FI70595C - Framstaellningsfoerfarande foer narasin - Google Patents

Description

1 70595

Narasiinin valmistusmenetelmä

Keksintö koskee menetelmää narasiini-antibiootin tuottamiseksi viljelemällä Streptomyces-sukuun kuuluvaa 5 mikro-organismia elatusaineessa, joka sisältää assimiloi tuvia hiilihydraatin, typen sekä epäorgaanisten suolojen lähteitä, nesteenalaisissa, aerobisissa käymisolosuhteissa, kunnes mainittu Streptomyces-suvun mikro-organismi on tuottanut huomattavan määrän antibioottiaktiivisuutta. Valin-10 naisesti narasiini eristetään elatusaineesta.

Näräsiini on tunnettu polyeetteriantibiootti. Berg et ai. ovat US-patenttijulkaisussa 4 038 384 (FI-patent-tijulkaisu 53837) kuvanneet narasiinin tuottoa Strepto-myces aureofaciens NRRL 5758:n tai Streptomyces aureo-15 faciens NRRL 8092:n käymisen avulla. Katso myös Berg et ai., julkaisussa J. Antibiot. 31 (1978) 1-6.

Boech et ai. kuvaavat sitä artikkelissa "Näräsin, A New Polyether Antibiotic: Discovery and Fermentation Studies", julkaisussa Developments In Industrial Micro-20 biology, osa 18, luku 38, s. 471-485 (Society for Industrial Microbiolog^n julkaisu (1977) .

Narasiini on aktiivinen gram-positiivisia bakteereita, anaerobisia bakteereita ja sieniä kohtaan, ja se on käyttökelpoinen kokkienvastaisena aineena sekä märehti-25 jöillä rehun hyväksikäyttöä lisäävänä aineena.

Keksintö koskee siis uutta menetelmää narasiinin tuottamiseksi, jolle on tunnusomaista, että viljellään juuri löydettyä kantaa,jota merkitään tässä Streptomyces granuloruber NRRL 12389:ksi.

30 Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä uusi mikro-organismi on biologisesti puhdas viljelmä, joka on peräisin maanäytteestä, joka on kerätty lähellä Surinam-jokea, Surinam, Etelä-Amerikka. Identifiointitarkoituksessa viljelmälle on tässä yhteydessä annettu numero A-39912, 35 vaikka, kuten yllä on mainittu, sitä säilytetään numeroituna NRRL 12389:ksi.

2 70595

Viljelmä A-39912 luokitellaan Streptomyces granu-loruberiksi perustuen Streptomyces rubran, Streptomyces griseoruberin ja Streptomyces griseoaurantiacuksen samanaikaiseen viljelyyn käyttäen Shirlingin ja Gottliebin käyttä-5 miä menetelmiä ja elatusaineita /."Methods of Characterization of Streptomyces species", Int. Bull, of Systematic Bacteriol. 16 (1966) 313-340/, yhdessä tiettyjen, täydentävien kokeiden kanssa. Viljelmää A-39912 myös verrattiin Gerberin, J. Antibiot. 28 (1975) 194-199, esittämään, Streptomyces 10 longispororuberia koskevaan kuvaukseen.

Viljelmä A-39912 eroaa Streptomyces rubrasta siten, että se tuottaa jyväsiä, s.o. undekyyliprodiginiinikitei-tä, väriltään sinipunervia, vegetatiivista huovastoa, jonka väri on sinipunervasta mustaan, sekä pelkistämällä 15 nitraattia. Viljelmä A-39912 tuottaa punaista ja harmaata ilmahuovastoa vastakohtana Steptomyces griseoruberin tuottamalle harmaalle ilmahuovastolle. Kasvuhuovasto, jota viljelmä A-39912 tuottaa, on väriltään sinipunervasta mustaan ja eroaa myös Streptomyces griseoruberin tuottamasta 20 kasvumyseelistä, jonka väri on kellanruskeasta punertavan oranssinväriseeen. Streptomyces griseoaurantiacus ei tuota viljelmän A-39912 tavoin tunnusmerkillistä kasvu- huovastoa, jonka väri on sinipunervasta mustaan. Myöskään

Streptomyces griseoruber eikä Streptomyces griseoauran-25 tiacus tuota sinipunervia undekyyliprodiginiinin kiteitä kuten A-39912 tuottaa.

Täten viljelmän A-39912 vertailu yllä mainittujen viljelmien kanssa osoittaa merkittäviä eroja. Viljelmämme arvellaan edustavan uutta lajia ja sitä kutsutaan Strepto-30 myces granuloruberiksi.

Narasiinia tuottavan kannan karakterisointi

Morfologia

Kanta tuottaa spiraalimaisia sporoforeja. Itiöt ovat sileitä, kuten on havaittu elektronimikroskoopilla 35 ja muodoltaan ne ovat soikeasta hiukan sylinterimäiseen.

