NL194373C

NL194373C - Werkwijze voor de bereiding van 3-hydroxy-ML-236B derivaten, bekend als M-4 en M-4'.

Info

Publication number: NL194373C
Application number: NL8204505A
Authority: NL
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1981-11-20
Filing date: 1982-11-19
Publication date: 2002-02-04
Also published as: FI823978A0; DE3242849A1; FR2516935A1; ES8402350A1; DK516182A; AU551720B2; AT387585B; IT8268359A0; GB2111052A; US4537859A; KR840002451A; ES517542A0; DK159328C; JPS5889191A; CH651065A5; ATA425182A; FR2516935B1; AU9061082A; SE453996B; FI70925C

Description

1 194373

Werkwijze voor de bereiding van 3-hydroxy-ML-236B derivaten, bekend als M-4 en M-4'

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van bepaalde 3-hydroxy-ML-236B derivaten, bekend als M-4 en M-4', alsmede zouten en esters van deze verbindingen.

5 ML-236B, dat kan bestaan in de vorm van een zuur (bekend als "ML-236B-carbonzuur”) of een lacton (bekend als ’’ML-236B lacton”) is beschreven in het Britse octrooischrift No. 1.435.425, en bezit in de lacton-vorm de formule 2a van het formuleblad.

Voorts beschrijft het Britse octrooischrift No. 1.555.831 een aantal zouten en esters van ML-236B. Van ML-236B en de zouten en esters ervan werd gevonden, dat ze de biosynthese van cholesterol remmen 10 door wedijveren met 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A-reductase, dat het snelheidsbepalende enzym voor de choiesteroi-biosynthese is. Deze verbindingen bleken derhalve een zeer opmerkelijk vermogen om het niveau van serum-cholesterol te verlagen, te bezitten.

Voorts werden bepaalde 3-hydroxy-ML-236B-derivaten geïsoleerd als producten van het dierlijk metabolisme van ML-236B lacton en werd gevonden, dat soortgelijke derivaten gevormd werden door de 15 enzymatische hydroxylering van ML-236B lacton of -carbonzuur of zouten of esters daarvan, tot stand gebracht door middel van verschillende micro-organismen van de geslachten Absidla, Cunninghamella, Syncephalastrum, Streptomyces, Mucor, Rhizopus, Zygorinchus, Circinella, Actinomucor, Gongronella, Phycomyces, Mortierella, Pycnoporus en Rhizoctonia. Deze werkwijzen zijn beschreven in het Amerikaanse octrooischrift No. 4.346.227 en de aldus gevormde verbindingen zijn in deze publicatie beschreven als M-4, 20 M-4', lsoM-4 en lsoM-4'. Gevonden werd, dat deze verbindingen een vermogen om de biosynthese van cholesterol te remmen bezitten, dat ten minste vergelijkbaar is met en in bepaalde gevallen aanzienlijk groter is dan dat van ML-236B zelf.

ML-236B en de derivaten ervan, met inbegrip van de M-4 en M-4'-verbindingen, zijn derhalve van therapeutische waarde voor de behandeling van hyperiipemie en het voorkomen van arteriosclerose.

25 Men heeft nu gevonden, dat M-4 en M-4' tevens uit ML-236B en verschillende verbindingen daarvan verkregen kunnen worden door behandeling met micro-organismen vein het geslacht Nocardla of een cellen-vrij, enzymen-bevattend extract daarvan.

De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een werkwijze voor de bereiding van een 3-hydroxy-ML- 236B derivaat met formule 1 van het formuleblad, waarin ~OH of ◄OH of.....OH voorstelt, een farmaceu- 30 tisch aanvaardbaar zout of ester daarvan en de overeenkomstige lactonen met een gesloten ring, waarbij men een ML-236B verbinding, gekozen uit de groep van ML-236B carbonzuur, zouten en esters daarvan en het overeenkomstige ML-236B lacton, in aanraking brengt met een hydroxyleringsenzym, gevormd door een micro-organisme, indien noodzakelijk het verkregen product onderwerpt aan een of meer reacties gekozen uit de groep van hydrolyse, zoutvorming, verestering en iactonvorming, en het product uit het reactie-35 mengsel afzondert, die wordt gekenmerkt doordat het micro-organisme van het geslacht Nocardla is.

De verbinding met formule 1, waarin ~OH voorstelt, ◄OH wordt M-4 carbonzuur genoemd en de overeenkomstige zouten en esters zijn bekend als M-4 carboxylaten. De verbinding met formule 1, waarin ~OH voorstelt.....OH wordt aangeduid als M-4' carbonzuur en de overeenkomstige zouten en esters daarvan als M-4' carboxylaten.

40 De lactonen met gesloten ring overeenkomende met de verbindingen met formule 1 kunnen weergegeven worden door formule 1a van het formuleblad, waarin ~OH ◄OH of.....OH voorstelt en zijn respectie velijk bekend als M-4 lacton en M-4' lacton.

Het lacton met gesloten ring overeenkomende met ML-236B carbonzuur met formule 2 kan weergegeven worden door formule 2a van het formuleblad en is bekend als ML-236B lacton.

45 Soorten van het geslacht Nocardia die bij voorkeur toegepast worden bij de werkwijze volgens de uitvinding, zijn Nocardia autotrophica, Nocardia asteroides, Nocardia farcinica en Nocardia coeliaca, in het bijzonder Nocardia autotrophica. Van deze soorten wordt de voorkeur gegeven aan de volgende stammen: Nocardia autotrophica FERM P-6181:

Nocardia autotrophica subsp. canberrica subsp. nov. FERM P-6182; 50 Nocardia autotrophica subsp. amethystina subsp. nov. FERM P-6183;

Nocardia autotrophica IFO 12743;

Nocardia asteroides IFO 3424;

Nocardia farcinica ATCC 3318; en Nocardia coeliaca ATCC 17040.

55 Van de bovengenoemde voorkeursstammen zijn Nocardia autotrophica IF012743, Nocardia asteroides IFO 3424, Nocardia farcinica ATCC 3318 en Nocardia coeliaca ATCC 17040 alle bekende stammen, die vrij en voor het publiek verkrijgbaar zijn bij de betreffende micro-organismen-verzameling, d.w.z. het Instituut 194373 2 voor Fermentation, Osaka, Japan (IFO) respectievelijk de American Type Culture Collection, U.S.A. (ATCC), onder de nummers, waaronder ze gedeponeerd zijn. FERM is een afkorting voor het Fermentation Research institute, Japan.

De door de toegangsnummers FERM P-6182 en FERM P-6183 geïdentificeerde stammen van Nocardia 5 autotrophica zijn nieuwe stammen van het micro-organisme en onlangs geïsoleerd uit de bodem en gedeponeerd op 16 oktober 1981 bij het Fermentation Research Institute, Ibaraki-Ken, Japan (FERM).

