DK159328B

DK159328B - Fremgangsmaade til fremstilling af cholesterolsynteseinhiberende 3-hydroxy-ml-236b derivater, betegnet m-4 og m-4'

Info

Publication number: DK159328B
Application number: DK516182A
Authority: DK
Inventors: Akira Terahara; Minoru Tanaka
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1981-11-20
Filing date: 1982-11-19
Publication date: 1990-10-01
Also published as: SE453996B; GB2111052A; GB2111052B; KR880002483B1; ATA425182A; AU551720B2; IT8268359A0; FI70925C; FI823978A0; ES8402350A1; KR840002451A; JPH0371116B2; US4537859A; BE895080A; DE3242849C2; CA1186647A; FI823978L; NL8204505A; AT387585B; CH651065A5

Description

i DK 159328 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af visse 3-hydroxy-ML-236B-derivater, betegnet M-4 og M-4' med formlen I

hooc^y"oh * ^Λί^' h3c^N^9 hxh (i) CH3

HCT

hvori OH betegner OH eller OH samt visse salte og estere af disse forbindelser.

15 ML-236B, der kan eksistere i form af en syre (betegnet "ML-236B carboxylsyre") eller en lacton (betegnet "ML-236B lacton") er omhandlet i engelsk patentskrft nr.

1 453 425, og forbindelsen har i sin lacton-form formlen: 20 °<γ^γ-0Η °v * s Λττ ^ 30

Engelsk patentskrift nr. 1 555 831 omhandler herefter en hel række salte og estere af ML-236B. ML-236B og salte og estere heraf viste sig at hæmme biosyntesen af cholesterol ved at konkurrere med 3-hydroxy-3-methylglutaryl-35 coenzym A-reduktase, der er det hastighedsbestemmende en-

DK 159328 B

2 zym ved cholesterolbiosyntesen; forbindelserne har således vist sig at udøve bemærkelsesværdig evne til at reducere serumcholesterolniveauer.

5 Visse 3-hydroxy-ML-236B derivater isoleret som produkter fra dyrisk nedbrydning af ML-236B lacton og lignende derivater har vist sig at blive frembragt ved enzymatisk hydroxylering af ML-236B lacton eller -carboxylsyre eller salte eller estere deraf udført ved hjælp af forskellige 10 mikroorganismer af slægterne Absidia, Cunninghamel1a, Syncephalastrum, Streptomyces, Mucor, Rhizopus, Zygorin-chus, Cirinella, Actinomucor, Gongronella, Phycomyces, Morierella, Pycnoporus og Rhizoctonia. Disse fremgangsmåder er omhandlet i USA patentskrift nr. 4 346 227, hvor 15 de således frembragte forbindelser er beskrevet som M-4, M-4', IsoM-4 og IsoM-4'. Forbindelserne viste sig at være i stand til at hæmme cholesterolbiosyntesen, idet virkningen var mindst sammenlignelig med og i visse tilfælde overgik virkningen af ML-236B selv.

20 ML-236B og derivater heraf, herunder M-4 og M-4'-forbindelserne, er således af terapeutisk værdi ved behandling af hyperlipæmi og ved profylaxen af arteriosclerose.

25 Det har nu vist sig, at M-4' og M-4' også kan frembringes ud fra ML-236B og forskellige derivater heraf ved behandling med en mikroorganisme af slægten Nocardia eller et cellefrit, enzymholdigt ekstrakt heraf. Anvendelsen af mikroorganismerne af slægten Nocardia har den fordel i 30 forhold til anvendelsen af de mikroorganismer, der er omhandlet i USA patentskrift nr. 4 346 227, at ML-236B forbindelsen anvendt som substrat kan forefindes i reaktionssubstratet i meget højere koncentrationer, end når de tidligere kendte mikroorganismer anvendtes. Dette er 35 særdeles overraskende, da ML-236B forbindelserne har vist sig at være i besiddelse af antifungale og antibiotiske egenskaber.

DK 159328 B

3

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser med formel I

5 hooc/^v"oh

naJ

Η O 7χ VH m h3AAA) hN (i) 15 hvori OH betegner < OH eller OH, farmaceutisk acceptable alkalimetal- og jordalkalimetalsalte og C^-Cg alkylestere heraf eller de tilsvarende ringsluttede laet oner, der er ejendommelig ved, at man bringer en ML-20 236B forbindelse valgt blandt ML-236B carboxylsyre med

formel II

„OH

HOOCr^ 25 HCL .

u O IS

Jl ΓΗ (Π) H3C"|V Hf CH3A1AAH3 30 og alkalimetal- og jordalkalimetalsalte og C^-Cg alkyl-35 estere heraf og den tilsvarende ML-236B lacton med formlen Ila angivet nedenfor i kontakt med et hydroxylerende enzym frembragt ved hjælp af en mikroorganisme af slægten 4

DK 159328 B

Nocardia; at man eventuelt underkaster den fremstillede forbindelse én eller flere omsætninger valgt blandt hydrolyse, saltdannelse, esterificering og lactonisering; og at man isolerer forbindelsen fra reaktionsblandingen.

5

Forbindelser med formel I, hvori OH betegner < OH betegnes M-4 carboxylsyre, og de tilsvarende salte og estere betegnes M-4 carboxylater. Forbindelser med formel I, hvori OH betegner OH, betegnes M-4' carb- 10 oxylsyre, og de tilsvarende salte og estere omtales som M-4* carboxylater.

De ringsluttede lactoner svarende til forbindelserne med formel I kan afbildes med følgende formel la 15

H O fC

20 i li Γ ^ Η I (Ig) 25 Her hvori OH betegner < OH eller OH og betegnes henholdsvis M-4 og M-4' lacton.

30 35

DK 159328 B

5

Den ringsluttede lacton svarende til ML-236B carboxylsyre med formel II kan afbildes med formel Ila

°^\x'0H

5 H O fvu „V « 10 C^AU^Ha og betegnes ML-236B lacton.

15

Foretrukne arter af slægten Nocardia til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er Nocardia autotrophi-ca, Nocardia asteroides, Nocardia farcinica og Nocardia coeliaca, specielt Nocardia autotrophica. Blandt disse 20 arter foretrækkes følgende stammer:

Nocardia autotrophica FERM P-6181 (SANK 62781);

Nocardia autotrophica subsp. canberrica subsp. nov. FERM P-6182 (SANK 62881); 25 Nocardia autotrophica subsp. amethystine subsp. nov. FERM P-6183 (SANK 62981);

Nocardia autotrophica IFO 12743 (SANK 91279);

Nocardia asteroides IFO 3424 (SANK 62065);

Nocardia asteroides ATCC 3318 (SANK 64265) og 30 Nocardia coeliaca ATCC 17040 (SANK 63665).

