DK143349B - Fremgangsmaade til udfoerelse af en enzymatisk reaktion og enzympraeparat til anvendelse hertil - Google Patents

Description

(19) DANMARK (

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT du U33U9 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 3652/75 (51) lnt.Cl.s C 12 N 9/00 (22) Indleveringsdag 12. aug. 1975 C 12 N 11/00 (24) Løbedag 12. aug. 1975 (41) Aim. tilgængelig 14. feb. 1976 (44) Fremlagt 10· aug. 1981 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 13· aug. 1974, 35556/74, GB 26. apr. 1975, 174^4/75, GB

(71) Ansøger BEECHAM GROUP LIMITED, Brentford, GB.

(72) Opfinder Richard Anthony Godwin _Smith, GB.

(74) Fuldmægtig Plougmann & Vingtoft Patent bureau.

(54) Fremgangsmåde til udførelse af en enzymatisk reaktion og enzytn= præparat til anvendelse hertil.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udførelse af en enzymatisk reaktion og et enzympræparat til anvendelse hertil, hvilket enzympræparat kan genvindes fra reaktionsmediet og genbruges.

Enzymatisk katalyserede omdannelser er vigtige trin i et stort antal kemiske processer, f.eks. forsæbning af lipider under anvendelse af ffl en hydrolase såsom lipase, nedbrydning af protein under anvendelse CD af et proteolytisk enzym såsom trypsin, fremstilling af steroider un- ^ der anvendelse af dehydrogenase, fremstilling af glucosesirupper ud GO fra stivelse under anvendelse af en hydrolase, og fremstilling af 6-aminopenicillansyre ud fra penicilliner såsom benzylpenicillin eller phenoxymethylpenicillin under anvendelse af penicillinacylase.

O

2 143349

Almindeligvis udføres enzymatiske reaktioner med enzymet i opløsning i det medium, som indeholder substratet. (Udtrykket "substrat" betegner i nærværende beskrivelse det stof, som enzymet omdanner til produktet.) Da enzymet er opløst i reaktionsmediet, er det hyppigt meget vanskeligt at skille enzymet fra substratet eller fra omdannelsesproduktet, når reaktionen er færdig. Når produktet er isoleret fra reaktionsblandingen, forårsager fraskillelsesproceduren almindeligvis en desaktivering af enzymet. Dette gør naturligvis enzymet ikke-genvindeligt.

For at løse dette adskillelsesproblem og for at få et enzymsystem, som kan genbruges, er det kendt at binde enzymet til et uopløseligt fast bærestof, enten ved adsorption (jfr. f.eks. britisk patentskrift nr. 1.264.147) eller ved covalente bindinger, enten direkte eller indirekte via brodannende grupper (jfr. de britiske patentskrifter nr. 1.349.498, 1.387.460 og 1.365.886.) Imidlertid har sådanne uopløselige præparater en række ulemper. For det første er de, da de er faste, udsat for mekanisk nedbrydning og endelig sønderdeling. For det andet er fastgørelsen af enzym på overfladen af det faste bærestof, og dermed præparatets specifikke aktivitet, ofte ringe, og for det tredje er substratets adgang til de aktive positioner i enzymet ofte hindret. Forsøg på at forbedre sådanne uopløselige enzym/polymerpræ-paraters specifikke aktivitet ved at forøge det faste stofs ydre overfladeareal nødvendiggør en formindskelse af det faste præparats partikelstørrelse, hvorved håndtering og især fraskillelse ved fil-# trering bliver vanskelig, og ved forøgelse af det indre overfladeareal ved at gøre partiklerne stærkt porøse fås partikler med mindre mekanisk styrke.

Visse vandopløselige enzym/polymercomplexer er desuden beskrevet (jfr. f.eks. britisk patentskrift nr. 1.284.925 og britiske patentbeskrivelser nr. 53822/72 og 44542/73), hvor enzymet er bundet enten direkte eller indirekte via en brodannende gruppe til et vandopløseligt polymerbærestof. Disse enzym/polymercomplexer kan isoleres fra det vandige reaktionsmedium ved ultrafiltrering. Ultrafiltrering er imidlertid en vanskelig og kostbar teknik, især i stor skala, og er derfor uønsket til industriel anvendelse.

Det har nu vist sig, at visse enzymer kan bindes til ikke-polære grupper, således at præparatet kan adskilles fra de vandige medier i kraft af affiniteten til med vand ikke-blandbare væsker.

3 U3349

Opfindelsen bygger på denne erkendelse.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til udførelse af en enzymatisk reaktion er ejendommelig ved, at et enzympræparat indeholdende et enzym, der direkte eller via mellemliggende led er bundet til tilstrækkeligt mange ikke-polære grupper til, at præparatet ved kontakt i vandigt miljø med en med vand ikke-blandbar væske bliver forenet med den inerte med vand ikke-blandbare væske og således kan adskilles fra det vandige miljø, i vandigt miljø bringes i kontakt med et substrat for enzymet, hvorefter enzympræparatet adskilles fra den vandige reaktionsblanding ved kontakt med en med vand ikke-blandbar væske, reaktionsproduktet genvindes fra den vandige fase, og det fraskilte enzympræparat, om ønsket, genanvendes ved at blive bragt i kontakt med yderligere substrat.

Enzympræparatet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder et enzym, der direkte eller via mellemliggende led er bundet til tilstrækkeligt mange ikke-polære grupper til, at præparatet ved kontakt i vandigt miljø med en med vand ikke-blandbar væske bliver forenet med den inerte med vand ikke-blandbare væske og således kan adskilles fra det vandige miljø.

I nærværende beskrivelse betegner udtrykket "en inert, med vand ikke-blandbar væske" en væske, som ikke reagerer med enzympræparatet, så den enzymatiske aktivitet ændres væsentligt.

Udtrykket "forenet med" betegner i nærværende beskrivelse en hvilken som helst form for gensidig påvirkning mellem de ikke-polære grupper i enzympræparatet og molekylerne i den inerte, med vand ikke-blandbare væske, som er tilstrækkelig stabil til at udgøre et middel til adskillelse af enzympræparatet fra det vandige medium.

Almindeligvis er et hvilket som helst enzym, som anvendes i en fremstillingsproces, egnet til inkorporering i de omhandlede præparater, f.eks. sådanne enzymer som amylase, asparaginase, neutral 4 143349 og alkalisk protease, chymotrypsin, cellulase, dextranase, lipase, oxynitrilase, pepsin, penicillinacylase og trypsin.

Enzymet er fortrinsvis lipase, penicillinacylase eller trypsin.

Egnede ikke-polære grupper, som kan bindes til enzymet, er car-bonhydridgrupper med mindst 6 carbonatomer, især alkylgrupper med 6-30 carbonatomer, f.eks. n-hexyl, n-heptyl, n-octyl, n-nonyl, n-decyl, n-dodecyl, n-octadecyl, 4-methylpentyl, 4,4-dimethylpentyl og 3-ethylhexyl; alkenylgrupper med 6-50 carbonatomer såsom unde-ca-10-enyl, oleyl og linoleyl? cycloalkyl med 6-20 carbonatomer? cycloalkenyl med 6-20 carbonatomer? arylgrupper og substituerede arylgrupper, f.eks. phenyl, som eventuelt er substitueret med 1 -3 alkylgrupper med 1-6 carbonatomer? og aralkylgrupper, f.eks. benzyl, 2-phenylethyl, 4-phenylbutyl og 2-tolylethyl.

Enzymet kan bindes enten direkte til den ikke-polære gruppe eller indirekte via en brodannende gruppe.

Ved nogle enzymer bevirker bindingen af et antal ikke-polære grupper direkte til et enzymmolekyle en konformationsændring og en ændring i enzymets aktivitet. Af den grund og i nogle tilfælde på grund af enzymets struktur er det undertiden ikke muligt at binde tilstrækkeligt mange ikke-polære grupper til et enzym til at gøre præparatet separabelt fra et vandigt medium, uden at der sker en uacceptabel reduktion i enzymets aktivitet.

For at overvinde denne vanskelighed foretrækkes det ofte at fremstille et enzympræparat, hvor enzymet er bundet til eller adsorbe-ret på et polymerbærestof, som så bærer ikke-polære grupper i stedet for eller foruden grupperne på enzymet selv. Dette udgør også en bekvem måde til at regulere det relative forhold mellem ikke-polære grupper og enzym i præparatet. Det er naturligvis også muligt at binde et enzym, som bærer et tilstrækkeligt antal ikke-polære grupper til at gøre det separabelt fra et vandigt medium, til et polymerbærestof, som eventuelt ikke bærer yderligere ikke-polære grupper.

Et foretrukket enzympræparat ifølge opfindelsen er derfor et enzympræparat som ovenfor defineret, hvor enzymet er bundet til de ikke--polære grupper via et polymerbærestof.

5 143349

Bindingen af enzymet til en polymer omfatter i nærværende beskrivelse både en covalent binding til og en adsorption på et polymerbærestof, når blot adsorptionen er tilstrækkelig kraftig til at holde enzymet på bærestoffet, når præparatet forenes med den med vand ikke-bland-bare væske.

