CN109576250A - 一种酶活提高的头孢菌素酶突变体及其构建方法 - Google Patents

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CN109576250A CN201811601326.4A CN201811601326A CN109576250A CN 109576250 A CN109576250 A CN 109576250A CN 201811601326 A CN201811601326 A CN 201811601326A CN 109576250 A CN109576250 A CN 109576250A
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丁姝元
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陈舒明
粱岩
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12Y—ENZYMES
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    • C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
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Abstract

本发明涉及一种酶活提高的头孢菌素酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明的酶活提高的头孢菌素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化头孢菌素酶分子结构、提高酶活，对于满足头孢菌素酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。

Description

一种酶活提高的头孢菌素酶突变体及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种酶活提高的头孢菌素酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
酶系主要由肠杆菌属等革兰阴性杆菌的染色体或质粒编码产生，可水解失活头孢菌素类抗菌药物。头孢菌素酶(ampc酶)大部分能够水解氧亚氨基β-内酰胺类抗生素，并不被克拉维酸抑制。氧亚氨基β-内酰胺类抗生素包括第三代(如头孢他啶、头孢噻肟)、以及单环β-内酰胺类抗生素(如氨曲南)，这些抗生素的分子结构中均含有一个氧亚氨基基团。头孢西丁、头孢美哇对其极不稳定，产此种酶的细菌可对其高度耐药，但第四代头孢菌素如头孢毗脂、头孢匹罗和亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类抗生素则对其稳定。
编码酶的基因按宿主携带方式，可分为染色体介导和质粒介导。染色体介导酶按其产生方式可分为诱导高产型、持续高产型和持续低产型。①诱导高产型大多数阴沟肠杆菌染色体上天然存在基因，但正常条件下只产生少量酶，而当有诱导作用的青霉素和头孢菌素等β-内酰胺类抗菌药物存在时，酶产量明显增加一倍；②持续高产型部分产酶的菌株染色体上也有基因，通过调控基因的微弱启动子和发夹状结构的衰减子的突变或等调节基因的突变，使其在不论有无β-内酰胺类抗菌药物存在时均可高产酶，也称去阻遏高表达；③持续低产型极少部分产酶菌株由于缺乏调控基因或基因发生突变，不产生或产生有缺陷的蛋白，不能在有β-内酰胺类抗菌药物存在的条件下起到激活子的作用，也不能在无β-内酰胺类抗菌药物存在的条件下起到抑制子的作用，使酶持续低水平表达，可见于大肠埃希菌。
质粒介导的AmpC酶目前已发现60多种，根据其来源区分为6个不同的群，分别为MOX、CIT、DHA、ACC、MIR(ACT-1)、FOX型质粒AmpC酶。质粒介导的AmpC酶多为持续高产型，呈高水平持续表达，且可通过转化、接合等方式在同种或不同种细菌中进行传播，造成耐药性的广泛传播和院内感染的暴发。这是由于质粒中的ampC基因缺乏调控基因ampR，或在ampR与ampC之间缺失ampR结合位点，不能产生转录调节作用而呈持续高表达。但近年研究表明，有些质粒介导的ampC基因酶如DHA-1、DHA-2、ACT-1等可能有调控序列及调控机制由复合操纵子调节，这些质粒可产诱导高产型AmpC酶。
GMP中规定无菌药品(包括生物制品)的无菌生产工艺必须采用环境监测来评估生产环境控制是否达到GMP要求。监控项目包括空气悬浮粒子、空气浮游菌、沉降菌、设施和设备表面的微生物以及操作人员的卫生状况监测等。注射用头孢类抗生素无菌分装间、功能间属于产尘功能间。头孢类抗生素粉尘落入监测用培养基平皿中，将降低平皿中培养基灵敏度，进而影响生产过程环境监控数据准确可靠性。监测用培养基平皿中添加头孢菌素酶的量，以确保环境监测用监测皿培养基灵敏度适用于生产过程环境监控。开发高活性的头孢菌素酶具有较高的商业价值。
异源表达头孢菌素酶突出的问题是，蛋白表达量低、头孢菌素酶酶活低。因此，定点突变改造头孢菌素酶，提高酶活，对于满足头孢菌素酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化头孢菌素酶分子结构、提高酶活。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种酶活提高的头孢菌素酶突变体及其构建方法，本发明的头孢菌素酶突变体具有较高的酶活，对于满足头孢菌素酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种酶活提高的头孢菌素酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
作为本发明所述头孢菌素酶突变体的优选实施方式，所述突变体在如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的基础上，将第154位的脯氨酸突变成苏氨酸。
作为本发明所述头孢菌素酶突变体的优选实施方式，编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。表达核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的头孢菌素酶的工程菌，为发明人之前研究所获得。
第二方面，本发明提供了一种酶活提高的头孢菌素酶突变体基因，所述基因编码上述酶活提高的头孢菌素酶突变体。
作为本发明所述头孢菌素酶突变体基因的优选实施方式，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
第三方面，本发明提供了一种工程菌，所述工程菌表达上述酶活提高的头孢菌素酶突变体。
第四方面，本发明提供了上述工程菌的制备方法，包括以下步骤：在如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的基础上，将第154位的脯氨酸突变成苏氨酸，得到突变体，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到DH5ɑ宿主菌中即得到工程菌。