3 70595

Itiöiden keskimääräinen mitta on 1,3 pm x 2,015 μιη vaihteluvälin ollessa 1,3 umx 1,3 μιη - 2,6 um. Viljelyominaisuudet

Seuraavassa taulukossa I on esitetty Streptomyces 5 granuloruberin kasvuominaisuudet erilaisissa elatusai- neissa.

Värien nimet on annettu ISCC-NBS-menetelmän mukaisesti (K.L. Kelly ja D.B. Judd, "ISCC-NBS Methods of Designating Colors and Dictionary of Color Names", U.S.

10 Department of Commerce Circ. 553, 1955, Washington, D.C). Suluissa esitetyt numerot tarkoittavat Tresnerin ja Bachuksen värisarjoja /H.D. Tresner ja E.J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy", Appi. Microbiol. 11 (1956) 335-338/. Värisuikalemerkinnät on 15 alleviivattu. Maerzin ja Paulin väriryhmät /Ä. Maerz ja M.R. Paul, "Dictionary of Color", McGraw-Hill Book Co., Inc., New York., (1950)_7 on esitetty suluissa.

Taulukko I

20 Viljelyominaisuudet erilaisissa elatusaineissa

Elatusaine:

Tomaattitahna-kaurajauhoagar Ominaisuudet:

Runsas kasvu, kääntöpuoli sinipunervan musta /56E-37; koh-25 talainen ilmahuovasto ja itiöt (GY) 5fe vaaleanharmahta- vanruskeanpunertavista (R) 5dc:een harmahtavankellahtavan-vaaleanpunaiseen. Ei yhtään tai vähän vesiliukoista pigmenttiä .

Elatusaine: 30 Glyseroli-glysiiniagar

Ominaisuudet:

Runsas kasvu, kääntöpuoli tummansinipunertava /55H4/; kohtalainen ilmahuovasto ja itiöt (R) 5dc harmahtavankel-lahtavanvaaleanpunaisia. Ei liukoista pigmenttiä.

70595 4

Elatusaine:

Hiivauute-mallasuuteagar Ominaisuudet:

Runsas kasvu, kääntöpuoli mustasta mustanpunaiseen /5601/: 5 stä /56H12/:een. Runsas ilmahuovasto ja itiöt Wb valkoisesta (GY)d vaaleanharmaaseen; ei ollenkaan tai vaaleanruskeaa vesiliukoista pigmenttiä.

Elatusaine:

Kaurajauhoagar (ISP-elatusaine 4f 3) 10 Ominaisuudet:

Runsas kasvu, kääntöpuolen elatusaine punertavan ruskea /7J7'7; hyvä ilmahuovasto ja itiöt (GY)d vaaleanharmaat; vaaleanruskeaa, vesiliukoista pigmenttiä.

Elatusaine: 15 Epäorgaaniset suolat-tärkkelyagar (ISP-elatusaine4) Ominaisuudet:

Runsas kasvu, kääntöpuoli kohtalaisen punertavanruskea /7j77; runsas ilmahuovasto ja itiöt (R) 5dc harmahtavan-kellahtavan vaaleanpunaisia; ei vesiliukoista pigmenttiä. 20 Elatusaine:

Glyseroli-asparagiiniagar (ISP-elatusaine ^5) Ominaisuudet:

Runsas kasvu, kääntöpuolen elatusaine punertavanruskea /6g97; hyvä ilmahuovasto ja itiöt (R) 5dc harmahtavan-25 kellahtavan vaaleanpunaisia. Ei vesiliukoista pigmenttiä. Elatusaine:

Ravintoelatusaine

Ominaisuudet:

Melko hyvä kasvu, kääntöpuoli harmahtavankeltainen /Ϊ2Β2/; 30 ei ilmahuovastoa eikä itiöitä; ei värinmuodostusta; ei vesiliukoista pigmenttiä.

Elatusaine:

Tryptoni-hiivauuteagar Ominaisuudet: 35 Melko hyvä kasvu, kääntöpuoli harmahtavankeltainen /12B2/; ei ilmahuovastoa tai itiöitä; ei värinluovutusta; ei vesiliukoista pigmenttiä.

it 5 70595

Elatusaine:

Kalsiummalaatti agar Ominaisuudet:

Vaalea kasvu, kääntöpuoli vaaleankeltainen /Ϊ0Β2/. Kohta-5 lainen ilmahuovasto ja itiöt (GY) 2ge vaaleanoliivinrus-keat. Ei vesiliukoista pigmenttiä.

Elatusaine:

Emersonin agar

Ominaisuudet: 10 Runsas kasvu, kääntöpuoli kohtalaisen kellanruskea /Ϊ4Η7/.

Ei ilmahuovastoa eikä itiöitä, ei värinmuodostusta. Ei vesiliukoista pigmenttiä.