Bærestoffer til anvendelse i de anførte præparater kan være vandopløselige eller vandgopløselige.

Når et vanduopløseligt polymerbærestof anvendes til de omhandlede præparater, er det fortrinsvis findelt, således at det har et stort overfladeareal til binding af enzymet og derved giver præparatet en høj specifik aktivitet.

Egnede vanduopløselige materialer er f.eks. cellulosepulver og cellulosederivater såsom carboxymethylcelluloseionbytterharpikser, nylon, højmolekylære polysaccharider såsom agarose og tværbundne dex-traner, polysaccharider modificeret med modificeringsmidler såsom epichlorhydrin eller modificeret til at inkorporere carboxymethyl-eller aminoethylgrupper, polyacrylater og polymethacrylater. Der foretrækkes især agarose og makrorectikulære tværbundne polyacrylat-og polymethacrylatharpikser.

Egnede vandopløselige materialer er polymere af naturlig oprindelse, f.eks. polysaccharider såsom dextran, dextriner eller stivelse, og polymere af naturlig oprindelse, som er modificeret, f.eks. partielt nedbrudt stivelse eller cellulose; polysaccharider, oligosac-charider og saccharider, som er modificeret med modificeringsmidler såsom epichlorhydrin; og cellulose, der er modificeret, således at der er inkorporeret carboxymethyl- eller aminoethylgrupper.

Af de ovenfor anførte modificerede saccharider og oligosaccharider har det vist sig, at copolymere af epichlorhydrin og enten lactose, dextrose eller saccharose er særlig velegnede· Foretrukne enzympræparater ifølge opfindelsen er derfor sådanne, hvor polymerbærestoffet er en copolymer af en oligosaccharid og epichlorhydrin eller en copolymer af saccharose og epichlorhydrin. En foretrukken polymer er saccharose-epichlorhydrinpolymeren "Ficoll"' m$d en molekylvægt på ca. 400.000. "Ficoll" er et registreret varemærke.

6 143349

Foruden polymere af naturlig oprindelse er det også muligt at anvende syntetiske vandopløselige polymere, f.eks. polymere af poly-vinylalkohol og copolymere af malein- eller acrylsyreanhydrider med ethylen, styren, methylvinylether, divinylether eller vinylacetat. Sådanne polymere er f.eks. beskrevet i de vesttyske offentliggørelsesskrifter nr. 1.948.177 og 1.948.298 og i de britiske patentskrifter nr. 1.290.701 og 1.223.281.

En velegnet klasse af vandopløselige copolymere er de methylvinyl-ether/maleinsyreanhydrid-copolymere, der betegnes "Gantrez AN".

"Gantrez AN" er et registreret varemærke.

Enzymet kan bindes direkte til en polymer indeholdende ikke-polære grupper, eller der kan til polymerbærestoffet bindes brodannende grupper, hvortil enzymet kan bindes. En brodannende gruppe er hensigtsmæssigt en aliphatisk α,ω-diamin med 2-10 carbonatomer, f.eks.

1,3-diaminopropan eller 1,6-diaminohexan. Den ene aminofunktion i den brodannende gruppe er bundet til den polymere, og den anden er fri til kobling med enzymet, f.eks. via et vandopløseligt dialdehyd såsom glyoxal og glutaraldehyd. Anvendelsen af sådanne bifunktionelle brodannende grupper fører også til nogen tværbinding mellem enzym- og polymer-enhederne. De brodannende grupper kan anvendes mellem enzym og bærestof; enzym og ikke-polære grupper (med eller uden yderligere tilstedeværelse af et bærestof); eller mellem bærestof og ikke-polære grupper.

Antallet af ikke-polære grupper, som inkorporeres i de omhandlede præparater, afhænger af flere faktorer. Binding af ikke-polære grupper til polymeren og/eller enzymet skaber et hydrofobt område omkring enzymet. Med nogle enzymer fører en for høj grad af hydrofobi-citet til desaktivering af enzymet på grund af den samtidige konfor-mationsændring.

Der skal være ligevægt mellem bindingen af det minimale antal ikke--polære grupper, som er nødvendigt for at tillade adskillelse fra det vandige medium, og det maksimale antal, som kan bindes uden at ødelægge enzymets stabilitet. Til bestemmelse af denne ligevægt må man nødvendigvis prøve sig frem. De kriterier, efter hvilke ligevægten kan findes, er følgende: U33A9 7 1) polymerbærestoffets molekylvægt; 2) monomerenhedens molekylvægt; 3) den procentvise andel af monomerenheder i den polymere substitueret med ikke-polære grupper; 4) de ikke-polære gruppers størrelse; 5) enzymets art; og 6) graden af substitution af den polymere med enzymet.

Når f.eks. bærestoffet er "Gantrez AN" 119 (polymermolekylvægt 230.000, monomerenhedmolekylvagt 156), hvor 1 mol "Gantrez AN" 119 er substitueret med 1 mol penicillinacylase, optræder den minimale substitution, som er nødvendig til at opnå effektiv adskillelse fra det vandige miljø, når ca. 25% af monomerenhederne er substitueret med n-decylgrupper; og den maksimale substitution med bevarelse af den enzymatiske aktivitet optræder, når ca. 50% af monomerenhederne er substitueret med n-octadecylgrupper.

De omhandlede enzympræparater kan fremstilles ved at bringe en forbindelse med den almene formel I

R - X I

hvor R er en ikke-polær gruppe, og X er en funktionel gruppe, i kontakt med et enzym, der er bundet til en aktiv gruppe, som er i stand til at reagere med gruppen X.

Gruppen X kan f.eks. være amino, carboxy, aldehyd, hydroxy, thibl eller azo; eller reaktive bindende grupper afledt af f.eks. dialdehyder såsom glyoxal eller glyceraldehyd, og/eller diaminer såsom 1,6-hexamethylendiamin eller ethylendiamin, og/eller α,ω-amino-aliphatiske carboxylsyrer såsom glycin eller 6-aminohexaminsyre; eller et polymerbærestof indeholdende en sådan funktionel gruppe. X er fortrinsvis en aminogruppe eller en del, som bærer en aminogrup-pe.

Den aktive gruppe, som er bundet til enzymet og i stand til at reagere med gruppen X, kan være en gruppe, som findes i enzymet enten i forvejen eller ved modificering,f .eks. en carboxy-, amino-, thipl- eller phenolisk hydroxygruppe eller anhydridbindinger; eller et poly- 143349 merbærestofmateriale indeholdende en sådan aktiv gruppe; eller en reaktiv bindende gruppe, som eksemplificeret ovenfor i forbindelse med gruppen X.

Reaktionen mellem forbindelsen med formlen I og enzymet udføres fordelagtigt ved i det væsentlige neutral pH-værdi, hensigtsmæssigt i pH-området 4 - 9, og ved en temperatur imellem -4 og +40°C, alt afhængig af enzymet. pH-Værdien er fortrinsvis ca. 7,0, og temperaturen ligger fortrinsvis i området 0 - 5°C.

Når enzympræparatet i det væsentlige består af enzymet og ikke-polære grupper alene, foretrækkes det, at gruppen X er afledt af et dialdehyd og/eller en α,ω-diamin, dvs. at de ikke-polære grupper er bundet til enzymet via sådanne brodannende grupper.

Ved fremstillingen af et enzympræparat ifølge opfindelsen, som også indeholder et polymerbærestof, foretrækkes det, at bærestoffet først modificeres, således at den ikke-polære gruppe, og om nødvendigt den brodannende gruppe, inkorporeres, før bindingen til enzymet. Ved denne udførelsesform betegner gruppen X i formlen I ovenfor et polymermateriale, som er bundet til den ikke-polære gruppe R og til en funktionel gruppe.

De enzym/modificerede polymerpræparater kan derefter fremstilles efter en hvilken som helst kendt metode til binding af enzymer til polymere. Sådanne bindingsmetoder er f.eks. beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.325.912 og består i kobling af enzymet til den polymere ved anvendelse af sådanne reagenser som cyanogenhalogenider, især cyano-genbromid; s-triaziner, især 2-amino-4,6-dichlor-s-triazin; acyl-azider, diazoniumforbindelser, f.eks. 2-hydroxy-3-(p-diazophenyl)pro-pylether; organiske cyanater såsom phenylcyanat og carbodiimider. Sådanne bindingsmidler anvendes ofte først til at reagere med den polymere og forsyne den med reaktive grupper, hvilke grupper derefter bringes til at reagere med enzymet. I nogle tilfælde kan enzymerne reagere direkte med polymeren, f.eks. hvis denne indeholder eller er blevet modificeret til at indeholde aktive grupper såsom anhydrid-bindinger eller acetazidgrupper.

Det er derfor klart, at reaktionsmetoden og -betingelserne, som anvendes til at fremstille de modificerede polymere og binde dem til enzymerne, vil variere alt efter enzymets natur og polymermaterialets natur.