第五方面，本发明提供了上述酶活提高的头孢菌素酶突变体在制备头孢菌素酶中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化头孢菌素酶分子结构、提高酶活，对于满足头孢菌素酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。
附图说明
图1为头孢菌素酶突变体工程菌的发酵曲线图。
图2为头孢菌素酶突变体工程菌破碎裂解后上清的酶SDS-PAGE检测图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1定点突变
以含有SEQ ID NO:4的重组质粒为模板质粒，参照TaKaRa生物产品及操作手册，利用TaKaRa MuTanBEST突变试剂盒，利用设计的相应突变引物对，PCR扩增出BmPGA的定点突变序列，具体操作步骤如下：
(1)突变引物
正向引物BLAB-154-F为5’-GACCCTGAACACCGCTATCRHTGGTGACAAACGTGACAC-3’，
反向引物BLAB-154-R为5’-GTGTCACGTTTGTCACCADYGATAGCGGTGTTCAGGGTC-3’。
(2)反应体系(10ul)
10xPfu聚合酶缓冲液10ul，10mmol/L dNTP溶液2ul，正向引物25pmoles，反向引物25pmoles，Pfu DNA聚合酶5U，质粒DNA模板100-200pg，加水至100ul。
(3)PCR条件：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃300s，30个循环，72℃10min。
参考TAKARA公司操作手册，对PCR获得的DNA片断的5’末端进行磷酸化，然后将磷酸化的突变引物进行自身环化，接着转化DH5α感受态细胞，并涂布于加入卡纳硫酸霉素抗生素的LB选择性平板上，37℃倒置培养约20h。能在加入卡纳硫酸霉素抗生素的LB平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。最后对转化子进一步培养以对重组质粒进行扩增，并抽提扩增的重组质粒。
对筛选到的突变质粒进行测序，确定所获得的质粒在目的突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变。
实施例2工程菌的获得
参照《分子克隆实验指南》的方法，将突变后的质粒转化大肠杆菌感受态细胞或酵母菌感受态细胞，获得表达突变酶的基因工程菌株，最后将工程菌株涂布于加入硫酸卡那霉素抗生素的LB选择性平板上，37℃倒置培养约12-18h，能在加入硫酸卡那霉素抗生素的LB平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。
实施例3工程菌发酵培养
从LB选择性培养平板上挑单菌落，接种至3mL的LB液体培养基中，加入卡那霉素，至其终浓度为100μg/mL，于37℃下250r/min培养过夜；取2mL培养过夜的培养液，接种至200mL的LB液体培养基中，于37℃下250r/min培养4-6h，OD600达到1.0-1.6之间，获得种子菌液。按1：15的接种量接入到含有3升TB培养基的5升发酵罐中，在37℃，400rpm，1.3vvm的发酵条件下，发酵培养至OD600达到25时，调节温度为30℃，用终浓度为1％的IPTG诱导，继续培养2小时后，再加入终浓度为0.5％IPTG诱导，再继续培养约14-16小时，发酵结束。
工程菌的发酵曲线图如图1所示，横坐标为时间，纵坐标为OD600数值，数值越高，菌浓越高，收菌时OD600达到85，达到工业化生产的要求。发酵液8000rpm离心20min，收集菌体，-20℃保存。
取1ml发酵培养14-16小时的菌液，12000rpm离心1min，弃上清，然后用1ml 20mM磷酸钾盐(PH7.0)重悬菌体，然后超声破碎细胞，进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE采用Laemmli电泳方法，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为8％，还原样品与上样缓冲液混合后，100℃煮沸5分钟进行上样电泳。
结果如图2所示，头孢菌素酶的分子量约为25KD，3-B为诱导前取样，3-A为诱导后取样，结果显示诱导后在25KD处出现了阳性条带，表明头孢菌素酶成功表达。
实施例4突变酶的纯化
量取5mL预处理的亲和载体FP-IDA-Ni2+，装入纯化柱中。样品按照1.0BV/h速度过柱。用3-5BV的Washing缓冲液以1.0BV/h流速去除杂蛋白，同时利用蛋白核酸检测仪在280nm条件下检测流出液的蛋白含量，直到Washing缓冲液澄清以及蛋白核酸检测仪的数值不再变化为止，最后在蛋白核酸检测仪280nm的监控下，用约1-2BV的Elution缓冲液以1-2BV/h的速度洗脱目的酶，酶液4℃保存。
实施例5酶水解活力的测定
1、测定方法
青霉素溶液的制备：称取青霉素钠(钾)适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。
头孢菌素酶稀释液的制备：取头孢菌素酶发酵液/纯化后的酶，稀释1000-5000倍，在37℃预热。
测定法：精密量取青霉素溶液50ml，置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的头孢菌素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.005mol/L)[精密量取碘滴定液(0.05mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度]25ml中，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。
空白试验：取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.005mol/L)25ml，然后精密加头孢菌素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式计算：
E＝(B-A)×M×F×D×100
式中，E为头孢菌素酶活力，单位/(ml·小时)；
B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；
A为供试品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；
M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L；
F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.005mol/L)相当于青霉素的效价，单位；
D为头孢菌素酶溶液的稀释倍数。