Blandt de ovenfor nævnte foretrukne stammer er Nocardia autotrophica IFO 12743, Nocardia asteroides IFO 3424, Nocardia asteroides ATCC 3318 og Nocardia coeliaca ATCC 35 17040 velkendte stammer, der er frit og offentligt til gængelige fra de pågældende kultursamlinger, dvs. the Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) eller the 6

DK 159328 B

American Type Culture Collection, USA (ATCC) under de angivne registreringsnumre.

Stammerne af Nocardia autotrophia identificeret med regi-5 streringsnumrene FERM P-6181, FERM P-6182 og FERM P-6183 er alle hidtil ukendte stammer af mikroorganismen, der for nylig er isoleret fra jord og anbragt 16. oktober 1981 i the Fermentation Research Institute, Ibaraki-Ken,

Japan (FERM). Herudover er ovennævnte stammer deponeret 10 frit tilgængelige fra ATCC som henholdsvis ATCC 35202, ATCC 35203 og ATCC 35204. Yderligere er disse stammer deponeret i overenstemmelse med Budapesttraktaten i Deutsche Samlung von Mikroorganismen som henholdsvis nr. DMS2644, DMS2645 og DMS2646.

15

De morfologiske og fysiologiske egenskaber ved de hidtil ukendte isolerede mikroorganismer bestemtes under anvendelse af almindelige substrater og fremgangsmåder beskrevet af Shirling og Gottlieb [International Journal of 20 Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966)] sammen med adskillige supplerende forsøg. Undersøgelser af kulturen foretoges efter inkubering i 2 uger ved 28 °C. De anvendte farvenavne bestemtes ud fra "Guide to Colur Standard" (en håndbog udgivet af Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokyo, 25 Japan). Kulturernes egenskaber sammenlignedes med egen skaberne hos forskellige kendte arter af actinomyceter beskrevet i "The Actinomycetes, Vol. 2" af Waksman, "The ISP Report" af Shirling og Gottlieb, "Bergey's Manual of Determinative Bateriology", 8. udgave og anden for nylig 30 udgiven litteratur, der angår taxonomien hos familien No-cardiaceae. De omhandlede mikroorganismer identificeredes ved hjælp af deres FERM registreringsnumre.

35

DK 159328 B

7

Morfologiske egenskaber TABEL 1

5 FERM FERM FERM

P-6181 P-6182 P-6183

Morfologi af sporekæde RF RF RF

10 Forgrening enkel enkel enkel

Fragmentering Ja Ja Ja

Overfladeopbygning af 15 delte hyphae (sporer) glat glat glat

Andre organer Knuder, Knuder Ingen redeagtige sammen- 20 filtret RF = rectus-flexibilis Vækst på taxonomiske substrater 25

Alle de omhandlede stammer viste god vækst på en hel række substrater.

Stammen FERM P-6181 havde hvide luftmycelier på en gul-30 lig-grå til svagt gult-orange vækst. I visse substrater sås et svagt gul-brunt opløseligt pigment, men kun i ringe grad.

Stammen FERM P-6183 havde en brun-hvid til svagt gul-35 orange vækst og brun-violette pletter efterhånden som væksten skred fremad. Brunlige-grå luftmycelier fandtes på alle substrater, undtagen på gær-malt substrat.

8

DK 159328 B

Dyrkningsegenskaberne efter 14 dages dyrkning ved 28 "C i en hel række substrater er angivet i tabel 2. Forkortelserne, der er anvendte i tabellerne, er følgende: 5 G = vækst AM = luftmycelium R = bagside SP = opløseligt pigment 10 15 20 25 30 35 TABEL 2 9

DK 159328 B

Substrat FERM P-6181 FERM P-6182 FERM P-6183 Særdeles god, Særdeles god, Særdeles god, G. svagt gul- brun hvid (2-9-8) 5 brun (6-4-1) til grålig- (6-7-9) rødbrun (4-3-5) Gær- Rigelig, Rigelig, Spor, hvid malt- AM. hvid brunlig agar hvid 10 <2-9-7>

Anelse, Brun Brund-hvid R. gul-orange (4-4-7) (2-9-8) til (ISP 2) (8r-8-8) grålig rødbrun (4-3-5) 15 SP. Gul-brun Intet Intet (8-7-9)

God, Særdeles god, Særdeles god, G. svagt brun svagt gul- mørk rødbrun (2-8-9) orange (4-3-4) (2-9-9) 20

Havre- Noget, Rigelig, Noget mels- AM. hvid svagt lyserød agar gulbrun (2-8-4) (2-9-9)

Gullig- Svagt Brund-violet (ISP 3) R. brun gul-brun (3-3-2) 25 (4-7-9) (4-8-9) SP. Svagt Intet Intet gul-brun (4-8-9)

God, Dårlig, Særdeles god, „n G. gullig-grå gullig-grå brun-violet (2-9-10) (1-9-10) (3-3-2)

Stivel- Noget, Rigelig, God, klar se/uor- AM. hvid svagt gul- brun-grå ganisk orange (2-8-2) saltagar (2-9-9) 35 Svagt gul Svagt Mørk rød- (ISP4) R. (3-9-10) gul-orange brun (2-9-9) (4-3-4) SP. Intet Intet Intet

DK 159328 B

Substrat FERM P-6181 FERM P-6182 FERM P-6183 10

God, God, Særdeles god, G·· Svagt brun grålig svagt brun (2-8-9) gul-brun (2-9-9) til (4-5-7) brun-violet (3-3-2)

Glyce- Rigelig, Rigelig, Rigelig, rol- AM. hvid brun-hvid hvid aspara- (1-8-6) ginagar

Svagt Brun Svagt R. gul-brun (4-4-6) gul-orange (ISP 5) (6-8-9) (2-9-9) til 10 grålig-rødbrun (4-3-6) SP. Svagt Intet Intet gul-brun (6-9-11) 15 Særdeles god, Særdeles god, God, G. svagt gul- grålig- grålig-brun orange gul-brun (4-6-6) (3-8-8) (4-5-7)

Tyrosin- Rigelig, Rigelig, Spor, hvid agar AM. hvid brun-hvid (2-9-7) 20

Gullig-grå Klar brun Svagt (ISP 7) R. (1-9-10) (6-5-7) gul-orange (2-9-9) til brun-violet (3-3-2) pc Svagt Intet Intet gul-brun (6-7-9) Dårlig, Dårlig, G. svagt gul- svagt svagt 131:1111 gul-brun gul-orange (2-9-9) (2-9-9) (2-9-9) 30

Saccha- Nogen, Rigelig, Nogen, hvid rose AM. hvid brun-hvid nitrat- (2-9-7) agar

Gulli£T-gr& Brun-hvid Svagt oc R* (1-9-10) (1-9-6) gul-orange (2-9-9) SP. Intet Intet Intet

Substrat FERM P-6181 FERM P-6182 FERM P-6183 11

DK 159328 B

Særdeles god, God, Særdeles god, G. svagt gul- grålig svagt gulorange gul-brun orange (2-9-9) (4-5-7) (2-9-9) til brun-violet (3-3-2) 5 Glucose- Nogen, Rigelig, Nogen, hvid aspara- AM. hvid klart ginagar brun-hvid (1-7-6)

