있으며, 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 문헌[Pharma Polymer No. 7, Oct. 2000]에 기재되어 있다.

임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 투약량뿐만 아니라 투약 스케줄은 치료 중인 질환, 대상체의 일반적 건강상태 및 투여하는 의사의 재량을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 매개변수에 의존할 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 제제는 투여가 필요한 대상체에게 추가적인 치료제의 투여 전에(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 전), 동시에 또는 후속적으로(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 후) 투여될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 제제는 1분 간격, 10분 간격, 30분 간격, 1시간 미만의 간격, 1시간 간격, 1시간 내지 2시간 간격, 2시간 내지 3시간 간격, 3시간 내지 4시간 간격, 4시간 내지 5시간 간격, 5시간 내지 6시간 간격, 6시간 내지 7시간 간격, 7시간 내지 8시간 간격, 8시간 내지 9시간 간격, 9시간 내지 10시간 간격, 10시간 내지 11시간 간격, 11시간 내지 12시간 간격, 24시간 이하의 간격 또는 48시간 이하의 간격으로 투여된다.

단일 투약량을 생성하기 위해 담체 물질과 혼합되는 본 명세서에 기재된 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 양은 치료 중인 대상체 및 특정 투여 방식에 따라서 다를 것이다. 시험관내 또는 생체내 분석은 최적의 투약량 범위를 동정하기 위해 사용될 수 있다.

일반적으로, 유용한 용량은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 용량은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 문헌[Physicians' Desk Reference, 66th Edition, PDR Network; 2012 Edition (December 27, 2011)]에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 환자가 문헌[Physicians' Desk Reference]에 의해 결정되는 것을 초과하는 용량을 수용하게 한다.

임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 투약량은 병태의 중증도, 병태가 치료 또는 예방되는지의 여부, 치료될 대상체의 연령, 체중 및 건강상태를 포함하는 몇몇 인자에 의존할 수 있다. 추가적으로, 특정 대상체에 대한 약리유전체학(치료의 약동학, 약역학 또는 효능 프로파일에 대한 게놈유형의 효과) 정보는 사용되는 투약량에 영향을 미칠 수 있다. 더 나아가, 정확한 개개 투약량은 투여 중인 제제의 구체적 조합, 투여 시간, 투여 경로, 제형의 특성, 배설 속도, 치료 중인 특정 질환, 장애의 중증도 및 장애의 해부학적 위치를 포함하는 다양한 인자에 따라서 다소 조절될 수 있다. 투약량에서 일부 변형이 예상될 수 있다.

구체적 실시형태에서, 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 농도는 경구로 투여될 때 약 0.2 내지 약 20g/ℓ이거나 또는 정맥내로 투여될 때 약 4g/㎖이다.

일부 실시형태에서, 포유류에게 경구로 투여될 때, 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 투약량은 약 0.001㎎/㎏/일 내지 약 100㎎/㎏/일, 약 0.01㎎/㎏/일 내지 약 50㎎/㎏/일, 또는 약 0.1㎎/㎏/일 내지 약 10㎎/㎏/일일 수 있다. 인간에게 경구로 투여될 때, 본 명세서에 기재된 임의의 제제의 투약량은 정상적으로 약 0.001㎎ 내지 1000㎎/일, 약 1㎎ 내지 약 600㎎/일, 또는 약 5㎎ 내지 약 30㎎/일이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물의 100㎎/일은 인간에게 경구로 투여된다. 비경구 주사에 의한 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 투여를 위해, 투약량은 정상적으로 약 0.1㎎ 내지 약 250㎎/일, 약 1㎎ 내지 약 20㎎/일, 또는 약 3㎎ 내지 약 5㎎/일이다. 주사는 1일에 4회까지 제공될 수 있다. 일반적으로, 경구 또는 비경구로 투여될 때, 본 명세서에 기재된 임의의 제제의 투약량은 정상적으로 약 0.1㎎ 내지 약 1500㎎/일, 또는 약 0.5㎎ 내지 약 10㎎/일, 또는 약 0.5㎎ 내지 약 5㎎/일이다. 약 3000㎎/일까지의 투약량이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 1000㎎/일일 수 있다. 일부 실시형태에서, 다음의 용량 요법이 사용될 수 있다: 100㎎, 1일 4회.

다양한 실시형태에서, 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 투약량은 약 1ng/㎖ 내지 약 10,000ng/㎖, 약 1ng/㎖ 내지 약 5,000ng/㎖, 약 1ng/㎖ 내지 약 2,500ng/㎖, 약 1ng/㎖ 내지 약 1,000ng/㎖, 약 1ng/㎖ 내지 약 500ng/㎖, 약 1ng/㎖ 내지 약 250ng/㎖, 약 1ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖, 약 1ng/㎖ 내지 약 50ng/㎖, 약 1ng/㎖ 내지 약 25ng/㎖, 약 1ng/㎖ 내지 약 10ng/㎖, 약 10ng/㎖ 내지 약 10,000ng/㎖, 약 10ng/㎖ 내지 약 5,000ng/㎖, 약 10ng/㎖ 내지 약 2,500ng/㎖, 약 10ng/㎖ 내지 약 1,000ng/㎖, 약 10ng/㎖ 내지 약 500ng/㎖, 약 10ng/㎖ 내지 약 250ng/㎖, 약 10ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖, 약 10ng/㎖ 내지 약 50ng/㎖, 약 10ng/㎖ 내지 약 25ng/㎖, 약 100ng/㎖ 내지 약 10,000ng/㎖, 약 100ng/㎖ 내지 약 5,000ng/㎖, 약 100ng/㎖ 내지 약 2,500ng/㎖, 약 100ng/㎖ 내지 약 1,000ng/㎖, 약 100ng/㎖ 내지 약 500ng/㎖, 또는 약 100ng/㎖ 내지 약 250ng/㎖의 장 농도를 달성하기 위해 투여된다. 다양한 실시형태에서, 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 장 농도는 10ng/㎖, 100ng/㎖ 또는 1,000ng/㎖이다.

다른 실시형태에서, 전달은 소수포 특히 리포좀에 있을 수 있다(문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)] 참조).

임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 제어 방출 또는 지속 방출 수단에 의해 또는 당업자에게 잘 공지된 전달 장치에 의해 투여될 수 있다. 예는 미국 특허 제3,845,770호; 제3,916,899호; 제3,536,809호; 제3,598,123호; 제4,008,719호; 제5,674,533호; 제5,059,595호; 제5,591,767호; 제5,120,548호; 제5,073,543호; 제5,639,476호; 제5,354,556호; 및 제5,733,556호에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된다. 이러한 제형은 다양한 비율로 목적으로 하는 방출 프로파일을 제공하기 위해, 예를 들어, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 다른 중합체 기질, 겔, 침투성 막, 삼투 시스템, 다층 코팅, 마이크로입자, 리포좀, 마이크로스피어 또는 이들의 조합물을 이용하는 하나 이상의 활성 성분의 제어 또는 지속 방출을 제공하는데 유용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 당업자에게 공지된 적합한 제어- 또는 지속 방출 제형은 본 명세서에 기재된 제제의 활성 성분과 함께 사용을 위해 용이하게 선택될 수 있다. 따라서 본 발명은 제어- 또는 지속-방출에 적합한, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 정제, 젤캡 및 캐플릿과 같은 경구 투여에 적합한 단일 단위 제형을 제공한다.

활성 성분의 제어- 또는 지속-방출은 pH 변화, 온도 변화, 적절한 빛의 파장, 효소의 농도 또는 이용가능성, 물의 농도 및 이용가능성 또는 다른 생리적 조건 또는 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 조건에 의해 자극될 수 있다.

다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability , Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)]; [Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol . Sci . Rev. Macromol . Chem . 23:61] 참조; 또한 문헌[Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol . 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조).

다른 실시형태에서, 제어 방출 시스템은 치료될 표적 면적에 가깝게 배치될 수 있고, 따라서 전신 용량 분획만을 필요로 한다(예를 들어, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533]에 의한 검토에서 논의되는 다른 제어-방출 시스템이 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)의 투여는 독립적으로 1일에 1 내지 6회(예를 들어, 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6회/일) 또는 1 내지 4회/개월 또는 1 내지 6회/년 또는 2, 3, 4 또는 5년에 1회일 수 있다. 투여는 1일 또는 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 3년의 지속기간 동안일 수 있고, 심지어 대상체의 수명 동안일 수 있다. 만성, 장기간 투여는 다수 경우로 나타날 것이다. 투약량은 단일 용량으로서 투여될 수 있거나 또는 다회 용량으로 나뉘어질 수 있다. 일반적으로, 몇개월 또는 몇 년 이상의 장기간의 투여가 필요할 수도 있지만, 목적으로 하는 투약량은 장기간 동안, 보통 적어도 몇 주 또는 몇 개월에 걸쳐 설정 간격으로 투여되어야 한다.

임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 이용하는 투약 요법은 대상체의 유형, 종, 연령, 성별 및 의학적 병태; 치료 중인 병태의 중증도; 투여 경로; 대상체의 신장 또는 간 기능; 개체의 약리유전체학 구성; 및 사용되는 본 발명의 구체적 화합물을 포함하는 다양한 인자에 따라 선택될 수 있다. 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 단일 1일 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 전체 매일의 투약량은 1일 2, 3 또는 4회의 분할된 용량으로 투여될 수 있다. 더 나아가, 임의의 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 투약량 요법 전체적으로 간헐적으로보다는 지속적으로 투여될 수 있다.

다양한 양상에서, 본 발명은 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 유효량의 베타-락타마제 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 투여하는 단계를 포함하는, GI관에서 항생제-유도 부작용을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 양상에서, 본 발명은 예방이 필요한 환자(비제한적 예로서, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 항생제를 투여 중인 환자 또는 투여될 환자)에게 본 명세서에 기재된 유효량의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 투여하는 단계를 포함하는, GI관에서 항생제-유도 부작용을 예방하는 방법을 제공한다. 다양한 양상에서, 본 발명은 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 본 명세서에 기재된 유효량의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 투여하는 단계를 포함하는, 클로스트리듐 디피실 감염(CDI) 및/또는 클로스트리듐 디피실-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 양상에서, 본 발명은 예방이 필요한 환자(비제한적 예로서, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 항생제를 투여 중인 환자 또는 투여될 환자)에게 본 명세서에 기재된 유효량의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 투여하는 단계를 포함하는, 클로스트리듐 디피실 감염(CDI) 및/또는 클로스트리듐 디피실-관련 질환을 예방하는 방법을 제공한다.

다양한 실시형태에서, 항생제-유도 유도 부작용 및/또는 CDI 또는 클로스트리듐 디피실-관련 질환은 항생제-관련 설사, 클로스트리듐 디피실 설사(CDD), 클로스트리듐 디피실 장 염증성 질환, 대장염, 가막성 대장염, 발열, 복통, 탈수 및 전해질 장애, 거대결장증, 복막염, 및 천공 및/또는 결장 파열 중 하나 이상이다.

다양한 양상에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 투여하는 단계를 포함하는, 위장의 마이크로바이옴을 보호하는 방법을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 치료를 받고 있거나 또는 최근에 항생제에 의한 치료를 받았다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 항생제를 분해 또는 불활성화할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 대상체는 마이크로바이옴-매개 장애에 대한 특정 위험에 있는 대상체, 비제한적 예로서, 항생제에 의한 치료를 받고 있는 또는 최근에 항생제에 의한 치료를 받은 대상체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 대상체는 과거 약 30일 동안 항생제를 취했을 수 있고/있거나 (예를 들어, 만성 질병으로부터) 쇠약한 면역계를 갖고/갖거나 여성이고/이거나 (예를 들어, 약 65세 이상의) 노인이고/이거나 노인 여성이고/이거나 속쓰림 또는 위산 장애에 의한 치료를 (예를 들어, 프레바시드(PREVACID), 타가메트(TAGAMET), 프릴로섹(PRILOSEC) 또는 넥시움(NEXIUM) 및 관련된 약물과 같은 제제에 의한) 겪고 있고/있거나 집중 치료실에서를 포함하여 병원에 있거나 또는 요양원에 살고 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 병원 감염 및/또는 2차 발생 감염 및/또는 원내 감염(hospital acquired infection: HAI)을 치료 또는 예방한다.