9 U3349

Til fremstilling af de fleste enzym/polymerpræparater er en bekvem fremgangsmåde illustreret i skema I. Det første trin består i til polymeren at binde a) de ikke-polære grupper, fortrinsvis via en primær eller sekundær amin RNH^ eller R NH, og b) brodannende grupper såsom a,ω-diaminer, der derefter skal bindes til enzymet via dlaldehydgrup-per. Disse omsætninger udføres hensigtsmæssigt i vandig opløsning eller suspension ved alkalisk pH-værdi (hensigtsmæssig pH-værdi 8 - 12) og ved stuetemperatur. Enzymet med dialdehydgrupper kan derefter kobles til den modificerede polymer i vandigt miljø ved i det væsentlige neutral pH-værdi.

Skema I

CT~; Γ--NH.R

Polymer _Polymer _ RNH2 eller R2NH _I -}- ^-NH(CH2)xNH2 NH2(CH2)xNH2

Enzym CHO(CH2)yCHO Enzym ...-N<:H(CH2)yCHO

- -^ -

-γ-NH.R

Polymer

--I-NH. (CH,) -N

π v

Enzym -N*=CH-(CH2)y-CH

hvor R betegner en ikke-polær gruppe som ovenfor anført? ΝΗ2(ΟΗ2)χΝΗ2 betegner en α,ω-diamin; og CHO(CH2) CHO betegner et dialdehyd.

Det er ofte nødvendigt at aktivere grupper på polymeren, fortrinsvis ved hjælp af cyanogenbromid, før en binding til de ikke-polære grupper er mulig.

10 U3349 På den anden side findes der i nogle polymere grupper, som kan anvendes til kobling med ikke-polære grupper og/eller enzym, om ønsket, uden mellemliggende brodannende grupper. De enzympræparater ifølge opfindelsen, som er fremstillet på denne måde, mangler så den tværbinding, som skyldes anvendelsen af brodannende grupper, og har ofte fordelagtige egenskaber som nedenfor beskrevet.

F.eks. kan anhydridgrupperne langs "rygraden" i polymere baseret på maleinsyreanhydridmonomer, f.eks. "Gantrez"-materialer, anvendes til at binde både ikke-polære grupper og enzymer. Den polymere modificeres hensigtsmæssigt først ved tilknytning af ikke-polære grupper, og de tilbageværende anhydridgrupper i polymeren anvendes derefter direkte til kobling med enzymet. Denne proces er illustreret i skema II:

Skema II

OCH, I 3 -•CH^CH-CH-CH--- [ I + m RNH, --\ C C ' / ✓v\ 0 0 0 n OCH., 0CH3

i 3 I

- CH2-CH-CH-CH-i--CH2-CH-CH-CH-- C02H C=0 /\ /\ 0 0 0

NHR

„ n-m m x enz-nh2 _ _ OCH, OCH, OCH,

I 3 I I

-> -ΌΗ,-ΰΗ-ΟΗ-ΰΗ---CH,-CH-CH-CH---CH,-CH-CH-CH---

Il II 2 I I

H,0 C0,H C=0 C0,H C=0 C0oH C0,H

Z z

NHR NH

m I

— —1 __ ENZ X L - ' n-(m+x) u 143349 R betegner den ovenfor anførte ikke-polære gruppe; ENZ-NH2 betegner enzymet med en aminogruppe.

"Gantrez"-polymere, f.eks. "Gantrez AN" 119 og "Gantrez AN" 149, har yderligere den fordel, at de opløses uden omsætning i visse aprotiske ikke-vandige opløsningsmidler såsom dimethylform-amid, som også er gode opløsningsmidler for aminerne RN^ °9 R NH.

Det er muligt at opnå en homogen reaktionsblanding, og derfor er sådanne opløsningsmidler fordelagtige reaktionsmedier til bindingen af ikke-polære grupper til disse polymere under fremstillingen af de omhandlede enzympræparater.

Det foretrækkes, at aminen omsættes med polymeren i nærværelse af en tertiær base, f.eks. pyridin. Udtrykket "tertiær base" betegner i nærværende beskrivelse en tertiær amin eller en heterocyclisk aromatisk amin.

Det ikke-vandige aprotiske opløsningsmiddel er fortrinsvis N,N-di-methylformamid eller selve den tertiære base. Den temperatur, ved hvilken reaktionen udføres, afhænger af polymerbærestoffets art og aminens art. Almindeligvis udføres reaktionen imidlertid ved en temperatur mellem stuetemperatur og 100°C.

Det modificerede polymerbærestof kan isoleres fra det medium, i hvilket det dannes, ved udfældning med et mindre polært opløsningsmiddel, særlig hensigtsmæssigt diethylether, eller ved tilsætning af opløsningen til vand, når opsvulmning og anhydridhydrolyse finder sted, og isolering af den hydrolyserede modificerede polymer fra det vandige medium under anvendelse af en med vand ikke-blandbar væske, eller ved centrifugering.

Enzymet bindes derefter til det ovenfor anførte isolerede, modificerede bærestof ved, at det modificerede bærestof bringes i kontakt med' enzymet i vandig opløsning, eventuelt med et koblingsmiddel, f.eks. et substitueret carbodiimid. Alternativt kan den ikke-hydrolyserede reaktionsblanding , eller den ikke-hydrolyserede modificerede polymer opløst i et ringe volumen af et polært ikke-vandigt opløsningsmiddel sættes direkte til en vandig opløsning af enzymet.

12 U33A9

Alternativt kan koblingen udføres ved først at tildanne det ovenfor anførte ikke-hydrolyserede bærestof ved at behandle det med hydrazinhydrat i dimethylformamidopløsning. Det tildannede bærestof, som derefter hydrolyseres og isoleres fra det vandige medium ved centrifugering, kan kobles med enzymet i vandigt medium under anvendelse af natriumnitrit som aktivator.

Et foretrukket enzympræparat ifølge opfindelsen er et sådant, hvor polymerbærestoffet har anhydridgrupper på polymerens "rygrad", dels fordi ikke-polære grupper direkte kan knyttes til polymeren ved omsætning af en egnet anion med polymeren, dels fordi enzymet kan knyttes til polymeren ved omsætning af denne direkte med enzymet, jfr. det ovenstående.

Mange forskellige, med vand ikke-blandbare væsker kan anvendes til at adskille enzympræparatet fra det vandige medium. Egnede væsker er f.eks. alkaner såsom heptan, octan, nonan, decan og hexadecan, aromatiske carbonhydrider, højere aliphatiske estere såsom glyceryl-trioleat og aliphatiske alkoholer med 4-12 carbonatomer såsom n--decanol.

Ved kontakt med en sådan væske danner enzympræparatet en overfladefase i kontaktområdet. For at gøre dette kontaktområde så stort som muligt går en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen ud på, at kontakten mellem enzympræparatet og den med vand ikke-blandbare væske etableres ved agitation, f.eks. omrøring eller omrystning, for at nedbryde den med vand ikke-blandbare væske til små dråber. Hver dråbe omgives derefter af enzympræparat, som hæfter ved dens overflade.

Denne kontakt mellem enzympræparatet og den med vand ikke-blandbare væske kan etableres før, under eller efter udførelse af den enzymatiske reaktion. Den etableres ifølge opfindelsen fortrinsvis før den enzymatiske reaktion ved, at enzympræparatet, ved hjælp af agitation, 13 143349 dispergeres med en med vand ikke-blandbar væske i et vandigt medium indeholdende substratet. Under den enzymatiske reaktion er præparatet således forenet med dråber af med vand ikke-blandbar væske, som foreligger som en emulsion i vandigt medium, og dispersionen vedligeholdes under omsætningen ved agitation. Når enzympræparatet skal fraskilles, standses agitationen, og faserne forenes.

Alternativt kan enzympræparatet foreligge i den vandige reaktionsblanding som en opløsning eller en suspension og bringes i kontakt med den med vand ikke-blandbare væske efter omsætningen, når enzympræparatet skal adskilles.

Den måde, hvorpå enzympræparatet forenes med den med vand ikke--blandbare væske, varierer alt afhængig af hvilket polymermateriale og/eller hvilke ikke-polære grupper, som er inkorporeret i enzympræparatet. F.eks. dannes der med enzym/polymerpræparater, som har betydelig tværbinding, faste aggregater, og disse hæfter sig på drå--berne af den med vand ikke-blandbare væske. Med ikke-tværbundne præ- · parater, f.eks. de "Gantrez"-bårne materialer som ovenfor beskrevet (og præparater, der ikke indeholder polymere), er der normalt ingen større vedhæftning af faststof på dråberne, og der dannes et monolag af enzympræparat på dråberne. Dette er især fordelagtigt, når enzymreaktionen udføres, efter at enzympræparatet først er bragt i kontakt med den med vand ikke-blandbare væske til dannelse af et sådant system.

Uafhængigt af naturen af tilknytningen muliggør kontakten mellem enzympræparatet og den med vand ikke-blandbare væske (sædvanligvis i form af smådråber) adskillelse af enzympræparatet fra det vandige medium. Dråberne, som er overtrukket med enzympræparat, har tilnærmelsesvis samme massefylde som den med vand ikke-blandbare væske.

Ved henstand flyder dråberne enten på overfladen af det.vandige medium (i tilfælde af væsker, som er lettere end vand) eller lægger sig på bunden (i tilfælde af tungere væsker). Der dannes således en adskilt fase bestående af den med vand ikke-blandbare væske forenet med enzympræparatet, som let adskilles fra det vandige medium.

