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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung enzymatischer Reaktionen unter Verwendung von Enzympräparaten, welche Präparate aus dem Reaktionsmedium zur Wiederverwendung gewonnen werden können.
Enzymatisch katalysierte Umsetzungen stellen bei zahlreichen chemischen Verfahren wichtige Stufen dar. Als Beispiele seien die Verseifung von Lipoiden unter Verwendung einer Hydrolase, wie Lipase, der Proteinabbau unter Verwendung eines proteolytischen Enzyms, wie Trypsin, die
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aus Stärke unter Verwendung von Hydrolase und die Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen, wie Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenicillinsäure unter Verwendung von Pencillin-Acylase, genannt.
Gewöhnlich werden die enzymatischen Umsetzungen mit dem Enzym in Lösung in einem solchen Medium durchgeführt, das ein Substrat enthält (der Ausdruck "Substrat" bedeutet hier eine Substanz, die ein Enzym umwandelt, um das Produkt zu liefern). Da das Enzym im Reaktionsmedium gelöst ist, ist es häufig sehr schwierig, das Enzym vom Substrat oder, wenn die Umsetzung beendet ist, vom Umsetzungsprodukt zu trennen. Wenn das Produkt aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird, führt das Trennverfahren gewöhnlich zu einer Desaktivierung des Enzyms. Dies beeinträchtigt natürlich das Enzym in einer nicht wiedergutzumachenden Weise.
Um diese Schwierigkeit einer Trennung zu beheben und ein Enzymsystem zu schaffen, das wiederverwendbar ist, ist es bekannt, das Enzym an einen unlöslichen festen Trägerstoff entweder durch Adsorption (vgl. GB-PS Nr. 1, 264, 147) oder durch kovalente Bindung entweder direkt oder indirekt über Brückenglieder zu binden (vgl. GB-PS Nr. 1, 349, 498, Nr. 1, 387, 460 und Nr. 1, 365, 886).
Derartige unlösliche Präparate zeigen jedoch verschiedene Nachteile. Zunächst sind sie, wenn es sich um Feststoffe handelt, einem mechanischen Zerfall und gegebenenfalls einem Auseinanderbrechen unterworfen. Zweitens ist das Aufbringen des Enzyms auf die Oberfläche des festen Trägerstoffes und somit die spezifische Aktivität des Präparates oft ungenügend. Drittens ist die Zugänglichkeit des Substrats zur aktiven Stelle des Enzyms häufig gehindert.
Versuche zur Verbesserung der spezifischen Aktivität derartiger unlöslicher Enzym-Polymerisat-Präparate durch Vergrössern des äusserlichen Oberflächenbereiches des Feststoffes erfordern eine Herabsetzung der Teilchengrösse der festen Präparate, was die Handhabung und insbesondere die Abtrennung durch Abfiltrieren schwieriger gestaltet, und erzeugt anderseits, wenn der innere Oberflächenbereich erhöht wird, indem die Teilchen stärker porös gemacht werden. Teilchen mit einer geringeren mechanischen Fe- stigkeit.
Des weiteren wurden bestimmte wasserlösliche Enzym-Polymerisat-Komplexe gefunden (vgl.
GB-PS Nr. 1, 284, 925), wobei das Enzym entweder direkt oder indirekt über ein Brückenglied an einen wasserlöslichen polymeren Trägerstoff gebunden ist. Diese Enzym-Polymerisat-Komplexe kann man aus dem wässerigen Reaktionsmedium durch Ultrafiltration wiedergewinnen. Jedoch stellt die Ultrafiltration eine schwierige und kostspielige Technik dar, insbesondere im grossen Massstab, und ist aus diesem Grunde für eine industrielle Anwendung unerwünscht.
Es wurde nun gefunden, dass bestimmte Enzyme an nichtpolare Gruppen gebunden werden können, um das Präparat aus wässerigen Medien dank seiner Affinität zu mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeiten abtrennbar zu machen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Enzympräparat, in welchem das Enzym an genügend viele nichtpolare Gruppen, z. B. Kohlenwasserstoffreste mit mindestens 6 C-Atomen, wie Alkyl mit 6 bis 30 C-Atomen, Alkenyl mit 6 bis 50 C-Atomen, Cycloalkyl und Cycloalkenyl mit 6 bis 20 C-Atomen, gegebenenfalls substituiertes Aryl und Aralkyl, gebunden ist, dass sich das Präparat beim Inberührungbringen in einem wässerigen Medium mit einer inerten, mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit mit letzterer assoziiert und dadurch aus dem wässerigen Medium abtrennbar ist, in einem wässerigen Medium mit einem Substrat für das Enzym in Berührung bringt,
danach das Enzympräparat aus dem wässerigen Reaktionsgemisch mittels Inberührungbringen mit einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit abtrennt, das Reaktionsprodukt aus der wässerigen Phase gewinnt und gegebenenfalls das abgetrennte Enzympräparat durch Inberührungbringen mit weiterem Substrat wiederverwendet.
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Der hierin verwendete Ausdruck "inerte, mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit" bedeutet, dass die Flüssigkeit mit dem Enzympräparat nicht reagiert und demzufolge auch nicht die Enzymaktivität wesentlich ändert.
Der Ausdruck "assoziiert" umfasst jede Form einer Wechselwirkung zwischen den nichtpolaren Gruppen des Enzympräparates und den Molekülen der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, wobei die Form ausreichend stabil ist, um ein Mittel zur Abtrennung des Enzympräparates aus dem wässerigen Medium zu schaffen.
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ren verwendeten Enzyme geeignet. Beispiele derartiger Enzyme sind Amylase, Asparaginase, neutrale und alkalische Proteasen, Chymotrypsin, Cellulase, Dextranase, Lipase, Oxynitrilase, Pepsin, Penicillin-Acylase und Trypsin.
Bevorzugt werden die Enzyme Lipase, Penicillin-Acylase und Trypsin.
Geeignete nichtpolare Gruppen, die mit den Enzymen verbunden sein können, sind, wie erwähnt, Kohlenwasserstoffreste mit mindestens 6 C-Atomen, zweckmässigerweise Alkyl mit 6 bis 30 C-Atomen, z. B. n-Hexyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Dodecyl, n-Octadecyl, 4-Methylpen- tyl, 4, 4-Dimethylpentyl und 3-Äthylhexyl, ferner Alkenyl mit 6 bis 50 C-Atomen, wie Undeca-10- - enyl, Oleyl oder Linoleyl, Cycloalkyl und Cycloalkenyl mit 6 bis 20 C-Atomen, Aryl und substituiertes Aryl, z. B. Phenyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 3 Alkylgruppen mit 1 bis 6 C-Atomen substituiert sein kann, sowie Aralkyl, z. B. Benzyl, 2-Phenyläthyl, 4-Phenylbutyl und 2-Tolyläthyl.
Das Enzym kann entweder direkt mit der nichtpolaren Gruppe verbunden sein oder indirekt über ein Brückenglied.
Bei einigen Enzymen erzeugt die unmittelbare Verknüpfung zahlreicher nichtpolarer Gruppen an das Enzymmolekül eine Änderung hinsichtlich der Konformation und eine Änderung hinsichtlich der Aktivität des Enzyms. Deswegen und auch in einigen Fällen wegen der Struktur des Enzyms ist es manchmal nicht möglich, geeignete nichtpolare Gruppen an das Enzym zu binden, um das Präparat aus den wässerigen Medien abtrennbar zu machen, ohne die Aktivität des Enzyms in unannehmbarer Weise herabzusetzen.
Um diese Schwierigkeit zu umgehen, bevorzugt man häufig, ein Enzympräparat herzustellen, bei dem das Enzym an einen polymeren Trägerstoff gebunden oder adsorbiert ist. Letzterer kann dann die nichtpolaren Gruppen an Stelle derjenigen des Enzyms selbst oder zusätzlich zu denjenigen des Enzyms tragen. Darüberhinaus schafft dies einen einfachen Weg zur Regulierung der relativen Anteile von nichtpolaren Gruppen zum Enzym in dem Präparat. Es ist natürlich auch möglich, ein bereits zum Abtrennbarmachen aus wässerigen Medien genügend nichtpolare Gruppen tragendes Enzym an einen polymeren Trägerstoff zu binden, der gegebenenfalls weitere nichtpolare Gruppen tragen kann.
Die Bindung des Enzyms an das Polymerisat schliesst sowohl eine kovalente Bindung als auch eine Adsorption an den polymeren Trägerstoff ein, sofern die Adsorption ausreichend stark genug ist, um das Enzym auf dem Trägerstoff zurückzuhalten, wenn das Präparat mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit zusammengebracht wird.
Der verwendete Träger kann in Wasser löslich oder unlöslich sein.