De morfologische en fysiologische eigenschappen van de onlangs geïsoleerde micro-organismen werden bepaald met behulp van de gebruikelijke media en methoden beschreven door Shirting and Gottlieb /International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966)/tezamen met verscheidene aanvul· 10 lende proeven. Waarnemingen van de kweek werden gedurende 2 weken na incubatie bij 28’C uitgevoerd. De toegepaste kleuraanduidingen werden toegewezen volgens de ’’Guide to Colour Standard” (een handleiding gepubliceerd door Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokio, Japan). De eigenschappen van de kweken kunnen worden vergeleken met die van verschillende bekende soorten van actinomycetes, beschreven in ’’The Actinomycetes, Vol.2” door Waksman, ’The ISP Report” Shirting en Gottlieb, "Berge/s 15 Manual of Determinative Bacteriology”, 8e editie en andere recente literatuur met betrekking tot de taxonomie van de familie Nocardiaceae. De nieuwe micro-organismen zijn geïdentificeerd door hun FERM-toegangsnummers.

Morfologische eigenschappen

20 TABEL A

FERM FERM FERM

P-6181 P-6182 P-6183 25 --

Sporeketenmorfologie RF RF RF

Vertakking eenvoudig eenvoudig eenvoudig

Fragmentatie ja ja ja

Oppervlaktestructuur van gesegmen- glad glad glad 30 teerde hyphae (sporen)

Andere organen knopen, knopen geen nestachtige klitten 35 RF = rectus-flexibilis Groei op taxonomische media

Alle nieuwe stammen tonen een goede groei op een aantal verschillende media.

40 De stam FERM P-6181 bezat witte lucht-mycelia op een geel-grijze tot lichtgeel-oranje groei. In bepaalde media werd een lichtgeel-bruin oplosbaar pigment waargenomen, doch slechts in geringe hoeveelheid.

De stam FERM P-6182 bezat bruin-witte tot lichtgeel-oranje lucht-mycelia op een grijsachtig-geel-baiine groei. Geen oplosbaar pigment werd waargenomen.

De stam FERM P-6183 bezat een bruin-witte tot lichtgeel-oranje groei en bruin-violette vlekken werden 45 waargenomen, naarmate de kweek voortschreed. Bruinachtig-grijze lucht-mycelia waren aanwezig op alle media, met uitzondering van het gistmout-medium.

De kweekeigenschappen op de 14e dag van de kweek bij 28°C in een aantal verschillende media zijn vermeld in tabel B.

De in de tabel toegepaste afkortingen betekenen het volgende: 50 G = groei AM = aerial mycelium (lucht mycelium); R = reverse (omkeer); SP = soluble pigment (oplosbaar pigment); 3 194373

TABEL B

Media FERM FERM FERM P-6183 P-6181 P-6182 5 -—-—

Gist-mout-agar G Erg goed, Zeer goed, Zeer goed, licht-geel- bruin (6-4-1) bruin-wit, bruin (6-7-9) (2-9-8) tot grijsachtig 10 roodbruin (ISP 2) (4-3-5) AM overvloedig, overvloedig, spoor, wit wit bruinachtig- wit (2-9-7) 15 R Matig,geel- bruin (4-4-7) bruin-wit (2-9-8) oranje (8-8-8) tot grijsachtig rood-bruin (4-3-5) SP Geel-bruin Geen Geen 20 (8-7-9)

Havermeel agar (ISP 3) G goed, zeer goed, zeer goed, lichtbruin lichtgeel- donker- j 25 (2-8-9) oranje (2-9-9) roodbruin i

(4-3-4) I

AM Redelijk, wit overvloedig, redelijk, I

lichtgeel· licht-roze m

bruin (2-9-9) (2-8-4)(2-9-9) M

30 R geelachtig- lichtgeel- bruin-violet bruin (4-7-9) bruin (4-8-9) (3-3-2) m SP lichtgeel- geen geen ^ bruin (4-8-9) 35 -— -

Zetmeel anorganisch zout agar G goed, gering, zeer goed, (ISP 4) geelachtig geei-grijs bruin violet grijs (29-10) (1-9-10) (3-3-2) AM redelijk, wit overvloedig, goed, licht 40 lichtgeel· brüin-grijs oranje (2-9-9) (2-8-2) R lichtgeel lichtgeel· donker- (3-9-10) oranje (2-9-9) roodbruin (4-3-4) 45 SP geen geen geen

Glycerine asparagine agar G goed, goed, zeer goed, (ISP 5) lichtbruin grijsachtig- lichtbruin 50 (2-8-9) geelbruin (2-9-9) tot (4-5-7) bruin-violet (3-3-2) AM overvloedig, overvloedig, overvloedig, wit wit bruin-wit 55 (1-8-6) 194373 4 TABEL B (vervolg)

Media FERM FERM FERM P-6183 P-6181 P-6182 5 - R lichtgeel- bruin (4-4-6) lichtgeel oranje bruin (6-8-9) (2-9-9) tot grijzig, rood-bruin 10 (4-3-6) SP lichtgeel- geen geen bruin (6-9-11) 15 Tyrosine agar (ISP 7) G zeer goed, zeer goed, goed, grijsbruin lichtgeel- grijsachtig- (4-6-6) oranje (3-8-8) geelbruin (4-5-7) AM overvloedig, overvloedig spoor, wit 20 wit bruin-wit (2-9-7) R geelgrijs helderbruin lichtgeel oranje (1-9-10) (6-5-7) (2-9-9) tot bruinviolet 25 (3-3-2) SP lichtgeelbruin geen geen (6-7-9) 30 Saccharose-nitraat agar G goed, gering, gering, . lichtgeel- lichtgeel licht-geel oranje bruin (2-9-9) bruin (2-9-9) (2-9-9) AM redelijk, wit overvloedig, redelijk, wit bruinwit 35 (2-9-7) R geelgrijs bruin-wit lichtgeel oranje (1-9-10) (1-9-6) (2-9-9) SP geen geen geen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 55 -- 2

Glucose/asparagine agar G zeer goed, goed, zeer goed, 3 lichtgeel- grijsgeel- lichtgeel-oranje 4 oranje (2-9-9) bruin (4-5-7) (2-9-9) tot 5 bruin-violet 6 (3-3-2) 7 AM redelijk, wit overvloedig, redelijk, wit 8 helderbruin- 9 wit (1-7-6) 10 R lichtgeel- grijs- lichtgeel- oranje 11 bruin (4-8-9) roodbruin (2-9-9) tot (4-3-6) grijsrood-bruin (4-3-6) SP lichtgeel- geen geen bruin (4-8-9) 5 194373 TABEL 5 (vervoig)

Media FERM FERM FERM P-6183 P-6181 P-6182 5 -

Voedingsagar G goed, zeer goed, goed, geel-grijs lichtgeel* lichtgeel-oranje (2-9-10) bruin (6-8-9) (2-9-9) AM redelijk, wit lichtgeel- spoor, wit 10 oranje (2-9-9) R geelgrijs iichtgeei- iichtgeei-oranje (4-9-10) bruin (6-8-9) (2-9-9) SP geen geen geen 15 -

Wateragar G gering, gering, gering, geel-grijs kleurloos lichtgeel-oranje (1-9-10) (2-9-0) AM redelijk, wit overvloedig, redelijk, wit 20 wit R geelgrijs lichtgeel- lichtgeel-oranje (1-9-10) oranje (2-9-9) (2-9-9) SP geen geen geen 25 -

Aardappel / wortelenextract agar G gering, gering, gering, geelgrijs kleurloos lichtgeel-oranje (1-9-10) (2-9-9) AM redelijk, wit redelijk, wit redelijk, wit 30 R geelgrijs lichtgeel· lichtgeel-oranje (1-9-10) oranje (2-9-9) (2-9-9) SP geen geen geen 35 Fysiologische eigenschappen

De fysiologische eigenschappen van de nieuwe stammen zijn vermeld in tabel C. De proef voor de melanoide-pigmentvorming werd uitgevoerd in drie media, n.l.:

Medium 1: Trypton-gist extract-bouillon (ISP 1);

Medium 2: Pepton-gist extract-ijzeragar (ISP 6); 40 Medium 3: Tyrosine-agar (ISP 7).