For væsker som ikke flyder ovenpå eller lægger sig på bunden af vandige medier tilstrækkeligt hurtigt, kan der anvendes andre adskillelsesmetoder, f.eks. centrifugering, eller blandingen kan 14 U33A9 ledes gennem et vandskyende filter, hvorved det vandige medium løber igennem, og den med vand ikke-blandbare væske (sammen med enzympræparatet) bliver tilbage og således adskilles derfra. En foretrukken enzymatisk proces er fremstilling af 6-aminopenicillansyre ud fra en penicillin under anvendelse af et præparat baseret på et penicillinacylaseenzym. I dette tilfælde fås acylaseenzymet fortrinsvis fra bakterier, f.eks. stammer af Escherichia coli, når det skal anvendes til spaltning af benzylpenicillin, eller fra fungi af actinomycetes, når det skal anvendes til spaltning af phenoxymethylpenicillin. Sådanne enzymer er almindeligvis velkendte.

De anvendes ved fremstillingen af. 6-APA i et pH-område mellem 6,0 og 9,0, fortrinsvis ved pH-værdi 7,0 - 8,5. Da deacylering af en penicillin fører til frigørelse af en fri syre fra penicillinsidekæden, er det nødvendigt at opretholde det ovenfor anførte pH-område under fremstillingen af 6-APA ved tilsætning efter behov af en base, f.eks. en opløsning af natrium- eller ammoniumhydroxid eller tri-ethylamin.

Fig. 1 viser frigørelsen af p-nitroanilin fra N-a-benzoyl-D,L-ar-ginin-p-nitroanilid; fig. 2 viser frigørelsen af p-nitrophenyllaurat katalyseret af to forskellige enzymer? og fig. 3 viser et egnet reaktionsanlæg.

En særlig fordel ved anvendelsen af enzympræparatet ifølge opfindelsen er den lette anvendelse deraf i en kontinuerlig metode til enzymatisk reaktion, som kan udføres i et apparatur, som er vist på fig. 3.

Fig. 3 viser en reaktionsbeholder 1 forsynet med agitationsindretninger i form af en omrører 2, tilgangsrør 3, 4 og 5 til henholdsvis substrat, base og enzymfase, og et afgangsrør 6. Beholderen 1 indeholder også en pH-målesonde 7, som styrer en ventil 8 forbundet med basetilgangsrøret 4. Gennem beholderens afgangsrør 6 fødes, via en pumpe 9, en separationsbeholder 10 gennem et tilgangsrør 11. Sepa-rationsheholderen har et øvre afgangsrør 12, der er forbundet med reaktionsbeholderens tilgangsrør 5, et nedre afgangsrør 13 til fjernelse af reaktionsprodukt via en pumpe 14 og et filter i form af en glassinterplade 15 anbragt over det nedre afgangsrør 13. Substratilgangsrøret 3 fødes fra en pumpe 16, og pumperne 14 og 16 er forbundet, så de kører med samme strømningshastighed.

, 1Λ 3 3 Λ 9 15

Ved drift fyldes reaktionsbeholderen 1 gennem tilgangsrøret 3 med substratet i vandigt miljø sammen med et enzympræparat ifølge opfindelsen og en med vand ikke-blandbar væske. Blandingen dispergeres af omrøreren 2 til dannelse af en emulsion. Beholderen 1 kan holdes ved konstant temperatur, f.eks. ved hjælp af en vandkappe (ikke vist) rundt om beholderen. Til emulsionen i beholderen sættes base gennem tilgangsrøret 4, og tilsætningshastigheden reguleres af ventilen 8, der styres af sonden 7, således at pH-værdien i reaktionsblandingen holdes i det område, som er nødvendigt til optimal reaktion. Under reaktionen kører pumpen 9, og blandingen tages ud af afgangsrøret 6 og overføres til separationsbeholderen 10 gennem tilgangsrøret 11.

I separationsbeholderen 10 danner den med vand ikke-blandbare væske (som i dette tilfælde er lettere end vand) en fraskilt øvre fase 17, i der medfører enzympræparatet. Den nedre vandige fase 19 indeholdende reaktionsproduktet tages ud gennem filteret 15 og derfra gennem afgangsrøret 13 ved hjælp af pumpen 14. Den øvre fase 17 indeholdende enzympræparatet i forening med den med vand ikke-blandbare væske lades løbe ud gennem afgangsrøret 12 og løbe tilbage til reaktionsbeholderen gennem tilgangsrøret 5. Medens produktet tages ud gennem afgangsrøret 13, ledes yderligere substratopløsning til beholderen 1 gennem tilgangsrøret 3 ved hjælp af pumpen 16. Pumperne 14 og 16 er koordineret således, at tilgangshastigheden for substrat er lige så stor som afgangshastigheden for produktet.

Strømningshastighederne, opholdstiden i reaktionsbeholderen og andre parametre for reaktionen afhænger af det pågældende enzympræparat/ substratsystem. Af indledende forsøg fremgår det, at der i en 10.000 liters reaktionsbeholder med 1000 kg af et enzympræparat baseret på penicillinacylase bundet til et "Gantrez AN" 149-bærestof kan omdannes ca. 2000 kg penicillin G/dag i en koncentration på 5 vægt/ volumenprocent ved 22°C og pH-værdi 7,8; disse tal kan forbedres med enzympræparater med større specifik aktivitet.

Fremstillingen af og egenskaberne ved nogle enzym/polymercomplexer ifølge opfindelsen illustreres i nedenstående eksempler, hvor nedenstående forkortelser anvendes til at betegne polymere og modificerede polymere, enzymer, bindingsgrupper, ikke-polære grupper og koblingsmidler: 16 143349

Enzymer: L : lipase PA : penicillinacylase T : trypsin Bærestoffer: F : "Ficoll" GAN: "Gantrez" SR : "Sepharose" T2000: dextran T.2000

Enzym/baerestof-bindingsgruppe : HD : 1,6-diaminohexan

Ikke-polære grupper: D : n-decylamino DD : n-dodecylamino OD : n-octadecylamino

Bindingsmidler og aktiverende midler og aktiverede grupper: CMC : l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimidmethan--p-toluensulfonat G : glutaraldehyd A : hydraz id.

Tallene efter forkortelsen betegner batchnummeret.

F.eks. er enzympræparatet i eksempel 1 betegnet PAFHDDG. Enzymet er således penicillinacylase (PA), bærestoffet er "Ficoll" (F), der bærer hexamethylendiamingrupper (HD) til binding til enzymet, og tillige decylgrupper (D) som ikke-polære grupper. Koblingen mellem den frie aminogruppe i hexamethylendiaminbindingen og enzymet udføres under anvendelse af glutaraldehyd (G).

17 143349 GAN 149 HDOD er det modificerede bærestof fremstillet ud fra "Gantrez" 149 modificeret med 1,6-diaminohexan og octadecylamin, og PAGAN 149 HDOD-G er det modificerede, ovenfor anførte bærestof, til hvilket er bundet penicillinacylase i nærværelse af glutaral-dehyd.

Eksempel 1.

a) n-Decylamino, (6-aminohexylamino)-"Ficoll" (FHDD - 1).

5 g "Ficoll" opløses i 300 ml vand, og der indstilles på pH-værdi 11,0. 1 g cyanogenbromid tilsættes, og pH-værdien holdes konstant under omsætningen ved hjælp af 2N NaOH. Reaktionen ophører efter 20 minutter ved stuetemperatur, og der tilsættes 4 g n-decylamin og 0,5 g 1,6-diaminohexan opløst i 10 ml methanol. pH-Værdien indstilles på 9,5 ved tilsætning af 2N HC1, og blandingen omrøres i 16 timer ved 4°C. Den resulterende kolloide opløsning centrifugeres ved 22.000 g i 1 time, hvorved der fås en hvid kugle (35 g fugtig vægt), som gemmes, og en uklar overstående væske, som kasseres.

b) Penicillinacylase [n-decylamino, (6-aminohexylamino)"Ficoll"] (PAFHDDG - 1).

21,6 g (fugtig vægt) FHDD - 1 blandes med 20 ml 0,1M natriumphos-phatpuffer med pH-værdi 6,0 og indstilles på pH-værdi 6,2 ved tilsætning af 2N HCl. 50 ml af en opløsning af Escherichia coli-peni-cillinacylase (340 mg protein delvis renset) indstilles på pH-værdi 6,2 ved 0°C, og 5 ml glutaraldehyd (25 vægt/volumenprocent i vandig opløsning) tilsættes. Efter omrøring ved 0°C i 30 minutter tilsættes FHDD-1-suspensionen. Blandingen omrøres ved 0°C i 3 timer og ved 4°C i 4 timer, hvorefter den fryses ved -20°C i 16 timer. Efter optøning centrifugeres suspensionen ved 20.000 g/4°C i 45 minutter, hvorved der fås en brun gel-lignende kugle. Gelen resuspenderes i 30 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0 og centrifugeres igen ved 20.000 g/4°C i 30 minutter. De overstående væsker sammenhældes, og den brune kugle (ca. 6,3 g fugtig vægt) suspenderes i 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0 og oplagres ved 4°C.