Svagt Grålig- Svagt R. gul-brun rødbrun gul-orange 10 (4-8-9) (4-3-6) (2-9-9) til grålig-rødbrun (4-3-6) SP. Svagt Intet Intet gul-brun (4-8-9) 15 God, Særdeles god, God, G. gullig-grå svagt svagt brun gul-brun gul-orange (2-9-10) (6-8-9) (2-9-9) Nærings- Nogen, Svagt Spor, hvid agar AM. hvid gul-orange 20 (2-9-9)

Gullig-grå Svagt Svagt R. (4-9-10) gul-brun gul-orange (ISP2) (6-8-9) (2-9-9) SP. Intet Intet Intet 25 Dårlig, Dårlig, Dårlig, G. gullig-grå farveløs svagt (1-9-10) gul-orange (2-9-9)

Vand- Nogen, Rigelig, Nogen, hvid agar AM. hvid hvid 30

Gullig-grå Svagt Svagt R. (1-9-10) gul-orange gul-orange (2-9-9) (2-9-9) SP. Intet Intet Intet 35

Substrat FERM P-6181 FERM P-6182 FERM P-6183

DK 159328 B

12 Dårlig, Dårlig, Dårlig, G.' gullig-grå farveløs farveløs (1-9-10)

Kartof- Noget, Noget, Noget, fel AM. hvid hvid hvid gulerods-5 ekstrakt agar

Gullig-grå Svagt Svagt R. (1-9-10) gul-orange gul-orange (2-9-9) (2-9-9) 10

Fysiologiske egenskaber

De fysiologiske egenskaber ved de omhandlede stammer er angivet i tabel 3. Undersøgelsen for melanoidpigmentdan- nelse udførtes på følgende tre substrater: I o

Substrat 1: Trypton-gærekstraktbouillon (ISP 1);

Substrat 2: Pepton-gærekstrakt-jernagar (ISP 6);

Substrat 3: Tyrosinagar (ISP 7).

20 25 30 35 13

DK 159328 B

TABEL 3

FERM FERM FERM

P-6181 P-6182 P-6183 5 -------

Nitratreduktion -

Stivelseshydrolyse -

Urinstofnedbrydning + - +

Lysozymresistens + 10 Melanoidpigment- dannelse

Substrat 1 -

Substrat 2 Substrat 3 15 Syreproduktion fra

Arabinose + - +

Xylose + - +

Raffinose + - NG

20 - negativ + = positiv NG « ingen vækst

Nedbrydning af kulhydrater 25

De omhandlede stammers nedbrydning af kulhydrater er angivet i tabel 4. Det anvendte substrat var Pridham-Gottlieb agar (ISP 9) og bestemmelsen foretoges efter dyrkning i 14 dage ved 28 °C.

30 35 TABEL 4 14

DK 159328 B

FERM FERM FERM

P-6181 P-6182 P-6183 5 D-Glucose + + + D-Arabinose + - + D-Xylose + - + D-Fructose + + + 10 L-Rhamnose + - +

Inositol + + +

Sacharose +

Raffinose + D-Mannitol + + + 15 Kontrol - - - + = forbrugt + = let forbrugt 20 - * ikke forbrugt

Analyse af cellevæg

Der udførtes papirchromatografiske analyser på syrehydro-25 lysater af hver af de tre omhandlede stammer således som beskrevet af B. Becker et al. [Applied Microbiology, 13, 236 (1965) og i M.P. Lechevalier et al. [The

Actinomycetales af H. Prauser, 311 (1970)]. Meso-2,6- diaminopimelinsyre fandtes i cellevæggene, og arabinose 30 og galactose fandtes som saccharidkomponenter i de hele celler, hvilket bekræftede, at hver af stammerne havde cellekomponenter af typen IV-A.

Resultaterne af disse taxonomiske undersøgelser viser, at 35 alle stammer hører til slægten Nocardia. Blandt de kendte arter af Nocardia, er egenskaberne ved de omhandlede stammer nærmest beslægtet med egenskaberne hos Nocardia 15

DK 159328 B

autotrophica [International Journal of Systematic Bacteriology, 30, 337 (1980)], bortset fra de i tabel 5 angivne forskelle. I tabellen er symboler og forkortelser som angivet i tabellerne 1-4.

5 TABEL 5 FERM FERM FERM Nocardia

Forsøg P-6181 P-6182 P-6183 autotrophica

Hvid Hvid til Hvid til Hvid til 10 AM. svagt brunlig- svagt gul Vækst- gul-orange grå farver G. Gullig- Grålig-gul Brun- Svagt gul grå til brun violet til gulligsvagt grå gul- 15 _orange___

Nedbrydning af + - + + urinstof

Resistens over for - + - 20 lysozym

Syrepro duktion fra: arabinose + - + + xylose + - + + raffinose + - NG - 25 ___

Forbrug af: arabinose + - + + xylose + - + + rhamnose + + + saccharose + - - + raffinose + - - + 30 --------- - 35

DK 159328 B

16

Stammen FERM P-6181 og Nocardia autotrophica ligner hinanden med hensyn til deres morphologiske, dyrkningsmæssige og fysiologiske egenskaber, og det konkluderedes derfor, at denne stamme hører til species Nocardia autotro-phia.

5

Stammen FERM P-6182 er forskellige fra Nocardia autotrophica med hensyn til urinstofnedbrydning, resistensen overfor lysozym, og syreproduktionen udfra kulhydrater og nedbrydningen af kulhydrater. Imidlertid er disse forskelle ikke tilstrækkelige til, at stammen FERM P-6182 10 kan betragtes som en ny species; den betragtes derfor som en subspecies af Nocardia autotrophica. Denne stamme be-nævntes derfor Nocardia autotrophia subspecies canberrica subspecies nov..

15

Stammen FERM P-6183 var forskellige fra Nocardia autotrophica med hensyn til vækstfarven og nedbrydningen af rhamnose, saccharose og raffinose. Disse forskelle var ligeledes heller ikke tilstrækkelige til, at stammen kan betragtes som en ny speies, og den betragtes derfor som 20 en subspecies af Nocardia autotrophica. Den betegnes Nocardia autotrophica subspecies amethystina subspecies nov..

Som det gælder for alle mikrobiologiske stammer, er de 25 omhandlede stammer FERM P-6181, FERM P-6182 og FERM P-6183 ustabile med hensyn til deres egenskaber, og de mu-terer let ved hjælp af kunstigt muterende midler som f.eks. ultraviolet bestråling, højfrekvente elektromagnetiske bølger, atombestråling og kemisk muterende midler.