Wenn ein in Wasser unlösliches polymeres Material angewendet wird, liegt es vorzugsweise in feinteiliger Form vor, so dass es einen grossen Oberflächenbereich für die Bindung des Enzyms darstellt und somit dem Präparat eine hohe spezifische Aktivität verleiht.
Beispiele von geeigneten, in Wasser unlöslichen Materialien sind Cellulosepulver und Cellulosederivate, wie Carboxymethylcellulose-Ionenaustauscherharze, Polyamide, hochmolekulare Polysaccharide, wie Agarose und vernetzte Dextrane, ferner solche Polysaccharide, die mit Modifizierungsmitteln, wie Epichlorhydrin, oder durch Einarbeiten von Carboxymethyl- oder Aminoäthyigruppen modi- fiziert sind, sowie Polyacrylate und Polymethacrylate. Besonders bevorzugt sind Agarose und makrorektikulär vernetzte Polyacrylate und Polymethacrylate.
Beispiele von wasserlöslichen Materialien sind Polymerisate natürlichen Ursprungs, z. B. Polysaccharide, wie Dextran, Dextrine oder Stärke, sowie solche Polymerisate natürlichen Ursprungs, die modifiziert worden sind, wie teilweise abgebaute Stärke oder Cellulose, ferner Polysaccharide, Oligosaccharide und Saccharide, die mit Modifizierungsmitteln, wie Epichlorhydrin, modifiziert
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worden sind, sowie Cellulose, die durch Einführen von Carboxymethyl- oder Aminoäthylgruppen modifiziert worden ist.
Von den vorgenannten modifizierten Sacchariden und Oligosacchariden wurde festgestellt, dass Copolymerisate von Epichlorhydrin und entweder Lactose, Dextrose oder Saccharose besonders zweckmässig sind. Ein bevorzugtes Polymerisat ist ein Saccharose-Epichlorhydrin-Polymerisat (das unter dem Warenzeichen"Ficoll"bekannt ist), insbesondere ein solches mit einem Molgewicht von etwa 400000.
An Stelle der Polymerisate natürlichen Ursprungs kann man auch wasserlösliche synthetische Polymerisate verwenden, wie Polymerisate von Polyvinylalkohol und Mischpolymerisate von Malein- säure- oder Acrylsäureanhydriden mit Äthylen, Styrol, Methylvinyläther, Divinyläther oder Vinylace-
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und Nr. 1, 223, 281 beschrieben.
Eine zweckmässige Klasse von wasserlöslichen Mischpolymerisaten sind die (unter dem Namen "Gantrez AN"bekannten) Methylvinyläther-Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisate.
Das Enzym kann unmittelbar an das eine nichtpolare Gruppe tragende Polymerisat gebunden werden. Gegebenenfalls kann es auch an einen polymeren Träger mit Brückengliedern, an die das Enzym geknüpft werden kann, gebunden werden. Geeignete Brückenglieder sind aliphatische a, w- - Diamine mit 2 bis 10 C-Atomen, wie 1, 3-Diaminopropan oder 1, 6-Diaminohexan. Die eine Aminogruppe des Brückengliedes wird an das Polymerisat gebunden und die andere ist frei zur Kupplung mit dem Enzym, z. B. über einen wasserlöslichen Dialdehyd, wie Glyoxal oder Glutaraldehyd. Die Verwendung derartiger bifunktioneller Brückenglieder ergibt auch eine gewisse Vernetzung zwischen den Enzym-Polymerisat-Einheiten.
Die Brückenglieder können zwischen Enzym und Trägerstoff oder zwischen Enzym und nichtpolarer Gruppe (mit oder ohne zusätzliches Vorliegen eines Trägerstoffes) oder zwischen Trägerstoff und nichtpolarer Gruppe angewendet werden.
Die Anzahl der nichtpolaren Gruppen, die in die Präparate eingearbeitet werden, hängt von einer Anzahl Faktoren ab. Ein Verknüpfen der nichtpolaren Gruppen an ein Polymerisat und/oder ein Enzym ruft in der unmittelbaren Nähe des Enzyms eine hydrophobe Umgebung hervor. Bei einigen Enzymen eribt sich bei einem zu hohen Hydrophobizitätsgrad eine Desaktivierung des Enzyms infolge gleichzeitiger Änderung bei der Konformation.
Es ist ein Gleichgewicht zwischen der Verknüpfung der geringsten Anzahl von erforderlichen nichtpolaren Gruppen, um eine Abtrennung aus wässerigen Medien zu gestatten, und der grösstmöglichen Anzahl, die mit der Stabilität des Enzyms verträglich ist, erforderlich. Die Bestimmung dieses Gleichgewichts muss notgedrungen eine Routineangelegenheit von Versuchen und Fehlern bleiben.
Die Kriterien, durch die das Gleichgewicht bestimmt werden kann, sind folgende :
1. das Molgewicht des polymeren Trägerstoffes ;
2. das Molgewicht der Monomer-Einheiten ;
3. der prozentuale Anteil an Monomer-Einheiten in dem durch nichtpolare Gruppen substituier- ten Polymerisat ;
4. die Grösse der nichtpolaren Gruppen ;
5. die Identität des Enzyms und
6. der Substitutionsgrad des Polymerisats durch das Enzym.
Wenn z. B. als Träger ein Polymerisat mit einem Molgewicht von 230000 und Monomer-Einheiten vom Molgewicht 156 (Gantrez AN 119) verwendet wird, wobei 1 Mol dieses Trägerstoffes durch 1 Mol Penicillin-Acylase substituiert ist, tritt die geringstmögliche Substitution, die zur wirksamen Abtrennung aus wässerigen Medien erforderlich ist, auf, wenn etwa 25% der Monomer-Einheiten durch n-Decylgruppen substituiert sind. Anderseits tritt die grösstmögliche Substitution zur Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität auf, wenn etwa 50% der Monomer-Einheiten durch n-Octadecylgruppen substituiert sind.
Die erfindungsgemäss verwendeten Enzympräparate werden dadurch hergestellt, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel
R-X, (I)
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worin
R eine nichtpolare Gruppe und
X eine funktionelle Gruppe ist, mit einem Enzym in Berührung bringt, das eine aktive Gruppe gebunden enthält, die mit der Gruppe X reagieren kann.
Die Gruppe X kann beispielsweise eine Amino-, Carboxyl-, Aldehyd-, Hydroxy-, Thiol- oder Azogruppe sein. Die Gruppe X kann sich auch von reaktionsfähigen Vernetzungsgruppen ableiten, z. B. von Dialdehyden, wie Glyoxal oder Glycerinaldehyd, und/oder Diaminen, wie l, 6-Hexamethylen- diamin oder Äthylendiamin, und/oder aliphatischena. M-Diaminocarbonsäuren, wie Glycin oder Lysin, oder einem polymeren Trägerstoff, der derartige funktionelle Gruppen enthält. Vorzugsweise ist X Amino oder ein Rest mit einer Aminogruppe.
Die an das Enzym gebundene und zur Umsetzung mit der Gruppe X befähigte aktive Gruppe kann eine im Enzym vorhandene Gruppe sein, die entweder von Anfang an vorliegt oder durch Modifikation entstanden ist, wie beispielsweise die Carboxyl-, Amino-, Thiol- oder die phenolische Hydroxylgruppe, oder Anhydridbindungen oder ein derartiger aktive Gruppen enthaltender polymerer Trägerstoff oder ein reaktionsfähiges Brückenglied, wie in bezug auf die Gruppe X oben erläutert wurde.
Die Umsetzung zwischen einer Verbindung der Formel (I) und dem Enzym wird am vorteilhaftesten bei einem im wesentlichen neutralen PH-Wert, zweckmässigerweise im Bereich von 4 bis 9, und bei einer Temperatur im Bereich von-4 bis +40 C. je nach dem verwendeten Enzym, durchgeführt.
Vorzugsweise liegt der PH-Wert bei etwa 7, 0 und die Temperatur im Bereich von 0 bis 5 C. Wenn das Enzympräparat im wesentlichen nur aus dem Enzym und nichtpolaren Gruppen besteht, ist es vorteilhaft, dass die Gruppe X von einem Dialdehyd und/oder einem a, 00 -Diamin stammt, so dass die nichtpolaren Gruppen an das Enzym über ein Brückenglied gebunden sind.
Beim Herstellen eines Enzympräparates, das auch einen polymeren Trägerstoff enthält, ist es vorteilhaft, dass das Trägermaterial zuerst modifiziert wird, um eine nichtpolare Gruppe zu erhalten, und, sofern erforderlich, ein Brückenglied, bevor die Verbindung mit dem Enzym erfolgt.
Bei dieser Ausführungsform stellt X in der Formel (I) den polymeren Träger dar, der an die nichtpolare Gruppe R und an eine funktionelle Gruppe gebunden ist.