다양한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 마이크로바이옴-매개 장애를 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다. 예시적인 마이크로바이옴-매개 장애는, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 WO 2014/121298의 표 3에서 발견되는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 마이크로바이옴-매개 장애는 항생제-유도 부작용, 클로스트리듐 디피실 감염(CDI), 클로스트리듐 디피실-관련 질환, 궤양성 대장염, 크론병 및 과민성 대장 증후군으로부터 선택될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 마이크로바이옴-매개 장애는 항생제-유도 부작용, 클로스트리듐 디피실 감염(CDI), 또는 클로스트리듐 디피실-관련 질환이다. 실시형태에서, 본 발명은 항생제에 의한 치료를 받고 있거나 또는 최근에 항생제에 의한 치료를 받은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 투여하는 단계를 포함하는, GI관에서 항생제-유도 부작용을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 항생제에 의한 치료를 받고 있거나 또는 최근에 항생제에 의한 치료를 받은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)을 투여하는 단계를 포함하는, GI관에서 항생제-유도 부작용을 예방하는 방법을 제공한다.

다양한 실시형태에서, 본 용도 및 방법은 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물 및 본 명세서에 기재된 임의의 추가적인 제제와의 (동시 또는 순차적) 공동치료 및/또는 본 발명의 베타-락타마제의 제형 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 및 임의의 추가적인 제제의 공동 제형에 의한 임의의 초기 및/또는 보조 치료법 또는 치료 및/또는 본 명세서에 기재된 다양한 질환의 치료를 위한 임의의 초기 및/또는 보조적 치료법, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 추가적인 제제에 의한 치료를 받고 있는 환자에서 본 명세서에 기재된 다양한 질환을 치료하는 방법 및/또는 환자에게 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물을 투여하는 것에 의한 본 명세서에 기재된 임의의 초기 및/또는 보조 치료법에 관한 것이다.

다양한 실시형태에서, CDI 및/또는 클로스트리듐 디피실 관련 질환은 초기 개시 또는 재발/재발생과 관련하여(예를 들어, 지속적 또는 재시작된 항생제 치료법에 기인) 치료 또는 예방된다. 예를 들어, CDI로 이전에 고통받은 환자에서, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 재발의 제1 증상에 대해 투여될 수 있다. 비제한적 예로서, 재발 증상은 경증의 경우에, 약 5 내지 약 10회의 설사/일, 상당한 발열 없음, 및 단지 약한 복통을 포함하는 반면, 혈액 검사는 약 15,000개까지(정상 수준은 내지 약 10,000까지임) 백혈구 수의 약간의 상승을 나타낼 수 있고, 중증의 경우에, 약 10회 초과의 설사/일, 구역, 구토, 고발열(예를 들어, 약 102 내지 104°F), 직장 출혈, 중증의 복통(예를 들어, 누름압통이 있음), 복부 팽창, 및 고백혈구 수(예를 들어, 약 15,000 내지 약 40,000개)를 나타낼 수 있다.

초기 개시 또는 재발/재발생에도 불구하고, CDI 및/또는 클로스트리듐 디피실 관련 질환은 본 명세서에 기재된 임의의 증상을 통해 진단될 수 있다(예를 들어, 물같은 설사 2일 이상 동안 하루에 약 3회 이상, 배에서 경증 내지 악성의 크램핑 및 통증, 발열, 대변 내 혈액 또는 고름, 구역, 탈수, 식욕 상실, 체중 감소 등). 초기 개시 또는 재발/재발성에도 불구하고, CDI 및/또는 클로스트리듐 디피실 관련 질환은, 예를 들어, 클로스트리듐 디피실 독소 A 또는 B 항원 및/또는 글루타민 탈수소효소(GDH)(클로스트리듐 디피실 유기체에 의해 생성됨)를 검출하기 위한 효소 면역분석, 중합효소 연쇄 반응(예를 들어, 일루미진 램프(ILLUMIGENE LAMP) 분석을 포함하는 클로스트리듐 디피실 독소 A 또는 B 유전자 또는 이의 일부(예를 들어, tcdA 또는 tcdB)를 검출), 세포독성 분석을 통해 진단될 수 있다. 예를 들어, 다음의 시험 중 임의의 하나가 사용될 수 있다: 메리디안 이뮤노카드(ImmunoCard) 독소 A/B; 웜폴(Wampole) 독소 A/B 퀵 첵(Quik Chek); 웜폴 클로스트리듐 디피실 퀵 첵 컴플리트(Quik Chek Complete); 레멜 엑스펙트(Remel Xpect) 클로스트리듐 디피실 독소 A/B; 메르디안 프리미어 독소 A/B; 웜폴 클로스트리듐 디피실 톡스 A/B II; 레멜 프로스펙트(Prospect) 독소 A/B EIA; 바이오메리에욱스 비다스(Biomerieux Vidas) 클로스트리듐 디피실 독소 A&B; BD 게네옴(Geneohm) 클로스트리듐 디피실; 프로데세 프로가스트로(Prodesse Progastro) CD; 및 세펠드 엑스퍼트 클로스트리듐 디피실. 다양한 실시형태에서, 임상 샘플은 환자 분변 샘플이다.

또한 S자 결장검사 "스코프" 시험 및/또는 결장의 영상을 제공하는 복부 X-선 및/또는 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔이 환자를 평가하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 결장 벽에 부착된 특징적인 크림같은 백색 또는 황색 플라그를 찾음). 추가로, 생검(예를 들어, GI관의 임의의 영역)이 잠재적 CDI 및/또는 클로스트리듐 디피실 관련 질환 환자를 평가하기 위해 사용될 수 있다.

더 나아가, 본 발명의 환자는 CDI 및/또는 클로스트리듐 디피실 관련 질환에 대한 특정 위험에 있는 환자, 예컨대 과거 약 30일 동안 항생제를 취했을 수 있고/있거나 (예를 들어, 만성 질병으로부터) 쇠약한 면역계를 갖고/갖거나 여성이고/이거나 (예를 들어, 약 65세 이상의) 노인이고/이거나 노인 여성이고/이거나 속쓰림 또는 위산 장애에 의한 치료를 (예를 들어, 프레바시드, 타가메트, 프릴로섹 또는 넥시움 및 관련된 약물과 같은 제제에 의한) 겪고 있고/있거나 집중 치료실에서를 포함하는 병원에 있거나 또는 요양원에 살고 있는 환자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 병원 감염 및/또는 2차 발생 감염 및/또는 원내 감염(HAI)을 치료 또는 예방한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세프트리악손-관련 부작용(예를 들어, 설사, 구역, 구토, 미각장애 및 가막성 대장염 질환 및/또는 증상)을 치료 또는 예방한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 하나 이상의 1차 항생제에 의한 치료를 받고 있거나 최근에 받은 환자에 관한 것이다. "1차 항생제"는 환자에게 투여되는 항생제 및 CDI 및/또는 클로스트리듐 디피실 관련 질환을 초래할 수 있는 항생제를 지칭한다. 이들은 가장 종종 CDI 및/또는 클로스트리듐 디피실 관련 질환을 야기하는 항생제를 포함한다: 플루오로퀴놀론, 세팔로스포린, 클린다마이신 및 페니실린.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 대장 내로 유입되기 전에 1차 항생제를 가수분해시키는 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 GI관 내의 과량의 항생제 잔여물을 가수분해시키는 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 정상 장 미생물상을 유지하고/하거나 환자의 GI관 내 하나 이상의 병원성 미생물의 과성장을 방지하는 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)에 관한 것이다. 다양한 실시형태에서, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 1차 항생제의 혈장 수준을 실질적으로 방해하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 환자가 감염에 필요할 수 있는 1차 항생제를 받게 하고, 항생제의 전신 효용을 방해하지 않는다. 오히려, 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 GI관의 부분에 있을 수 있는 과량의 항생제를 불활성화시킬 수 있고, 그렇게 함에 있어서, 본 명세서에 기재된 다양한 질환 상태와 관련된 미생물상의 붕괴를 방지한다.

다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 전신으로 흡수되지 않는다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 전신으로 투여되는 항생제의 활성을 실질적으로 방해하지 않는다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 마이크로바이옴의 미생물상(예를 들어, 대장을 포함하는 장)을 방해하는 것으로부터 항생제를 제거하는 작용을 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 항생제 순환의 반감기를 충분히 변경하기 위해 장으로부터 및/또는 장간순환으로(enterohepatically) 항생제 흡수를 방해하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)은 임상적으로 중요하게 되는데 충분하게 장으로부터 및/또는 장간순환으로 항생제 흡수를 방해하지 않는다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 초기 및/또는 보조적 치료법이 환자에게 투여되는 것을 포함한다. 초기 및/또는 보조적 치료법은 이러한 질환의 검출 시 CDI 및/또는 클로스트리듐 디피실 관련 질환을 치료하기 위해 사용되는 치료법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 초기 및/또는 보조적 치료법은 메트로니다졸, 반코마이신, 피닥소미신, 리팍시민,　분변 박테리아요법, 프로바이오틱스 치료법, 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 치료법 중 하나 이상이다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 (공동 투여 또는 순차적 투여를 포함하는) 임의의 이들 초기 및/또는 보조적 치료법에 대한 애주번트로서 본 발명의 베타-락타마제의 용도를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 초기 및/또는 보조적 치료법을 받고 있는 환자에서 본 발명의 베타-락타마제의 용도를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 GI관에서 항생제-유도 부작용을 치료하고/하거나 클로스트리듐 디피실 감염(CDI) 및/또는 클로스트리듐 디피실-관련 질환의 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 양상에서, GI관에서 항생제-유도 부작용을 치료하고/하거나 클로스트리듐 디피실 감염(CDI) 및/또는 클로스트리듐 디피실-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 베타-락타마제 및/또는 약제학적 조성물의 용도가 제공된다. 추가로, 일부 양상은 GI관에서 항생제-유도 부작용을 치료하고/하거나 클로스트리듐 디피실 감염(CDI) 및/또는 클로스트리듐 디피실-관련 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 의약의 제조에서 개시된 베타-락타마제의 용도를 제공한다.

다양한 실시형태에서, 본 발명은 환자 장에서 다양한 대장균형(악성 및/또는 항생제 내성인 대장균형을 포함)의 과성장을 완화 또는 예방하는 조성물 및 방법을 제공한다. 다양한 양상에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 내성 유기체에 의한 2차 감염을 예방하거나 또는 감소시키고, 일부 실시형태에서, 베타-락탐 내성 발생을 감소시킬 수 있다. 추가로, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 내성 문제에 기인하여 현재 회피되는 베타-락탐 항생제의 사용을 허용할 수 있고/있거나 하나 이상의 베타-락타마제 저해제와의 공동 투여 또는 공동 제형화에 대한 필요를 감소시킬 수 있다(예를 들어, 오구멘틴(AUGMENTIN)은 아목시실린과 클라불란산의 혼합물이다).

일부 실시형태에서, 용어 "환자" 및 "대상체"는 상호호환적으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 포유류, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 기닉픽, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 토끼, 양 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지 또는 개코원숭이이다. 다른 실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 비인간 동물, 예를 들어, 제브라피시이다. 일부 실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 형광 표지된 세포(예를 들어, GFP를 지님)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 형광 세포를 포함하는 유전자이식 동물이다.

일부 실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 인간은 소아 인간이다. 다른 실시형태에서, 인간은 성인 인간이다. 다른 실시형태에서, 인간은 노인 인간이다. 다른 실시형태에서, 인간은 환자로서 지칭될 수 있다.

특정 실시형태에서, 인간은 약 6 내지 약 18개월령, 약 18 내지 약 36개월령, 약 1 내지 약 5세, 약 5 내지 약 10세, 약 10 내지 약 15세, 약 15 내지 약 20세, 약 20 내지 약 25세, 약 25 내지 약 30세, 약 30 내지 약 35세, 약 35 내지 약 40세, 약 40 내지 약 45세, 약 45 내지 약 50세, 약 50 내지 약 55세, 약 55 내지 약 60세, 약 60 내지 약 65세, 약 65 내지 약 70세, 약 70 내지 약 75세, 약 75 내지 약 80세, 약 80 내지 약 85세, 약 85 내지 약 90세, 약 90 내지 약 95세 또는 약 95 내지 약 100세 범위의 연령을 가진다.

다른 실시형태에서, 대상체는 비-인간 동물이고, 따라서 본 발명은 수의과적 용도에 관한 것이다. 구체적 실시형태에서, 비-인간 동물은 애완동물이다. 다른 구체적 실시형태에서, 비-인간 동물은 가축 동물이다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 제제의 투여를 단순화할 수 있는 키트를 제공한다. 본 발명의 예시적인 키트는 단위 제형으로 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 포함한다. 일 실시형태에서, 단위 제형은 멸균이고 본 명세서에 기재된 임의의 제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 비히클을 함유할 수 있는 사전 충전된 주사기와 같은 용기이다. 상기 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 제제의 용도를 지시하는 라벨 또는 인쇄된 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 리드 스페큘럼(lid speculum), 국소 마취제 및 투여 위치에 대한 세정제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 추가적인 제제를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 키트는 유효량의 본 발명의 조성물 및 유효량의 다른 조성물, 본 명세서에 기재된 것을 함유하는 용기를 포함한다.