磷酸盐缓冲液(pH7.0)：取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g，加水使成1000ml。
醋酸钠缓冲液(pH4.5)：取冰醋酸13.86ml，加水使成250ml；另取结晶醋酸钠27.30g，加水使成200ml，两液混合均匀。
2、测试结果
酶水解活力的测试结果如表1所示。由表1可知，突变酶的水解底物的酶活为9.52×1011U/L.h，相对于原始菌株(1.77×1011U/L.h)提高了5.36倍。
表1
菌号 氨基酸突变位点 相对活力(％)
原始菌株 —— 100％
头孢菌素酶P154T P154T 536％
实施例6加酶TSA固体培养基制备及灵敏度测试
配制TSA固体培养基，其中胰蛋白胨15.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂14g/L，pH值7.5。将配置好的培养基于121℃下高压灭菌25分钟，待其冷却至50℃，加入头孢菌素酶，混合均匀，使得头孢菌素酶溶解在TSA培养基中的浓度为30万单位/mL。在超净工作台，将20ml TSA加酶培养基均匀平铺于平皿底板，冷却凝固，盖上平皿上盖。
往皿中加入头孢类抗生素10mg，按《中国药典》2015年版四部通则1105平皿法中的涂布法进行试验，计算回收率。藤黄微球菌(G+球菌)、皮氏罗尔斯顿菌(G－杆菌)及霉菌的回收率分别为100％、100％、100％。结果显示均有效中和头孢类抗生素10mg粉尘，灵敏度满足培养基的适用性试验，适用于头孢类抗生素日常环境沉降菌监测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州白云山拜迪生物医药有限公司
<120> 一种酶活提高的头孢菌素酶突变体及其构建方法
<130> 20181221
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gln Pro Ala Asn Ala Lys Ala Asn Ile Gln Gln Gln Leu Ser Glu
1 5 10 15
Leu Glu Lys Asn Ser Gly Gly Arg Leu Gly Val Ala Leu Ile Asp Thr
20 25 30
Ala Asp Asn Ser Gln Ile Leu Tyr Arg Gly Asp Glu Arg Phe Pro Met
35 40 45
Cys Ser Thr Ser Lys Val Met Ala Val Ser Ala Leu Leu Lys Gln Ser
50 55 60
Glu Thr Asp Lys Asn Leu Leu Ala Lys Arg Met Glu Ile Lys Gln Ser
65 70 75 80
Asp Leu Val Asn Tyr Asn Pro Ile Ala Glu Lys His Leu Asp Thr Gly
85 90 95
Met Thr Leu Ala Glu Phe Ser Ala Ala Thr Ile Gln Tyr Ser Asp Asn
100 105 110
Thr Ala Met Asn Lys Ile Leu Glu His Leu Gly Gly Pro Ala Lys Val
115 120 125
Thr Glu Phe Ala Arg Thr Ile Gly Asp Lys Thr Phe Arg Leu Asp Arg
130 135 140
Thr Glu Pro Thr Leu Asn Thr Ala Ile Thr Gly Asp Lys Arg Asp Thr
145 150 155 160
Thr Ser Pro Gln Ala Met Ala Ile Ser Leu Gln Asn Leu Thr Leu Gly
165 170 175
Lys Ala Leu Ala Glu Pro Gln Arg Ala Gln Leu Val Glu Trp Met Lys
180 185 190
Gly Asn Thr Thr Gly Gly Ala Ser Ile Arg Ala Gly Leu Pro Thr Thr
195 200 205
Trp Val Val Gly Asp Lys Thr Gly Ser Gly Asp Tyr Gly Thr Thr Asn
210 215 220
Asp Ile Ala Val Ile Trp Pro Ala Asn His Ala Pro Leu Val Leu Val
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Thr Gln Pro Gln Gln Asn Ala Glu Ala Arg Lys Asp Val
245 250 255
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<210> 2
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<212> PRT
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<210> 3
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgcagccgg ctaacgctaa agctaacatc cagcagcagc tgtctgaact ggaaaaaaac 60
tctggtggtc gtctgggtgt tgctctgatc gacaccgctg acaactctca gatcctgtac 120
cgtggtgacg aacgtttccc gatgtgctct acctctaaag ttatggctgt ttctgctctg 180
ctgaaacagt ctgaaaccga caaaaacctg ctggctaaac gtatggaaat caaacagtct 240
gacctggtta actacaaccc gatcgctgaa aaacacctgg acaccggtat gaccctggct 300
gaattctctg ctgctaccat ccagtactct gacaacaccg ctatgaacaa aatcctggaa 360
cacctgggtg gtccggctaa agttaccgaa ttcgctcgta ccatcggtga caaaaccttc 420
cgtctggacc gtaccgaacc gaccctgaac accgctatca ctggtgacaa acgtgacacc 480
acctctccgc aggctatggc tatctctctg cagaacctga ccctgggtaa agctctggct 540
gaaccgcagc gtgctcagct ggttgaatgg atgaaaggta acaccaccgg tggtgcttct 600
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Claims (8)