Die enzymmodifizierten Polymerisat-Präparate können dann nach an sich bekannten Verfahren zur Bindung von Enzymen an Polymerisate hergestellt werden. Derartige Verknüpfungsverfahren sind z. B. in der GB-PS Nr. 1, 325, 912 beschrieben und umfassen das Kuppeln des Enzyms an das Polymerisat unter Verwendung von Reagentien, wie Cyanhalogeniden, insbesondere Cyanbromid, s-Triazinen, insbesondere 2-Amino-4, 6-dichlor-s-triazin, Acylaziden, Diazoniumverbindungen, z. B.
2-Hydroxy-3- (p-diazophenyl) -propyläther, organischen Cyanaten, wie Phenylcyanat, und Carbodiimiden. Häufig werden derartige Verknüpfungsmittel zuerst zur Umsetzung mit dem Polymerisat verwendet, um reaktionsfähige Gruppen am Polymerisat zu schaffen, wobei diese Gruppen dann zur Umsetzung mit dem Enzym dienen. In einigen Fällen können die Enzyme unmittelbar mit dem Polymerisat reagieren, z. B. wenn dieses aktive Gruppen, wie Anhydridbindungen oder Säureazidgruppen, enthält oder durch Modifizieren erhalten hat.
Es wird deshalb als vorteilhaft angesehen, dass die zur Herstellung der modifizierten Polymersate und zu deren Bindung an die Enzyme angewendeten Umsetzungsverfahren und-bedingungen je nach der Art des Enzyms und des polymeren Trägerstoffes variieren.
Für die meisten Enzym-Polymerisat-Präparate ist ein zweckmässiges Verfahren im Schema I veranschaulicht. Bei der ersten Stufe wird das Polymerisat (a) an die nichtpolaren Gruppen, vorzugsweise über ein primäres oder sekundäres Amin R. NHa oder Rt. NH und (b) an Brückenglieder, wie a, w-Diamine, für eine anschliessende Verknüpfung des Enzyms über Dialdehydgruppen gebunden. Diese Reaktionen werden zweckmässigerweise in wässeriger Lösung oder Suspension bei einem alkalischen pH-Wert, zweckmässigerweise bei PH 8 bis 12, und bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Dialdehydgruppen tragende Enzym kann dann mit dem modifizierten Polymerisat in wässerigen Medien bei im wesentlichen neutralen pH-Werten gebunden werden.
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Schema I
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wobei
R die obige Bedeutung hat, NH:(CH2) NH2 ein a, w-Diamin bedeutet und CHO(CH:) CHO einen Dialdehyd darstellt.
Es ist häufig erforderlich, die Gruppen am Polymerisat, vorzugsweise mit Cyanbromid, zu aktivieren, bevor eine Bindung an die nichtpolaren Gruppen möglich ist.
Anderseits weisen einige Polymerisate Gruppen auf, die zur Verbindung mit nichtpolaren Gruppen und/oder Enzymen gegebenenfalls ohne Zwischenschalten von Brückengliedern verwendet werden können. Den auf diese Weise hergestellten Enzympräparaten fehlt dann die mit der Verwendung von Brückengliedern verbundene Vernetzung. Häufig besitzen derartige Enzympräparate vorteilhafte Eigenschaften, wie nachstehend noch beschrieben wird.
Bei auf Maleinsäureanhydrid-Monomeren beruhenden Polymerisaten, wie beispielsweise den "Gantrez"-Polymerisaten, können die entlang der Hauptkette befindlichen Anhydridgruppen zur Bindung sowohl nichtpolarer Gruppen als auch der Enzyme verwendet werden. Zweckmässigerweise wird das Polymerisat zuerst durch Bindung nichtpolarer Gruppen modifiziert. Dann werden die restlichen Anhydridgruppen im Polymerisat unmittelbar mit dem Enzym gebunden. Dieses Verfahren ist im Schema II veranschaulicht :
Schema II
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Schema Il (Fortsetzung)
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Bei diesem Schema II stellt R die nichtpolare Gruppe dar, während der Rest ENZ-NH : ein eine Aminogruppe tragendes Enzym bedeutet.
"Gantrez"-Polymerisate (z. B."Gantrez AN 119" und "Gantrez AN 149") haben weiterhin den Vorteil, dass sie sich ohne Reaktion in bestimmten aprotischen, nichtwässerigen Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid, lösen, die auch gute Lösungsmittel für die Amine RNHz und R : NH sind. Ein homogenes Reaktionsgemisch ist möglich, und deshalb schaffen derartige Lösungsmittel vorteilhafte Reaktionsmedien für die Bindung der nichtpolaren Gruppen an diese Polymerisate, wenn die Enzympräparate hergestellt werden.
Vorzugsweise werden die Enzym-Polymerisat-Präparate durch Umsetzen eines Polymerisats mit Anhydridgruppen an der Hauptkette mit einem Amin der Formeln RNH : oder R2NH in einem aprotischen nichtwässerigen polaren Lösungsmittel hergestellt, wobei R die nichtpolare Gruppe ist. Anschliessend wird das modifizierte Polymerisat an das Enzym gebunden.
Bevorzugt wird das Amin mit dem Polymerisat in Gegenwart einer tert. Base, z. B. Pyridin, umgesetzt. Der hier verwendete Ausdruck"tert. Base" bedeutet ein tert. Amin oder ein aromatisches heterocyclisches Amin.
Vorzugsweise ist das nichtwässerige aprotische Lösungsmittel N, N-Dimethylformamid oder die tert. Base selbst. Die Temperatur, bei der die Reaktion durchgeführt wird, hängt von der Identität des polymeren Trägerstoffes und des Amins ab. Im allgemeinen wird die Reaktion jedoch bei Temperaturen zwischen Raumtemperatur und 100 C durchgeführt.
Der modifizierte polymere Träger kann auch aus dem Medium, in dem er hergestellt wird, durch Ausfällen mit einem weniger polaren Lösungsmittel, am zweckmässigsten Diäthyläther, oder durch Zugeben der Lösung zu Wasser, wenn ein Aufquellen und eine Anhydridhydrolyse auftritt, und durch Isolieren des hydrolysierten modifizierten Polymerisats aus dem wässerigen Medium unter Verwendung einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, oder durch Zentrifugieren isoliert werden.
Das Enzym wird dann an den obgenannten isolierten modifizierten Träger durch Inberührungbringen desselben mit dem Enzym in wässeriger Lösung, gegebenenfalls mit einem Kupplungsmittel, z. B. einem substituierten Carbodiimid, verknüpft. Gegebenenfalls kann das nicht hydrolysierte Reaktionsgemisch oder das nicht hydrolysierte modifizierte Polymerisat, das in einem geringen Volumen eines polaren nichtwässerigen Lösungsmittels gelöst ist, unmittelbar zu einer wässerigen Lösung des Enzyms gegeben werden.
Gegebenenfalls wird das Kupplungsmittel dadurch erhalten, dass man zuerst den obgenannten nicht hydrolysierten Träger durch Behandeln mit Hydrazinhydrat in Dimethylformamidlösung anpasst.
Ein derartig angepasster Träger, der dann hydrolysiert und aus dem wässerigen Medium durch
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Zentrifugieren isoliert wird, kann mit dem Enzym in wässerigen Medien unter Verwendung von Natriumnitrit als Aktivator gekuppelt werden.
Erfindungsgemäss können zahlreiche, mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeiten zur Abtrennung des Enzympräparates aus dem wässerigen Medium verwendet werden. Beispiele geeigneter Flüssigkeiten sind Alkane, wie Heptan, Octan, Nonan, Decan, Hexadecan, aromatische Kohlenwasserstoffe, höhere aliphatische Ester, wie Glycerintrioleat, sowie aliphatische Alkohole mit 4 bis 12 C-Atomen, wie n-Decanol.
Bei der Berührung mit einer derartigen Flüssigkeit bildet das Enzympräparat eine Oberflächenschicht im dazwischenliegenden Berührungsbereich aus. Um einen möglichst grossen Berührungsbereich zu haben, wird bei dieser Berührungsstufe gewöhnlich eine Bewegung angewendet, z. B. durch Rühren oder Schütteln, um die mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit in kleinste Tröpfchen überzuführen. Jedes Tröpfchen wird dann von dem Enzympräparat umhüllt, das an der Oberfläche haftet.
Diese Berührung des Enzympräparates mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit kann vor, während oder nach der Durchführung der enzymatischen Reaktion erfolgen. Vorzugsweise wird sie vor der enzymatischen Reaktion durch Dispergieren mittels Bewegen des Enzympräparates mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit in einem das Substrat enthaltenden wässerigen Medium durchgeführt. Während der enzymatischen Reaktion wird somit das Präparat mit Tröpfchen der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, die als Emulsion in den wässerigen Medien vorliegt, assoziiert, und die Dispersion wird während der Reaktion mittels Bewegen aufrechterhalten. Wenn eine Abtrennung des Enzympräparates gewünscht wird, unterbricht man das Bewegen und lässt die Phasen sich vereinigen.