30 Eventuelle opnåede mutanter udfra disse stammer, og som er i besiddelse af de ønskede egenskaber, kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Blandt de forskellige mikroorganismer af slægten Nocar-35 dia, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindel-

DK 159328 B

17 sen, foretrækkes specielt at anvende de tre omhandlede stammer, dvs. Nocardia autotrophia FERM P-6181, Nocardia autotrophica, subsp. canberrica FERM P-6182 eller Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183.

5

Den omhandlede enzymatiske hydrolysemetode kan udføres ved at bringe ML-236B forbindelsen i kontakt med den udvalgte mikroorganisme af slægten Nocardia eller med en cellefri, enzymholdig ekstrakt heraf.

10

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres fortrinsvis på en af følgende tre måder: (a) udgangsforbindelsen ML-236B sættes til dyrkningssub- 15 stratet under dyrkningen af de omdannede mikroorga nismer, og omdannelsen foregår herefter samtidig med dyrkningen; (b) en kultur af de omdannende mikroorganismer høstes, og 20 de indhøstede celler bringes i kontakt med udgangs- ML-236B forbindelsen; eller (c) der fremstilles en cellefri, enzymholdig ekstrakt udfra cellerne af de omdannende mikroorganismer, og

25 denne ekstrakt bringes i kontakt med udgangs-ML-236B

forbindelsen.

Dyrkningen af de omdannende mikroorganismer af slægten Nocardia kan udføres på sædvanlig måde i almindelige 30 dyrkningssubstrater, der indeholder næringsstoffer, der er velkendte til anvendelse for sådanne mikroorganismer.

Det er således velkendt, at et sådant dyrkningssubstrat indeholder kilder for assimilerbart carbon og assimiler-bart nitrogen og ofte uorganiske salte. Eksempler på 35 assimilerbare carbonkilder omfatter glucose, saccharose, stivelse, glycerol, hirsegelé, melasse og sojabønneolie. Eksempler på assimilerbare nitrogenkilder omfatter faste 18

DK 159323 B

materialer fra sojabønner (herunder formalede sojabønner og sojabønnemel), hvedekim, kødekstrakt, pepton, majsstøbevæske, tørret gær og ammoniumsalte som f.eks. ammoniumsulfat. Dersom det er nødvendigt, kan også uorganiske 5 salte som f.eks. natriumchlorid, kaliumchlorid, calcium-carbonat eller -phosphater være tilsat. Eventuelt kan også andre additiver, der er i stand til at fremskynde produktionen af de hydroxylerende enzymer, anvendes i passende kombinationer. Den specielt anvendte dyrknings-10 metode er ikke kritisk for den omhandlede fremgangsmåde, og almindeligt anvendte metoder, der anvendes til dyrkning af mikroorganismer, kan ligeledes anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Naturligvis vil den anvendte metode være afhængig af den industrielle effek-15 tivitet. Således foretrækkes sædvanligvis flydende kulturer, og dybdedyrkningsmetoder er de mest bekvemme at anvende set udfra et industrielt synspunkt.

Dyrkningen udføres sædvanligvis under aerobe betingelser 20 og ved en temperatur inden for området fra 20 til 37 °C, fortrinsvis fra 26 til 28 °C.

Fremgangsmåden (a) udføres ved at sætte udgangs-ML-236B forbindelsen til dyrkningssubstratet under dyrkningen.

25 Det nøjagtige tidspunkt under dyrkningen, hvor udgangs-forbindelsen tilsættes, varierer afhængig af dyrkningsudstyret, substratets sammensætning, dyrkningssubstratets temperatur og andre faktorer, men fortrinsvis tilsættes på det tidspunkt, hvor mikroorganismernes hydroxylerings-30 evne begynder at stige, og dette er sædvanligvis to eller tre dage efter starten af mikroorganismernes dyrkning.

Den tilsatte mængde ML-236B forbindelse er fortrinsvis fra 0,01 til 5,0 vægt-% af substratet, foretrukkent fra 0,05 til 0,5% f.eks. fra 0,05 til 0,1 vægt-%. Efter til-35 sætning af ML-236B forbindelsen fortsætter dyrkningen aerobt, normalt ved en temperatur indenfor det ovenfor foreslåede temperaturområde. Dyrkningen fortsættes nor-

DK 159328 B

19 malt i et tidsrum på fra tre til fem dage efter tilsætningen af ML-236B forbindelsen.

Ved fremgangsmåde (b) udføres mikroorganismernes dyrkning 5 først under sådanne betingelser, at der opnås maksimal hydroxylerende evne; denne evne når sædvanligvis sit maksimum mellem fire og fem dage efter dyrkningens start, skønt tidsrummet kan variere afhængigt af arten og temperaturen af substratet, af mikroorganismearten og andre 10 faktorer. Kulturens hydroxyleringsevne kan kontrolleres ved at udtage prøver af kulturen med passende mellemrum, bestemme hydroxyleringsevenen af prøven ved at bringe den i kontakt med en ML-236B forbindelse under standardbetingelser og måle mængden af fremstillet M-4- og M-4'-for-15 bindelse og aftegne denne evne overfor tiden i en kurve.

Dersom hydroxyleringsevnen har nået sit maksimumpunkt, stoppes dyrkningen, og de mikrobielle celler indsamles.

Dette kan ske ved at centrifugere kulturen, ved filtrering eller ved andre kendte adskillelsesmetoder. De hele 20 celler fra den dyrkede mikroorganisme indhøstes på denne måde, vaskes fortrinsvis med en passende vaskevæske som f.eks. fysiologisk saltvand eller en passende pufferopløsning .

25 Kontakt mellem de indsamlede celler af mikroorganismerne af slæten Nocardia og ML-236B forbindelsen udføres sædvanligvis i et vandigt substrat, f.eks. i en phosphatpuf-feropløsning med en pH-værdi på fra 5 til 9. Reaktionstemperaturen er fortrinsvis indenfor området fra 20 til 30 45 °C, foretrukkent fra 25 til 30 °C. ML-236B forbindel sens koncentration i reaktionssubstratet er fortrinsvis inden for området 0,01 til 5,0 vægt-%. Den nødvendige reaktionstid er fortrinsvis fra 1 til 5 dage, skønt denne kan variere afhængig af ML-236B forbindelsens kon-35 centration i reaktionsblandingen, reaktionstemperaturen, mikroorganismernes hydroxyleringsevne (der naturligvis kan variere fra art til art og også, som omtalt ovenfor,

DK 159328 B

20 afhænger af dyrkningstiden) og andre faktorer.

Den cellefri, enzymholdige ekstrakt anvendt ved fremgangsmåde (c) kan fås ved at nedbryde de hele mikroorga-5 nismeceller, der er fremstillet som beskrevet under fremgangsmåde (b), ved hjælp af fysiske eller kemiske metoder, f.eks. ved formaling eller ved ultralydbehandling, hvorved der fås en nedbrudt cellemasse eller ved behandling med overfladeaktive midler eller et enzym, hvorved 10 der fås en cellulær opløsning. Den opnåede cellefri ekstrakt bringes herefter i kontakt med udgangs-ML-236B forbindelsen under samme betingelser som beskrevet for fremgangsmåde (b) ovenfor.