TABEL C

FERM FERM FERM

45 P-6181 P-6182 P-6183

Nitraatreductie -

Zetmeelhydrolyse - 50 Ureumontleding + - +

Lysozym-bestendigheid +

Melanoide-pigmentvorming

Medium 1 -

Medium 2 55 Medium 3 -

Zuurproductie uit 194373 6 TABEL C (vervolg)

FERM FERM FERM

arabinose + - + 5 xylose + - +

raffinose + - NG

- s negatief 10 + = positief NG= geen groei

Gebruik van koolhydraten

Het gebruik van koolhydraten door de nieuwe stammen is vermeld in tabel D. Het toegepaste medium was 15 Pridham-Gottlieb agar (ISP 9) en de bepaling werd uitgevoerd na 14 dagen kweken bij 28°C.

TABEL D

FERM FERM FERM

20 P-6181 P-6182 P-6183 D-glucose + + + D-arabinose + - + 25 D-fructose + + + L-rhamnose + - + inositol + + + saccharose + - - raffinose + - - 30 D-mannitol + + + blanco - - - D-xylose + - + 35 + = gebruikt -t- = enigszins gebruikt - = niet gebruikt

Analyse van de celwand 40 Papier-chromatografische analyses werden uitgevoerd met zuurhydrolysaten van elk van dè drie nieuwe stammen volgens de methode van B. Becker et al: Applied Microbiology 13,236 (1965) en die van M.P. Lechevalier et al: "The Actinomycelates” door H.Prauser, 311 (1970). Meso-2,6+diaminopimelinezuur werd gevonden in de celwanden en arabinose en galactose werden gevonden als saccharide-bestanddelen van de gehele cel, waardoor derhalve bevestigd werd , dat elk van de stammen cellulaire bestanddelen van het 45 type IV-A bezat

De resultaten van de taxonomische onderzoeken tonen, dat alle stammen tot het geslacht Nocardia behoren. Van de bekende soorten van Nocardia zijn de eigenschappen van de nieuwe stammen het meest verwant aan die van Nocardia autotrophica: International Journal of Systematic Bacteriology, 30, 337 (1980) met als enige uitzondering de in tabel E getoonde verschillen. In deze tabel zijn de symbolen en afkortingen 50 hetzelfde als in de overeenkomstige tabellen Ar-D.

7 194373

TABEL E

Proef FERM FERM FERM Nocardia autotrophica 5 P-6181 P-6182 P-6183

Groeikleuren AM wit wit tot wit tot wit tot lichtgeel bruinachtig lichtgeel oranje grijs 10 G geelgrijs grijs- bruin-violet lichtgeel tot tot geelbruin geelgrijs licht- geeloranje 15 -

Ontleding van ureum + - + +

Bestendigheid tegen - + - - 20 lysozyme

Zuurproductie uit arabinose + - + + 25 xylose + + + raffinose + - NG -

Gebruik van: arabinose + - + + 30 xylose + - + + rhamnose + - + + saccharose + - - + raffinose + - - + 35

De stam FERM P-6181 en Nocardia autotrophica lijken op elkaar in hun morfologische, kweek- en fysiologische eigenschappen en hieruit werd de conclusie getrokken, dat deze stam tot de soort Nocardia autotrophica behoorde.

De stam FERM P-6182 verschilde van Nocardia autotrophica met betrekking tot de ontleding van ureum, 40 de bestendigheid tegen lysozyme, de zuurproductie uit koolhydraten en het gebruik van koolhydraten. Deze verschillen zijn echter niet voldoende om de stam FERM P-6182 als een nieuwe soort te beschouwen. Deze wordt derhalve beschouwd als een nieuwe ondersoort van Nocardia autotrophica. Deze stam werd dienovereenkomstig Nocardia autotrophica subsp. canberrica subsp. nov., genoemd.

De stam FERM P-6183 verschilde van Nocardia autotrophica met betrekking tot de groeikleur en het 45 gebruik van rhamnose, saccharose en raffinose. Deze verschillen zijn eveneens niet voldoende om de stam te beschouwen als een nieuwe soort, zodat deze beschouwd wordt als een ondersoort van Nocardia autotrophica. De stam is Nocardia autotrophica subsp. amethystina subsp. nov., genoemd.

Zoals alle microbiologische stammen zijn de nieuwe stammen FERM P-6181, FERM P-6182 en FERM P-6183 onstabiel in hun eigenschappen en worden zij gemakkelijk gemuteerd door kunstmatige mutatie-50 middelen zoals ultraviolette straling, hoogfrequente elektromagnetische golven, kernstraling en chemische mutatiemiddelen. Alle mutanten, die uit deze stammen verkregen worden en de gewenste werkzaamheden bezitten, kunnen bij de werkwijze der uitvinding toegepast worden.

Van de verschillende micro-organismen van het geslacht Nocardia die bij de werkwijze der uitvinding toegepast kunnen worden, worden in het bijzonder bij voorkeur de drie nieuwe stammen toegepast, d.w.z.

55 Nocardia autotrophica FERM P-6181, Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182 of Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183.

De enzymatische hydroxyleringsmethode volgens de uitvinding kan uitgevoerd worden door de ML-236B

194373 8 verbinding in aanraking te brengen met het gekozen micro-organisme van het geslacht Nocardia of met cellen-vrij, enzymen-bevattend extract ervan.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt bij voorkeur op één van de drie volgende wijzen uitgevoerd: a. toevoeging van de ML-236B uitgangsverbinding aan het kweekmedlum tijdens het kweken van het 5 omzettende micro-organisme en vervolgens voortzetting van het kweken, b. verzamelen van een kweek van het omzettende micro-organisme en in aanraking brengen van de verzamelde cellen met de ML-236B uitgangsverbinding, of c. bereiden van een cellen-vrij, enzymen-bevattend extract uit de cellen van het omzettende micro-organisme en in aanraking brengen van dit extract met de ML-236B uitgangsverbinding.