Gegebenenfalls kann das Enzympräparat in dem wässerigen Reaktionsgemisch als Lösung oder Suspension vorliegen und nach der Reaktion mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit in Berührung gebracht werden, wenn eine Abtrennung des Enzympräparates gewünscht wird.
Die Art der Assoziation des Enzympräparates zur mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit variiert je nach dem polymeren Material und/oder den in das Enzympräparat eingebrachten nichtpolaren Gruppen. Bei den Enzym-Polymerisat-Präparaten, die im wesentlichen vernetzt sind, bilden sich z. B. feste Aggregate aus, und diese Teilchen haften an den Tröpfchen der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit. Bei nichtvernetzten Präparaten jedoch, wie sie sich mit den vorgenannten "Gantrez"-Trägermaterialien bilden (und auch bei keine Polymerisate enthaltenden Präparaten), tritt gewöhnlich keine grosse Haftung von Feststoffen an die Tröpfchen auf, und es bildet sich auf den Tröpfchen eine monomolekulare Schicht des Enzympräparates aus.
Dies ist besonders vorteilhaft, wenn die Enzymreaktion nach dem ersten Inberührungbringen des Enzympräparates mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, um ein solches System zu erzeugen, durchgeführt wird.
Was auch immer die Art der Assoziation betrifft, so befähigt die Berührung zwischen dem Enzympräparat und der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit (gewöhnlich in Form von Tröpfchen) die Abtrennung des Enzympräparates vom wässerigen Medium. Die mit dem Enzympräparat überzogenen Tröpfchen haben annähernd die gleiche Dichte wie diejenige der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit. Wenn man die Tröpfchen stehenlässt, so sammeln sie sich entweder an der Oberfläche des wässerigen Mediums (für Flüssigkeiten einer geringeren Dichte als Wasser) an oder sinken zu Boden (bei Flüssigkeiten mit höherer Dichte als Wasser). Somit wird eine gesonderte Schicht erzeugt, die aus der mit dem Enzympräparat vereinigten, mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit besteht, und die in einfacher Weise aus dem wässerigen Medium gewonnen werden kann.
Bei Flüssigkeiten, die auf den wässerigen Medien nicht rasch genug obenauf schwimmen oder sich davon absetzen, können andere Trennverfahren angewendet werden. Beispielsweise seien genannt Zentrifugieren oder das Filtrieren des Gemisches durch ein wasserabweisendes Filter, das das wässerige Medium durchlaufen lässt und die mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit (zusammen mit dem Enzympräparat) zurückbehält und dadurch abtrennt.
Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung der oben beschriebenen Enzympräparate besteht in der einfachen Anwendung auf ein kontinuierliches Verfahren einer enzymatischen Reaktion, die in einer Vorrichtung durchgeführt werden kann, die in den Zeichnungen in Fig, 3 dargestellt ist, die ein schematisches Diagramm eines geeigneten Reaktionsgefässes zeigt.
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Gemäss Fig. 3 ist das Reaktionsgefäss-l-mit Mitteln zum Bewegen in Form eines Rührers --2-, Einleitungsrohren-3, 4 und 5-- für Substrat, Alkali und die Enzymphase und einem Auslass - versehen. Das Reaktionsgefäss-l-enthält weiterhin eine Sonde --7-- zur Feststellung des PH-Wertes, die ein Ventil --8-- steuert, das mit dem Alkali-Einlassrohr --4-- in Verbindung steht.
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-6-- wird- zur Entfernung des Reaktionsproduktes mittels einer Pumpe --14-- und ein Filter in Form einer Sinterglasplatte-15-, die oberhalb des unteren Auslasses --13-- angeordnet ist. Das Substrat wird durch das Einleitungrohr --3-- über eine Pumpe --16-- geführt, die mit der gleichen Fliessgeschwindigkeit wie die Pumpe --14-- betrieben wird und auch verbunden ist.
Beim Betrieb wird das Reaktionsgefäss --1-- durch das Einleitungsrohr --3-- mit dem Substrat in einem wässerigen Medium zusammen mit dem erfindungsgemäss hergestellten Enzympräparat und der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit beschickt. Das Gemisch wird mittels des Rührers - dispergiert, so dass eine Emulsion entsteht. Das Reaktionsgefäss --1-- kann bei einer konstanten Temperatur gehalten werden, z. B. mittels eines (hier nicht gezeigten) Wassermantels um das Reaktionsgefäss. Alkali wird der Emulsion im Behälter durch das Einleitungsrohr --4-- zugegeben.
Die Zuführgeschwindigkeit wird durch das Ventil --8-- bestimmt, das durch die Sonde --7-- gesteuert wird, so dass der PH-Wert des Reaktionsgemisches im erforderlichen PH-Bereich für die bestmögliche Umsetzung gehalten wird. Im Verlauf der Reaktion wird die Pumpe-9-- betrieben und das Gemisch aus dem Auslass --6-- abgezogen und durch das Einleitungsrohr --11-- in das getrennte Gefäss --10-- übergeführt. Im Gefäss --10-- bildet die mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit (in diesem Fall mit einer geringeren Dichte als Wasser) eine gesonderte obere Schicht-17-. die das Enzympräparat mit enthält. Die untere wässerige Schicht -18-- mit dem Gehalt an dem Reaktionsprodukt wird durch das Filter --15-- und danach durch den Auslass --13-- mittels der Pumpe --14-abgezogen.
Die obere Schicht --17- mit einem Gehalt an dem Enzympräparat, assoziiert mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, wird durch den Auslass --12-- fliessen gelassen und kehrt somit durch das Einleitungsrohr --5-- in das Reaktionsgefäss-l-zurück. In dem Masse, wie das Produkt durch den Auslass --13-- abgezogen wird, wird weitere Substratlösung dem Reaktionsgefäss - durch das Einleitungsrohr --3-- mittels der Pumpe --16-- zugeführt. Die Pumpen --14 und 16-sind koordiniert, so dass die Einleitungsgeschwindigkeit des Substrats gleich der Ausflussgeschwindigkeit des Produktes ist.
Die Fliessgeschwindigkeiten, die Verweilzeit im Reaktionsgefäss und andere Parameter der Reaktion hängen von den betreffenden einzelnen Enzympräparat-Substrat-Systemen ab. Aus Vorversuchen war ersichtlich, dass ein 10000 1-Reaktionsgefäss unter Verwendung von 1000 kg eines Enzympräparates auf Basis von einer an"Gantrez AN 149"-Träger gebundenen Penicillin-Acylase täglich etwa 2000 kg Penicillin G in einer Konzentration von 5%-Masse, bezogen auf das Volumen, bei 22 C und einem PH-Wert von 7, 8 liefern konnte, obwohl dieser Zahlenwert mit Enzympräparaten höherer spezifischer Aktivität verbessert werden konnte.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne dass diese jedoch hierauf beschränkt sein soll.
Bei diesen Beispielen werden die folgenden Abkürzungen zur Bezeichnung der Polymerisate und modifizierten Polymerisate, der Enzyme, der Brückenglieder, der nichtpolaren Gruppen und der Verbindungssubstanzen angewendet :
Enzyme :
L : Lipase PA : Penicillin-Acylase
T : Trypsin
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Trägerstoffe :
F : "Ficoll" = Saccharose/Epichlorhydrinkomplex der
Fa. Pharmacia Fine Chemicals AB,
Uppsala, Schweden ; GAN : "Gantrez" = Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid- copolymeres der GAF Corporation,
New York, U. S. A. ;
SR :"Sepharose"= aus Agarose hergestelltes Gel der
Fa. Pharmacia Fine Chemicals AB ; T2000 : "Dextran T. 2000" = Poly-a- (1-6)-D-glucopyranosid.
Enzym und Träger verknüpfende Gruppe :
HD : 1, 6-Diaminohexan
Nichtpolare Gruppen :
D : n-Decylaminogruppe
DD : n-Dodecylaminogruppe 00 : n-Octadecylaminogruppe
Verbindungssubstanzen und Aktivierungsmittel und aktivierte Gruppen :
CMC : 1-Cyclohexyl-3- (2-morpholinoäthyl)-carbodiimid- methano-p-toluolsulfonat
G : Glutaraldehyd
A : Hydrazid
Die Zahl hinter der Bezeichnung gibt die Ansatznummer wieder.
Beispielsweise wird das Enzympräparat des Beispiels 1 mit PAFHDDG bezeichnet. Das Enzym ist demnach die Penicillin-Acylase (PA). Der Trägerstoff ist"Ficoll" (F), der Hexamethylendiamingruppen (HD) zur Verknüpfung des Enzyms und weiterhin Decylgruppen (D) als nichtpolare Gruppen trägt. Die Verknüpfung zwischen der freien Aminogruppe des Hexamethylendiaminrestes und des Enzyms wird unter Verwendung von Glutaraldehyd (G) durchgeführt.