15 Efter at omdannelsen er foretaget og afsluttet ved hjælp af en af de ovenfor nævnte fremgangsmåder, kan den ønskede forbindelse isoleres direkte, fraskilles eller renses ved hjælp af almindelige metoder. F.eks. kan fraskillelse og rensning udføres ved at filtrere reaktionsblandingen, 20 ekstrahere det opnåede filtrat med et vandblandbart organisk opløsningsmiddel (som f.eks. ethylsulfat), afdestillere opløsningsmidlet fra ekstrakten, behandle den opnåede urensede forbindelse med søjlekromatografi (f.eks. på silicagel eller aluminiumoxid) og eluere søjlen med et 25 passende elueringsmiddel.

Dersom den fremstillede M-4- og M-4'-forbindelse omdannet ved hjælp af mikroorganismerne ikke er i den ønskede form, kan produktet opnået ved omdannelsen underkastes en 30 eller flere omsætninger som f.eks. hydrolyse, saltdannelse, esterificering eller latonisering ved almindelige fremgangsmåder, der er beskrevet detaljeret nedenfor. Sådanne yderligere omsætninger kan udføres inden, efter, eller under fraskillelsen og oprensningen beskrevet oven-35 for, fortrinsvis i løbet af disse behandlinger.

DK 159328B

21

Hydroxyleringsenzymet aktivt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen har ingen virkning i sig selv på carb-oxygruppen i ML-236B forbindelsen, og derfor vil, når andre faktorer er lige, ML-236B lacton give M-4- og/eller 5 M-4'-lacton, ML-236B carboxylsyre vil give M-4- og/eller M-4'-carboxylsyre og et salt eller ester af ML-236B carboxylsyre vil give det samme salt eller ester af M-4-og/eller M-4'-carboxylsyre. Imidlertid kan begge påvirkes af andre faktorer, specielt af reaktionsblandingens pH-10 værdi, på en måde, der er forudsigelig ifølge de almindelige kemiske love.

ML-236B udgangsforbindelsen kan være den frie ML-236B carboxylsyre med formlen II, dens tilsvarende lacton med 15 formlen Ila eller et salt eller en alkylester heraf, som defineret i krav 1. Foretrukne salte er Na-, K- og Ca-saltene.

ML-236B estere f.eks. methyl-, ethyl-, propyl-, iso-20 propyl-, butyl-, isobutyl eller pentylester, hvoriblandt methylesteren foretrækkes.

Blandt ML-236B udgangsmaterialerne er alkalimetalsaltene f.eks. natrium- eller kaliumsaltene særligt foretrukne, 25 idet natriumsaltet er de mest foretrukne, da de har vist sig, at det giver den bedste omdannelse af ML-236B forbindelsen til den ønskede M-4- eller M-4'-forbindelse.

Dersom den fremstillede forbindelse ved hjælp af den om-30 handlede enzymatiske hydroxyleringsproces er et salt af carboxylsyren med formlen I, kan selve den frie carboxylsyre opnås ved at indstille filtratets pH til 4 eller herunder, fortrinsvis fra 3 til 4. En hvilken som helst organisk syre eller mineralsyre kan anvendes, forudsat at 35 den ikke har nogen uheldig virkning på den ønskede forbindelse. Eksempler på de mange syrer, der er velegnede, omfatter trifluoreddikesyre, eddikesyre, saltsyre og

DK 159328 B

22 svovlsyre. Carboxylsyren kan selv være den Ønskede forbindelse eller den kan, og dette foretrækkes, omdannes ved en række reaktioner beskrevet nedenfor, eventuelt efter behandlinger som f.eks. ekstraktion, vask og dehy-5 dratisering.

Metalsalte af carboxyl syrerne med formlen I kan fås ved at bringe et hydroxid, carbonat eller lignende reaktiv forbindelse af det pågældende salt i et vandigt opløs-10 ningsmiddel i kontakt med carboxylsyren med formlen I.

Det anvendte vandige opløsningsmiddel er fortrinsvis vand eller det kan være en blanding af vand med et organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis en alkohol (som f.eks. methanol eller ethanol), en keton (som f.eks. acetone), en 15 alifatisk carbonhydrid (som f.eks. hexan) eller en ester (som f.eks. ethylacetat). Det foretrækkes at anvende en blanding af et hydrofilt organisk opløsningsmiddel med vand. Disse omsætninger udføres sædvanligvis ved stuetemperatur, men de kan eventuelt gennemføres under opvarm-20 ning.

C^-g alkylestere af carboxylsyrerne med formel I kan fås ved at bringe carboxylsyren med formlen I i kontakt med en passende alkohol. Det foretrækkes at udføre omsæt-25 ningen i nærværelse af en syrekatalysator som f.eks. en mineralsyre (som saltsyre eller svovlsyre), en Lewis-syre (f.eks. bortrifluorid) eller en ionbytterharpiks. Det anvendte opløsningsmiddel ved denne reaktion er ikke kritisk, forudsat at det ikke har uheldig indvirkning på 30 reaktionen; passende opløsningsmidler omfatter benzen, chloroform og ethere. Alternativt kan den ønskede forbindelse fås ved at bringe carboxylsyren med formel I i kontakt med diazoalkan, i hvilken alkandelen kan være substitueret eller usubstitueret. Denne omsætning udføres 35 sædvanligvis ved at bringe syren i kontakt med en ether-opløsning af diazoalkan. Som et yderligere alternativ kan esteren fås ved at bringe et metalsalt af carboxylsyren 23

DK 159328 B

med formlen I i kontakt med et halogenid, fortrinsvis et alkylhalogenid, i et passende opløsningsmiddel; foretrukne opløsningsmidler omfatter dimethylformamid, tetrahy-drofuran, dimethylsulfoxid og acetone. Alle omsætningerne 5 til fremstilling af estere Udføres fortrinsvis ved omkring stuetemperatur, skønt man afhængigt af reaktionssystemets art, eventuelt kan udføre omsætningen under opvarmning .

10 Lactoner af carboxyl syrerne med formlen I kan fås ved at bringe carboxylsyren med formlen I i kontakt med en katalytisk mængde af en syre, der kan være organisk eller uorganisk. Det foretrækkes at anvende organiske syrer og mineralsyrer som f.eks. trifluoreddikesyre, saltsyre og 15 svovlsyre. Denne omsætning udføres ligeledes fortrinsvis ved stuetemperatur.

Eksempler på de omhandlede salte og estere af M-4- og M-4'-forbindelserne omfatter de ovenfor som salte og estere 20 ML-236B angivne, der anvendes som udgangsmateriale.