본 발명은 다음의 비제한적 예에 의해 추가로 예시된다.

실시예

다음의 약어를 전체적으로 사용한다:

실시예 1: 물질 및 방법

SOE 또는 퀵 체인지(QUIKCHANGE) 다중 부위-지정 돌연변이유발 키트(미국 캘리포니아주에 소재한 스트라타겐(Stratagene))를 이용하는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 또는 진몰프(GeneMorph)(등록상표) II 무작위 돌연변이유발 키트(미국 캘리포니아주에 소재한 스트라타겐)를 이용하는 무작위 돌연변이유발에 의해 상이한 P1A 돌연변이체를 생성하였다. 돌연변이시킨 DNA를 이콜라이 또는 바실러스 서브틸리스 중 하나의 박테리아로 형질전환시키고, 이를 세포탁심(부위-지정 돌연변이체) 또는 세프트리악손(무작위 돌연변이체) 상에서 선별하였다. 콜로니 중의 β-락타마제의 존재를 나이트로세핀 시험에 의해 추가로 확인하였고, 양성 콜로니를 추가 분석을 위해 선택하였다. 돌연변이체 β-락타마제의 DNA 서열을 서열분석에 의해 확인하였다.

돌연변이체의 β-락타마제 활성을 암피실린, 세포탁심, 세프트리악손, 세푸록심, 세프타지딤, 메로페넴 및 이미페넴을 지니는 이콜라이 세포 용해물 및 바실러스 서브틸리스 상청액으로부터 추가로 특성규명하였다. 시험한 각각의 항생제의 단지 하나의 기질 농도를 이용하여 활성을 결정하였다. 실행적인, [S] >> Km인 것만큼 높게 항생제 농도의 선택을 행하였다. 이들 예비 실험에 기반하여, 부위-지정과 무작위 돌연변이유발 연구 계통 둘 다로부터의 돌연변이체의 결합에 대해 더 정확한 역학 매개변수를 결정하였다. 더 상세한 연구에 대해 선택한 모든 돌연변이체 효소를 바실러스 서브틸리스 숙주 균주 RS303에서 발현시켰다. 세포를 채취한 후에 돌연변이 단백질을 운반하는 세포를 밤새 최소 배지에서 성장시키고, 상청액을 아미콘 울트라-4(Amicon Ultra-4) 원심분리 장치, MWCO 10000(아미콘(Amicon))을 이용하여 1:10으로 농축시켰다. 각각의 배양 상청액에서 단백질 농도를 표준으로서 P1A 기준 물질 A18K31을 이용하여 12% SDS-PAGE(기준 XT 비스-트리스, 미국 캘리포니아주에 소재한 바이오라드)로부터 추정하였다. 역학 매개변수를 각각 선택된 돌연변이체 균주에 대해 세포탁심, 세프트리악손 및 세푸록심에 대해 측정하였다. 부위-지정 돌연변이체를 세포탁심을 가수분해시키도록 설계하고 나서, 무작위 돌연변이체를 세프트리악손을 이용하여 선별하고, 이들 항생제를 역학 매개변수를 결정하기 위한 천연 선택으로 만들었다.

P1A 변형

다음을 포함하는 P1A에서 일련의 돌연변이를 생성하였다:

(표 1)

부위-지정 돌연변이유발과 유사하게, 무작위 돌연변이유발을 선별 항생제로서 세프트리악손을 이용하여 P1A 및 P3A 상에서 행하였다.

또한 품질 제어 연구에 대해 이루어진 P1A의 두 변형 돌연변이체가 있다: P1A-N293D(IS205, "탈아마이드화 돌연변이체") 및 P1A-ΔMNGK(IS206, "결실 돌연변이체"). 이들 균주는 둘 다 P1A-균주 RS310와 동일하게 성장하였고, 단백질 생성을 마찬가지로 거의 동일하였다. 이들 돌연변이는 둘 중 하나의 단백질의 결정성에 영향을 미치지 않았다.

선택된 CTX-M-효소의 서열은 스위스-프롯(Swiss-Prot) 단백질 서열 데이터 뱅크로부터 유래하였고, 3D 구조는 단백질 데이터 뱅크(PDB)로부터 유래되었다. 개개 서열 및 구조에 대한 수탁 코드를 이하에 나타낸다. 일부 예에서, 이 데이터를 사용하여 구조 기능성 활성을 예측하였다.

본 연구에서 사용한 효소에 대한 예시적인 스위스- 프롯 또는 TrEMBL , 젠뱅크 및 단백질 데이터 뱅크( PDB ).

리눅스(Linux) 워크스테이션 및 페도라 코어 5(Fedora Core 5) 작업 시스템을 연구 플랫폼으로서 사용하였다. 서열 정렬 및 분석뿐만 아니라 모델링 및 3D 구조 분석을 보딜(Bodil) 분자 모델링 환경에 의해 수행하였다.

추가적으로, 몇몇 다른 P1A 돌연변이체를 설계하고 생성하였다. 이들 돌연변이체 중 하나는 IS288였고, 이는 다음의 돌연변이를 가진다: A232G, A237S, A238G, A240S 및 D276N. 4가지 돌연변이 A232G, A237S, A238G 및 A240S는 소위 "블록2"-돌연변이이다. 제5 돌연변이체인 D276N은 단독으로 세프트리악손을 분해하는 단백질 능력을 제공하는 "P3A"-돌연변이이다. P1A 변이체 IS288은 P1A 유전자에 대한 2회의 돌연변이유발 및 분비된 P1A 변이체의 예비 활성 분석의 결과였다. 부위-지정 돌연변이유발에 의해 이루어진 몇몇 P1A 변이체를 바실러스 서브틸리스 생성 숙주 내로 클로닝시키고 나서, 진탕기 플라스크 배양에서 생성하였다. 이들 돌연변이체 균주의 성장 상청액을 농축시키고 나서, 선택한 세팔로스포린을 분해하는 각각의 균주 능력을 측정하기 위해 사용하였다. IS288을 더 대규모로 생성하고 나서, 황산암모니아 침전, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 초미세여과를 이용하여 정제하였다. 선택한 P1A 변이체 IS288를 더 상세하게 특성규명하기 위해 상기 연구를 시작하였다.

HIC에 의한 정제에 추가적으로, 추가로 탈염하고 용리된 단백질 피크에서 단백질의 양 및 순도를 특성규명하기 위한 방법을 개발하였다.

소수성 상호작용 크로마토그래피, 즉, HIC는 생체분자의 분리가 배지의 소수성 사이의 상호작용, 샘플의 특성 및 조성, 표면-노출된 소수성 아미노산 잔기의 널리퍼짐 및 분포, 및 결합 완충제 중의 염의 유형 및 농도에 기반하는 방법이다. 겔 기질 내로 단백질의 흡수는 항-카오트로픽(anti-chaotropic) 염, 예컨대 (NH₄)₂SO₄ 및 Na₂SO₄의 농도; 더 높은 염 농도, HIC 매질의 더 강한 흡수 능력에 의존한다. HIC 기질은 뷰틸, 옥틸 또는 페닐기와 같은 상이한 유형의 소수성 치환체를 가질 수 있다. 뷰틸 세파로스를 HIC 기질로서 선택하였는데, 적절하게 용리되지 않는 옥틸 세파로스에 P1A가 단단히 결합되기 때문이다.

IS288 정제 절차:

첫 번째 날에, 소량의 냉동 IS288 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포 배양물을 10㎍/㎖카나마이신을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에서 도말하였다. 다음날 아침에 이 플레이트로부터 단일 배양물을 취하였고, 진탕기 플라스크 배양을 위해 10 X 3㎖의 최소 성장 배지 내에 접종시켰다. 동일한 날의 오후에, 100㎖에서 밤새(o/n) 0.01 시작 OD₆₀₀을 초래하는 용적을 3㎖ 사전 배양물로부터 취하였다. 100㎖ 배양물을 +37℃에서 밤새 진탕기에서 인큐베이션시켰다. 3㎖ 사전 배양물의 결합으로부터, OD₆₀₀=1 글리세롤 저장액(10% 글리세롤)을 생성하였다. 글리세롤 저장액을 -70℃에서 저장하였다.

제3일에, 대략 16시간의 배양 후에, 최종 OD₆₀₀의 진탕기 플라스크 배양을 측정하고 나서, 세포를 SLA-3000 로터(+4℃에서 7000rpm, 10분)를 이용하여 원심분리시켰다(소발 RC6(Sorvall RC6)). 배양물 상청액을 수집하고 나서, 합하고, 이어서, 0.2㎛ 필터를 이용하여 여과시켰다. 여과액의 용적을 대략 745㎖로 측정하였다. 70% (NH₄)₂SO₄ 포화를 초래하는 326.86g의 고체 (NH₄)₂SO₄를 칭량하고 나서, 상청액 낼 대략 33g 분취액으로서 첨가한 한편, 지속적으로 혼합하였다. 일단 모든 염이 용해되면, 용액을 +4℃ 냉장고에 옮겼다.

다음날 아침에, 황산암모니아 용액을 SLA-3000 로터(90분, 10500rpm, +4℃, 가속 9 및 감속 4)를 이용하여 원심분리시켰다(소발 RC6). 원심분리 후에, 상청액을 합하고 나서, 0.2㎛ 멸균 필터를 통해 여과시켰다. 72.5㎖의 여과액을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 위해 취하였다. 여과액의 나머지를 17 x 50㎖ 분취액으로 나누고 나서, +4℃에서 처음 저장하고 나서, 이후에, -20℃로 옮겼다. 게다가, 여과액의 두 1㎖ 샘플을 취하고 나서, +4℃에서 처음 저장하고 나서, 이후에, -20℃로 옮겼다.

황산암모니아 여과액의 (NH₄)₂SO₄ 농도는 대략 2.7M이 되는 것으로 추정하며, 190mM Na-H-인산염 완충제, pH 6.8을 이용하여 (NH₄)₂SO₄의 농도가 대략 2M로 감소되도록 희석시켰다. 여과액에 50mM Na-H-인산염, pH 6.9, 2M(NH₄)₂SO₄를 이용하여 평형상태로 만든 5㎖ 하이트랩 뷰틸(HiTrap Butyl) FF 칼럼에서 HIC를 실시하였다. 총 50㎖의 샘플을 칼럼을 통해 펌핑하고 나서, 통과액을 5㎖ 분획으로서 수집하였다. 비결합 샘플을 50mM Na-H-인산염, pH 6.9, 2M (NH₄)₂SO₄를 이용하여 세척하였다. 단계 구배 및 50mM Na-H-인산염, pH 6.8을 이용하는 감소되는 (NH₄)₂SO₄ 농도를 이용하여 결합된 IS288을 용리시켰다. 제1 실행에서, 용리 분획은 1㎖였다. 용리된 단백질을 함유하는 분획을 3개의 상이한 세트(C3-C8, C9-D1 및 D2-D8)에서 합하였다. 통과액 분획 및 나머지 용리 분획을 +4℃에서 저장하였다. 샘플을 통과액 분획 B1 및 B8뿐만 아니라 풀링한 단백질 분획으로부터 취하고 나서, +4℃에서 저장하였다.

HIC 단계를 상이한 샘플 용적, 즉 평형상태의 황산암모니아 여과액 65㎖ 및 125㎖에 대해 2회 반복하였다. 이들 후자의 HIC 실행을 제1 실행으로부터 다소 변형시켰다. 비결합 샘플에 대한 세척 용적은 3 및 4 CV였고, 통과액 분획의 용적을 10㎖로 증가시켰으며, 용리 분획의 용적을 1.5㎖로 증가시켰다. 실행 조건에 대한 다른 변형은 이루어지지 않았다.

제1 실행의 B1 및 B8의 풀링한 단백질 분획뿐만 아니라 통과액 분획을 초미세여과시켰고, 10000 NMWL을 지니는 아미콘 울트라-4 농도를 이용하여 농축시켰다. 샘플을 6회 원심분리시키고, 각각의 원심분리 후에, 마지막 하나를 제외하고, 4㎖ 용적을 얻기 위해 나머지 샘플 또는 완충제를 잔류물에 첨가하였다. 제6 농축 단계 후에, 잔류물을 수집하고 나서, 측정하고, +4℃에서 저장하였다. 연속 HIC 실행으로부터의 샘플뿐만 아니라 제1 실행으로부터의 하나 이상의 통과액 분획을 초미세여과시키고 나서, 10000 NMWL을 지니는 아미콘 울트라-15를 이용하여 농축시켰고, 4회의 원심분리 라운드만이 필요하였다. 이들 샘플을 또한 +4℃에서 저장하였다. 황산암모늄 여과액을 초미세여과시키고 나서, 농축시키고, 통과액 분획을 10000 NMWL의 울트라셀-10 막을 지니는 멀티스크린(MultiScreen) 필터 플레이트를 이용하여 1회 이상 농축시켰다. 통과액 샘플의 단백질 농도를 이 마지막 농축 단계 전에 측정한 반면, 황산암모니아 여과액에 대한 단백질 농도를 측정하지 않았다.