Des weiteren bezeichnet "GAN 149 HDOD"einen modifizierten Träger, der aus einem mit 1, 6- - Diaminohexan und Octadecylamin modifizierten "Gantrez 149" hergestellt worden ist, und die Bezeichnung "PAGAN 149 HDOD-G"den vorgenannten modifizierten Träger, an den in Gegenwart von Glutaraldehyd Penicillin-Acylase geknüpft ist.
Beispiel 1 : a) n-Decylamino- (6-aminohexyl amino) -Ficoll (FHDD-l)
5 g"Ficoll"werden in 300 ml Wasser gelöst und auf einen PH-Wert von 11, 0 eingestellt.
Dann wird 1 g Cyanbromid zugegeben. Während der Reaktion wird der PH-Wert mittels 2n Natronlauge aufrechterhalten. Die Reaktion ist nach 20 min bei Raumtemperatur beendet, und es werden 4 g n-Decylamin und 0, 5 1,6-Diaminohexan, das in 10 ml Methanol gelöst ist, zugegeben. Der PH-Wert wird mittels 2n Salzsäure auf 9, 5 eingestellt. Das Gemisch wird 16 h bei 4 C gerührt.
Die erhaltene kolloidale Lösung wird bei 22000 g/h zentrifugiert. Man erhält ein weisses Sediment (35 g Feuchtmasse), das aufgehoben wird. Die trübe überstehende Flüssigkeit wird verworfen. b) Penicillin-Acylase-[n-decylamino-(6-aminohexylamino)-Ficoll] (PAFHDDG-1)
21, 6 g FHDD-1 (Feuchtmasse) werden mit 20 ml einer O. lm Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 6, 0 vermischt. Der PH-Wert wird mit 2n Salzsäure auf 6, 2 eingestellt.
Dann wird eine Lösung von Escherichia coli-Penicillin-Acylase (50 ml, 340 mg teilweise gereinigtes Protein) auf PH 6, 2 bei 0 C eingestellt und mit 5 ml einer 25%-Masse wässerigen Lösung von Glutaraldehyd versetzt.
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und das braune Sediment (Feuchtmasse etwa 6, 3 g) wird in 0, 1m Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 7, 0 suspendiert und dann bei 4 C gelagert. Die Sediment-Suspension schwimmt, wenn sie schliesslich mit der gleichen Masse n-Decanol vermischt wird, zusammen mit dem Decanol auf der Oberfläche der wässerigen Lösungen, wobei diese darunterschwimmenden Lösungen frei von den Enzymteilchen sind. Die Enzymaktivität des Sediments, der überstehenden Lösung und des gelagerten Enzyms sind in Tabelle I angegeben.
Annähernd 43% der ursprünglichen Enzymaktivität werden wiedergewonnen und tatsächlich alles in der Verbindung. Die Aktivität des Komplexes kann im wesentlichen aus den Penicillinlösungen entweder durch Aufschwimmen oder übliches Zentrifugieren wiedergewonnen werden.
Tabelle I
EMI10.2
die Enzymprobe zugegeben. Der PH-Wert wird durch Zugabe von O, ln oder 0, 5n Natronlauge aufrechterhalten. Die Aktivität wird ausgedrückt als Anfangsgeschwindigkeit der 6-Aminopenicillansäure-Erzeugung. Beim Wiederholungsversuch 1 werden 2 ml n- - Decanol zu dem gerührten Reaktionsgemisch gegeben. Nach der Bestimmung lässt man die Suspension sich in zwei Schichten trennen. Die obere Schicht wird mit einem Spritzgerät entfernt und wiederverwendet. Beim Wiederholungsversuch 2 wird die Endsuspension 15 min bei 2000 g zentrifugiert und das Sediment wiederverwendet.
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<tb>
<tb>
Material <SEP> Anteile <SEP> %-Masse <SEP> Penicillin <SEP> G <SEP> Anfangsgeschwindigkeit
<tb> im <SEP> Versuch <SEP> der <SEP> 6-APS-Erzeugung
<tb> Mol/min <SEP> x <SEP> 1O- <SEP>
<tb> Ausgangsenzym <SEP> l <SEP> ml <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 885
<tb> PAFHDDG-1
<tb> überstehendes <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> 5 <SEP> 0,008
<tb> PAFHDDG-1 <SEP> 0,5 <SEP> g <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 500
<tb> PAFHDDG-1
<tb> (Wiederholungen)
<tb> Verfahren <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 860 <SEP>
<tb> 2. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 550 <SEP>
<tb> 3. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 500 <SEP>
<tb> Verfahren <SEP> 2 <SEP> :
<SEP> 1. <SEP> 0,5 <SEP> g <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 300
<tb> 2. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 210 <SEP>
<tb> 3. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 110 <SEP>
<tb> 4. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 030 <SEP>
<tb>
Beispiel 2 : a) n-Octadecylamino- (6-aminohexylamino) -Ficoll (FODHD-1)
5 g"Ficoll"werden in 300 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 1 g Cyanbromid bei PH 11, 0, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Nach 20 min wird die Lösung mit 2n Salzsäure auf PH 10, 0 eingestellt.
Dann wird die Lösung mit 5 g n-Octadecylamin und 0, 5 g 1, 6-Diaminohe-
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mit einem oberflächlichen Schaum (Octadecylamin). b) Penicillin-Acylase- [n-octadecylamino- (6-aminohexylamino) -Ficoll] (PAFODHDG-1)
25 ml Penicillin-Acylase (170 mg Protein) werden bei Raumtemperatur auf PH 6, 2 eingestellt und dann mit 2, 5 ml einer 25%igen Lösung von Glutaraldehyd versetzt. Das Gemisch wird 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Dann werden 10 ml FODHD-1 zugegeben. Die Suspension wird mittels 2n Salzsäure auf einen PH-Wert von 6,2 eingestellt. Nach 3 h Rühren bei 4 C wird das Reaktionsgemisch 30 min bei 4 C mit 20000 g zentrifugiert.
Das rosafarbene Sediment wird in 0, lm Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 7, 0 suspendiert und dann bei 40C gelagert. Die Suspension wird mittels n-Decanol wirksam aufschwimmen gelassen. Die Aktivität ist in Tabelle II angegeben. Die Wiedergewinnung der Aktivität beträgt annähernd 60%.
Tabelle II
Aktivität des PAFODHDG-1
Versuchsverlauf : wie bei Tabelle I angegeben. Es werden insgesamt
5%-Masse Penicillin G, bezogen auf das Volumen, eingesetzt
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<tb>
<tb> Material <SEP> Anteil <SEP> Anfangsgeschwindigkeit <SEP> der
<tb> 6-APS-Erzeugung
<tb> Mol/min <SEP> x <SEP> 10-'
<tb> Ausgangsenzym <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> 0,885
<tb> PAFODHDG-1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 940
<tb> Wiederholungen
<tb> (Verfahren <SEP> 2) <SEP> 1. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 800 <SEP>
<tb> 2. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 585 <SEP>
<tb>
Beispiel 3 :
EMI11.3
beschrieben, mit 2, 5 g Cyanbromid aktiviert. Nach 20 min werden 5 g n-Decylamin und 1, 0 g 1, 6- - Diaminohexan zugegeben. Der PH-Wert wird auf 10, 0 eingestellt.
Die Lösung wird 16 h bei 4 C gerührt und dann 90 min bei 4 C mit 20000 g zentrifugiert. Das gebildete Sediment wird in 100 ml O, ln Salzsäure nochmals suspendiert und 1 h bei 20000 g zentrifugiert. Das zweite Sediment (50 g Feuchtmasse) wird aufbewahrt.
EMI11.4
(340 mg Protein) auf PH 6, 2 eingestellt und mit 5 ml einer 25%igen (Masse) Glutaraldehydlösung versetzt. Die Lösung wird 45 min bei 4 C gerührt und dann mit T2000HDD versetzt. Das Gemisch wird weitere 30 min bei 4 C gerührt und dann 16 h bei -200C ge1agert. Nach dem Auftauen wird die Suspension 1 h bei Raumtemperatur gerührt und dann 30 min bei 22 C mit 6000 g zentrifugiert.
Das Überstehende wird aufbewahrt, und das Sediment wird in 75 ml 0, lu Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 7, 0 suspendiert und homogenisiert. Dann wird, wie oben beschrieben, zentrifugiert, dann wieder suspendiert und nochmals zentrifugiert. Man erhält 8, 0 g eines braunen Sediments (Feuchtmasse), das wirksam durch n-Decanol und weniger wirksam durch n-Heptan aufschwimmen gelassen wird. Die Aktivität dieses Präparats ist in Tabelle III angegeben. Annähernd 10% der ursprünglichen Enzymaktivität liegen in der Verbindung vor.