10 Het kweken van het omzettende micro-organisme van het geslacht Nocardia kan uitgevoerd worden met gebruikelijke middelen in een gebruikelijk kweekmedium dat de bekende voedingsstoffen voor dergelijke micro-organismen bevat. Zoals bekend, bevatten dergelijke kweekmedia derhalve bronnen voor assimileerbare koolstof en assimileerbare stikstof en dikwijls anorganische zouten. Voorbeelden van bronnen voor assimileerbare koolstof omvatten glucose, saccharose, zetmeel, glycerine, gierstgelei, melassen, en 15 sojabonenolie. Voorbeelden van bronnen voor assimileerbare stikstof zijn vaste stoffen uit sojabonen (met inbegrip van gemalen sojabonenmeel), tarwekiemen, vleesextracten, pepton, maïsweekvloeistof, gedroogde gist en ammoniumzouten, zoals ammoniumsulfaat. Desgewenst kunnen de media tevens anorganische zouten, zoals natriumchloride, kafiumchloride, calciumcarbohaat of fosfaten bevatten. Tevens kunnen desgewenst andere toevoegsels, die in staat zijn om de vorming van de hydroxyleringsenzymen te 20 bevorderen, in geschikte combinaties toegepast worden. De bijzondere kweekmethode is niet kritisch voor de werkwijze der uitvinding en alle gewoonlijk voor het kweken van micro-organismen toegepaste methoden kunnen evenzeer toegepast worden bij de onderhavige uitvinding. In het algemeen, zullen de toegepaste methoden vanzelfsprekend gekozen worden met het oog op de industriële doelmatigheid. Aldus wordt in het algemeen de voorkeur gegeven aan een vloeibare kweek en is de dompelkweekmethode het meest 25 geschikt vanuit industrieel oogpunt.

Het kweken zal gewoonlijk uitgevoerd worden onder aërobe omstandigheden en bij een temperatuur van 20-37°C, bij voorkeur van 26-28°C.

De methode (a) wordt uitgevoerd door de ML-236B uitgangsverbinding toe te voegen aan het kweekmedium tijdens het kweken. Het nauwkeurige punt tijdens het kweken, waarop de uitgangsverbinding wordt 30 toegevoegd, zal afhangen van de kweekuitrusting, de samenstelling van het medium, de temperatuur van het kweekmedium en andere factoren, doch is bij voorkeur het tijdstip, waarop de hydroxyleringscapaciteit van het micro-organisme begint toe te nemen en dit is gewoonlijk 2 of 3 dagen na het begin van het kweken van het micro-organisme. De toegevoegde hoeveelheid van de ML-236B verbinding bedraagt bij voorkeur 0,01 tot 5,0 gew./vol.% van het medium, in het bijzonder 0,05 tot 0,5 gew./vol.%, bijvoorbeeld 0,05 tot 35 0,1 gew./vol.%. Na toevoeging van de ML-236B verbinding wordt het kweken aëroob voortgezet, gewoonlijk bij een temperatuur binnen de bovengenoemde grenzen. Het kweken wordt gewoonlijk gedurende 3 tot 5 dagen na de toevoeging van de ML-236B verbinding voortgezet.

Bij de methode (b) wordt het kweken van het micro-organisme eerst uitgevoerd onder zodanige omstandigheden, dat de maximale hydroxyleringscapaciteit bereikt wordt. Deze capaciteit bereikt gewoonlijk 40 een maximum tussen 4 en 5 dagen na het begin van het kweken, hoewel deze periode kan variëren afhankelijk van de aard en de temperatuur van het medium, de soort van micro-organisme en andere factoren. De hydroxyleringscapaciteit van de kweek kan bepaald worden door met geschikte tussenpozen monsters van de kweek te nemen, de hydroxyleringscapaciteit van de monsters te bepalen door ze onder standaardomstandigheden in aanraking te brengen met een ML-236B verbinding en de verkregen hoeveel-45 heid M-4 en M-4'-verbinding te bepalen en deze capaciteit in een grafiek tegen de tijd uit te zetten.

Wanneer de hydroxyleringscapaciteit het maximum bereikt heeft wordt het kweken gestopt en worden de microbiologische cellen verzameld. Dit kan uitgevoerd worden door de kweek te onderwerpen aan centrifugaalafscheiding, filtratie of soortgelijke bekende scheidingsmethoden. De gehele cellen van het aldus verzamelde micro-organisme worden dan bij voorkeur gewassen met een geschikte wasvloeistof, zoals een 50 fysiologische zoutoplossing of een geschikte bufferoplossing.

Het contact tussen de verzamelde cellen van het micro-organisme van het geslacht Nocardia en de ML-236B verbinding wordt in het algemeen tot stand gebracht in een waterig medium, bijvoorbeeld in een fosfaatbufferoplossing met een pH van 5-9. De reactietemperatuur ligt bij voorkeur tussen 20 en 45°C, in het bijzonder tussen 25 en 30eC. De concentratie van de ML-236B verbinding in het reactiemedium 55 bedraagt bij voorkeur 0,01 tot 5 gew.A/ol.%. De toegestane tijd voor de reactie bedraagt bij voorkeur 1 tot 5 dagen, hoewel deze kan variëren afhankelijk van de concentratie van de ML-236B verbinding in het reactiemengsel, de reactietemperatuur, de hydroxyleringscapaciteit van het micro-organisme (die vanzelf- 9 194373 sprekend kan variëren van soort tot soort en tevens, zoals eerder uiteengezet, zal afhangen van de kweektijd) en andere factoren.

Het bij de methode (c) toegepaste cellen-vrije, enzymen-bevattende extract kan verkregen worden door afbreken van de gehele cellen van het micro-organisme, die verkregen zijn zoals beschreven met betrekking 5 tot methode (b), door fysische of chemische middelen, bijvoorbeeld door fijnmalen of ultrasone behandeling ter verkrijging van een uiteengevallen cellulaire massa of door behandeling met een oppervlakte-actief middel of een enzym ter vorming van een cellulaire oplossing. Het verkregen cellenvrije extract wordt dan in aanraking gebracht met de ML-236B uitgangsverbinding onder dezelfde omstandigheden als eerder beschreven met betrekking tot methode (b).

10 Na voltooiing van de omzetting volgens één der eerder genoemde methoden kan de gewenste verbin-ding direct met gebruikelijke middelen geïsoleerd, afgescheiden of gezuiverd worden. Bijvoorbeeld kan afscheiding en zuivering uitgevoerd worden door het reactiemengsel te filtreren, het verkregen filtraat te extraheren met een niet met water mengbaar organisch oplosmiddel (zoals ethylsulfaat), het oplosmiddel uit het extract af te dampen, de verkregen ruwe verbinding te onderwerpen aan kolomchromatografie 15 (bijvoorbeeld op silicagel of aluminiumoxide) en de kolom te elueren met een geschikt elutiemiddel.

Wanneer de door het micro-organisme omgezette M-4 of M-4'-verbinding niet de gewenste vorm van die verbinding is, kan het product van de omzetting onderworpen worden aan één of meerdere verdere reacties, zoals hydrolyse, zoutvorming, verestering of lactonvorming volgens bekende methoden, zoals hierna nadar beschreven zal worden. Dergelijke bijkomende reacties kunnen vóór, nè of tijdens de eerder beschreven 20 afscheidings- en zuiveringstrappen uitgevoerd worden, bij voorkeur tijdens deze trappen.