샘플의 단백질 농도를 BCA 단백질 분석-키트를 이용하여 측정하였다.

로부터 얻은 용리 피크에 기반하여, 용리 단백질 분획을 대략 1:20 및 대략 1:40으로 희석시킨 반면, 통과액 분획을 이와 같이 사용하였고(1:1 희석) 또는 절반으로 희석시켰다(1:2 희석).

최종적으로, 모드 3회의 정제로부터의 샘플을 크기가 6 내지 66kDa의 단백질을 최적으로 분리시키기 위해 MOPS 실행 완충제를 이용하여 기준 XT 12% 비스-트리스 SDS-PAGE 상에서 실행하였다. 최대량의 샘플을 황산암모니아 여과액, 및 단백질 함량이 33 X 농축 샘플 중에서 0.21㎍/㎕가 되는 것으로 결정한 B1₁₂₁₁₀₈를 제외한 모든 통과액 분획에 대해 첨가하였다. 0.5㎍의 단백질이 겔 상에서 장입되도록 피펫팅한 단백질 피크 분획의 양을 계산하였다.

IS288의 정제된 단백질 용액을 사용하여 질량 단위 당 IS288의 활성을 결정하였다. 단백질이 분해되거나 일부 다른 방법에 의해 저장 동안 변형되는지를 판명하기 위해 저장 조건에서 IS288의 안정성을 시험하였다. 표적 부위 기질에서 단백질의 안정성을 또한 결정하였다. 표적 부위 기질에서 안정성 분석으로부터의 결과를 활성 분석으로부터의 결과와 조합하여 소장 내 항생제 잔사를 제거하기 위해 IS288에 대해 취한 시간을 추정한다.

P1A 변이체 IS288에 대한 더 상세한 정보를 얻기 위해, 연구 동안 생성한 특징 계획을 다른 후속적 P1A 변이체의 특성규명에서 사용하였다.

P1A 변이체 IS288의 생성 수준을 연구하는 방법

바실러스 서브틸리스 진탕기 플라스크 배양 동안, 샘플을 다양한 시점에 취하여서 IS288의 생성 수준을 평가하였다. 세포가 성장하는 방법도 알아보기 위해 OD₆₀₀ 값을 각각의 시점에 대해 측정하였다. 생성된 단백질의 양을 SDS-PAGE 상에서 추정하였다.

상이한 pH 수준에서 효소 효능 및 항생제 범위를 연구하기 위한 방법

이 연구에서 사용한 항생제는, 예를 들어, 정맥내로 투여한 세팔로스포린의 선택이었다. 선택된 항생제의 농도는, 이론에 의해 구속되는 일 없이 가능하다면 담즙 또는 십이지장 내의 문헌 보고 농도에 가깝게 설정하였다. 이 실험을 또한 다양한 pH에서 수행하였다.

인간 회장 유미즙에서 효소 안정성을 연구하기 위한 방법

상이한 양의 정제된 효소를 설정한 일정 시간 동안 적절한 온도에서 인간 회장 유미즙 중에서 인큐베이션시켰다. 상이한 시점에 샘플을 취하였다. IS288의 분해 패턴을 SDS-PAGE를 이용하여 분석하고 나서, IS288의 활성을 기질로서 나이트로세핀을 이용하여 분석하였다.

화합물 및 박테리아 균주: 암피실린, 세프트리악손, 세프타지딤, 메로페넴, 세페핌, 세파졸린, 암피실린/설박탐, 세포페라존, 세포탁심 및 세푸록심을 상업적 공급원으로부터 구입하고 나서, 각각 15㎎/㎖ 및 10㎎/㎖의 냉동 저장액으로서 저장하였다. P1A를 32㎎/㎖의 저장액 농도로서 신테틱 바이올로직스(Synthetic Biologics)에 의해 공급하였고, -80℃에서 저장하였다. 에스케리키아 콜라이 ATCC 25922를 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC, 버지니아주 매너서스에 소재)로부터 얻었다.

P1A(RS310), P3A(IS118), 및 P4A(IS288)의 부재 및 존재에서 효과적인 저해 농도의 결정: 암피실린, 세프트리악손, 세프타지딤, 메로페넴, 세페핌, 세파졸린, 암피실린/설박탐, 세포페라존, 세포탁심 및 세푸록심의 효과적인 저해 농도(EC50, 90)를 CLSI 가이드라인(M07-A9: 호기성으로 성장하는 박테리아에 대한 희석 항미생물 감수성 시험을 위한 방법; 승인 표준 - 제9판)에 따라 마이크로브로스 희석 분석에 의해 결정하였다. 에스케리키아 콜라이 균주 25922를 대기 환경에서 37℃로 양이온 조절 뮐러-힌톤(Mueller-Hinton)에서 대수증식까지 글리세롤 저장액으로부터 배양시키고, 양이온 조절 뮐러-힌톤 브로스에서 희석시켜 5 x 105 CFU/㎖의 웰 놀도에서 시작을 달성하였다. 항미생물 화합물의 연속 2-배 희석을 양이온 조절 뮐러-힌톤 브로스에서 제조하여 암피실린에 대해 128㎍/㎖ 내지 0.13㎍/㎖ 및 P1A, P3A 또는 P4A β-락타마제 표준의 연속 10배 희석 없이 또는 존재하에 4㎍/㎖ 4ng/㎖, 암피실린에 대해 5pg/㎖ 내지 50ng/㎖ 및 세프트리악손, 세프타지딤, 메로페넴, 세페핌, 세파졸린, 암피실린/설박탐, 세포페라존, 세포탁심 및 세푸록심에 대해 50pg/㎖ 내지 500ng/㎖의 웰 농도를 최종적으로 달성하였다. 항생제를 P1A에 첨가하고, 박테리아의 첨가 전에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시키거나(사전-인큐베이션), 또는 P1A, P3A, P4A 및 박테리아(동시)의 첨가 후 플레이트에 첨가하였다. 모든 농도 및 조합물을 배지 단독, 화합물 + 배지 단독(비색 대조군) 및 비처리 박테리아 대조군을 함유하는 96-웰 플레이트에서 3회 중복해서 평가하였다. 밤새 인큐베이션 후에, 플레이트의 OD625를 스펙트라맥스 384(Spectramax 384) 플레이트 리더에서 측정하고 나서, 데이터를 선형 회귀 분석에 의해 50%, 90% 및 99%(EC50, 90, 99)만큼 박테리아 성장을 저해한 효과적인 농도의 결정을 위해 맞춤형 엑셀 스프레드시트에 입력하였다.

실시예 2: 돌연변이유발의 결과

돌연변이 설계는 특히 다음의 구조적 데이터(예를 들어, 결정 구조 데이터, 상동체 모델 등)에 기반하였다: P1A 결정 구조(Knox and Moews, J. Mol Biol ., 220, 435-455 (1991)), CTX-M-44(1BZA (Ibuka et al. Journal of Molecular Biology Volume 285, Issue 5 2079-2087 (1999), 1IYS(Ibuka et al. Biochemistry, 2003, 42 (36): 10634-43), 1IYO, 1IYP 및 1IYQ(Shimamura et al. 2002 　J. Biol . Chem.　277:46601-08), 프로테우스 불가리스 K1(1HZO, Nugaka et al. J Mol Biol . 2002 Mar 15;317(1):109-17) 및 프로테우스 펜네리 HugA(Liassine et al. Antimicrob Agents Chemother.　2002 Jan;46(1):216-9. 2002), 및 (CTM-X에 대해) 문헌[Bonnet, Antimicrob . Agents Chemother 48(1): 1-14 (2004)]에서 검토, 모든 이들 문헌의 내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 일부 실시형태에서, 본 돌연변이는 다음의 β-락타마제 중 임의의 하나의 구조적 데이터(예를 들어, 결정 구조 데이터, 상동체 모델 등)의 분석에 의해 알려진다: P1A, P2A, P3A, CTX-M-3, CTX-M-4, CTX-M-5, CTX-M-9, CTX-M-10, CTX-M-14, CTX-M-15, CTX-M-16, CTX-M-18, CTX-M-19, CTX-M-25, CTX-M-26, CTX-M-27, CTX-M-32, CTX-M-44, CTX-M-45 및 CTX-M-54. 이러한 정보는 공지된 데이터베이스, 예를 들어, 스위스-프롯 단백질 서열 데이터 뱅크, NCBI 및 PDB에서 당업자가 이용 가능하다.

부위-지정 및 무작위 돌연변이유발로부터의 결과를 각각 표 2 및 표 3에 요약한다. 선택된 돌연변이체에 대한 효소 활성을 표 4에 제시하고, 역학 매개변수를 표 5에 나타낸다. 이전의 효소 P1A, P3A 및 P2A에 대한 역학 매개변수를 또한 해당 표에 포함한다.

돌연변이 블록 1. I72S, Q135M 및 T160F

I72S, Q135M 및 T160F를 포함하는 돌연변이의 제1 블록을 퀵 체인지 다중 부위 지정 돌연변이 유발 키트(이후에 멀티 키트로 약칭함)(스트라타겐)를 이용하는 1회의 반응으로 돌연변이 프라이머에 도입하였다. penP 유전자를 운반하는 플라스미드를 돌연변이유발 반응에서 주형으로서 사용하였다. 돌연변이체 단일-가닥 플라스미드를 이콜라이 XL10골드로 형질전환시키고 나서, 카나마이신/클로람페니콜을 이용하여 선택하였다. 적격 XL10 골드 세포를 멀티 키트로 제공한다. 콜로니(10 내지 30)를 선별하고 나서, 나이트로세핀으로 검사하여 β-락타마제 활성을 확인하였다. 콜로니의 부분을 PCR에서 주형으로서 사용하고, 얻어진 단편이 깨끗하다면 DNA 서열분석으로 보냈다. 콜로니의 나머지를 적절한 항생제로 보충한 루리아(Luria)에서 밤새 37℃로 배양시키고 나서, 배양물의 부분을 글리세롤(≤10%, 최종) 중에 저장하고, 다른 부분을 플라스미드 단리를 위해 사용한다. 목적으로 하는 돌연변이를 DNA 서열분석에 의해 확인한 후에, 돌연변이체 클론을 더 상세하게 특성규명하였다. 주변세포질 용해물을 준비하고 나서, SDS PAGE에서 분석하고, 세포탁심 가수분해의 역학을 분광광도적으로 측정하였다.

돌연변이 블록 2. A232G, A237S, A238G 및 S240D

다중 부위 프로토콜이 적어도 1라운드에 적합하지 않은 P1A의 B3 β-가닥의 표적 아미노산을 서로 가깝게 위치시킨다. 대신, 모두 4종의 아미노산을 SOE 기법을 이용하여 교환하였다. 교환을 포함하는 영역은 24개 뉴클레오타이드(8개 아미노산 코돈)를 함유하였고, 두 PCR 프라이머의 중복 연장부에 포함시켰다. 돌연변이된 penP 유전자를 프라이머 A+B 및 C+D를 이용하여 두 부분으로 처음 PCR 하였다(도 7). 이어서, 두 PCR 산물을 합하고, penP 유전자의 5' 및 3' 부분에 상보적인 프라이머 A 및 D를 이용하여 증폭시켰다. 클로닝 부위를 프라이머 A 및 D에 포함시켰다. 일단 작제물이 준비되면, 멀티 키트를 이용하여 추가 돌연변이를 첨가하였다.

추가 돌연변이, R244T 및 D276R(K)

이들 돌연변이를 다중 부위 키트 기법 및 주형으로서 이전에 제조한 플라스미드를 이용하여 첨가하였다. 구성된 돌연변이의 목록을 표 1에 나타낸다. 돌연변이 조합의 수를 용이하게 증가시켰고, 결과적으로 개개 클론의 세포탁심 분해 역학을 측정하는 것보다 더 강력한 방법으로 특성규명을 행하였다. 1차 특성규명은 세포탁심 MIC의 결정이었다.