<Desc/Clms Page number 12>
Tabelle III
Aktivität von PAT2000HDDG-1 Versuchsanordnung : wie in Beispiel 1 unter Verwendung von
5%-Masse Penicillin G, bezogen auf das Volumen
EMI12.1
<tb>
<tb> Material <SEP> Anteil <SEP> Anfangsgeschwindigkeit <SEP> der
<tb> 6-APS-Erzeugung
<tb> Mol/min <SEP> x <SEP> M-'
<tb> Ausgangsenzym <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> 0,875
<tb> PAT2000HDDG-1
<tb> Überstehendes <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 022
<tb> PAT2000HDDG-1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 270
<tb> Wiederholungen
<tb> (Verfahren <SEP> 2) <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 155
<tb>
Beispiel 4 :
EMI12.2
(6-aminohexylamino) -Sepharose2 g einer mit Cyanbromid aktivierten"Sepharose 4B" (Trockenmasse) werden 15 min bei 4 C in 50 ml 10-3 n Salzsäure angequollen und dann auf einem Sinterglas 2mal mit je 100 ml 10- 3 n Salzsäure gewaschen.
Das Gel wird zu 20 ml einer 0, lm Natriumbicarbonatlösung, 5 ml Äthanol, 0, 5 g n-Decylamin und 0, 1 1,6-Diaminohexan gegeben, Das Gemisch wird langsam 16 h bei 4 C gerührt und dann an einer Glasfritte filtriert. Das Gel wird unter Absaugen 4mal mit je 20 ml 10- 3 n Salzsäure, 4mal mit je 20 ml Äthanol und 4mal mit je 50 ml Wasser gewaschen, dann in Wasser suspendiert und bei 4 C gelagert.
EMI12.3
men) versetzt. Das Gemisch wird 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann auf einer Glasfritte trockengesaugt. Das Gel wird dann zu einem Gemisch von 2 ml Penicillin-Acylase (13, 6 mg) und 3 ml einer O. lm Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 6, 0 gegeben.
Das Gemisch wird 24 h bei 4 C gerührt, trockengesaugt und auf der Glasfritte 5mal mit je 20 ml einer 0, 1m NatriumphosphatPufferlösung vom PH 7,0 gewaschen. Dann wird das Produkt in 5 ml der gleichen Pufferlösung suspendiert. Die erhaltenen Perlchen werden mit n-Decanol aufschwimmen gelassen, im Gegensatz zur nichtmodifizierten "Sepharose", die sich aus wässerigen Suspensionen mit einem Gehalt an n- - Decanol absetzt. Die Aktivität dieses Präparates ist in Tabelle IV angegeben. Annähernd 72% der ursprünglichen Aktivität sind in der Verbindung vorhanden.
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Tabelle IV
Penicillin-acylase-Aktivität von PASRHDDG-1 Versuchsanordnung : wie in Beispiel 1, unter Verwendung von
5% Penicillin G (Masse/Volumen)
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<tb>
<tb> Material <SEP> Anteil <SEP> Anfangsgeschwindigkeit <SEP> der
<tb> 6-APS-Erzeugung
<tb> Mol/min <SEP> x <SEP> 10-1
<tb> Ausgangsenzym <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 885
<tb> PASRHDDG-1 <SEP> 2 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 505 <SEP>
<tb> Wiederholungen
<tb> Verfahren <SEP> 2 <SEP> 1. <SEP> 2 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 410
<tb> 2. <SEP> 2 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 375
<tb> Verfahren <SEP> 1 <SEP> 3. <SEP> 2 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 270
<tb>
EMI13.2
<Desc/Clms Page number 14>
einen bemerkenswerten Absorptions-Blindwert. In einigen Fällen wird die untere Schicht verdünnt, um die Absorptionsablesungen zu erleichtern.
Nach der Ablesung werden sowohl die Heptan- als auch die wässerigen Schichten dem gerührten Reaktionsgemisch zugegeben. Die durch die Verbindung beibehaltene Gesamtaktivität beträgt 17% der ursprünglichen amidolytischen Aktivität.
Beispiel 7 : Lipase- [n-decylamino- (6-aminohexylamino) -Dextran T 2000] (LT2000HDDG-1)
200 mg Lipase von Candida cylindracea werden in 20 ml einer 0, 1m Natriumphosphat-Puffer-
EMI14.1
(Masse) Glutaraldehydlösung, bezogen auf das Volumen, versetzt. Das Gemisch wird 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird aus einer Suspension mittels Äthanol T2000HDD-1 (vgl. Beispiel 3) ausgefällt und die Ausfällung in Wasser aufgequollen. 10 g des erhaltenen Gels werden in 20 ml einer O. lm Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 6, 0 homogenisiert und mit dem EnzymGlutaraldehyd-Gemisch versetzt. Der PH -Wert wird auf 6, 2 eingestellt. Das Gemisch wird 16 h bei
EMI14.2
1mdiert. Die Suspension ist sowohl mit n-Decanol als auch mit n-Heptan flotierbar. Die Aktivität der Verbindung ist in Fig. 2 gezeigt.
Die Versuchsanordnung war wie folgt :
5 ml p-Nitrophenyl-Iaurat (10-'m in n-Heptan) werden bei Raumtemperatur mit 20 ml einer 0, 1m Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 8, 0 rasch verrührt. Unter diesen Bedingungen ist über 1 h und mehr keine nicht enzymatische Esterhydrolyse feststellbar. Nach der Zugabe des Enzyms werden 5 ml aliquote Anteile in bestimmten Zeitintervallen entnommen, die 90 s mit 4000 g zentrifugiert werden. Die untere (wässerige) Schicht wird entfernt. Genau 3 min nach dem Entfernen des ursprünglichen aliquoten Anteils wird die optische Dichte in einer Schichtdicke von 1 cm und bei 400 nm bestimmt.
Die wässerigen und Heptan-Schichten werden dann zu dem gerührten Gemisch gegeben (da das Substrat bei diesem Versuch in einer nichtwässerigen Phase vorliegt, muss die Rührgeschwindigkeit, d. h. das Ausmass der Dispersion, während des Versuches konstant gehalten werden).
Annähernd 1% der ursprünglichen Lipase-Aktivität liegt in der Verbindung vor.
Beispiel 8 : a) GAN149HDOD-1
1 g n-Octadecylamin und 0, 2 1,6-Diaminohexan werden in 10 ml Methanol suspendiert und mit 200 ml einer 0. 2m Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 8, 0 mit einem Gehalt von 40 ml Methanol versetzt. Dann werden unter lebhaftem Rühren und in kleinen Anteilen 2 g"Gantrez 149"zuge- geben. Das Gemisch wird 16 h bei Raumtemperatur gerührt und dann 1 h bei Raumtemperatur mit 12000 g zentrifugiert. Schaum und überstehende Lösung werden verworfen. Das Sediment wird in
EMI14.3
nochmals zentrifugiert.
Das gelähnliche Sediment (80 g) wird bei 4 C gelagert. b) PAGAN149HDOD-1-G
20 ml einer Penicillin-Acylase-Lösung (1, 36 x 10- 7 Einheiten ; 136 mg Protein) werden auf PH 6, 2 eingestellt und dann mit 2 ml 25%iger (Masse) wässeriger Glutaraldehydlösung, bezogen auf das Volumen, versetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 10 g einer Suspension von GAN149HDOD-1 in 12 ml einer 0, 1m Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 6, 0 versetzt.
Der PH -Wert wird bei 6, 2 gehalten und das Rühren 2 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Suspen-
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Spezifische Aktivität : 3 x 10-5 Mol 6-APS min-' (5% Penicillin G, PH 7, 8, 22OC) ; wiedergewonnene Aktivität : 21%. Flotierbar mit n-Decanol oder n-Decan.
Beispiel 9 : a) GAN149HDOD-2 5 g n-Octadecylamin werden in 50 ml Äthanol gelöst und zu 1 l einer 0, 1m Natriumphosphat-
<Desc/Clms Page number 15>
Pufferlösung vom PH 9, 0 mit einem Gehalt von 200 ml Äthanol gegeben. Dann werden 5 g"Gantrez 149" in kleinen Anteilen während 45 min unter Rühren zugegeben. Mittels 2n Natronlauge wird der PH-Wert zwischen 8 und 9 gehalten. Nach Zugabe von"Gantrez 149"werden 5 g 1, 6-Diaminohexan zugesetzt. Das Gemisch wird 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Der PH-Wert wird dann mittels konz. Salzsäure auf 3, 0 herabgesetzt und die Suspension 1 h bei Raumtemperatur mit 12000 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird verworfen. Das Sediment wird in 550 ml Wasser suspendiert und nochmals zentrifugiert.
Man erhält schliesslich ein weisses Sediment von 150 g, das bei 4 C gelagert wird. b) PAGAN149HDOD-2-G
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bei 4 C mit 20000 g zentrifugiert. Das Sediment wird in 0, lm Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 7, 0 suspendiert und nochmals zentrifugiert. Diese Arbeitsweisen werden wiederholt. Man erhält ein endgültiges Sediment mit einer Masse von 11, 2 g, das bei 4 C gelagert wird.