18 143349

Suspensionen af kuglen flyder, når den er blandet med mindst sin egen vægt n-decanol, sammen med decanolen op til overfladen af vandige opløsninger, og tilbage bliver en underliggende væske uden partikulært enzym. Enzymaktiviteten i kugle, overstående væske og stamenzym er vist i tabel I. Ca. 43% af den oprindelige enzymaktivitet er genvundet, faktisk det hele i konjugatet. Aktiviteten i complexet kan i det væsentlige genvindes fra penicillinopløsningerne, enten ved flotering eller ved sædvanlig centrifugering.

Tabel I.

Penicillinacylaseaktivitet af PAFHDDG-1.

Forsøgsteknik: Natriumsaltet af penicillin G opløses til en passende koncentration i 20 ml 0,02M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,8 ved 37°C, og enzymprøven tilsættes. pH-Værdien opretholdes ved tilsætning af 0,1N eller 0,5N NaOH-opløsning, og aktiviteten udtrykkes som begyndelseshastigheden for dannelsen af 6-aminopenicillansyre (6-APA). Ved genforsøgfremgangsmåde 1 sættes 2 ml n-decanol til den omrørte reaktionsblanding, og efter bestemmelsen lades suspensionen adskille i to faser. Den øvre fase fjernes med en sprøjte og genanvendes. Ved genforsøgfremgangsmåde 2 centrifugeres den endelige suspension ved 2000 g i 15 minutter, og kuglen genanvendes.

Materiale Mængde Vægt/volumen- Begyndelsesprocent peni- hastighed for cillin G i for- 6-APA-dannel- søget se mol/minut x 10~4

Stamenzym 1 ml 5 0,885 PAFHDDG-1

Overstående væske 1 ml 5 0,008 PAFHDDG-1 0,5 g 5 1,500 PAFHDDG-1 genforsøg

Fremgangsmåde 1.1. 0,5 g 5 0,860 2. 0,5 g 5 0,550 3. 0,5 g 5 0,500 19 143349

Tabel I fortsat

Fremgangsmåde 2. 1. 0,5 g 5 1,300 2. 0,5 g 5 1,210 3. 0,5 g 5 1,110 4. 0,5 g 5 1,030.

Eksempel 2.

a) n-Octadecylamino, (6-aminohexylamino)-"Ficolln (FODHD-1).

5 g "Ficoll" opløses i 300 ml vand, og opløsningen behandles med 1 g cyanogenbromid ved pH-værdi 11,0 som ovenfor anført. Efter 20 minutters forløb indstilles pH-værdien i opløsningen på 10,0 ved tilsætning af 2N HC1, og der tilsættes en Opløsning af 5 g n-octadecylamin og 0,5 g 1,6-diaminohexan i 20 ml methanol. pH-Værdien genindstilles på 10,0 ved tilsætning af 2N HC1, og blandingen omrøres ved 4°C i 72 timer. Produktet centrifugeres ved 20.000 g/4°C i 45 minutter. Der dannes en løs hvid kugle (25 ml, retineret) og en klar overstående væske med skum på overfladen (octadecylamin).

b) Penicillinacylase [n-octadecylamino, (6-aminohexylamino)-"Ficoll"] (PAFODHDG-1).

25 ml penicillinacylase (170 mg protein) indstilles på pH-værdi 6,2 ved stuetemperatur, og der tilsættes 2,5 ml (25 vægt/volumenprocent) glutaraldehyd. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 15 minutter, hvorefter 10 ml FODHD-1 tilsættes, og suspensionen indstilles på pH-værdi 6,2 ved tilsætning af 2N HC1. Efter omrøring ved 4°C i 3 timer centrifugeres materialet ved 20.000 g/4°C i 30 minutter.

Den lyserøde kugle gensuspenderes i 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0 og oplagres ved 4°C. Suspensionen floteres effektivt af n-decanol, og aktiviteten er anført i tabel II. Aktivitetsgenvindingen er ca. 60%.

143349 20

Tabel II

Aktivitet af PAFODHDG-1.

Forsøgsteknik: som beskrevet i tabel I. Der anvendes 5 vægt/volumen-procent penicillin G.

Materiale Mængde Begyndelseshastighed for 6-APA-dannelse, mol/minut x 10-4

Stamenzym 1 ml 0,885 PAFODHDG-1 0,5 g 0,940

Genforsøg (fremgangsmåde 2) 1. 0,5 g 0,800 2. 0,5 g 0,585

Eksempel 3.

a) n-Decylamino, (6-aminohexylamino) dextran T2000 (T2000HDD-1).

10 g dextran (gennemsnitlig molekylvægt 2.000.000) opløses i 800 ml vand og aktiveres med 2,5 g cyanogenbromid som ovenfor beskrevet.

Efter 20 minutters forløb tilsættes 5 g n-decylamin og 1,0 g 1,6--diaminohexan, og pH-værdien indstilles på 10,0. Opløsningen omrøres ved 4°C i 16 timer og centrifugeres derefter ved 20.000 g/ 4°C i 1 1/2 time. Den dannede kugle gensuspenderes i 100 ml 0,1N HCl og centrifugeres igen ved 20.000 g i 1 time. Den anden kugle (ca. 50 g fugtig vægt) opbevares.

b) Penicillinacylase [n-decylamino, (6-aminohexylamino)-dextran T2000] PAT2000HDDG-1.

10 g (fugtig vægt) T2000HDD-1 homogeniseres i 0,1M natriumphosphat-puffer med pH-værdi 6,0, og pH-værdien i suspensionen indstilles på 21 143349 6,2. 50 ml penicillinacylase (340 mg protein) indstilles på pH-vær-di 6,2, og der tilsættes 5 ml (25 vægt/volumenprocent) glutaraldehyd. Opløsningen omrøres i 45 minutter ved 4°C, hvorefter T2000HDD tilsættes. Blandingen omrøres ved 4°C i 30 minutter og oplagres derefter ved -20°C i 16 timer. Efter optøning omrøres suspensionen ved stuetemperatur i 1 time, hvorefter den centrifugeres ved 6000 g/22°C i 30 minutter. Den overstående væske gemmes, og kuglen gensuspenderes i 75 ml 0,1M natriumphosphat med pH-værdi 7,0 og homogeniseres. Ved centrifugering som ovenfor beskrevet efterfulgt af gensuspension og yderligere centrifugering fås en brun kugle (8,0 g fugtig vægt). Denne floteres effektivt af n-decanol og, mindre effektivt, af n-heptan. Dette præparats aktivitet er anført i nedenstående tabel III. Ca. 10% af den oprindelige enzymaktivitet findes i konjugatet.

Tabel III

Aktivitet af PAT2000HDDG-1.

Porsøgsteknik: Som ovenfor beskrevet. Der anvendes 5 vægt/volumen-procent penicillin G.

Materiale Mængde Begyndelseshastighed for 6-APA-dannelse, mol/minut x 10~4

Stamenzym 1 ml 0,875 PAT 200 0HDDG-1

Overstående væske 1 ml 0,022 PAT2000HDDG-1 n c n 0,5 g 0,270

Genforsøg (fremgangsmåde 2) 0,5 g 0,155

Eksempel 4.

a) n-Decylamino, (6-aminohexylamino) "Sepharose" 4B (SRHDD-1).

22 143349 2 g (tør vægt) cyanogenbromid-aktiveret "Sepharose" 4B kvældes ±-50 ml 0,001N HC1 ved 4°C i 15 minutter og vaskes derefter på en glassinterplade med 2 x 100 ml 0,001N HCl. Gelen sættes til en opløsning af 20 ml 0,lM natriumhydrogencarbonatopløsning, 5 ml ethanol, 0,5 g n-decylamin og 0,1 g 1,6-diaminohexan. Blandingen omrøres langsomt ved 4°C i 16 timer og filtreres derefter gennem en glassinterplade. Gelen vaskes under sugning fire gange med hver gang 20 ml 0,001N HCl, fire gange med hver gang 20 ml ethanol og fire gange med hver gang 50 ml vand, gensuspenderes i vand og oplagres ved 4°C.

b) Penicillinacylase [n-decylamino, (6-aminohexylaraino)-"Sepharose" 4B] PASRHDDG-1.

1,5 g sugetørret SRHDD-l-gel suspenderes i 5 ml 0,1M natriumphos-phatpuffer med pH-værdi 6,0, og der tilsættes 0,5 ml (25 vægt/volu-menprocent) glutaraldehyd. Blandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur og suges derefter tørt på en glassinterplade. Gelen sættes derefter til en blanding af 2 ml (13,6 mg) penicillinacylase og 3 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 6,0. Blandingen omrøres i 24 timer ved 4°C, suges tør og vaskes på sinterpladen fenr gange med hver gang 20 ml 0,lM natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0. Den suspenderes i 5 ml af denne puffer. De resulterende små-kugler floteres med n-decanol i modsætning til umodificeret "Sepharose" , som sedimenterer fra vandige suspensioner indeholdende n-decanol. Præparatets aktivitet er vist i nedenstående tabel IV.

Ca. 72% af den oprindelige aktivitet findes i konjugatet.