Het bij de werkwijze der uitvinding werkzame hydroxyleringsenzym heeft zelf geen invloed op de carboxylgroep van de ML-236B verbinding en dientengevolge zou het ML-236B bij overigens gelijke omstandigheden M-4 en/of M-4' lacton, het ML-236B carbonzuur M-4 en/of M-4' carbonzuur en een zout of ester van ML-236B carbonzuur hetzelfde zout of ester van M-4 en/of M-4' carbonzuur geven. Dit kan echter 25 beïnvloed worden door andere factoren, in het bijzonder de pH van het reactiemengsel, op een wijze, die volgens de gewone wetten van de chemie te voorspellen is.

De ML-236B uitgangsverbinding kan het vrije ML-236B carbonzuur met formule 2, het overeenkomstige . lacton met formule 2a of een zout (bijvoorbeeld een metaal-, aminozuur- of aminozout) of ester (in het bijzonder alkytester) daarvan zijn.

30 Metaalzouten, waaraan de voorkeur gegeven wordt, zijn zouten met alkalimetalen, zoals natrium of kalium, zouten met aardalkalimetalen, zoals calcium, of zouten met andere metalen, zoals magnesium, aluminium, ijzer, zink, koper, nikkel of kobalt, waarvan de voorkeur wordt gegeven aan zouten met alkalimetalen, aardalkalimetalen, magnesium en aluminium, in het bijzonder met natrium, calcium en aluminium.

35 Aminozuren, waaraan de voorkeur wordt gegeven ter vorming van zouten zijn basische aminozuren, zoals arginine, lysine, histidine, α,β-diaminoboterzuur of ornithine.

Aminen, waaraan de voorkeur wordt gegeven ter vorming van aminozouten, zijn t-octylamine, dibenzyla-mine, dichloorhexylamine, morfoline, alkylesters van D-fenylglycine en D-glucosamine.

ML-236B esters zijn bij voorkeur de alkylesters, zoals de methyl-, ethyl-, propyl·, isopropyl-, butyl-, 40. isobutyl of pentylesters, waarvan de voorkeur wordt gegeven aan de methylester. Desgewenst kunnen echter ook andere esters worden toegepast.

Van de ML-236B uitgangsmaterialen wordt bijzondere voorkeur gegeven aan de alkaiimetaalzouten, bijvoorbeeld de natrium- of kaliumzouten, waarbij de meeste voorkeur wordt gegeven aan het natriumzout, aangezien men gevonden heeft, dat dit de beste omzetting van de ML-236B verbinding in de gewenste M-4 45 of M-4' verbinding geeft.

Wanneer het door de enzymatische hydroxyleringsmethode volgens de uitvinding verkregen product een zout van het carbonzuur met formule 1 is, kan het vrije carbonzuur zelf verkregen worden door regeling van de pH van het filtraat op een waarde van vier of minder, bij voorkeur op een waarde van 3-4. Elk organisch zuur of anorganisch zuur kan toegepast worden, mits het/geen nadelige invloed op de gewenste verbinding 50 uitoefent. Voorbeelden van de vele geschikte zuren zijn trifluorazijnzuur, azijnzuur, zoutzuur en zwavelzuur. Het carbonzuur kan zelf het gewenste product zijn of kan en bij voorkeur zal onderworpen worden aan daaropvolgende reacties, zoals hierna beschreven, eventueel na behandelingen zoals extractie, wassen en dehydratatie.

Metaalzouten van de carbonzuren met formule 1 kunnen verkregen worden door een hydroxide, 55 carbonaat of soortgelijke reactieve verbinding.van het gekozen metaal in een waterig oplosmiddel in aanraking te brengen met het carbonzuur met formule 1. Het toegepaste waterige oplosmiddel is bij voorkeur water of kan een mengsel zijn van water met een organisch oplosmiddel, bij voorkeur een alkanol 194373 10 (zoals methanol of ethanol), een keton (zoals aceton), een alifatische koolwaterstof (zoals hexaan) of een ester (zoals ethylacetaat). In het bijzonder wordt met voorkeur gebruik gemaakt vein een mengsel van een hydrofiel organisch oplosmiddel met water. Dergelijke reacties worden gewoonlijk uitgevoerd bij kamertemperatuur, doch kunnen desgewenst uitgevoerd worden onder verwarmen.

5 Aminozouten van de carbonzuren met formule 1 kunnen verkregen worden door een amine in een waterig oplosmiddel in aanraking te brengen met het carbonzuur met formule 1. Geschikte waterige oplosmiddelen zijn water en mengsels van water met alkanolen (zoals methanol of ethanol), ethers, (zoals tetrahydrofuran) nitrillen (zoals acetonitril) of ketonen (zoals aceton). In het bijzonder wordt bij voorkeur gebruik gemaakt van waterige aceton als oplosmiddel voor deze reactie. De reactie wordt bij voorkeur 10 uitgevoerd bij een pH van 7-8,5 en bij voorkeur bij kamertemperatuur of lager, in het bijzonder een temperatuur van 5-10°C. De reactie verloopt onmiddellijk volledig.Anderzijds kan een metaalzout van het carbonzuur met formule 1 (dat op de eerder beschreven wijze verkregen kan zijn) opgelost worden in een waterig oplosmiddel, waarna een anorganisch zout (bijvoorbeeld het hylrochloride) van het gewenste amine wordt toegevoegd onder toepassing van dezelfde reactieomstandigheden als wanneer men het amine zelf 15 iaat reageren met het carbonzuur met formule 1, waarna het gewenste product dan verkregen wordt door een zout-uitwisselingsreactie.

Aminozuur-zouten van de carbonzuren met formule 1 kunnen verkregen worden door een aminozuur in waterige oplossing in aanraking te brengen met het carbonzuur met formule 1. Geschikte waterige oplosmiddelen zijn water en mengsels van water met alkanolen (zoals methanol of ethanol) of ethers (zoals 20 tetrahydrofuran). De reactie wordt bij voorkeur uitgevoerd onder verwarming bijvoorbeeld op een temperatuur van 50 tot 60°C.

Esters, bij voorkeur alkylesters, van de carbonzuren met formule 1 kunnen verkregen worden door het carbonzuur met formule 1 in aanraking te brengen met een geschikte alkanol. Bij voorkeur wordt deze reactie uitgevoerd in de aanwezigheid van een zure katalysator, bijvoorbeeld een anorganisch zuur (zoals 25 zoutzuur of zwavelzuur), een Lewis-zuur (bijvoorbeeld boriumtrifluoride) of een ionenwisselend hars. Het voor deze reactie toegepaste reactiemiddel is niet kritisch, mits het de reactie niet nadelig beïnvloedt. Geschikte oplosmiddelen zijn benzeen, chloroform en ethers. Anderzijds kan het gewenste product verkregen worden door het carbonzuur met formule 1 in aanraking te brengen met een diazoalkaan, waarin het alkaangedeelte al dan niet gesubstitueerd kan zijn. Deze reactie wordt gewoonlijk uitgevoerd door het 30 zuur in aanraking te brengen met een oplossing van het diazoalkaan in ether. Voorts kan de ester verkregen worden door een metaalzout van het carbonzuur met formule 1 in aanraking te brengen met een halogenide bij voorkeur een alkylhalogenide, in een geschikt oplosmiddel. Bij voorkeur toegepaste oplosmiddelen zijn dimethylformamide, tetrahydrofuran, dimethylsulfoxide en aceton. Alle reacties voor de vorming van esters worden bij voorkeur uitgevoerd bij kamertemperatuur, hoewel de reacties, wanneer dit 35 noodzakelijk is in verband met de aard van het reactiesysteem, ook onder verwarming uitgevoerd kunnen worden.