De således fremstillede M-4- og M-4'-derivater kan isoleres, fraskilles og renses ved almindelige metoder f.eks. ved adsorption på et bærestof (som f.eks. aktivt kul el-25 ler silicagel) eller ved ionbytterkromatografi eller gel-filtrering på en Sephadex søjle eller ved ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel som f.eks. en ether, ethylacetat eller chloroform; eventuelt, og dette er almindeligt, anvendes en kombination af disse metoder.

30 M-4- og M-4'-isomererne kan skilles fra hinanden enten efter omdannelsen er fuldført eller på et hvilket som helst passende punkt under omsætningerne eller under de ovenfor nævnte adskillelses- eller rensningsprocesser.

Opfindelsen illustreres nærmere i de nedenfor angivne eksempler.

35

DK 159328 B

24 EKSEMPEL 1

Celler af Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183 udsåedes fra en skråagarkultur ved hjælp af en 5 platinøse i tyve 500 ml Erlenmeyer kolber, der hver indeholder 100 ml dyrkningssubstrat med følgende sammensætning (procenterne er vægt/volumen):

Glucose 1,0% 10 Pepton 0,2% Kødekstrakt 0,1% Gærekstrakt 0,1%

Maj sstøbevæske 0,3%

Postevand resten 15 (pH ikke indstillet)

Dyrkning under rystning udførtes herefter ved 26 °C og 220 omdrejninger pr. minut i to dage, på hvilket tidspunkt natrium ML-236B carboxylat tilsattes til en slut-20 koncentration på 0,05 vægt/rumfang-%. Inkuberingen fortsatte ved 26 °C og 220 omdrejninger pr. minut i yderligere fem dage.

Efter dyrkningen var ophørt, filtreredes reaktionsblan-25 dingen, og filtratets pH indstilledes til 3 ved tilsætning af trifluoreddikesyre. Herefter ekstraheredes det syrnede filtrat tre gange med 1 liter ethylacetat pr.

gang, hvorved der opnåedes ekstrakter indeholdende en blanding af M-4-carboxylsyre og M-4'-carboxylsyre. Prøver 30 af disse ekstrakter udtoges og underkastedes tyndtlags-kromatografi på en silicagelplade Art 5715 (fremstillet af Merck & Co., Inc.) fremkaldt med en 50:50:3 rumfangsblanding af benzen, acetone og eddikesyre. Rf-værdien af M-4-carboxylsyre var 0,45, og Rf-værdien af M-4'-carb-35 oxylsyre var 0,46.

25

DK 159328 B

Hele resten af ekstrakten vaskedes med en mættet opløsning af natriumchlorid, hvorefter der tilsattes en ækvi-molær mængde, af en etheropløsning af diazomethan ved stuetemperatur. Blandingen henstod 30 minutter, hvorefter 5 den inddampedes til tørhed under reduceret tryk.

Remanensen anbragtes på en "Lobar" søjle (Si 60, fremstillet af Merck & Co., Inc. størrelse A), der herefter elueredes med en 1:1 rumfangsblanding af benzen og ethyl-10 acetat. Der opnåedes adskilte fraktioner indeholdende me-thyl-M-4-carboxylat og methyl-M-4'-carboxylat. Disse fraktioner koncentreredes ved inddampning under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 320 mg methyl-M-4-carboxylat og 11 mg methyl-M-4'-carboxylat begge i form af farveløse 15 olier.

Ved at erstatte diazomethanen i fremgangsmåden beskrevet ovenfor med andre passende diazoalkaner, kan der opnås andre estere af M-4-carboxylsyre og M-4'-carboxylsyre.

20

Fysiske egenskaber af methyl-M-4-carboxylat.

Kernemagnetisk resonansspektrum (i deuterochloroform, under anvendelse af tetramethylsilan som den indre standard 25 ved 200 MHz), 6 ppm: 30 35

DK 159328 B

26 0,88 (3H, triplet, J = 7,3 Hz); 0,89 (3H, doublet, J = 6,5 Hz); 1,12 (3H, doublet, J = 6,8 Hz); 1,1-1,7 (10H, multiplet); 5 2,34 (IH, sextet, J = 7 Hz); 2,3-2,5 (2H, multiplet); 2,49 (2H, doublet, J = 6,4 Hz); 2,58 (IH, multiplet); 3,72 (3H, singlet); 10 3,78 (IH, multiplet); 4,25 (IH, kvintet, J = 7 Hz); 4,40 (IH, multiplet); 5,42 (IH, multiplet); 5,56 (IH, multiplet); 15 5,90 (IH, dobbelte doubletter, J = 9,8 og 5,6 Hz); 5,99 (IH, doublet, J = 9,8 Hz).

Massespektrum 20 Efter silylering med N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoracet- amid foretoges målinger under anvendelse af et D-300 type instrument fremstillet af Nihon Electronic Co.

M/e: 654 (M+), 552, 462, 372, 290, 272, 233, 231.

25

Ultraviolet absorptionsspektrum (ethanol) ,vmaxnm: 230,1, 237,3, 246,2.

Infrarødt absorptionsspektrum (tynd film) i'inaxcm ; 3400, 30 2950, 1730.

Tyndtlagskromatografi

Kromatografien foretoges på en silicagelplade Art 5715 35 fremstillet af Merck & Co., Inc. under anvendelse af 1:1 rumfangsblanding af benzen og acetone som fremkaldermiddel .

DK 159328 B

27

Rf-værdi: 0,88.

Fysiske egenskaber af methyl-M-4'-carboxylat.

5 Kernemagnetiske resonansspektrum (i deuterochloroform, under anvendelse af tetramethylsilan som den indre standard ved 60 MHz), δ ppm: 3,70 (3H, singlet); 10 5,50 (IH, bred singlet); 5,75 (IH, bred singlet); 5,90 (IH, kvartet); 6,01 (IH, doublet).

15 Ultraviolet absorptionsspektrum (ethanol) Kraaxnm: 230, 238, 246.

Infrarødt absorptionsspektrum (tynd film) » -,σιιΓ1: 3400, ΙΠαΧ 1730.

20

Massespektrum

Efter silylering med N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoracet-amid foretoges målinger under anvendelse af et D-300 25 type instrument fremstillet af Nihon Electronic Co.

M/e: 654 (M+)

Analyse beregnet for C24H38®7: 30 C 65,73 %, H 8,73 %

Fundet: C 65,66 %, H 8,79 % EKSEMPEL 2 35 Fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 gentoges, hvorved opnåedes 1,9 liter af en omdannelsesreaktionsblanding. Blandingens pH indstilledes herefter til 3,0 ved tilsæt

DK 159328 B

28 ning af trifluoreddikesyre, hvorefter blandingen ekstra-heredes tre gange, hver gang med 1 liter ethylacetat, hvorved der opnåedes en fraktion, der indeholdt M-4-carb-oxylsyre og M-4'-carboxylsyre.