구성한 돌연변이 및 다른 가능한 조합

클론	기법	아미노산 치환
블록 1	다중 키트	I72S, Q135M, T160F
	다중 키트	I72S, T160F
	다중 키트	I72S, Q135M
	다중 키트	I72S
	다중 키트	Q135M
	다중 키트	T160F
블록 2	SOE	A232G, A237S, A238G, S240D
	SOE + 다중 키트	A232G, A237S, A238G, S240D + R244T
	SOE + 다중 키트	A232G, A237S, A238G, S240D + D276R(K)
	SOE + 다중 키트	A232G, A237S, A238G, S240D + R244T+ D276R(K)
	SOE + 다중 키트	A232G, A237S, A238G, S240D + I72S, Q135M, T160F
	SOE + 다중 키트	A232G, A237S, A238G, S240D + I72S, Q135M, T160F + R244T
	SOE + 다중 키트	A232G, A237S, A238G, S240D + I72S, Q135M, T160F + D276R(K)
	SOE + 다중 키트	A232G, A237S, A238G, S240D + I72S, Q135M, T160F + R244T + D276R(K)
	다중 키트	R244T
	다중 키트	D276R(K)
	다중 키트	R244T+ D276R(K)
	다중 키트	I72S, Q135M, T160F + R244T
	다중 키트	I72S, Q135M, T160F + D276R(K)
	다중 키트	I72S, Q135M, T160F + R244T + D276R(K)

효소 활성 및 역학 매개변수

이론에 의해 구속되는 일 없이, 세포탁심, 세프트리악손 및 세푸록심에 대해 P1A에 대해 측정한 역학 매개변수로부터, P1A는 낮은 고유한 세팔로스포리나제 활성을 가진다는 것을 추론하였다. 일반적으로, 리간드에 대한 돌연변이체의 친화도는 증가되었다(즉, 감소된 Km). IS229(블록 2 + R244T) 돌연변이체에서 V_max는 증가되고, 친화도는 감소되었다(Km는 증가됨)(표 5). IS229에 대해, k_cat는 대부분 증가되었다.

세프트리악손을 이용하는 무작위 돌연변이유발 선별은 항생제에 대해 낮은 Km(고 친화도)을 지니는 돌연변이체에 바람직하다.

후속 돌연변이 라운드에 의한 Km의 감소는 돌연변이 계열 P3A → IS158 → IS232에서 볼 수 있었고; IS232는 세프트리악손에 대해 극도로 높은 친화도를 가졌다. 세프트리악손에 대한 V_max는 IS158에 대해 가장 높게 되도록 순차적으로 감소되지 않았지만, 그럼에도 불구하고, k_cat는 돌연변이 라운드를 통해 감소되었다. 이 라운드의 제1의 두 돌연변이체는 세포탁시마제 활성을 갖지 않지만, 추가적인 A238T를 지니는 IS232는 세포탁시마제 활성을 가진다.

부위-지정 블록2(IS191) 돌연변이 단독은 세팔로스포린에 대해 P1A-유도체 활성을 현저하게 증가시키지 않았지만, 암피실린에 대한 활성은 20배 감소되었다(표 4). 블록2+D276R/K(IS219/IS221)의 세팔로스포리나제 활성은 IS191의 활성보다 상당히 더 양호하였다. IS219 및 IS221 부위-지정 돌연변이체의 역학 매개변수는 부위-지정 돌연변이유발이 표적 항생제에 대해 효소 친화도를 바람직하게 증가시켰다는 것을 나타내었다.

안정성 분석/글루코스 스트레스 시험

바실러스 서브틸리스 성장 조건에서 돌연변이체의 안정성을 시험하기 위해, RS310, IS219 및 IS232를 지니는 진탕기 플라스크 배양을 수행하였다. 5g/ℓ 및 10g/ℓ의 2가지의 상이한 글루코스 농도로 배양시켰다.

P1A(RS310) 및 두 돌연변이체 IS219 및 IS232를 5 또는 10g/ℓ 글루코스를 지니는 최소 배지에서 진탕기 플라스크(100㎖)에서 배양시켰다. 세포의 상태를 현미경으로 모니터링하고 나서, 글루코스 소모를 5g/ℓ 성장으로부터 측정하였고, 배양 상청액으로부터의 샘플(농축 및 비-농축)을 12% 비스-트리스 SDS-PAGE(크리테리온(Criterion), 바이오라드) 상에서 실행하였다(도 1 및 도 2). 세포 배양물의 OD를 또한 모니터링하였다.

10g/ℓ 글루코스 배양물에서, P1A 및 IS232를 상당한 양으로 생성하였지만, IS219의 생성은 더 낮았다(레인 2 내지 4, 도 1). 농축 동안, IS219 수율은 추가로 감소되었다(레인 6, 9 및 16, 도 1). 도 1의 레인 16에서 약한 밴드 대략 29kDa을 볼 수 있다. P1A 및 IS232는 또한 농축될 수 있다(레인 5, 7, 8, 10, 15 및 16 도 1).

5g/ℓ 글루코스의 존재에서, P1A 균주 RS310는 다른 두 균주보다 더 느리게 성장하기 시작하였다. 그러나, 배양의 마지막까지, P1A의 양은 다른 단백질의 양을 대신하였다(도 2). 돌연변이체 균주 IS219는 균주 IS232와 거의 동일한 속도로 생성을 시작하였지만, 배양의 10시간까지 그의 생성은 IS232보다 뒤떨어지기 시작하였고, 그의 양은 시간에 따라 감소되었다. 모든 글루코스는 IS219와 IS232 배양 둘 다에서 그리고 프로테아제의 양이 증가하기 시작하는 것으로 추정되는 시점으로부터 배양의 9.5시간까지 소모되었다. RS310이 더 느리게 성장하기 때문에, 11시간의 배양에 일부 글루코스가 여전히 남아있었지만, 또한 RS310은 다음날 아침까지 모든 글루코스를 소모시켰다. 밤 동안 RS310으로부터 취한 샘플이 없었기 때문에, RS310이 모든 그의 글루코스를 사용하고 프로테아제를 생성하기 시작한 정확한 시점은 언급할 수 없다. 배양의 27.5시간까지, P1A의 양은 증가되었지만, IS219와 IS232 둘 다의 양은 이전 날보다 감소되었다. 연구로부터, 이론에 의해 구속되는 일 없이, IS232는 프로테아제를 전혀 견디지 못한 IS219보다 프로테아제를 더 잘 견딘다는 것을 추론할 수 있다.

10g/ℓ 글루코스와 5g/ℓ 글루코스 배양 둘 다에 기반하여, 이론에 의해 구속되는 일 없이, P1A에 대한 변형이 단백질의 프로테아제 내약성을 감소시키는 것을 언급할 수 있다. 글루코스 부족은 IS219 및 IS232의 경우에 분해 산물의 출현을 야기하며, 분해 산물의 양은 모든 글루코스가 소모된 후에 증가되었다. IS219 단백질은 그것의 양이 IS232의 양보다 더 감소됨에 따라 분해에 더 민감하게 되었다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 이는 바실러스 프로테아제에 대해 더 낮은 분비능력 또는 더 큰 민감성 또는 둘 다를 나타낼 수 있다. 결과적으로, IS219의 생성은 RS310 및 IS232와 동일한 성장조건을 이용하는 것이 가능하지 않았다. 글루코스 스트레스 시험은 또한 이 시험이 생성된 돌연변이체의 프로테아제 내약성을 추정하기 위해 사용될 수 있다는 것을 입증하였다.

글루코스 스트레스 시험에 의해, 블록2 + D276R = IS219(및 가장 유사하게는 블록2 + D276K = IS221) 돌연변이는 효소의 프로테아제 내약성을 감소시킨다는 것을 입증되었다. 가장 유사하게는, 이론에 의해 구속되는 일 없이, 불안정성은 단백질 표면 상의 프로테아제 절단 부위를 생성하는 D276R 돌연변이에 기인한다.

블록2 + D276N 돌연변이체를 야기하는 IS191 상의 D276N 돌연변이체를 생성하였다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 아스팔트산의 아스파라긴으로의 돌연변이는 IS191의 세프트리악손(및 세포탁심일 수 있음) 활성을 증가시키는 것으로 예상되지만, 동시에 IS219(및 IS221)보다 프로테아제에 대해 더 내성이 있게 유지시킨다. R244T 돌연변이는 본 발명자들이 이 돌연변이에 의해 V_max(및 k_cat)를 증가시킬 수 있는지의 여부를 알기 위해 블록2 및 D276N과 조합할 수 있었다. R244T 돌연변이를 또한 IS219 및 IS221과 조합할 수 있었다.

활성 분석(표 4) R244T(IS217) 돌연변이는 P1A의 거의 모든 효소 활성을 없앴다. 이중 돌연변이체 R244T+D276K(IS215)에 의해 일부 활성을 얻었지만, 야생형 효소 수준은 아니었다. 따라서, R244T 돌연변이 단독은 세팔로스포리나제 활성을 지니는 P1A를 제공할 수 없었다.

역학 데이터에 기반하여(표 5) 블록1 돌연변이(I72S/Q135M/T160F, IS227)는 세팔로스포린을 가수분해시키는 P1A의 능력을 개선시키지 않았다. 다른 활성 분석에서, Q135M 또는 T160F 중 어떤 것도 세팔로스포린을 가수분해시키는 P1A의 능력을 단독으로 증가시키지 않았고, 대신에 단일 돌연변이는 둘 다 암피실린에 대해서조차 거의 모든 P1A의 효소 활성이 없었다. 그러나, 블록2 + Q135M -돌연변이체(IS224)가 있었으며, 이는 블록2(IS191)과 블록2 + D276R/K(IS219/IS221) 돌연변이체 사이의 세포탁심 및 세프트리악손에 대해 활성을 가졌다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 블록1은 촉매적 Glu166이 위치된 Ω-루프를 "느슨하게" 할 수 있다. T160F 돌연변이는 단백질 구조 중심에서 상당히 큰 변형이 있다. 이는 구조를 전체적으로 붕괴시킬 수 있거나 또는 적어도 단백질이 적절하게 기능화하지 못하게 할 수 있다. 이 가능성을 피하기 위해, 두 상보적 돌연변이를 P1A에서의 T160F 돌연변이, 즉, I72S 및 Q135M을 수반하도록 첨가하고 나서, 돌연변이의 이 조합을 "블록1"로서 불렀다.

실시예 3: P1A 돌연변이체 IS288의 생성 및 정제로터의 결과

정제 결과를 용리 피크 도면(도 3, 도 4 및 도 5) 및 피크 표로서, 단백질 농도로서 그리고 SDS-PAGE 사진(들)로서(도 6) 보고한다.

소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 크로마토그램

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 상이한 매개변수를 이용하여 3가지 별도의 경우로 실행하였다. 제1 실행에서(16.10.08, 도 3) 샘플 용적은 대략 50㎖, 통과액 분획 용적은 5㎖, 비결합 샘플에 대한 세척 용적은 2 CV, 용리 분획의 용적은 1.0㎖였다. 다음의 HIC 실행에서(4.11.08, 도 4) 샘플 용적을 65㎖로, 통과액 분획 용적을 10㎖로, 비결합 샘플에 대한 세척 용적은 3 CV로, 분획 크기는 1.5㎖로 증가시켰다. 마지막 실행에서(12.11.08, 도 5) 앞의 실행과 상이한 샘플 용적 및 비결합 샘플에 대한 세척 용적만이 각각 125㎖ 및 4 CV였다.

HIC 실행의 모든 그래프(도 3, 4 및 5)는 동일한 전체 형태를 나타낸다. 통과액 분획은 샘플 적용 전체적으로 280㎚에서 대략 700 mAU의 일정한 흡광도를 제공한 반면, 비결함 샘플의 세척 동안, 280㎚에서 흡광도는 0으로 하락하였고, 결합 단백질이 용리되었을 때, 다시 상승되었다. 샘플의 전도도는 2M (NH₄)₂SO₄를 함유하는 실행 완충제 A에서보다 도 3 및 도 4에 적용된 샘플에서 약간 더 낮은 반면, 2008년 11월 12일의 실행에서, A-완충제와 동일하게 머물러 있었다. 2회의 처음 실행에서, 황산암모니아 여과액의 (NH₄)₂SO₄ 농도는 2.7M로 추정하였고, 마지막 실행에서 2.6M로서 추정하였다. 결과 용액의 전도도는 샘플 적용 동안 하락하지 않았기 때문에, 2.6M 추정은 황산암모니아 여과액의 실제 (NH₄)₂SO₄ 농도에 가까운 것으로 여겨진다(도 5).

용리 완충제(완충제 B)가 칼럼에 적용된 직후에 용리를 시작하였다. 이는 샘플 내 단백질이 구배에서 매우 초기에 용리되었기 때문에 칼럼에 거의 결합되지 않았음을 나타내었다. 따라서, 샘플의 전도도가 대략 240mS/㎝ 미만으로 얻어지지 않는 것이 필수적이었다.