Lactonen van de carbonzuren met formule 1 kunnen verkregen worden door het carbonzuur met formule 1 in aanraking te brengen met een katalytische hoeveelheid vein een zuur, dat organisch of anorganisch kan zijn. Bij voorkeur worden als organische en anorganische zuren trifluorazijnzuur, zoutzuur of zwavelzuur 40 toegepast. Deze reactie wordt bij voorkeur omstreeks kamertemperatuur uitgevoerd.

Voorbeelden van de volgens de werkwijze der uitvinding gevormde zouten en esters van de M-4 en M-4' verbindingen zijn de eerder ter toepassing als uitgangsmaterialen genoemde zouten en esters van ML-236B.

De aldus verkregen M-4 en M-4' verbindingen kunnen geïsoleerd, gescheiden of gezuiverd worden door 45 gebruikelijke middelen, bijvoorbeeld door adsorptie aan een drager (zoals actieve kool of silicagel) of ionenuitwisselings-chromatografie, of gelfiltratie door een cefadex (handelsnaam) kolom, of door extractie dor een organisch oplosmiddel, zoals een ether, ethylacetaat of chloroform. Desgewenst, en gewoonlijk bij voorkeur, wordt een combinatie van deze methoden toegepast.

De M-4 en M-4' isomeren kunnen van elkaar gescheiden worden na voltooiing van de omzettingsreactie 50 of op elk geschikt punt tijdens de reacties of tijdens de eerder beschreven scheidings- of zuiverings-bewerkingen.

De uitvinding wordt nader toegelicht door de volgende voorbeelden.

Voorbeeld I

55 Cellen van Nocardia autotrophica subsp. amethystine FERM P-6183 werden vanaf een schuine kweekbodem met behulp van een platina-oogje geënt in elk van 20 Erlenmeyer-kolven van 500 ml, die elk 100 ml van een kweekmedium met de onderstaande samenstelling in gewicht/volume% bevatten.

' 11 194373 . Glucose 1,0%

Pepton 0,2%

Vleesextract 0,1% 5 Gistextract 0,1%

MaTsweekvIoeistof 0,3%

Kraanwater rest (pH niet geregeld)

Een schudkweek werd vervolgens uitgevoerd bij 26°C en 220 r.p.m. gedurende 2 dagen, waarna natrium 15 ML-236B carboxylaat toegevoegd werd tot een uiteindelijke concentratie van 0,05 gew/vol%. De incubatie werd nog 5 dagen bij 26°C en 220 r.p.m. voortgezet.

Na voltooiing van het kweken werd het reactiemengsel gefiltreerd en de pH van het filtraat geregeld op een waarde van 3 door toevoeging van trifluorazijnzuur. Het aangezuurde filtraat werd 3 x geëxtraheerd met telkens 1 liter ethylacetaat ter vorming van extracten, die een mengsel van M-4 carbonzuur en M-4' 15 carbonzuur bevatten. Van deze extracten werden monsters genomen en onderworpen aan dunnelaag-chromatografie op een silicagelplaat Art 5715 (vervaardigd door Merck & Co. Ine.), en ontwikkeld met een mengsel van benzeen, aceton en azijnzuur in een volumeverhouding van 50:50:3. De Rf waarde van M-4 carbonzuur bedroeg 0,45 en de Rf waarde van M-4' carbonzuur 0,46.

De gehele rest van het extract werd gewassen met een verzadigde oplossing van natriumchloride, 20 waarna een equimolaire hoeveelheid van een oplossing van diazomethaan in ether bij kamertemperatuur werd toegevoegd. Men liet het mengsel 30 min. staan, waarna het onder verminderde druk ingedampt werd tot droog. Het residu werd op een Lobarkolom gebracht (Si 60, vervaardigd door Merck & Co. Inc., size A), die vervolgens geëlueérd werd met een mengsel van benzeen en ethylacetaat in een volumeverhouding van 1:1. Men verkreeg afzonderlijke fracties, die methyl M-4 carboxylaat en methyl M-4' carboxylaat bevatte.

25 Deze fracties werden onder verminderde druk ingedampt tot droog, waarbij 320 mg methyl M-4 carboxylaat en 11 mg methyl M-4' carboxylaat, beide in de vorm van kleurloze oliën werden verkregen.

Door in de bovenbeschreven procedure het diazomethaan te vervangen door andere geschikte diazoalkanen, kunnen andere esters van M-4 carbonzuur en M-4' carbonzuur verkregen worden.

30

Fysische eigenschappen van methyl M-4 carboxylaat

Magnetisch kernspinresonantiespectrum (in deuterochloroform, onder toepassing van tetramethylsilaan als inwendige standaard, bij 200 MHz), 5-ppm: 0,88 (3H, triplet, J= 7,3 Hz); 35 0,89 (3H, doublet, J= 6,5 Hz); 1,12 (3H, doublet, J = 6,8 Hz); 1,1-1,7 (10H, multiplet); 2,34 (1H, sextet, J = 7 Hz); 2,3-2,5 (2H, multiplet); 40 2,49 (2H, doublet, J = 6,4 Hz); 2,58 (1H, multiplet); 3,72 (3H, singulet); 3,78 (1H, multiplet); 4,25 (1H, quintet, J= 7 Hz); 45 4,40 (1H, multiplet); 5,42 (1H, multiplet); 5,56 (1H, multiplet); 5,90 (1H, doublet van doublets, J = 9,8 en 5,6 Hz); 5,99 (1H, doublet, J = 9,8 Hz).

50

Massaspectrum

Na silylering met N,0-bis(trimethylsilyl)trifluoraceetamide, werd de bepaling uitgevoerd onder toepassing van een instrument van het type D-300, vervaardigd door Nihon Electronic Co.

M/e: 654 (M+), 552, 462, 372, 290, 272, 233, 231.

55 Ultraviolet absorptiespectrum (ethanol) nm: 230,1,237,3,264,4.

Infraroodabsorptiespectrum (dunne laag) cm1: 194373 12 3400, 2950,1730 Dunnelaag-chromatografie

Op een silicagelplaat Art 5715, vervaardigd door Merck & Co. Ine., onder toepassing van een mengsel van benzeen en aceton in een volumeverhouding van 1:1 als ontwikkeloplosmiddel.

5 Rf waarde: 0,88.

Fysische eigenschappen met methyl M-4' carboxylaat

Magnetisch kernresonantiespectrum (in deuterochloroform onder toepassing van tetramethylsilaan als inwendige standaard, bij 60 MHz) 10 8 ppm: 3,70 (3H, singulet); 5,50 (1H, breed singulet); 5,75 (1H, breed, singulet); 5.90 (1H, kwartet); 15 6,01 (1H, doublet).