5

Denne ekstrakt vaskedes herefter med en mættet opløsning af natriumchlorid, hvorefter der tørredes over vandfrit natriumsulfat. En katalytisk mængde trifluoreddike tilsattes herefter for at udvirke lactonisering. Den frem-10 stillede blanding vaskedes herefter med 5 vægt/rumfang-% vandig opløsning af natriumhydrogencarbonat, hvorefter der tørredes over vandfrit natriumsulfat og inddampedes til tørhed, hvorved der opnåedes en lactonfraktion.

15 Denne lactonfraktion anbragtes på en Lobarsøjle (Si 60, fremstillet af Merck & Co., Inc. størrelse A), og der elueredes med en 7:3 rumfangsblanding af benzen og acetone, hvorved der opnåedes adskilte fraktioner indeholdende M-4-lacton og M-4'-lacton. Disse fraktioner omkrystalli-20 seredes hver for sig med ethylacetat, hvorved der opnåedes 270 mg M-4-lacton og 8 mg M-4'-lacton.

Fysiske egenskaber af M-4-lacton 25 Kernemagnetiske resonansspektrum (i deuterochloroform, under anvendelse af tetramethylsilan som den indre standard ved 100 MHz), 6 ppm: 4,38 (IH, multiplet); 30 4,41 (IH, multiplet); 4,62 (IH, multiplet); 5,41 (IH, multiplet); 5,58 (IH, multiplet); 5,90 (IH, kvartet); 35 6,01 (IH, doublet).

29 DK 159328 B

Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol) ,vmaxnm: 230, 236,7, 244,6.

Infrarødt absorptionsspektrum (tynd film) ^^cm : 3400, 5 2950, 1725.

Tyndt1agskromatografi På en silicagelplade Art 5715 fremstillet af Merck & Co., 10 Inc. foretoges kromatografi under anvendelse af en 50:50:3 rumfangsblanding af benzen, acetone og eddikesyre som fremkalderopløsningsmidlet.

Rf-værdi: 0,62.

15 M-4*-1actons fysiske egenskaber.

Kernemagnetiske resonansspektrum (i deuterochloroform, under anvendelse af tetramethylsilan som den indre stan-20 dard ved 100 MHz), δ ppm: 4,25 (IH, multiplet); 4,60 (IH, multiplet); 5,50 (IH, multiplet); 25 5,75 (IH, multiplet); 5,90 (IH, kvartet); 6,01 (IH, doublet).

Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol) λ nm: 230,

IUctX

30 237, 245.

Infrarødt absorptionsspektrum (KBr) l,rnaycm~^': 3500, 1720.

Massespektrum M/e: 406 (M+), 304, 286.

35

DK 159328 B

30

Optisk drejning [a]22 = +310,9° (c = 0,66 methanol).

D

5 Smeltepunkt 141-143 °C

Analyse beregnet for C23H34°6: C 67,95 %, H 8,43 %

Fundet: C 68,05 %, H 8,37 % 10

Tyndtlagskromatografi

Kromatografi foretoges på silicagelplader Art 5715 fremstillet af Merck & Co., Inc. under anvendelse af 1:1 rum-15 fangsblanding benzen og acetone som fremkalderopløs ningsmiddel .

Rf-værdi: 0,64.

20 EKSEMPEL 3

Fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 gentoges til og med ekstraktionen med tre portioner ethylacetat, hvorved der opnåedes en ekstrakt indeholdende både M-4-carboxylsyre 25 og M-4'-carboxylsyre.

Denne ekstrakt overførtes herefter straks til en 5 vægt/rumfang-% vandig opløsning af natriumhydrogencarbo-nat, og blandingens pH indstilledes til 7,0 ved tilsæt-30 ning af 2N saltsyre. Blandingen absorberedes herefter på en "Dianion" HP-20 søjle (fremstillet af Mitsubishi Chemical Industries). Søjlen vaskedes med vand og elueredes herefter med 60 rumfang-% vandig acetone, hvorved der opnåedes en fraktion indeholdende natrium M-4-carboxylat.

35 Denne frysetørredes, hvorved der opnåedes 200 mg natrium M-4-carboxylat.

31

DK 159328 B

Natrium M-4-carboxylats fysiske egenskaber

Kernemagnetiske resonansspektrum (i deuterochloroform, under anvendelse af tetramethylsilan som den indre stan-5 dard ved 200 MHz), 6 ppm: 0,91 (3H, triplet, J = 7,5 Hz); 0,92 (3H, doublet, J = 7 Hz); 1,12 (3H, doublet, J = 7 Hz); 10 1,1-1,8 (10H, multiplet); 2,25 (IH, dobbelt doubletter, J » 15 & 7,6 Hz); 2,34 (IH, dobbelt doubletter, J = 15 & 5,5 Hz); 2,2-2,4 (3H, multiplet); 2.48 (IH, multiplet); 15 3,68 (IH, multiplet); 4,07 (IH, multiplet); 4,28 (IH, multiplet); 5,36 (IH, multiplet); 5.48 (IH, dobbelt doubletter, J = 3 & 2 Hz); 20 5,88 (IH, dobbelt doubletter, J = 9,6 & 5,3 Hz); 5,98 (IH, doublet, J = 9,8 Hz).

Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol) Kmaxnm: 230,0, 237,2, 245,0.

25

Infrarødt absorptionsspektrum (KBr) »magcm : 3400, 3900, 1725, 1580.

Tyndtlagskromatografi 30

Kromatografien foretoges på silicagelplader Art 5715 fremstillet af Merck & Co., Inc. under anvendelse af en 50:50:3 rumfangsblanding af benzen, acetone og ethylace-tat som fremkaldelsesopløsningsmiddel.

Rf-værdi: 0,45.

35

DK 159328 B

32 EKSEMPEL 4

Fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 1-3 gentoges under anvendelse af stammen Nocardla autotrophica FERM P-6181 i 5 stedet for Nocardla autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183; der opnåedes: 150 mg methyl-M-4-carboxylat; 37 mg methyl-M-4'-carboxylat; 140 mg M-4 lacton; 30 mg M-4'-lacton og 110 mg natrium-M-4-carboxylat. I hvert tilfælde havde forbindelserne samme egenskaber som de respektive 10 forbindelser fremstillet i eksemplerne 1-3.

EKSEMPEL 5

En øskenfuld af en kultur af Nocardia autotrophica subsp.

15 canberrica FERM P-6182 udsåedes i 20 500 ml Erlenmeyer-kolber, der hver indeholdt 100 ml af et substrat med følgende sammensætning (procenter i vægt/rumfang):

Glycerol 0,5% 20 Saccharose 2,0%

Sojabønnemel 1,0%

Pressegær 1,0%

Maj sstøbevæske 0,001%

Postevand resten 25 (pH 7,0)

Dyrkning af kulturen under rystning fortsatte ved 26 °C og 220 omdrejninger pr. minut i to dage, på hvilket tidspunkt natrium-ML-236B tilsattes til en slutkoncentration 30 på 0,05 vægt/rumfang-%. Derefter fortsattes dyrkningen ved 26 °C og 220 omdrejninger pr. minut i yderligere fem dage.