Spezifische Aktivität : 1, 8 x 10-5 Mole 6-APS x min-'x g-'.
Wiedergewonnene Aktivität : 55%. Flotierbar mit n-Decanol oder n-Decan.
Beispiel 10 : Trypsin- (n-decylamino-Gantrez AN 119) (TGAN119D)
1 g"Gantrez AN 119" wird unter kräftigem Rühren in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Dann werden 0, 3 g n-Decylamin in 1 ml Dimethylformamid zugegeben. Die Lösung wird viskoser. Nach 10 min Rühren wird die Lösung zu 300 ml einer Lösung von Rindertrypsin in 60 ml einer 0, lm Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 8, 0 bei 22 C zugetropft. Der PH-Wert wird mittels 2n Natriumhydroxydlösung aufrechterhalten. Wenn keine weitere Änderung auftritt, werden 4 g Natriumchlorid zugegeben. Die erhaltene Suspension wird in 175 ml einer 0, 1m Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 7, 6 gegossen und das Gemisch auf 4 C gekühlt.
Dann werden 50 g Ammoniumsulfat zugegeben.
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Das Zentrifugieren wird wiederholt mit anschliessendem zweimaligem Homogenisieren und Zentrifugieren, so dass man schliesslich ein lockeres Gel von 7, 5 g erhält. Die Herstellung wird spektrophotometrisch unter Verwendung von 2 mMol n-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid in einer 0, 1m VeronalPufferlösung vom PH 8, 3 bei 22 C untersucht. Eine Einheit ist ein Anstieg der optischen Dichte von 0, 001 min bei 400 nm. Da das Gel eine bemerkenswerte Lichtstreuung verursacht, ist es erforderlich, die Küvette (1 cm Weglänge) intermittierend zu schütteln.
Gelaktivität : 168 Einheiten/mg Feuchtmasse, 2000 Einheiten/mg Trockenmasse (gefriergetrockne- tes Gel).
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Die Immobilisierung der Enzymverbindung auf den Lösungsmitteltröpfchen wird durch folgenden Versuch veranschaulicht :
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Schicht aus dichtgepackten Decantröpfchen und eine untere wässerige Schicht. Beide Schichten werden unter Anwendung der obgenannten spektrophotometrischen Methode untersucht. Wieder wird die Küvette in regelmässigen Zeitabständen geschüttelt, wenn die obere Schicht untersucht und die Durchschnittsgeschwindigkeit des Anwachsens der optischen Dichte gemessen wird.
Aktivität der oberen Phase : 2280 Einheiten/ml i
Aktivität der unteren Phase : 57 Einheiten/ml.
Da die scheinbare Aktivität der oberen Phase wahrscheinlich viel geringer als die wirkliche Aktivität infolge der angewendeten Methode ist, zeigt das Ergebnis an, dass mindestens 90% der Trypsin-Aktivität mit den Lösungsmitteltröpfchen vereinigt sind.
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Beispiel 11 : Penicillin-Acylase- (n-octadecylamino-Gantrez AN 119) (PAGAN1190D) 0, 5 g"Gantrez AN 119" werden in 2, 5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf dem Wasserbad auf 800C erwärmt. Dann werden 0, 28 g Octadecylamin in 2, 5 ml Dimethylformamid bei 800C gelöst und rasch zu der "Gantrez"-Lösung gegeben, während sie noch warm ist. Das Gemisch wird gerührt und mit 0, 1 ml Pyridin versetzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur innerhalb 1 h wird die Gesamtlösung zu 175 mg Penicillin-Acylase in 30 ml Wasser bei PH 7, 0 gegeben und kurz bei 0 C homogenisiert.
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der Verbindung.
Die obgenannte Suspension (4, 0 ml) wird mit 20 ml einer O, 02m NatriumphosphatPufferlösung und mit 5 ml n-Decanol vermischt und dann 5 min bei 0 C mit etwa 4000 Umdr/min homogenisiert. Dann wird die Emulsion 20 min bei Raumtemperatur mit 100 g zentrifugiert und in eine obere organische Emulsion und in eine untere wässerige Schicht aufgetrennt. Die untere Schicht wird beibehalten und die obere wird wieder in 20 ml einer 0, 02m Natriumphosphat-Pufferlö- sung suspendiert und nochmals zentrifugiert. Die ursprüngliche untere Schicht enthält eine Gesamtaktivität von 1, 25 x 10- Mol/min und die gewaschene obere Schicht eine solche von 9, 5 x 10- Mol/min.
Das Verhältnis der spezifischen Aktivitäten (auf das Volumen bezogen) beträgt 21, 6 (obere zu unterer Schicht). Nach der Aktivitätsbestimmung nach dem obgenannten Verfahren wird die organische Schicht durch schwaches Zentrifugieren rückgeführt. Das Entfernen der wässerigen Schicht ist in Tabelle V gezeigt.
Tabelle V
Prozentuale ursprüngliche Aktivität der PAGAN1190D-n-Decanol-Phase auf die nachfolgenden Flotations-Wiederverwendungszyklen
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<tb>
<tb> Zyklus <SEP> Nr. <SEP> % <SEP> Aktivität <SEP> Zyklus <SEP> Nr. <SEP> % <SEP> Aktivität <SEP>
<tb> 1 <SEP> 80 <SEP> 7 <SEP> 46
<tb> 2 <SEP> 86 <SEP> 8 <SEP> 46
<tb> 3 <SEP> 93 <SEP> 9 <SEP> 44
<tb> 4 <SEP> 73 <SEP> 10 <SEP> 42
<tb> 5 <SEP> 64 <SEP> 11 <SEP> 45
<tb> 6 <SEP> 47 <SEP> 12 <SEP> 43
<tb>
Beispiel 12 : Penicillin-Acylase- (n-Dodecylamino-Gantrez AN 119) (PAGAN 119DD)
0, 25 g n-Dodecylamino-Gantrez AN 119 werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und zu einer Lösung von Penicillin-Acylase gegeben (100 mg in 14 ml einer 0,1m Natriumphosphat-Pufferlösung
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Nach kurzzeitiger Homogenisierung bei 0 C wird die Suspension 16 h bei 4 C gerührt. Dann werden 7, 8 g Ammoniumsulfat bei 4 C zu der nunmehr homogenen Lösung gegeben. Der PH-Wert wird mit 1m Natriumcarbonatlösung bei 7, 0 gehalten. Nach dem Lösen des Ammoniumsulfats bildet sich eine trübe Suspension. Das Gemisch wird 1 h bei 0 C mit 25000 g zentrifugiert. Das Sediment wird in einer Lösung von 7,8 g Ammoniumsulfat in 30 ml Wasser nochmals suspendiert und dann bei PH 7, 0 nochmals zentrifugiert. Das endgültige Sediment wiegt 1, 36 g und wird in 10 ml Wasser nochmals gelöst. Man erhält eine viskose Lösung.
Die Aktivität des Sediments (Versuch wie zuvor)
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den folgenden Versuch veranschaulicht :
1 ml der obgenannten Lösung wird in 20 ml einer 0. 02m Natriumphosphat-Pufferlösung gelöst und 3 min bei 0 C mit 10 ml n-Decanol bei 4000 Umdr/min homogenisiert. Die Emulsion trennt sich nach 10 min Zentrifugieren mit 300 g in zwei Schichten auf. Die obere Schicht hat eine Gesamtaktivität von 1, 14 x 10-5 Mol/min. Die Aktivität bei den anschliessenden Zyklen ist in Tabelle VI gezeigt.
Bei einem zweiten Versuch werden 2 ml der Lösung der Enzymverbindung unter den gleichen Bedingungen mit 2,5 ml n-Decanol und 10 ml 0, 02m Natriumphosphat-Pufferlösung homogenisiert.
Nach dem Zentrifugieren und Waschen mit 20 ml der gleichen Pufferlösung besitzt die obere Schicht eine Aktivität von 1, 8 x 10- Mol/min und die ursprüngliche untere Schicht eine Aktivität von 8, 0 x 10- 6 Mol/min. Das Verhältnis der spezifischen Aktivität (obere zu unterer Schicht, bezogen auf das Volumen) ist etwa 7,5.
Tabelle VI
Prozentuale ursprüngliche Aktivität der PAGAN1l9DD-n-Decanol-Phase auf die anschliessenden Flotations-Wiederverwendungszyklen
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<tb>
<tb> Zyklus <SEP> Nr. <SEP> % <SEP> Aktivität
<tb> 1 <SEP> 96
<tb> 2 <SEP> 66
<tb> 3 <SEP> 66
<tb> 4 <SEP> 53
<tb>
Beispiel 13 :
Trypsin- (hydrolysiertes n-Octadecylamino-Gantrez AN 149) (TGAN149DCMC)
15 g eines angequollenen Polymerisatgels werden mit 0, 1m Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 7, 0 vermischt. Der PH-Wert wird mit 2n Salzsäure auf 4, 7 eingestellt. Dann werden 0, 5 g 1-Cyclo- hexyl-3- (2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (CMC) zugegeben. Der PH-Wert wird mittels 2n Hel bei 4, 7 gehalten.