Tabel IV

Penicillinacylaseaktivitet af PASRHDDG-1,

Forsøgsteknik: som ovenfor anført. Der anvendes 5 vægt/volu-menprocent penicillin G.

23 143349

Materiale Mængde Begyndelseshastighed for 6-APA- -dannelse, mol/minut x 10“4

Stamenzym 1 ml 0,885 PASRHDDG-1 2 ml 0,505

Genforsøg

Fremgangsmåde 2. 1. 2 ml 0,410 2. 2 ml 0,375

Fremgangsmåde 1. 3. 2 ml 0,270

Eksempel 5.

n-Decylaminoglutaral-penicillinacylase (PADDG-1).

40 ml (272 mg) penicillinacylase indstilles på pH-værdi 6,2, og der tilsættes 4 ml (25 vægt/volumenprocent) glutaraldehyd. Efter omrøring i 20 minutter ved 0°C tilsættes 6 ml n-decanol og 0,6 ml n-decylamin, og der omrøres fortsat kraftigt ved 0°C i 6 timer og derefter ved stuetemperatur i 1 time. Blandingen centrifugeres ved 2000 g/22°C i 10 minutter, hvorved der fås en brun overstående fase, scan fjernes og oplagres suspenderet i 30 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH--værdi 7,0. Materialet flyder spontant op til overfladen af vandige suspensioner, men er noget mindre dispergerbar end polymerkonjuga-terne og har en tendens til at danne store aggregater. 1 ml af suspensionen, undersøgt som beskrevet i eksempel 1, viser en aktivitet på 0,49 x 10 ^ mol/minut, hvilket svarer til 42%'s bibeholdelse af acylaseaktiviteten i konjugatet.

Eksempel 6.

Trypsin-[n-octadecylamino, (6-aminohexylamino)-"Ficoll"] (TFODHDG-1).

50 mg saltfri trypsin opløses i 20 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 6,0 ved 0°C. 1 ml (25 vægt/volumenprocent) glutaraldehyd tilsættes, og blandingen omrøres i 15 minutter ved 0°C. 10 ml FODHD-1 24 143349 (eksempel 2 a) tilsættes, og opløsningen indstilles på pH-værdi 6,2 ved tilsætning af 2N HC1. Blandingen omrøres i 16 timer ved 4°C og centrifugeres derefter ved 20.000 g/4°C i 30 minutter. Kuglen gensuspenderes i 20 ml vand og filtreres under anvendelse af "Whatman" IPS-faseadskillelsespapir. Remanensen gensuspenderes i 20 ml Ο,ΟΟΙΜ HC1 og genfiltreres. Ved gensuspension (i 0,001M HC1) og centrifugering ved 10.000 g/14°C i 20 minutter to gange fås 2,65 g af en brun gel. Dette materiale kan floteres med både n-de-canol og n-heptan. Konjugatets aktivitet er vist på fig. 1. Undersøgelsesteknikken er følgende: N-a-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid opløses i 5 ml dimethylformamid og sættes til 45 ml 0,05M tris-puffer med pH-værdi 8,3 (inde- -3 holdende 10 millimol calciumchlorid), hvorved der fås en 2 x 10 M opløsning af det chromogene stof. 5 ml n-heptan tilsættes, og blandingen omrøres kraftigt ved 22°C. Enzymprøven tilsættes, og 5 ml's alikvoter af blandingen udtages med mellemrum. Ved kort tids henstand eller ved forsigtig centrifugering fraskilles heptanfasen (medbringende TFODHDG-1). Den understående vandige fase fjernes, og O,*400 nm m^es bestemmelse af frigørelsen af p-nitroanilid. Hep-tansmådråber giver en signifikant "blank" absorptionsværdi. I nogle tilfælde fortyndes den nedre fase for at lette absorptionsaflæsningerne. Efter aflæsning hældes både heptan- og vandfasen tilbage til den omrørte reaktionsblanding. Den totale bibeholdte aktivitet i konjugatet er 17¾ af den oprindelige amidolytiske aktivitet.

Eksempel 7.

Lipase-[n-decylamino, (6-aminohexylamino)-dextran T2000] (LT2000HDDG-1).

200 mg Candida cylindracea-lipase opløses i 20 ml 0,1M natrium-phosphat med pH-værdi 6,0, og pH-værdien indstilles på 6,2. 2 ml (23 vægt/volumenprocent) glutaraldehyd tilsættes, og blandingen omrøres i 30 minutter ved stuetemperatur. T2000HDD-1 (eksempel 3) udfældes fra suspensionen ved hjælp af ethanol, og det udfældede genopkvældes i vand. 10 g af den resulterende gel homogeniseres i 20 ml 0,1M. natriumphosphat med pH-værdi 6,0 og sættes til enzym--glutaraldehydblandingen. pH-Værdien indstilles på 6,2, og blandingen 25 143349 omrøres ved 4°C i 16 timer. Suspensionen centrifugeres ved 20.000 g/4°C i 30 minutter, og kuglen gensuspenderes i 50 ml 0,1M natri-umphosphat med pH-værdi 7,0 og centrifugeres igen. Denne fremgangsmåde gentages yderligere to gange. Den endelige kugle (8,4 g fugtig vægt) gensuspenderes i 20 ml Q,1M natriumphosphat med pH-værdi 7,0. Suspensionen floteres med både n-decanol og n-heptan. Konjugatets aktivitet er som anført i fig. 2. Forsøgsteknikken er som følger: 5 ml 0,01M p-nltrophenyllaurat i n-heptan omrøres hurtigt med 20 ml 0,1M natriumphosphat med pH-værdi 8,0 ved stuetemperatur. Under disse betingelser kan der i løbet af 1 time eller mere ikke påvises ikke-enzymatisk esterhydrolyse. Efter tilsætning af enzymet fjernes 5 ml's alikvoter med mellemrum, de centrifugeres ved 4000 g i

XdQ

1 1/2 minut, og den nedre (vandige) fase fjernes. OD400 ^ bestemmes nøjagtig 3 minutter efter fjernelse af den oprindelige alikvot.

Vand- og heptanfaserne hældes tilbage til den omrørte blanding.

(Da substratet findes i den ikke-vandige fase i dette forsøg, skal omrøringshastigheden (dvs. dispersionsomfanget) holdes konstant under forsøget).

Ca. 1% af den oprindelige lipaseaktivitet findes i konjugatet.

Eksempel 8. a) GAN149HDOD-1.

1 g n-octadecylamin og 0,2 g 1,6-diaminohexan suspenderes i 10 ml methanol og sættes til 200 ml 0,2M natriumphosphatpuffer med pH-vær-di 8,0 indeholdende 40 ml methanol. 2 g "Gantrez" 149 tilsættes i små mængder under kraftig omrøring. Blandingen omrøres i 16 timer ved stuetemperatur og centrifugeres derefter ved 12.000 g i 1 time ved stuetemperatur. Skum og overstående væske kasseres, og kuglen gensuspenderes i 100 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0 og centrifugeres igen som ovenfor anført. Den gellignende kugle (80 g) oplagres ved 4°C.

7 26 143349 b) PAGAN14 9HD0D-1-G.

20 ml penicillinacylaseopløsning (1,36 x 10 enheder, 136 mg protein) indstilles på pH-værdi 6,2, og der tilsættes 2 ml (25 vægt/ volumenprocent) glutaraldehyd i vand. Blandingen omrøres ved stuetemperatur, og der tilsættes 10 g af en suspension af GAN149HDOD-1 1 12 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 6,0. pH-Værdien holdes på 6,2, og omrøringen fortsættes ved stuetemperatur i 2 timer. Suspensionen centrifugeres i 1 time ved 20.000 g/4°C, og kuglen (14 g) opbevares. Denne kugle gensuspenderes i 10 ml 0,1M natriumphosphat med pH-værdi 7,0, og centrifugeringen gentages.

Den endelige kugle oplagres ved 4°C.

-5

Specifik aktivitet: 3 x 10 mol 6-APA/minut (5% penicillin G, pH-værdi 7,8, 22°C)

Aktivitetsgenvinding: 21%. Floterbar med n-decanol eller n-decan.

Eksempel 9.

a) GAN149HDOD-2.

5 g n-octadecylamin opløses i 50 ml ethanol og sættes til 1 liter 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 9,0 indeholdende 200 ml ethanol. 5 g "Gantrez" 149 tilsættes i små mængder i løbet af tre kvarter under omrøring. pH-Værdien holdes mellem 8 og 9 ved tilsætning af 2N NaOH-opløsning. Efter tilsætning af "Gantrez" tilsættes 5 g 1,6-diaminohexan, og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 6 timer. pH-Værdien sænkes til 3,0 ved hjælp af koncentreret HC1, og suspensionen centrifugeres ved 12.000 g i 1 time ved stuetemperatur. Den overstående væske kasseres, og kuglen gensuspenderes i vand (550 ml) og centrifugeres igen, hvorved der til slut fås en hvid kugle (150 g), som oplagres ved 4°C.

b) PAGAN149HD0D-2-G.