Omdannelsesreaktionsblandingen filtreredes herefter, og 35 filtratets pH indstilledes til 3,0 ved tilsætning af saltsyre. Dernæst ekstraheredes blandingen tre gange hver gang med 1 liter ethylacetat, hvorved der opnåedes en

DK 159328 B

33 ekstrakt indeholdende M-4-carboxylsyre og M-4'-carboxylsyre, der ved tyndtlagskromatografi viste sig at være identisk med de respektive forbindelser fra eksempel 1.

5 Denne ekstrakt behandledes herefter yderligere som beskrevet i eksempel 1, hvorved der opnåedes 180 mg methyl-M-4-carboxylat og 110 mg methyl-M-4*-carboxylat.

EKSEMPEL 6 10

Fremgangsmåden i eksempel 5 gentoges til og med fremstillingen af ekstrakten indeholdende M-4-carboxylsyre og M-4'-carboxylsyre. Denne ekstrakt behandledes dernæst som beskrevet i eksempel 2, hvorved der opnåedes 170 mg M-4- 15 lacton og 90 m g M-4'-lacton.

EKSEMPEL 7

En øskenfuld af en kultur af Nocardia autotrophica subsp.

20 amethystina FERM P-6183 udsåedes i 10 500 ml Erlenmeyer-kolber, der hver indeholdt 100 ml af et substrat med følgende sammensætning (procenter i vægt/rumfang):

Glucose 1,0% 25 Pepton 0,2% Kødekstrakt 0,1% Gærekstrakt 0,1%

Postevand resten (pH ikke indstillet).

30

Dyrkning af kulturen under rystning foretoges herefter ved 26 “C og 220 omdrejninger pr. minut i 5 dage, hvorefter de hele celler centrifugeredes fra. Cellerne vaskedes med en 0,1 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0) og op-35 samledes herefter atter og opslæmmedes i 900 ml 0,1 M phosphatpufferopløsning. Til denne suspension sattes na-trium-ML-236B carboxylat til en koncentration på 0,5

DK 159328 B

34 g/100 ml, og blandingen inkuberedes ved 26 “C og 220 omdrejninger pr. minut i fem dage. Herefter filtreredes blandingen, og pH-værdien indstilledes til 3,0 ved tilsætning af saltsyre. Dernæst ekstraheredes blandingen tre 5 gange med 1 ml ethylacetat pr. gang. Herved opnåedes en ekstrakt indeholdende M-4-carboxylsyre og M-4'-carboxylsyre, der ved tyndtlagskromatografi vist sig at være de samme som de respektive forbindelser i eksempel 1.

10 EKSEMPEL 8

Fremgangsmåden i eksempel 2 gentoges bortset fra at mikroorganismerne anført i tabel 6 anvendtes; mængden af fremstillet M-4-lacton er angivet i tabellen.

15 TABEL 6 Mængde (mg)

Mikroorganisme af M-4 lacton 20---

Nocardia asteroides ATCC 3318 7

Nocardia coeliaca ATCC 17040 5

Nocardia autotrophica IFO 12743 10

Nocardia asteroides IFO 3424 15 25 - EKSEMPEL 9

Celler af Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM 30 P-6183 udsåedes fra en skråagarkultur ved hjælp af en platinøsken i hver af 20 500 ml Erlenmeyer-kolber, der hver indeholdt 100 ml dyrkningssubstrat med sammensætningen angivet i eksempel 7. Dyrkning under rystning udførtes herefter ved 26 °C og 220 omdrejninger pr. minut i to 35 dage, hvorefter natrium-ML-236B carboxylat tilsattes til en slutkoncentration på 0,4 vægt/rumfang-%. Inkuberingen fortsattes yderligere fem dage ved 26 “C og 220 omdrej- 35

DK 159328 B

ninger pr. minut. Herefter gentoges fremgangsmåden beskrevet i eksempel 2, hvorved der opnåedes 2,9 g M-4-lacton.

5 10 15 20 25 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser med 5 formel I ΗΟΟΟ-^ν·"“ΟΗ 10 hq ,KH (I) HCr hvori OH betegner < OH eller OH, eller disses farmaceutisk acceptable alkalimetal- eller jordalkalime-20 talsalte og C^-Cg alkylestere eller de tilsvarende ringsluttede lactoner, kendetegnet ved, at man bringer en ML-236B forbindelse valgt blandt ML-236B carboxylsyre med formel XI 25 „OH HOOcr^‘ naJ IX k H ®

30 H3CT 0 h j CHaAlA^ og alkalimetal- og jordalkalimetalsalte og C^-Cg alkylestere heraf og den tilsvarende ML-236B lacton med form- 35 DK 159328 B len 11a °υύ°η s? X H3C/^pA'9 η%Η (π°) i kontakt med et hydroxylerende enzym frembragt af en mi-15 kroorganisme af slægten Nocardia; at man eventuelt underkaster den fremstillede forbindelse én eller flere reaktioner valgt blandt hydrolyse, saltdannelse, esterifice-ring og lactonisering; og at man isolerer forbindelsen fra reaktionsblandingen. 20

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ML-236B forbindelsen bringes i kontakt med enzymet ved at dyrke en mikroorganisme af slægten Nocardia i et substrat indeholdende ML-236B forbindelsen. 25

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ML-236B forbindelsen bringes i kontakt med enzymet ved at bringe hele celler af mikroorganismer af slægten Nocardia i kontakt med ML-236B forbindelsen. 30

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ML-236B forbindelsen bringes i kontakt med enzymet ved at bringe forbindelsen i kontakt med en cellefri, enzymholdig ekstrakt af mikroorganismer af slægten Nocar- 35 dia. DK 159328 B

5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, kendetegnet ved, at mikroorganismen hører til en af arterne Nocardia autotrophica, Nocardia asteroides og Nocardia coeliaca. 5

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at mikroorganismen er valgt blandt: Nocardia autotrophica FERM P-6181 10 Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182 Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183 Nocardia autotrophica IFO 12743 Nocardia asteroides IFO 3424 Nocardia asteroides ATCC 3318 og 15 Nocardia coeliaca ATCC 17040

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at mikroorganismen er valgt blandt:

20 Nocardia autotrophica FERM P-6181 Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182 Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183 Nocardia autotrophica IFO 12743 og Nocardia asteroides IFO 3424. 25

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at mikroorganismen er valgt blandt: Nocardia autotrophica FERM P-6181 30 Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182 og Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183.

9. Fremgangsmåde ifølge et vikårligt af kravene 1-8, kendetegnet ved, at der fremstilles en M-4 35 forbindelse hvori OH betegner < OH. DK 159328B

10. Fremgangsmåde ifølge et vikårligt af kravene 1-8, kendetegnet ved, at der fremstilles en M-4' forbindelse hvori OH betegner OH.

11. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-10, kendetegnet ved, at natriumsaltet af forbindelsen med formlen I fremstilles. 10 15 20 25 30 35