Nach 5 min bei Raumtemperatur werden 75 mg Rindertrypsin in 2 ml einer 0, lm Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 7, 0 gegeben. Der PH-Wert des Gemisches wird auf 5, 9 eingestellt und während der nächsten Stunde mittels 2n Natriumhydroxydlösung aufrechter-
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10 ml n-Decan vermischt und kurzzeitig homogenisiert. Dieses Verfahren liefert eine unvollständige Dispersion, und das Gemisch wird deshalb mit Ultraschall bei 20 kHz in 5 Stössen zu 5 min mit
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Die obere Schicht wird 3mal mit je 25 ml Phosphat-Pufferlösung gewaschen. Das endgültige Volumen der oberen Schicht beträgt 11 ml. Diese obere Schicht hat eine Aktivität (Untersuchung wie in Beispiel 3) von 1050 BANA-Einheiten/ml (BANA = N-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid). Die scheinbare wiedergewonnene Aktivität beträgt etwa 5%.
Beispiel 14 : a) Hydrolysiertes n-Octadecylamino-Gantrez AN 119-Hydrazid (GAN1190DH)
5 g"Gantrez AN 119" werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und auf dem Wasserbad auf 600C erwärmt. Eine Lösung von 2, 8 g n-Octadecylamin in 30 ml auf 80 C erwärmtem Dimethylformamid wird zugegeben. Das Gemisch wird 1 h bei etwa 600C gehalten. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Lösung zu einem Gemisch von 10 ml Hydrazinhydrat und 50 ml Dimethylformamid bei Raumtemperatur gegeben. Es bildet sich ein schwachbrauner Niederschlag. Das Gemisch wird 10 min gerührt und dann mit 500 ml Wasser versetzt. Es bildet sich eine seifige grüne Lösung.
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Nach 15 min Rühren wird der PH -Wert mittels konz.
Salzsäure auf 7, 0 eingestellt. Dann werden 50 g Natriumchlorid zugesetzt. Es tritt eine Ausflockung auf, und die Suspension wird 30 min bei 40C mit 10000 g zentrifugiert. Das erhaltene Sediment wird in 400 ml Wasser nochmals suspendiert, dann 16 h bei 4 C gerührt und anschliessend, wie oben angegeben, zentrifugiert. Man erhält ein blaugraues Sediment von 39 g (Feuchtmasse). b) Penicillin-Acylase- (n-Octadecylamino-Gantrez AN 119)-hydrazid (PAGAN1190DH)
6 g GAN1190DH (Feuchtmasse) werden in 50 ml 2n Salzsäure suspendiert und 15 min bei 0 C gerührt. Dann wird eine Lösung von 0, 5 g Natriumnitrit in 5 ml Wasser zugegeben und das Gemisch
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tein) gegeben. Das Gemisch wird auf PH 8, 0 eingestellt.
Die Suspension wird 72 h bei 4 C gerührt und dann 1 h bei 0 C mit 25000 g zentrifugiert. Anschliessend wird das Sediment in 0, 1m Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH 7, 0 suspendiert und nochmals zentrifugiert.
Die Masse des endgültigen Sediments beträgt 3, 74 g. Die spezifische Aktivität (Untersuchung wie oben) beträgt 5, 2 x 10-5 Mol/min/g. Die wiedergewonnene Aktivität beträgt 32. 5%.
Eine Suspension der obgenannten Verbindung in 0, lm Natriumphosphat-Pufferlösung vom PH
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mischt und 2 min und 5000 Umdr/min bei 0 C mit 7, 5 ml n-Decanol homogenisiert. 10 min langes Zentrifugieren mit 100 g ergibt zwei Schichten. Die untere Schicht hat eine Gesamtaktivität von 1, 8 x 10-6 Mol/min und die obere Schicht nach dem Waschen mit 20 ml der obgenannten Pufferlösung eine Aktivität von 1, 9 x 10- Mol/min. Das Verhältnis der spezifischen Aktivitäten (untere zu oberer Schicht, bezogen auf das Volumen) beträgt etwa 30. Die Ergebnisse der Rückführung der oberen Phase sind in Tabelle VII angegeben.
Tabelle VII
Prozentuale ursprüngliche Aktivität der PAGAN1190DH-n-Decanol-Phase auf die nachfolgenden Flotations-Wiederverwendungszyklen
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<tb>
<tb> Zyklus <SEP> Nr. <SEP> % <SEP> Aktivität <SEP>
<tb> 1 <SEP> 90 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 84
<tb> 3 <SEP> 74 <SEP>
<tb>
Beispiel 15 :
Enzymatische Spaltung von Benzylpenicillin zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure 1, 0 g"Gantrez AN 119" werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0, 56 g Octadecylamin versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
48 ml einer teilweise gereinigten Zubereitung von Penicillin-Acylase werden mittels 1m Natriumcarbonatlösung auf ein PH 9, 0 eingestellt. Die Lösung des"Gantrez"-Harzes wird dann in zwei gleichen Anteilen unter Homogenisieren und einem PH-Einstellen zwischen den beiden Zugaben zugegeben. Danach wird das Gemisch 3 h gerührt, wobei der PH-Wert durch Zugabe von 1m Natriumhydroxydlösung auf 9, 0 gehalten wird.
Das Enzym-Harz wird dann durch Zentrifugieren wiedergewonnen, in 120 ml einer 0, lm Phosphat-Pufferlösung vom PH 7,0 suspendiert und dann 30 s homogenisiert. Das Enzym-Harz wird durch Zentrifugieren und wiederholtes Waschen wiedergewonnen.
20 g des Enzym-Gels werden mit 80 ml n-Decan und 20 ml 0, 02m Phosphat-Pufferlösung vom PH 7, 8 1 min homogenisiert. Das Homogenisat wird zu 250 ml destilliertem Wasser gegeben. Das
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penicillin versetzt. Das Gemisch wird 5 h gerührt und der PH-Wert durch Zugabe von 4%iger (Masse) Natriumhydroxydlösung, bezogen auf das Volumen, auf 7, 8 gehalten. Nach Beendigung der Reak-
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tion wird das Gemisch in einen Scheidetrichter gegeben. Dann lässt man das Enzym von der wässerigen Phase sich abtrennen. Dies dauert etwa 30 min. Die wässerige Schicht wird dann entfernt, und die 6-Aminopenicillansäure wird in der nachfolgenden Weise extrahiert.
Die Flüssigkeit wird auf 1/4 des ursprünglichen Volumens eingeengt, auf 5 C gekühlt und dann mit dem gleichen Volumen Isobutylketon unter Rühren versetzt. Der PH-Wert wird durch Zugabe von konz. Salpetersäure auf 4, 3 herabgesetzt, woraufhin die 6-Aminopenicillansäure ausfällt. Der Feststoff wird abfiltriert, mit Wasser und Aceton gewaschen und über Nacht bei 40 C getrocknet. Man erhält 7, 65 g 6-Amino- penicillansäure.
In den Zeichnungen illustriert Fig. 1 die Freisetzung von p-Nitroanilin aus N-a-Benzoyl-DL- - arginin-p-ni troani1Ï d
A) durch Trypsin (Img) und
B) durch den Trypsinkomplex TFODHDG-1 (0, 1 g) von Beispiel 6 und Fig. 2 die Freisetzung von p-Nitrophenyllaurat, katalysiert
A) durch Lipase (0, 1 g) und
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PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Enzympräparat, in welchem das Enzym an genügend viele nichtpolare Gruppen, z.
B. Kohlenwasserstoffreste mit mindesstens 6 C-Atomen, wie Alkyl mit 6 bis 30 C-Atomen, Alkenyl mit 6 bis 50 C-Atomen, Cycloalkyl und Cycloalkenyl mit 6 bis 20 C-Atomen, gegebenenfalls substituiertes Aryl und Aralkyl, gebunden ist, dass sich das Präparat beim Inberührungbringen in einem wässerigen Medium mit einer inerten, mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit mit letzterer assoziiert und dadurch aus dem wässerigen Medium abtrennbar ist, in einem wässerigen Medium mit einem Substrat für das Enzym in Berührung bringt, danach das Enzympräparat aus dem wässerigen Reaktionsgemisch mittels Inberührungbringen mit einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit abtrennt, das Reaktionsprodukt aus der wässerigen Phase gewinnt und gegebenenfalls das abgetrennte Enzympräparat durch Inberührungbringen mit weiterem Substrat wiederverwendet.