100 ml penicillinacylaseopløsning (9,8 x 10** enheder, 88 mg protein) blandes med 15 g GAN149HDOD-2, 20 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 6,0 og 1 ml (2 vægt/volumenprocent) natriumazid, og der 27 143349 homogeniseres i kort tid ved 0°C. Blandingen indstilles på pH-værdi 6,8 ved 0°C i 4 1/2 time og centrifugeres derefter ved 20.000 g/4°C i 1 time. Kuglen gensuspenderes i 0,1M natriumphosphat med pH-værdi 7,0 og centrifugeres igen. Disse operationer gentages, hvorved der til slut fås en kugle med en vægt på 11,2 g, som oplagres ved 4°C.

-5

Specifik aktivitet: 1,8 x 10 mol 6-APA/minut/gm (betingelser som ovenfor anført).

Aktivitetsgenvinding: 55%. Floterbar med n-decanol eller n-decan. Eksempel 10.

Trypsin (n-decylamino-"Gantrez AN" 119) (TGAN 119D) .

1 g "Gantrez AN" 119 opløses i 5 ml dimethylformamid og omrøres kraftigt. 0,3 g n-decylamin i 1 ml dimethylformamid tilsættes, og blandingen bliver mere viskøs. Efter omrøring i 10 minutter sættes opløsningen dråbevis til en opløsning af 300 ml bovint trypsin i 60 ml Q,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 8,0 ved 22°C. pH--Værdien holdes ved hjælp af 2N natriumhydroxidopløsning, og når der ikke finder yderligere ændring sted, tilsættes 4 g natrium-chlorid. Den resulterende suspension hældes ud i 175 ml 0,1M natriumphosphatpuf fer med pH-værdi 7,6 og afkøles til 4°C. 50 g ammoniumsulfat tilsættes, og blandingen omrøres ved 4°C i 20 minutter. Blandingen centrifugeres ved 25.000 g/4°C i 1 time, og den gellignende kugle homogeniseres igen i 30 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,6. Centrifugeringen gentages efterfulgt af yderligere to homogeniserings/centrifugeringscycler, hvorved der til slut fås 7,5 g af en løs gel. Præparatet undersøges spektrofotometrisk under anvendelse af N-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid (BANA) (2 millimol i 0,1M veronalpuffer med pH-værdi 8,3 ved 22°C). En enhed er en stigning i optisk tæthed på 0,001/minut ved 400 nanometer. Da gelen forårsager en kendelig lysspredning, er det nødvendigt ind imellem at ryste cuvetten (1 cm's vejlængde).

28 143349

Gelaktivitet: 168 enheder/mg fugtig vægt, 2000 enheder/mg tør vægt (lyofiliseret gel).

Aktivitetsgenvinding: 24,2%.

Immobiliseringen af enzymkonjugatet på opløsningsmiddeldråber illustreres i nedenstående forsøg: 1 g gel (fugtig vægt) homogeniseres i et lille vævsfindelingsapparatur med 2,5 ml n-decan og 10 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 8,0 ved 4.000 omdrejninger/minut og 0°C i 5 minutter. Den mælkeagtige suspension separeres i løbet af 3 timer ved 0°C i en øvre fase bestående af tæt sammenpakkede decandråber og en nedre vandig fase. Begge faser undersøges under anvendelse af den ovenfor anførte spektrofotometriske metode. Cuvetten rystes også her med regelmæssige mellemrum, medens den øvre fase undersøges, og middelhastigheden for optisk tæthedsforøgelse måles.

Den øvre fases aktivitet: 2280 enheder/ml.

Den nedre fases aktivitet: 57 enheder/ml.

Da den tilsyneladende aktivitet for den øvre fase sandsynligvis er meget mindre end den reelle aktivitet på grund af denne metode, tyder resultatet på, at mindst 90% af trypsinaktiviteten er knyttet til opløsningsmiddeldråberne.

Eksempel 11.

Penicillinacylase (n-octadecylamino "Gantrez AN" 119) (PAGAN1190D).

0,5 g "Gantrez AN" 119 opløses i 2,5 ml dimethylformamid og opvarmes på 80°C på vandbad. 0,28 g octadecylamin opløses også i 2,5 ml dimethylformamid ved 80°C og sættes hurtigt til "Gantrez"-opløsningen, medens den stadig er varm. Blandingen omrøres, og 0,1 ml pyri-din tilsættes. Efter afkøling til stuetemperatur i løbet af 1 time sættes hele opløsningen til 175 mg penicillinacylase i 30 ml vand med pH-værdi 7,0 og homogeniseres i kort tid ved 0°C.

29 143349

Den lyserøde blanding omrøres derefter ved 0°C i 3 timer, og pH-vær-dien holdes konstant ved 4°C i 16 timer, 5,8 g natriumehlorid opløses i suspensionen, og blandingen centrifugeres ved 25.000 g/0°C i 1 time. Den resulterende lyserøde kugle vejer 4,0 g og gensuspenderes i 20 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0.

Ved anvendelse af 5 vægt/volumenprocent penicillin G i 20 ml 0,02M

natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,8 ved 25°C har suspensionen en -5 specifik aktivitet på 4,0 x 10 mol/minut/ml. Dette repræsenterer ca. 70%'s genvinding af aktiviteten i konjugatet. 4,0 ml af den ovenfor anførte suspension blandes med 20 ml 0,02M natriumphosphatpuff er og 5 ml n-decanol og homogeniseres ved ca, 4000 omdrejninger /minut i 5 minutter ved 0°C. Emulsionen centrifugeres ved 100 g ved stuetemperatur i 20 minutter og adskilles i en øvre organisk emulsion og en nedre vandig fase. Den nedre fase gemmes, og den øvre resuspenderes i 20 ml 0,Q2M natriumphosphatpuffer og centrifugeres igen. Den oprindelige nedre fase har i alt en aktivitet på 1,25 x 10 ^ mol/minut og den udvaskede øvre fase 9,5 x 10 ^ mol/minut. Forholdet mellem de specifikke aktiviteter (på volumen-basis) er 21,6 (øvre/nedre). Efter bestemmelse af aktiviteten efter den ovenfor anførte metode recirkuleres den organiske fase ved forsigtig centrifugering og fjernelse af den vandige fase som anført i tabel V.

Tabel V

Procent begyndelseaktivitet for PAGAN1990D-n-decanol-fasen efter successive floterings-genbrugscycler.

Cyclus nr. Procent aktivitet Cyclus nr. Procent aktivitet 1 80 7 46 2 86 8 46 3 93 9 44 4 73 10 42 5 64 11 45 6 47 12 43

Eksempel 12.

30 143349

Penicillinacylase (n-dodecylamino "Gantrez AN" 119) (PAGAN119DD).

0,25 g n-dodecylamino-"Gantrez AN" 119 opløses i 1 ml dimethylform-amid og sættes til en opløsning af penicillinacylase (ca. 100 mg i 14 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0).

Efter kort tids homogenisering ved 0°C omrøres suspensionen i 16 timer ved 4°C. 7,8 g ammoniumsulfat sættes til den nu homogene opløsning' ved 4°C, og pH-værdien holdes på 7,0 ved tilsætning af 1M na-triumcarbonatopløsning. Efter opløsning af ammoniumsulfatet dannes en uklar suspension. Dette materiale centrifugeres ved 25.000 g/Ooc i 1 time. Kuglen gensuspenderes i en opløsning af 7,8 g ammoniumsulfat i 30 ml vand, pH-værdi 7,0, og centrifugeres igen. Den endelige kugle vejer 1,36 g og genopløses i 10 ml vand, hvorved der fås en viskos opløsning. Kuglens aktivitet (teknik som ovenfor beskrevet) er 1,62 x 10 ^ mol/minut/g fugtig vægt svarende til 80%'s aktivitetsgenvinding. Immobiliseringen af det vandopløselige konju-gat på n-decanoldråberne belyses i følgende forsøg: 1 ml af den ovenfor anførte opløsning opløses i 20 ml 0,02M natri-umphosphatpuffer og homogeniseres med 10 ml n-decanol ved 4000 omdrej ninger/minut i 3 minutter ved 0°C. Emulsionen adskilles i to faser ved centrifugering ved 300 g i 10 minutter. Den øvre fase har -5 en total aktivitet på 1,14 x 10 mol/minut, og dens aktivitet efter flere på hinanden følgende cycler er anført i tabel VI.

Ved et andet forsøg homogeniseres 2 ml af enzymkonjugatopløsningen under samme betingelser med 2,5 ml n-decanol og 10 ml 0,02M na- triumphosphatpuffer. Efter centrifugering og vask med 20 ml af samme puffer har den øvre fase en aktivitet på 1,8 x 10 ^ mol/minut, —6 og den oprindelige nedre fase har en aktivitet på 8,0 x 10 mol/minut. Forholdet mellem de specifikke aktiviteter (øvre/nedre, volumenbasis) er ca. 7,5.

3i 163349

Tabel VI

Procent oprindelig aktivitet af PAGAN119DD-n-decanol-fasen efter successive flotations-genbrugscycler.

Cyclus nr. Procent aktivitet 1 96 2 66 3 66 4 53

Eksempel 13.

Trypsin (hydrolyseret n-octadecylamino-"Gantrez AN" 149) TGAN149DCMC.