Ultraviolet absorptiespectrum (methanol) nm: ...

230, 238, 246.

Infraroodabsorptiespectrum (dunne laag) cm'1 3400,1730.

20 Massaspectrum

Na silylering met Ν,Ο-bis (trimethylsilyl)trifluoraceetamide, werd de bepaling uitgevoerd met behulp van een instrument van het type D-300, vervaardigd door Nihon Electronic Co.

M/e: 654 (M+).

Elementair analyse: 25 Berekend voor C24H3a07: C% 65,73 H% 8,73 Gevonden: 65,66 8,79.

Voorbeeld II

De in voorbeeld I beschreven handelingen werden herhaald ter verkrijging van 1,9 liter van een reactie-30 mengsel voor de omzetting. De pH van dit mengsel werd vervolgens geregeld op een waarde van 3,0 door toevoeging van trifluorazijnzuur, waarna het mengsel 3 x geëxtraheerd werd, telkens met 1 liter ethylacetaat, ter verkrijging van een fractie, die zowel M-4 carbonzuur als M-4' carbonzuur bevatte.

Dit extract werd vervolgens gewassen met een verzadigde oplossing van natriumchloride, waarna het boven watervrij natriumsulfaat werd gedroogd. Een katalytische hoeveelheid trifluorazijnzuur werd toege-35 voegd om de lactonvorming uit te voeren. Het verkregen mengsel werd vervolgens gewassen met een 5 gew/Vol% ’s waterige oplossing van natriumbicarbonaat, waarna het boven watervrij natriumsulfaat werd gedroogd en vervolgens tot droog werd ingedampt ter vorming van een lactonfractie.

Deze lactonfractie werd op een Lobar-kolom (Si 60, vervaardigd door Merck & Co. Inc., size A) geplaatst en geëlueerd met een mengsel van benzeen en aceton in een volumeverhouding van 7:3 ter verkrijging van 40 afzonderlijke fracties, die M-4 lacton en M-4' lacton bevatten. Men herkristalliseerde deze fracties afzonderlijk in ethylacetaat, waarbij 270 mg M-4 lacton en 8 mg M-4' lacton werden verkregen.

Fysische eigenschappen van M-4 lacton.

Magnetisch kemspinresonantiespectrum (in deuterochloroform, onder de toepassing van een tetramethylsil-45 aan als inwendige standaard, bij 100 MHz), δ ppm: 4,38 (1H, multiplet); 4,41 (1H, multiplet): 4,62 (1H, multiplet); 50 5,41 (1H, multiplet); 5,58 (1H, multiplet); 5.90 (1H, kwartet); 6,01 (1H, doublet).

Ultraviolet absorptiespectrum (methanol) nm: 55 230,236,7,244,6.

Infraroodabsorptiespectrum (dunne laag) cm'1: 3400, 2950, 1725.

13 194373 Dünnelaag-CMroiriaiografiö.

, Op een silicagelplaat Art 5715, vervaardigd door Merck & Co. Ine., onder toepassing van een mengsel van benzeen, aceton en azijnzuur in een volumeverhouding van 50:50:3 als ontwikkeloplosmiddel.

Rf waarde: 0,62.

5

Fysische eigenschappen van M-4' lacton.

Magnetisch kemspinresonantiespectrum (in deuterochloroform onder toepassing van tetramethylsilaan als inwendige standaard bij 100 MHz), δ ppm: 10 4,25 (1H, multiplet); 4,60 (1H, multiplet); 5,50 (1H, multiplet); 5,75 (1H, multiplet); 5,90 (1H, kwartet); 15 6,01 (1H. doublet).

Ultravioletabsorptiespectrum (methanol) λ™*, nm: 230, 237,245.

Infraroodabsorptiespectrum (KBr) cm*1: 3500,1720.

20 Massaspectrum: M/e 406 (M+), 304, 286.

Optische rotatie: [a],,22 = +310,9° (c = 0,66, methanol)

Smeltpunt 141-143°C 25 Elementair analyse:

Berekend voor Ο^Η^Οβ: C% 67,95 H% 8,43 Gevonden: 68,05 8,37 Dunnelaag-chromatografie:

Op een silicagelplaat Art 5715, vervaardigd door Merck & Co. Ine., onder toepassing van een mengsel 30 van benzeen en aceton in een volumeverhouding van 1:1 als ontwikkeloplosmiddel.

Rf waarde: 0,64.

Voorbeeld III

De in voorbeeld I beschreven procedure werd herhaald tot en met de extractie met drie porties ethylacetaat 35 ter verkrijging van een extract, dat zowel M-4 carbonzuur als M-4' carbonzuur bevat

Dit extract werd vervolgens onmiddellijk overgebracht in een 5 gew/vol% waterige oplossing van natriumbicarbonaat, en de pH van het mengsel werd op een waarde van 7,0 gebracht door toevoeging van 2N zoutzuur. Het mengsel werd vervolgens geabsorbeerd op een Dialon HP-20 kolom (vervaardigd door Mitsubishi Chemical Industries). De kolom werd met water gewassen en vervolgens geêlueerd met 50 40 vol/vol%’s waterige aceton ter vorming van een fractie, die natrium M-4 carboxylaat bevat. Deze werd onderworpen aan vriesdrogen, waarbij 200 mg natrium M-4 carboxylaat werd verkregen.

Fysische eigenschappen van natrium M-4 carboxylaat

Magnetisch kemspinresonantiespectrum ((in deuteromethanol) onder toepassing van tetramethylsilaan als 45 inwendige standaard, bij 200 MHz) δ ppm: 0,91 (3H, triplet, J = 7,5 Hz); 0,92 (3H, doublet, J - 7 Hz); 1,12 (3H, doublet, J - 7 Hz); 50 1,1-1,8 (10H, multiplet); 2,25 (1H, doublet van doubletten, J = 15 & 7,6 Hz); 2,34 (1H, doublet van doubletten, J = 15 & 5,5 Hz); 2,2-2,4 (3H, multiplet); 2,48 (1H, multiplet); 55 3,68 (1H, multiplet); 4,07 (1H, multiplet); 4,28 (1H, multiplet); 194373 14 5,36 (1H, multiplet); 5,48 (1 Η, doublet van doubletten, J = 3 & 2 Hz); 5,88 (1H, doublet van doubletten, J = 9,6 & 5,3 Hz); 5,98 (1H, doublet, J = 9,8 Hz).

5 Ultraviolet absorptiespectrum (methanol) nm: 230,0, 237,2, 245,0.

Infrarood absorptiespectrum (KBr) cm*1.

3400, 2900, -1725. 1580.

Dunne-laag-chromatografie: 10 Op een silicagelplaat Art 5715, vervaardigd door Merck & Co. Inc., onder toepassing van een mengsel van benzeen, aceton en ethylacetaat in een volumeverhouding van 50:50:3 als ontwikkeloplosmiddel. Rf-waarde: 0,45.