결합 단백질을 급격한 상승 기울기 및 완만한 하강 기울기를 지니는 전형적인 용리 피크로서 용리시켜 약간 비대칭의 피크를 제공하였다. 피크 크기는 제1 실행에서 대략 18㎖(18 x 1㎖ 분획)로 가장 컸다(도 3). 분획 C8과 C9 사이의 용리 피크에서 "숄더(shoulder)"가 있었기 때문에 이 피크를 3가지 설정(제1의 6㎖(분획 C3 내지 C8), 제2의 5㎖(분획 C9 내지 D1) 및 제3의 7㎖(분획 D2 내지 D8))으로 수집하고, 마지막 7 분획은 농축을 위해 매우 희석될 수 있다는 것을 고려하였다. 두 후속적 HIC 실행에서(각각 4.11.2008 및 12.11.2008, 도 4 및 도 5), 용리 피크는 13.5㎖(9 x 1.5㎖ 분획, 4.11.2008) 및 12㎖(8 x 1.5㎖ 분획, 12.11.2008)였고, 전체 피크는 하나의 분획으로 풀링하였다.

표 7에서, 3회의 HIC 실행의 A₂₈₀ 그래프에 대한 통계학적 값을 제공한다. 피크 면적을 사용하여 해당 샘플의 단백질 함량을 추정하였고, 그것을 사용하여 BCA 분석에서 상이한 샘플에 대한 희석 인자를 추정하였다. 계산은 단백질의 이론적 흡광 계수를 필요로 하였고, 이것을 ExPASy 웹 서비스를 이용하여 계산하였다. IS288에 대해, 이 계수는 25440M^-1cm^-1였고, 0.1% (=1g/ℓ) 용액에 대해 A₂₈₀ 0.869를 제공하였다.

상기 비율을 이용하여, 용리 단백질 샘플의 양 및 이들 샘플의 공지된 용적, 칼럼으로부터 용리시킨 단백질 양을 계산하였다. 사용한 식은: ((mAU^*㎖)^*10^-3 / V_분획)/0.869 ^* V_분획 → (mAU^*㎖)^*10^-3/0.869, 이는 3.36㎎ 단백질 161008, 2.95㎎ 041108, 및 3.60㎎ 121108을 야기하였다.

통과액 및 용리 단백질 분획의 초미세여과 및 농도

각각의 정제로부터, 농도에 대해서뿐만 아니라 용리된 단백질 피크를 함유하는 모든 분획에 대해 통과액 분획 중 1, 2, 3가지를 선택하였다. 선택한 샘플을 표 8에 나타낸다. 또한 표에서 해당 샘플의 시작 용적뿐만 아니라 최종 용적 및 농도 인자를 나타낸다.

초미세여과를 위해 선택한 통과액 분획은 시작으로부터 (B1₁₆₁₀₀₈ 및 A2₀₄₁₁₀₈) 그리고 샘플 적용의 마지막으로부터(B7₁₆₁₀₀₈, B8₁₆₁₀₀₈, A7₀₄₁₁₀₈ 및 B1₁₂₁₁₀₈) 유래되었다. 칼럼의 용량이 해당 특정 샘플 양을 초과하는지의 여부를 알아보기 위해 이들 샘플을 분석하였다.

게다가, 각각의 정제를 위한 황산암모니아 여과액은 초미세여과시켰고, 농축시키고 나서, 일단 농축되면, 통과액 분획을 울트라셀(Ultracell)-10 막, 10000 NMWL을 지니는 멀티스크린 플레이트를 이용하여 여전히 추가로 농축시켰다. 해당 농도의 결과를 표 9에 제시한다.

따라서 HIC 실행의 통과액 분획을 16배 이상만큼 농축시켰다. 통과액 분획의 최종 농축 인자를 표 10에 열거한다.

BCA 분석 결과

BCA 분석으로부터의 결과를 표 11에 제시한다. 울트라셀-10 막을 지니는 멀티스크린 플레이트를 이용하는 최종 농축 단계 전에 통과액 분획의 단백질 농도를 측정하였다.

HIC 실행으로부터의 크로마토그램은 결과 용액에 대한 샘플 적용 전체적으로 오히려 높은 대략 700 mAU인 A₂₈₀ 값을 제공하였다. 용리된 단백질 피크는 충분한 양의 단백질을 함유하였다. 그들은 칼럼의 추정 결합 용량이 거의 10㎎이었다.

로부터의 피크 면적은 BCA 분석보다 단백질 양에 대해 3배 더 낮은 추정값을 제공한다.

SDS-PAGE

B1₁₂₁₁₀₈에 대해 6.5㎕가 장입된 것을 제외하고, 샘플의 최대 용적(17.5㎕)을 황산암모니아 여과액 및 통과액 분획에 대해 SDS-PAGE 상에 장입하였다(도 6). 단백질 피크로부터의 샘플 용적을 계산하였고, 따라서 레인 당 대략 0.5㎍ 단백질이 되며, 샘플 내 모든 단백질이 P1A 유도체 IS288인 것을 추정하였다. SDS-PAGE를 도 6에 나타낸다.

황산암모니아 여과액 샘플은 모두 30kDa 근처에서 이중 밴드를 함유한다(IS288의 MW는 29288Da이고, P1A은 29273Da임). 약간 더 작은 추가 밴드에 의해 수반되는 동일한 이중 밴드를 통과액 분획 B1₁₂₁₁₀₈에서 분명하게 볼 수 있으며, 통과액 분획 A7₀₄₁₁₀₈에서 다소 더 희미하였다. 반면에, 이들 추가 밴드는 둘 다 용리된 단백질 피크로부터 제거되었다. 대략 10배의 의도한 양의 단백질을 장입하였을 때, 일부 소량의 불순물을 정제 D2 내지 D8 161008의 마지막 풀링 분획에 대해 볼 수 있다. 정제 단백질은 대부분의 단백질 형태이며, 분자량 분석에 의해 이는 P1A 변이체 IS288이라는 결론을 내릴 수 있다.

실시예 4: 베타- 락타마제 활성에 대한 미생물학적 선별 분석의 시험

에스케리키아 콜라이에 대한 암피실린 및 세프트리악손의 50% 유효 저해 농도(EC₅₀)를 P1A β-락타마제의 부재 및 존재에서 결정하였다. 이들 연구의 목적을 위해, 언급한 유효 농도는 실험의 시작 시 첨가한 암피실린 또는 세프트리악손의 초기 농도였고, 실험 과정 동안 또는 인큐베이션 기간의 마지막에 측정한 농도는 아니었다. 분석 결과를 표 12 내지 표 14에 제시한다.

초기 평가는 0.5ng/㎖ 내지 5㎍/㎖의 농도로 P1A 그리고 0.13㎍/㎖ 내지 128㎍/㎖의 농도로 암피실린 또는 세프트리악손을 이용하였다. 가장 낮은 농도의 P1A(0.5ng/㎖)의 첨가는 동시에 첨가하였을 때 16㎍/㎖로부터 128㎍/㎖의 가장 높은 시험 농도 초과로 그리고 박테리아의 첨가 전 P1A를 암피실린과 함께 사전 인큐베이션시켰을 때 64㎍/㎖로 암피실린의 EC₅₀을 이동시켰다(표 12). 0.13㎍/㎖ 내지 128㎍/㎖의 세프트리악손과 함께 동일한 농도의 P1A를 이용하여, 세프트리악손이 가장 낮은 농도에서 완전히 저해되고(EC₉₉ <0.13㎍/㎖) 세프트리악손의 EC₅₀은 동시에 첨가될 때 5ng/㎖ P1A의 존재 하에 0.25㎍/㎖로 그리고 50ng/㎖ P1A를 항생제와 함께 사전 인큐베이션시켰을 때 128㎍/㎖로 이동되었다는 것을 관찰하였다. 이 분석에 기반하여, P1A 및 세프트리악손의 농도를 둘 다의 저해 농도를 일괄하여 다루도록 조절하였다.

0.13㎍/㎖ 내지 128㎍/㎖의 암피실린과 함께 5pg/㎖ 내지 50ng/㎖의 P1A 농도를 이용하여, 사전 인큐베이션시키거나 또는 동시에 첨가했을 때, 암피실린의 EC₅₀은 P1A의 부재 시 16㎍/㎖로부터 50pg/㎖의 존재 하에 128㎍/㎖로 이동되었다. 더 저농도의 P1A(5pg/㎖)은 암피실린 EC₅₀에 대해 효과가 없었다. 세프트리악손의 EC₅₀은, 사전 인큐베이션시키거나 또는 동시에 첨가했을 때, P1A의 부재 시 0.03㎍/㎖로부터 50ng/㎖ 이상의 P1A의 존재 하에 4㎍/㎖ 초과로 이동되었다(표 13). 저농도의 P1A(50pg/㎖ 내지 5ng/㎖)는 세프트리악손 EC₅₀에 대한 효과가 없었다. 암피실린 또는 세프트리악손과 함께 P1A의 동시 첨가에 의한 결과를 반복 분석을 통해 확인하였다(표 14).

항생제를 박테리아의 첨가 전에 P1A에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션(사전 인큐베이션)시키거나, 또는 P1A 및 박테리아의 첨가 후 플레이트에 첨가하였다(동시). 모든 농도 및 조합을 96-웰 플레이트 형식으로 3회 중복해서 평가하였다. 밤새 인큐베이션 후에, 플레이트의 OD₆₂₅를 스펙트라맥스(Spectramax) 384 플레이트 판독기에서 측정하고 나서, 데이터를 선형 회귀 분석에 의한 50%(EC₅₀)의 결정을 위해 맞춤형 엑셀 스프레드시트에 입력하였다. 이들 연구 목적을 위해, 언급한 유효 농도는 실험의 시작 시 첨가한 암피실린 또는 세프트리악손의 초기 농도이며, 실험 과정 동안 또는 인큐베이션 기간의 마지막에 측정한 농도는 아니다.

항생제를 박테리아의 첨가 전에 P1A에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션(사전 인큐베이션)시키거나, 또는 P1A 및 박테리아의 첨가 후 플레이트에 첨가하였다(동시). 96-웰 플레이트 형식으로 3회 중복해서 평가하였다. 밤새 인큐베이션 후에, 플레이트의 OD₆₂₅를 스펙트라맥스(Spectramax) 384 플레이트 판독기에서 측정하고 나서, 데이터를 선형 회귀 분석에 의한 50%(EC₅₀)의 결정을 위해 맞춤형 엑셀 스프레드시트에 입력하였다.

항생제를 P1A 박테리아에 첨가하였다(동시). 모든 농도 및 조합을 96-웰 플레이트 형식으로 3회 중복해서 평가하였다. 밤새 인큐베이션 후에, 플레이트의 OD₆₂₅를 스펙트라맥스 384 플레이트 판독기에서 측정하고 나서, 데이터를 선형 회귀 분석에 의한 50%(EC₅₀)의 결정을 위해 맞춤형 엑셀 스프레드시트에 입력하였다.

이들 결과는 P1A가 시험관내 미생물 분석에서 암피실린 및 세프트리악손의 활성을 효과적으로 저해하였다는 것을 입증하였고, P1A는 미생물 분석에서 세프트리악손보다 암피실린에 대해 1,000-배 더 활성이라는 것을 나타낸다.

다음에, 에스케리키아 콜라이에 대한 암피실린, 세프트리악손, 세프타지딤, 메로페넴, 세페핌, 세파졸린, 암피실린/설박탐, 세포페라존, 세포탁심 및 세푸록심의 90% 유효 저해 농도(EC₉₀)를 P1A, P3A 또는 P4A β-락타마제의 부재 및 존재 하에 결정하였다. 이들 연구의 목적을 위해, 언급한 유효 농도는 실험의 시작 시 첨가한 암피실린, 세프트리악손, 세프타지딤, 메로페넴, 세페핌, 세파졸린, 암피실린/설박탐, 세포페라존, 세포탁심 및 세푸록심의 초기 농도였고, 실험 과정 동안 또는 인큐베이션 기간의 마지막에 측정한 농도는 아니었다. 분석 결과를 표 15 내지 17에 제시한다. 이하의 표(표 15 내지 표 17)에서 각각의 박스는 슬래시로 분리되는 2개의 숫자를 가진다-2개의 숫자는 2회 중복 분석이다(이들 모두는 엄격한 일치를 나타냄).