1.一种酶活提高的头孢菌素酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的头孢菌素酶突变体，其特征在于，所述突变体在如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的基础上，将第154位的脯氨酸突变成苏氨酸。
3.如权利要求2所述的头孢菌素酶突变体，其特征在于，编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种酶活提高的头孢菌素酶突变体基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1～3任一项所述酶活提高的头孢菌素酶突变体。
5.如权利要求4所述的头孢菌素酶突变体基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌表达权利要求1～3任一项所述酶活提高的头孢菌素酶突变体。
7.如权利要求6所述的工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在如SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列的基础上，将第154位的脯氨酸突变成苏氨酸，得到突变体，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到DH5ɑ宿主菌中即得到工程菌。
8.如权利要求1～3任一项所述的酶活提高的头孢菌素酶突变体在制备头孢菌素酶中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106163546A (zh) * 2014-04-17 2016-11-23 合成生物制品有限公司 具有改进的治疗性质的β‑内酰胺酶

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106163546A (zh) * 2014-04-17 2016-11-23 合成生物制品有限公司 具有改进的治疗性质的β‑内酰胺酶

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERRAZEG等: "Mutations in β-Lactamase AmpC Increase Resistance of Pseudomonas aeruginosa Isolates to Antipseudomonal Cephalosporins", 《ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY》 *
KENZAKA等: "PAA99192.1", 《GENBANK》 *
徐雪丽等: "头孢菌素C酰化酶突变位点的研究", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112662655A (zh) * 2020-12-29 2021-04-16 山东金城柯瑞化学有限公司 头孢菌素c酰化酶突变体及其制备方法和应用

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