15 g opkvældet polymergel blandes med 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0 og indstilles på pH-værdi 4,7 ved tilsætning af 2N saltsyreopløsning. 0,5 g l-cyclohexyl-3-(2-morphalinoethyl)car-bodiimid-metho-p-toluensulfonat (CMC) tilsættes, og pH-værdien holdes på 4,7 ved tilsætning af 2N HC1, efter 5 minutters forløb ved stuetemperatur tilsættes 2 ml bovint trypsin (75 mg i 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0), og pH-værdien i blandingen indstilles på 5,9 og holdes ved denne værdi i løbet af den næste time ved tilsætning af 2N natriumhydroxidopløsning. Efter 3 timer ved stuetemperatur centrifugeres gelen ved 25,000 g/4°C i 30 minutter. Kuglen gensuspenderes i 40 ml 0,1M natriumphos-phatpuffer med pH-værdi 7,0 og centrifugere^ igen. Den endelige kugle blandes med 15 ml af den ovenfor anførte puffer og 10 ml n-decan og homogeniseres i kort tid. Ved denne fremgangsmåde fås en ukomplet dispersion, og blandingen lydbehandles ved 20 kHz i 5 x 5 minuts ters behandlinger med afkøling i is ind imellem. Den endelige emulsion centrifugeres ved 100 g i 15 minutter. Den øvre fase vaskes tre gange med 25 ml phosphatpuffer. Det endelige volumen af den øvre fase er 11 ml, og fasen har en aktivitet (undersøgt som i eksempel 3) på 1050 BANA-enheder/ml. Tilsyneladende aktivitetsgenvinding: ca. 5%.

Eksempel 14.

32 143349 a) Hydrolyseret n-octadecylamino-"Gantrez AN" 119-hydrazid (GAN1190DH).

5 g "Gantrez AN" 119 opløses i 20 ml dimethylformamid og opvarmes til 60°C på vandbad. En opløsning af 2,8 g n-octadecylamin i 30 ml 80°C varmt dimethylformamid tilsættes, og blandingen holdes ved ca.

60°C i 1 time. Efter afkøling til stuetemperatur sættes opløsningen til en blanding af 10 ml hydrazinhydrat og 50 ml dimethylformamid ved stuetemperatur. Der dannes et let brunt bundfald, blandingen omrøres i 10 minutter, og der tilsættes 500 ml vand. En sæbeagtig grøn opløsning fås, og efter omrøring i 15 minutter indstilles pH-værdien på 7,0 ved tilsætning af koncentreret saltsyre, og der tilsættes 50 g natriumchlorid. Der optræder flokkulering, og suspensionen centrifugeres ved 10.000 g/4°C i 30 minutter. Kuglen gensuspenderes i 400 ml vand og omrøres i 16 timer ved 4°C, hvorefter den centrifugeres som ovenfor anført, og der fås en blågrå kugle (fugtig vægt 39 g) .

b) Penicillinacylase (n-octadecylamino-"Gantrez AN" 119)-hydrazid--koblet PAGAN1190DH.

5 g GAN1190DH (fugtig vægt) suspenderes i 50 ml 2N HC1 og omrøres ved 0°C i 15 minutter. En opløsning af 0,5 g natriumnitrit i 5 ml vand tilsættes, og blandingen omrøres ved 0°C i 10 minutter, hvorefter den centrifugeres ved 25.000 g/0°C i 30 minutter, og kuglen gensuspenderes i 50 ml 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 8,0 ved 0°C. Denne suspension sættes til en opløsning af 100 ml penicillinacylase (indeholdende 55 mg protein) og indstilles på pH-værdi 8,0. Suspensionen omrøres ved 4°C i 72 timer og centrifugeres derefter. ved 25.000 g/0°C i 1 time, gensuspenderes i 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0 og centrifugeres igen. Den endelige kugles vægt er 3,74 g. Den specifikke aktivitet (forsøgeteknik som —5 ovenfor anført): 5,2 x 10 mol/minut/g. Aktivitetsgenvinding: 32,5%.

33 143349

En suspension af det ovenfor nævnte konjugat i 2,5 ml (0,29 g/ml) 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,0 blandes med 20 ml 0,02M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,8 og homogeniseres med 7,5 ml n-decanol ved 0°C i 2 minutter ved 5.000 omdrejninger/minut.

Ved centrifugering ved 100 g i 10 minutter fås to faser. Den nedre fase har en total aktivitet på 1,8 x 10 mol/minut, og den øvre fase har efter vask med 20 ml af den ovenfor nævnte puffer en aktivitet på 1,9 x 10 mol/minut. Forholdet mellem de specifikke aktiviteter (øvre/nedre, volumenbasis) er ca. 30. Recycliseringsresul-tater med den øvre fase er anført i tabel VII.

Tabel VII

Procent begyndelsesaktivitet af PAGAN1190DH-n-decanol-fasen efter successive flotations-genbrugs cycler.

Cyclus nr. Procent aktivitet 1 90 2 84 3 74

Eksempel 15.

Enzymatisk spaltning af benzylpenicillin til dannelse af 6-amino-penicillansyre.

1,0 g "Gantrez AN" 119 opløses i 10 ml dimethylformamid, og der tilsættes 0,56 g octadecylamin. Der omrøres natten over ved stuetemperatur.

48 ml af et delvis renset præparat af penicillinacylase indstilles på pH-værdi 9,0 ved tilsætning af 1M natriumcarbonatopløsning. Opløsningen af "Gantrez"-harpiksen tilsættes derefter i to alikvoter med homogenisering og pH-indstilling mellem de to tilsætninger. Blandingen omrøres i 3 timer, og pH-værdien holdes på 9,0 ved tilsætning af 1M natriumhydroxidopløsning.

34 143349

Enzym-harpiksen isoleres derefter ved centrifugering, gensuspenderes i 120 ml 0/1M phosphatpuffer med pH-værdi 7,0 og homogeniseres i 30 sekunder. Enzym-harpiksen genvindes ved centrifugering, og vasken gentages.

20 g enzym-gel homogeniseres med 80 ml n-decan og 20 ml 0,02M phospha tpuf fer med pH-værdi 7,8 il minut. Homogenisatet sættes til 250 ml destilleret vand. Blandingen opvarmes til 37°C og indstilles på pH-værdi 7,8, og der tilsættes 21,8 g kalium-benzylpenicillin. Blandingen omrøres i 5 timer, og pH-værdien holdes på 7,8 ved tilsætning af 4 vægt/volumenprocent natriumhydroxidopløsning. I slutningen af reaktionen hældes blandingen ud i en skilletragt, og enzymet lades skilles fra den vandige fase. Dette tager 30 minutter. Den vandige fase fjernes, og 6-aminopenicillansyre ekstraheres på følgende måde: Væsken inddampes til kvart rumfang og afkøles til 5°C, og der tilsættes under omrøring et lige så stort volumen methylisobutylketon. pH-Værdien sænkes til 4,3 ved tilsætning af koncentreret salpetersyre, hvorefter 6-aminopenicillansyren udfældes. Det faste stof isoleres ved filtrering, vaskes med vand og acetone og tørres natten over ved 40°C. Der fås 7,65 g 6-aminopenicillansyre.

På fig. 1 illustreres frigørelsen af p-nitroanilin fra N-a-benzoyl--DL-arginin-p-nitroanilid ved A: Trypsin (1 mg) B: Trypsincomplex TFODHG-1 (0,1 g) ifølge eksempel 6.

På fig. 2 illustreres frigørelsen af p-nitrophenyllaurat katalyseret af A: Lipase (0,1 g) B: Lipasecomplex LT2000HDDG-1 (420 mg) ifølge eksempel 7.

Claims (6)

35 143349 Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til udførelse af en enzymatisk reaktion, kendetegnet ved, at et enzympræparat indeholdende et enzym, der direkte eller via mellemliggende led er bundet . til tilstrækkeligt mange ikke-polære grupper til, at præparatet ved kontakt i vandigt miljø med en med vand ikke-blandbar væske bliver forenet med den inerte med vand ikke-blandbare væske og således kan adskilles fra det vandige miljø, 1 vandigt miljø bringes i kontakt med et substrat for enzymet, hvorefter enzympræparatet adskilles fra den vandige reaktionsblanding véd kontakt med en med vand ikke-blandbar. væske, reaktionsproduktet genvindes fra den vandige fase, og det fraskilte, enzympræparat, om ønsket, genanvendes ved at blive bragt i kontakt med yderligere substrat.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at kontakten mellem enzympræparatet og den med vand ikke-blandbare væske etableres ved agitation.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at kontakten mellem enzympræparatet og den med vand ikke-blandbare væske etableres, før den enzymatiske reaktion udføres.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at enzympræparatet er baseret på peni-cillinacylase. **

5. Enzympræparat til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder et enzym, der direkte eller via mellemliggende led er bundet til tilstrækkeligt mange Ikke-polære grupper til, at præparatet ved kontakt i vandigt miljø med en med vand ikke-blandbar væske bliver forenet med den inerte med vand ikke-blandbare væske og således kan adskilles fra det vandige miljø.

6. Enzympræparat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at enzymet er bundet til de ikke-polære grupper via et polymerbærestof.