구체적으로, 96 웰 접시의 행을 가로지르는 선택 항생제를 희석시킴으로써(2배 단계) 상기 분석을 수행하였다. 희석 항생제가 박테리아(이 경우에, 모든 항생제에 민감한 이콜라이 균주)를 사멸시키는 것으로부터 사멸시키지 않는 것으로 이행되는 시점을 MIC로 결정하였다. P1A, P3A 및 P4A를 칼럼 아래로 희석시켰다(10배 단계)(β-락타마제 농도를 칼럼 아래로 증가시킴). β-락타마제 농도가 증가됨에 따라, 분명한 MIC 판독을 충분히 변경하기 위해 항생제를 분해하는 수준에 도달되었다(MIC는 실제로 변하지 않았지만, 웰 내에 남아있는 항생제의 양은 웰 내로 장입된 양 미만이었기 때문에 변화가 나타났다). 대부분의 경우에, 2개의 분해 지점(MIC가 약간 증가되는 것으로 나타난 첫 번째, 이어서 MIC가 시험한 항생제의 최대량을 초과하는 것보다 10배 더 큰 농도)이 있었다. 후자의 지점을 컷 오프 지점으로서 사용하였다. 이 이콜라이에 의해, MIC는 각각의 항생제에 대해 상이하다는 것을 주목하는 것은 중요하다.　그러나, 이 분석에 대해, 절대 MIC는 가장 중요한 매개변수가 아니다. 가장 적절한 판독은 명확한 MIC가 시험한 항생제의 최대량까지 증가되는 β-락타마제 농도였다.

컷 오프 지점이 낮은 β-락타마제 농도에서 생겼을 때, 이는 β-락타마제가 해당 항생제의 분해 시 강력하다는 것을 의미하였다. MIC를 이동시키기 위해 많은 β-락타마제를 취하였을 때, 이어서, β-락타마제는 해당 항생제에 대해 상대적으로 약하였다. 주어진 항생제에 대해 각각의 β-락타마제의 생체내 효능의 예측을 제공하기 위해 이론에 의해 구속되는 일 없이 이 분석을 설계하였다. 이들 데이터를 시험관내 역학 데이터와 조합할 수 있다.

이콜라이 29522를 96 웰 플레이트에서 세포 배양 상청액으로부터의 β-락타마제 단백질의 표시한 양 및 항생제의 연속 희석물의 존재 하에 밤새 인큐베이션시켰다. 배양물의 박테리아 밀도(OD₆₂₅)를 측정하고 나서, 밀도가 비처리 박테리아 대조군에 비해 90%까지 감소되는 농도(EC₉₀)를 결정하였다. 분석을 2일의 별개의 날에 수행하고 나서, 데이터를 Rep1 및 Rep2로서 보고하였다. NA= 분석하지 않음.

이콜라이 29522를 96 웰 플레이트에서 세포 배양 상청액으로부터의 β-락타마제 단백질의 표시한 양 및 항생제의 연속 희석물의 존재 하에 밤새 인큐베이션시켰다. 배양물의 박테리아 밀도(OD₆₂₅)를 측정하고 나서, 밀도가 비처리 박테리아 대조군에 비해 90%까지 감소되는 농도(EC90)를 결정하였다. 분석을 2일의 별개의 날에 수행하고 나서, 데이터를 슬래시로 분리되는 2개의 수치값으로서 보고하였다. NA= 분석하지 않음.

이콜라이 29522를 96 웰 플레이트에서 세포 배양 상청액으로부터의 β-락타마제 단백질의 표시한 양 및 항생제의 연속 희석물의 존재 하에 밤새 인큐베이션시켰다. 배양물의 박테리아 밀도(OD625)를 측정하고 나서, 밀도가 비처리 박테리아 대조군에 비해 90%까지 감소되는 농도(EC90)를 결정하였다. 분석을 2일의 별개의 날에 수행하고 나서, 데이터를 슬래쉬로 분리되는 2개의 수치값으로서 보고하였다. NA= 분석하지 않음.

이론에 의해 구속되는 일 없이, 이들 데이터는 대응하는 역학 데이터로부터 예측된 것보다 더 큰 시험관내 활성을 시사하였다. 예를 들어, 세프타지딤 역학 데이터는 치료 활성이 없음을 예측하였지만, 이들 데이터는 P4A에 대해 10배 개선으로 500ng/㎖에서 활성을 나타내었다. 다음에, P1A 및 P3A은 암피실린에 대해 상당히 효과적이었지만, P4A는 암피실린에 대해 일부 활성을 상실한다는 것을 관찰하였다. 암피실린/설박탐 데이터는 설박탐이 P1A, P3A 및 P4A를 효과적으로 저해하였다는 것을 입증하였다. 암피실린/설박탐 데이터는 설박탐이 효과적인 β-락타마제 저해제라는 것을 입증한 반면, 이는 이들 베타-락타마제가 생체내에서 효능이 있지 않을 것이라는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 구체적으로, 담즙 배설에 대한 약동학이 항생제 및 저해제와 상이하다면, 항생제를 그의 저해제가 없는 소장에서 발견할 수 있다. 예를 들어, P1A는 피페라실린/타조박탐과 함께 인간에서 효능이 있는 것으로 나타났다. 메로페넴 데이터는 예상한 것, 즉, P1A, P3A 및 P4A β-락타마제가 페니실리나제 및 세팔로스포리나제라는 것을 확인하였다. 최종적으로, P4A는 P3A보다 더 양호하게 세프트리악손의 분해 시 현저히 효과적이라는 것을 관찰하였다. P4A는 암피실린에 대해서와 같이 세프트리악손에 대해 양호하였다. P4는 또한 세페핌을 제외하고 몇몇 중요한 세팔로스포린에 대해 개선된 활성을 가졌다. P1A에 비해, P4A는 세프트리악손, 세포탁심, 세프타지딤, 세파졸린, 세포페라존, 및 세푸르신에 대해 10배 이상의 β-락타마제 활성을 나타내었다.

실시예 5: P1A , P3A, 및 P4A의 항생제 분해 특성의 분석

P1A 및 P4A를 고항생제 농도의 존재 하에 장에서 베타-락타마제 활성을 모방하도록 설계한 마이크로타이터 플레이트 활성 분석에서 암피실린, 세프트리아존, 세포탁심, 세포졸린, 세푸록심, 세포페라존, 세페핌 및 세프타지딤의 분해에 대해 선별하였다. 10, 100 또는 1000㎍/㎖의 표시한 항생제를 10 또는 100ng/㎖의 농도의 P1A 또는 P4A와 혼합함으로써 상기 분석을 수행하였다. 플레이트를 이콜라이(ATCC 25922)를 첨가한 후에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키거나, 또는 이콜라이를 베타-락타마제 효소의 첨가 직후에 첨가하였다. 플레이트를 밤새 인큐베이션시키고 나서, 스펙트라맥스 384 플러스 플레이트 판독기에서 625㎚에서 흡광도(OD₆₂₅)를 측정함으로써 박테리아 성장을 정량화하였다. 분석을 각각의 베타-락타마제 및 항생제에 대해 2회 수행하였다. 배양 상청액의 베타-락타마제 활성을 개개 웰에서 박테리아 성장의 출현에 기반하여 양성 또는 음성으로서 결정하였다. 1.0 이상의 OD₆₂₅는 최대 박테리아 성장을 나타내며, 따라서 완전한 항생제 분해 및 고 베타-락타마제 활성을 나타낸다. 1.0 미만의 OD₆₂₅는 낮은 박테리아 성장을 나타내었고, 따라서 불완전한 항생제 분해, 그에 따른 낮은 베타-락타마제 활성을 나타내었다.

분석으로부터의 결과를 도 8에 나타낸다. 사전인큐베이션을 겪지 않은 플레이트에 비해 베타-락타마제 및 항생제와 함께 사전인큐베이션시킨 플레이트에 대해 얻은 판독에서 차이는 없었다.

암피실린을 제외한 모든 항생제에 대해, P4A는 P1A에 비해 개선된 활성을 나타내었다. P1A는 세프트리악손, 세포탁심 및 세프타지딤에 대해 활성을 나타내지 않았다. P4A는 세포탁심, 세포졸린, 세포페라존, 세페핌, 및 세프타지딤에 대해 더 큰 효능을 나타낸다.

따라서, P1A에서 5종(P4A) 아미노산의 변형은 세팔로스포리나제 활성을 10 내지 1000-배로 촉진시켰다. 따라서 P4A의 경구 투여는 통상적으로 사용되는 세팔로스포린으로부터 장관 내균을 보호하며, 예를 들어 CDI의 예방에 대해 이 예방 전략의 임상 효용을 연장시킬 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 제시된 분석은 소장에서 용이하게 달성되어야 하는 농도에서, P4A는 세팔로스포린 및 다른 항생제를 분해시킬 수 있고, P1A에 비해 개선된 기질 프로파일을 가진다는 것을 나타낸다.

정의

다음의 정의를 본 명세서에 개시된 본 발명과 관련하여 사용한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용한 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 단수 용어는 하나 이상을 의미할 수 있다.

추가로, 용어 "약"은 기준 수치 표시와 관련하여 사용될 때 기준 수치 표시 + 또는 - 해당 기준 수치 표시의 10%까지를 의미한다. 예를 들어, 언어 "약 50"은 45 또는 55의 범위를 아우른다.

"유효량"은 의학적 용도와 관련하여 사용될 때 관심 대상의 질환의 발병 속도에서 측정가능한 치료, 예방 또는 감소를 제공하는데 효과적인 양이다.

본 명세서에서 언급되는 바와 같은 모든 조성물 백분율은 달리 구체화되지 않는 한 총 조성물의 중량이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 단어 "포함하다" 및 그의 변형은 목록에서 항목의 열거가 본 기술의 조성물 및 방법에서 또한 유용할 수 있는 다른 유사 항목을 제외하지 않도록 비제한적이 된다는 것을 의도한다. 유사하게, 용어 "할 수 있다" 및 "할 수도 있다" 및 그들의 변형은 실시형태가 특정 구성요소 또는 특징을 포함할 수 있거나 또는 포함할 수도 있다는 설명이 해당 구성요소 또는 특징을 함유하지 않는 본 발명의 기법의 다른 실시형태를 제외하지 않도록 비제한적인 것으로 의도된다.

개방형의 용어 "포함하는"은 포함하는(including), 함유하는 또는 갖는과 같은 용어의 유사어로서 본 발명 또는 이의 실시형태를 설명하고 청구하기 위해 본 명세서에서 사용되며, "이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는"과 같은 대안의 용어를 이용하여 대안적으로 기재될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 특정 상황 하에서 특정 이점을 얻는 기법의 실시형태를 지칭한다. 그러나, 다른 실시형태가 또한 동일 또는 다른 상황 하에서 바람직할 수 있다. 더 나아가, 하나 이상의 바람직한 실시형태의 인용은 다른 실시형태가 유용하지 않다는 것을 암시하지 않으며, 기법의 범주로부터 다른 실시형태를 제외하는 것으로 의도되지 않는다.

치료적 효과를 달성하는데 필요한 본 명세서에 기재된 조성물의 양은 특정 목적을 위한 전통적인 절차에 따라 경험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 치료적 목적을 위해 치료제(예를 들어, 본 발명의 β-락타마제 및/또는 약제학적 조성물(및/또는 추가적인 제제)를 투여하기 위해, 치료제는 약학적 유효량으로 제공된다. "약학적 유효량", "약학적 유효 용량", "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 특히 장애 또는 질환을 치료하기 위해 목적으로 하는 결과를 달성할 수 있는 목적으로 하는 생리적 효과 또는 양을 생성하는데 충분한 양을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 유효량은, 예를 들어, 장애 또는 질환 증상의 발생을 지연시키고, 장애 또는 질환 증상 과정을 변경시키고(예를 들어, 질환 증상의 진행을 늦춤), 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 징후를 감소 또는 제거하고, 장애 또는 질환 증상을 반전시키는데 충분한 양을 포함할 것이다. 예를 들어, GI관 장애(예를 들어, CDI)로 고통받는 환자에 대한 치료제의 투여는 근본적인 병태가 근절되거나 또는 개선될 때뿐만 아니라, 환자가 질환과 관련된 증상의 중증도 또는 지속기간의 감소를 보고할 때 치료적 이점을 제공한다. 치료적 이점은 또한 개선이 실현됨에도 불구하고 근본적인 질환 또는 장애의 진행을 멈추거나 또는 늦추는 것을 포함한다.

유효량, 독성 및 치료적 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 약 50%에 대해 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 약 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 투약량은 사용한 제형 및 이용한 투여 경로에 따라 다를 수 있다. 독성과 치료적 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, 비 LD50/ED50으로서 표현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 큰 치료 지수를 나타내는 조성물 및 방법이 바람직하다. 치료적 유효 용량은, 예를 들어 세포 배양 분석을 포함하는 시험관내 분석으로부터 초기에 추정될 수 있다. 또한 용량은 세포 배양에서 또는 적절한 동물 모델에서 결정한 바와 같은 IC50을 포함하는 순환 혈장 농도를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 혈장 중의 기재된 조성물 수준을, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다. 임의의 특정 투약량의 효과를 적합한 생체분석에 의해 모니터링할 수 있다. 투약량은 의사에 의해 결정될 수 있고, 필요하다면 치료의 관찰되는 효과에 적합하게 조절될 수 있다.