Voorbeeld IV

15 De in de voorbeelden l—111 beschreven procedures werden herhaald, doch onder toepassing van de stam Nocardia autotrophica FERM P-6181 in plaats van Nocardia autotrophica subsp. amethystine FERM P-6183; verkregen werd: 150 mg methyl M-4 carboxylaat, 37 mg methyl M-4' carboxylaat, 140 mg M-4 lacton, 30 mg M-4' iacton en 110 mg natrium M-4 carboxylaat In alle gevallen bezaten de producten dezelfde eigenschappen als de respectievelijk in voorbeelden l-lll verkregen verbindingen.

20

Voorbeeld V

Een oogje van een kweek van Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182 werd geënt in elk van 20 Erlenmeyer-kolven van 500 ml, die elk 100 ml van een medium mét de onderstaande samenstelling in gewicht/vol% bevatten: 25 glycerine 0,5% saccharose 2,0% sojabonenmeel 1,0% 30 geperste gist 1,0% maTsweekvloeistof 0,5% kobaltchloride 0,001% kraanwater rest (pH 7,0) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 2

Een schudkweek werd 2 dagen bij 26°C bij 220 rpm uitgevoerd, waarna natrium ML-236B carboxylaat 3 toegevoegd werd tot een uiteindelijke concentratie van 0,05 gew/vol%. Het kweken werd vervolgens nog 5 4 dagen bij 26°C en 220 rpm voortgezet Het reactiemengsel werd gefiltreerd en de pH van het filtraat werd 5 door toevoeging van zoutzuur op een waarde van 3,0 gebracht Het mengsel werd vervolgens 3 x 6 geëxtraheerd met telkens 1 liter ethylacetaat, ter verkrijging van een extract dat zowel M-4 carbonzuur als 7 M-4' carbonzuur bevatten, waarvan door dunnelaag-chromatografie werd aangetoond, dat ze identiek waren 8 aan de respectievelijke producten van voorbeeld I.

9

Dit extract werd vervolgens op de in voorbeeld I beschreven wijze verder behandeld, waarbij 180 mg 10 methyl M-4 carboxylaat en 110 mg methyl M-4' carboxylaat werden verkregen.

11 12

Voorbeeld VI

13

De in voorbeeld V beschreven procedure werd herhaald tot en met de bereiding van het extract dat M-4 14 carbonzuur en M-4' carbonzuur bevat. Dit extract werd vervolgens op de in voorbeeld 11 beschreven wijze 15 behandeld, waarbij 170 mg-M-4 lacton en 90 mg M-4' lacton werden verkregen.

16

Voorbeeld VII

Oogjes van een kweek van Nocardia autotrophica subsp. amesthystina FERM P-6183 werden geënt in 10 Erienmeyer kolven van 500 ml, die elk 100 ml van een medium met de onderstaande samenstelling in gew/vol% bevatten:

Claims

10 Een schudkweek werd gedurende 5 dagen bij 26°C en 220 r.p.m. uitgevoerd, waarna de hele microbiologische ceiien door centrifugale afscheiding verzameid werden. De verzamelde ceiien werden gewassen met een 0,1 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,0) en vervolgens opnieuw verzameld en gesuspendeerd in 900 ml van een 0,1 M fosfaatbufferoplossing. Aan deze suspensie werd natrium ML-236B carboxylaat toegevoegd tot een concentratie van 0,5 g/100 ml, en het mengsel werd 5 dagen bij 26°C en 220 r.p.m. 15 geïncubeerd. Hierna werd het mengsel gefiltreerd en de pH door toevoeging van zoutzuur op een waarde van 3,0 gebracht. Het mengsel werd vervolgens 3 x geëxtraheerd, telkens met 1 liter ethylacetaat, ter verkrijging van een extract, dat M-4 carbonzuur en M-4' carbonzuur bevatte, die door dunnelaag-chromatografie geïdentificeerd werden en hetzelfde bleken te zijn als de respectievelijke producten van voorbeeld I. 20 ------- Voorbeeld VIII De in voorbeeld 11 beschreven procedure werd herhaald, met uitzondering, dat de in tabel F vermelde micro-organismen werden toegepast. De verkregen hoeveelheid M-4 lacton is eveneens in de tabel vermeld. 25 TABEL F Micro-organismen Hoeveelheid M-4 lacton (MG). Nocardia faroinica ATCC 3318 7 30 Nocardia coellaca ATCC 17040 5 Nocardia autotrophica IFO 12743 10 Nocardia asteroides IFO 3424 15 35 Voorbeeld IX Cellen van Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183 werden vanaf een schuine voedingsbodem met behulp van een platina-oogje geënt in elk van 20 Erlenmeyer kolven van 500 ml, die elk 100 ml van een kweekmedium met de in voor beeld Vil vermelde samenstelling bevat. Een schudkweek werd vervolgens gedurende 2 dagen bij 26°C en 220 r.p.m. uitgevoerd, waarna natrium ML-236B carboxylaat 40 toegevoegd werd tot een uiteindelijke concentratie van 0,4 gew/vol%. De incubatie werd nog 5 dagen bij 26°C en 220 r.p.m. voortgezet. De in voorbeeld II beschreven procedure werd daarna herhaald, waarbij 2,9 g M-4 lacton werd verkregen. 1

1. Werkwijze voor de bereiding van een 3-hydroxy-ML-236B derivaat met formule 1 van het formuleblad, (waarin ~OH of ◄OH of.....OH voorstelt), een farmaceutisch aanvaardbaar zout of ester daarvan en de overeenkomstige lactonen met gesloten ring, waarbij men een ML-236B verbinding gekozen uit de groep 50 van ML-236B carbonzuur, zouten en esters daarvan en het overeenkomstige ML-236B lacton, in aanraking brengt met een hydroxyleringsenzym, gevormd door een micro-organisme, indien noodzakelijk het verkregen product onderwerpt aan een of meer reacties gekozen uit de groep vein hydrolyse, zoutvorming, verestering en lactonvorming, en het product uit het reactiemengsel afzondert, met het kenmerk, dat het micro-organisme van het geslacht Nocardia is.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de ML-4236B verbinding met het enzym in aanraking brengt door een micro-organisme van het geslacht Nocardia te kweken in een medium, dat de ML-236B verbinding bevat. » 194373 16

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de ML-236B verbinding met het enzym in aanraking brengt door gehele cellen van een micro-organisme van het geslacht Nocardia met de ML-236B verbinding in aanraking te brengen.

4. Werkwijze volgens één der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het micro-organisme behoort tot een 5 soort uit de groep van Nocardia autotrophica, Nocardia asteroides, Nocardia farcinica en Nocardia coeliaca.

5. Werkwijze volgens één der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men het micro-organisme kiest uit de groep van Nocardia autotrophica FERM P-6181; Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182;

10 Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183; Nocardia autotrophica IFO 12743; Nocardia asteroides IFO 3424; Nocardia farcinica ATCC 3318; en Nocardia coeliaca ATCC 17040.

6. Werkwijze volgens één der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat 15 men een M-4 verbinding bereidt, waarin ~OH 40H voorstelt.

7. Werkwijze volgens één der conclusies 1-6, met het kenmerk, dat men het natriumzout van een verbinding met formule 1 bereidt. Hierbij 1 blad tekening