특정 실시형태에서, 효과는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 90%의 정량화가능한 변화를 초래할 것이다. 일부 실시형태에서, 효과는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 50%, 약 70%, 또는 심지어 약 90% 이상의 정량가능한 변화를 초래할 것이다. 특정 실시형태에서, 효과는 2배, 또는 3배, 또는 4배, 또는 5배, 또는 10배의 정량가능한 변화를 초래할 것이다. 치료적 이점은 또한 개선이 실현되는지의 여부와 상관없이 근본적인 질환 또는 장애의 진행의 중단 또는 늦춤 또는 독성의 감소를 포함한다.

균등론

본 발명은 이의 구체적 실시형태와 관련하여 기재되었지만, 추가 변형이 가능할 수 있고 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원칙에 따르고, 본 발명이 속하는 분야 내의 공지된 또는 관습적인 실행 내이며 본 명세서의 필수 특징에 적용될 수 있는 것과 첨부하는 청구범위의 범주에 따르는 것과 같은 본 개시내용으로부터의 벗어남을 포함하여, 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 적용을 아우르는 것으로 의도된다는 것이 이해될 것이다.

당업자는 일상적인 것에 지나지 않는 실험을 이용하여, 본 명세서에 구체적으로 기재된 구체적 실시형태에 대한 수많은 동등물을 인식하거나 또는 확인할 수 있다. 이러한 동등물은 다음의 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.

참고에 의한 포함

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 포함된다.

본 명세서에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 그들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 발명이 앞선 발명 때문에 이러한 간행물을 선행한다는 자격이 부여되지 않는다는 용인으로서 해석되어서는 안 된다.

본 명세서에서 사용되는 모든 표제는 단순히 체계화를 위한 것이며, 임의의 방식으로 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 임의의 개개 부문의 내용은 모든 부문에 동등하게 적용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Synthetic Biologics, Inc. <120> BETA-LACTAMASES WITH IMPROVED PROPERTIES FOR THERAPY <130> WO/2015/161243 <140> PCT/US2015/026457 <141> 2014-04-17 <150> US 61/980,844 <151> 2014-04-17 <150> US 62/046,627 <151> 2014-09-05 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 263 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 1 Glu Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln Phe Asp Ala Lys 1 5 10 15 Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg Thr Val Ala Tyr 20 25 30 Arg Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile Lys Ala Leu Thr 35 40 45 Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp Leu Asn Gln Arg 50 55 60 Ile Thr Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn Pro Ile Thr Glu 65 70 75 80 Lys His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu Ala Asp Ala Ser 85 90 95 Leu Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile Leu Lys Gln Ile 100 105 110 Gly Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Ile Gly Asp Glu 115 120 125 Val Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn Glu Val Asn 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Ile 65 70 75 80 Lys Ala Leu Thr Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp 85 90 95 Leu Asn Gln Arg Ile Thr Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn 100 105 110 Pro Ile Thr Glu Lys His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu 115 120 125 Ala Asp Ala Ser Leu Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile 130 135 140 Leu Lys Gln Ile Gly Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys 145 150 155 160 Ile Gly Asp Glu Val Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn 165 170 175 Glu Val Asn Pro Gly Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu 180 185 190 Val Thr Ser Leu Arg Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu 195 200 205 Lys Arg Glu Leu Leu Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp 210 215 220 Ala Leu Ile Arg Ala Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Ala Asp Lys 225 230 235 240 Thr Gly Ala Ala Ser Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp 245 250 255 Pro Pro Lys Gly Asp Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp 260 265 270 Lys Lys Asp Ala Lys Tyr Asp Asp Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys 275 280 285 Val Val Met Lys Ala Leu Asn Met Asn Gly Lys 290 295 <210> 4 <211> 900 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 4 atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60 tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gcgcaagctt ccaagacgga gatgaaagat 120 gattttgcaa aacttgagga acaatttgat gcaaaactcg ggatctttgc attggataca 180 ggtacaaacc ggacggtagc gtatcggccg gatgagcgtt ttgcttttgc ttcgacgatt 240 aaggctttaa ctgtaggcgt gcttttgcaa cagaaatcaa tagaagatct gaaccagaga 300 ataacatata cacgtgatga tcttgtaaac tacaacccga ttacggaaaa gcacgttgat 360 acgggaatga cgctcaaaga gcttgcggat gcttcgcttc gatatagtga caatgcggca 420 cagaatctca ttcttaaaca aattggcgga cctgaaagtt tgaaaaagga actgaggaag 480 attggtgatg aggttacaaa tcccgaacga ttcgaaccag agttaaatga agtgaatccg 540 ggtgaaactc aggataccag tacagcaaga gcacttgtca caagccttcg agcctttgct 600 cttgaagata aacttccaag tgaaaaacgc gagcttttaa tcgattggat gaaacgaaat 660 accactggag acgccttaat ccgtgccggt gtgccggacg gttgggaagt ggctgataaa 720 actggagcgg catcatatgg aacccggaat gacattgcca tcatttggcc gccaaaagga 780 gatcctgtcg ttcttgcagt attatccagc agggataaaa aggacgccaa gtatgatgat 840 aaacttattg cagaggcaac aaaggtggta atgaaagcct taaacatgaa cggcaaataa 900 <210> 5 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Glu Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln Phe Asp Ala Lys 1 5 10 15 Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg Thr Val Ala Tyr 20 25 30 Arg Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile Lys Ala Leu Thr 35 40 45 Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp Leu Asn Gln Arg 50 55 60 Ile Thr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn Pro Ile Thr Glu Lys 65 70 75 80 His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu Ala Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile Leu Lys Gln Ile Gly 100 105 110 Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Ile Gly Asp Glu Val 115 120 125 Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn Glu Val Asn Pro Gly 130 135 140 Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu Val Thr Ser Leu Arg 145 150 155 160 Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu Lys Arg Glu Leu Leu 165 170 175 Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp Ala Leu Ile Arg Ala 180 185 190 Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Gly Asp Lys Thr Gly Ser Gly Asp 195 200 205 Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp Pro Pro Lys Gly Asp 210 215 220 Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp Lys Lys Asp Ala Lys 225 230 235 240 Tyr Asp Asn Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys Val Val Met Lys Ala 245 250 255 Leu Asn Met Asn Gly Lys 260 <210> 6 <211> 299 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met 1 5 10 15 Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Gln 20 25 30 Ala Ser Lys Thr Glu Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln 35 40 45 Phe Asp Ala Lys Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg 50 55 60 Thr Val Ala Tyr Arg Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile 65 70 75 80 Lys Ala Leu Thr Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp 85 90 95 Leu Asn Gln Arg Ile Thr Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn 100 105 110 Pro Ile Thr Glu Lys His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu 115 120 125 Ala Asp Ala Ser Leu Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile 130 135 140 Leu Lys Gln Ile Gly Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys 145 150 155 160 Ile Gly Asp Glu Val Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn 165 170 175 Glu Val Asn Pro Gly Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu 180 185 190 Val Thr Ser Leu Arg Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu 195 200 205 Lys Arg Glu Leu Leu Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp 210 215 220 Ala Leu Ile Arg Ala Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Gly Asp Lys 225 230 235 240 Thr Gly Ser Gly Asp Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp 245 250 255 Pro Pro Lys Gly Asp Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp 260 265 270 Lys Lys Asp Ala Lys Tyr Asp Asn Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys 275 280 285 Val Val Met Lys Ala Leu Asn Met Asn Gly Lys 290 295 <210> 7 <211> 900 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60 tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gcgcaagctt ccaagacgga gatgaaagat 120 gattttgcaa aacttgagga acaatttgat gcaaaactcg ggatctttgc attggataca 180 ggtacaaacc ggacggtagc gtatcggccg gatgagcgtt ttgcttttgc ttcgacgatt 240 aaggctttaa ctgtaggcgt gcttttgcaa cagaaatcaa tagaagatct gaaccagaga 300 ataacatata cacgtgatga tcttgtaaac tacaacccga ttacggaaaa gcacgttgat 360 acgggaatga cgctcaaaga gcttgcggat gcttcgcttc gatatagtga caatgcggca 420 cagaatctca ttcttaaaca aattggcgga cctgaaagtt tgaaaaagga actgaggaag 480 attggtgatg aggttacaaa tcccgaacga ttcgaaccag agttaaatga agtgaatccg 540 ggtgaaactc aggataccag tacagcaaga gcacttgtca caagccttcg agcctttgct 600 cttgaagata aacttccaag tgaaaaacgc gagcttttaa tcgattggat gaaacgaaat 660 accactggag acgccttaat ccgtgccggt gtgccggacg gttgggaagt gggtgataaa 720 actggaagcg gagattatgg aacccggaat gacattgcca tcatttggcc gccaaaagga 780 gatcctgtcg ttcttgcagt attatccagc agggataaaa aggacgccaa gtatgataat 840 aaacttattg cagaggcaac aaaggtggta atgaaagcct taaacatgaa cggcaaataa 900

Claims (73)

1. 서열번호 1과 적어도 95%의 서열동일성 및 앰블러 분류(Ambler classification)에 따른 하기 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 베타-락타마제:
   A232G, A237S, A238G, S240D 및 위치 276에서 아스파라긴(N), 아르기닌(R) 및 라이신(K)에서 선택되는, 아스파르테이트(D) 이외의 잔기.
2. 제1항에 있어서, 상기 베타-락타마제는 앰블러 분류에 따른 위치 135에서 글루타민(Q) 이외의 극성 및 중성 친수성 잔기의 추가 돌연변이를 갖는, 베타-락타마제.
3. 제2항에 있어서, 상기 극성 및 중성 친수성 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택되는, 베타-락타마제.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 베타-락타마제는 페니실린 및 세팔로스포린 중 하나 이상을 가수분해시키는, 베타-락타마제.
5. 제4항에 있어서, 상기 페니실린은 암피실린인, 베타-락타마제.
6. 제4항에 있어서, 상기 세팔로스포린은 세프트리악손, 세포탁심, 세포졸린, 세포페라존, 세페핌, 세푸록심 및 세프타짐으로부터 선택되는, 베타-락타마제.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 베타-락타마제는 서열번호 1에 비해 세팔로스포린에 대해 개선된 촉매 효율을 갖는, 베타-락타마제.
8. 제7항에 있어서, 상기 베타-락타마제는 서열번호 1에 비해 세팔로스포린에 대해 10배 내지 1000배 개선된 촉매 효율을 갖는, 베타-락타마제.
9. 제7항에 있어서, 상기 세팔로스포린은 세프트리악손, 세포탁심, 세포졸린, 세포페라존, 세페핌, 세푸록심 및 세프타짐으로부터 선택되는, 베타-락타마제.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 베타-락타마제는 P3A에 비해 세팔로스포린에 대해 개선된 촉매 효율을 갖는, 베타-락타마제.
11. 제10항에 있어서, 상기 세팔로스포린은 세포탁심, 세페핌 및 세프트리악손으로부터 선택되는, 베타-락타마제.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 베타-락타마제는 GI관에서 활성인, 베타-락타마제.
13. 제12항에 있어서, 상기 베타-락타마제는 선택적으로 십이지장, 공장 및 회장 중 하나 이상으로부터 선택된 소장에서 안정한, 베타-락타마제.
14. 제1항 또는 제2항의 베타-락타마제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
15. 제14항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
16. 제1항 또는 제2항의 베타-락타마제 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 항생제 요법을 받고 있는 환자에서 항생제 유도 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 감염(CDI) 및/또는 클로스트리듐 디피실-관련 질환의 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여용으로 제형화되고, 선택적으로 정제, 다중-미립자 스프링클(multi-particulate sprinkle) 및 다중-미립자 캡슐로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
18. 항생제 요법을 받고 있는 환자에서 항생제 유도 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 감염(CDI) 및/또는 클로스트리듐 디피실-관련 질환의 예방에 사용하기 위한 베타-락타마제로서, 상기 베타-락타마제는 서열번호 1과 적어도 95% 서열 동일성 및 앰블러 분류에 따른 하기 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 베타-락타마제:
    A232G, A237S, A238G, S240D 및 위치 276에서 아스파라긴(N), 아르기닌(R) 및 라이신(K)에서 선택되는, 아스파르테이트(D) 이외의 잔기.
19. 제18항에 있어서, 상기 베타-락타마제는 앰블러 분류에 따른 위치 135에서 글루타민(Q) 이외의 극성 및 중성 친수성 잔기의 추가의 돌연변이를 갖는, 베타-락타마제.
20. 제19항에 있어서, 상기 극성 및 중성 친수성 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택되는, 베타-락타마제.
21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 클로스트리듐 디피실-관련 질환은 항생제-관련 설사(AAD)인, 베타-락타마제.
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