Elatusaine:

Glukoosi-asparagiiniagar 15 Ominaisuudet:

Kasvu hyvästä runsaaseen, kääntöpuoli mustanpunainen /56J10/; ilmamyseeliä hyvästä runsaaseen ja itiöt (GY) 5fe vaalean-harmahtavanpunertavanruskeita. Vähäistä, ruskeaa vesiliukoista pigmenttiä.

20 Elatusaine:

Bennettin agar

Ominaisuudet:

Kasvu hyvä, kääntöpuoli harmahtavankeltainen /12J5/; ei ilmahuovastoa eikä itiöitä, ei värinmuodostusta; ei vesiliukois-25 ta pigmenttiä.

Elatusaine:

Tyrosiiniagar

Ominaisuudet:

Kasvu runsas, kääntöpuoli tumman sinipunertava /.54J6.7; 30 ilmahuovasto melko hyvästä hyvään ja itiöt (W)b valkoisesta (R) 6ec harmahtavankellahtavanvaaleanpunaiseen.

Ruskehtavaa vesiliukoista pigmenttiä.

Elatusaine:

Czapekin liuosagar 35 Ominaisuudet:

Melko hyvä kasvu, kääntöpuoli vaaleanoranssinkeltainen 6 70595 /9B27; melko hyvä ilmahuovasto ja itiöt (GY) 2dc kellahta-vanharmaat. Vaaleanruskea, vesiliukoinen pigmentti.

Organismi tutkittiin valittujen fysiologisten omi-5 naisuuksien suhteen standardimenetelmien mukaisesti. Havaitut ominaisuudet ja piirteet on merkitty taulukkoon II.

7 70595

:3 (O

tn tn m cm :3 0) ·· > c u H -H 0 :(0 :r0 :(0 :(0 E id •Η Ή *H Oj po) •Ρ -Ρ -P -P v/ pj .ρ -Ρ H· tn v G G G r-1 0 (U (D 0) TO (0 ε ε e °'° o 3 c tj> tn tn 3 > Q) •h -H -H o E id Φ

Ot Cu ft o (0

Ή G X LIT

(0 (0 rfl φ - -P -P -P I TO -Η öp cn

tn Φ W -H W

•Η -Η -H 0 0 :0 os (0 (0 (0 ·Η Ή Ή · v Pj .. -p-p-p-p-p -PC 'S’ (0 I-H rH rH PS PS ·Η Φ ,:(0 rH 3 3 3 3 3 φ V -Ρ rH pS PS PS Φ Φ -Ρ 3 C0 -Ρ (Λ •Η Ρ Ρ G ·ΓΤ ·· (0 3 (0 Φ G G G G UWC-Plo G ·Η ·Η ·Η G G 3 3 O tn 3 -Ρ * •ΗΤΟΤΟ Τ0ΦΦ -Ρ > m · -Ρ 3 υτ (0 ·Η ·Η ·Η G G ·Η Φ H· U ·Η g WOO ο ·Η ·Η (0 (0 Ο 3 ΟΟ Κ -P3GC G > > 3 3 W PS 3 (Ό tn dP Qj φ -Ρ 3 3 3 ·Η ·Η > > >1 -Ρ ·=Τ ·Η Ό 3 ή rH η η ο m m h tn tn Λ c ut 3 3-Ηφφ (o +J 4-> 3 3 Ο 3 ·· ' ' Ο '3 Η 3 φ g g Ε -η H X ϋ Ρ tnu -Ρ ro >

Htn mm το c ο ·η cu . n tn •H 3 -Η -Η ·Η o O -H -H >1 3 LO 3 φ Λ| 3

03-HWW W Pj Pj W W K OS oj -P Pj ' K

PS G Ή

PS -H -H

3 ε > Ή O 3 3 3

3 -Ρ P

Eh Φ 3 ~

m φ rH

•h tn

tr HtT

O O ^ r·*

rH -P Pj -P II

0 -ρ co 3 -ttr H o H G ,r^ m 3 ^ G Pj > -P -H CO — U-l -H Pj H tn G ε O — >1 G -H φ G Ή ·· -Ρ *H ·Η -Ρ Φ (N G iH > 3 :0 At

rH φ 3 I G -P PS

σ> g K 3 G -Ρ P

CO en -H u-1 -H ·· >j:3

ro -H rH G Pj G G -H :3 -P

1 O. I 3 O Φ Φ tn PS I

< Φ in G G G >i -P

G -Ρ Φ -H -H -H >j 3 -P

φ 3 -p > ε ε ή ji ή φ tn 3 3 I ίρ Φ O Η±;0 tn

•H 33 M -P G P ^ 3 PS

3 > 3 3 tn Φ TO G tn 3 P -h > 0"> -H PS >1 φ ε i—! *H -H 3 PS 3 ΚΦ-Ρ-Η O Φ 3 .G -H I rH Ή G Φ -Ρ -Ρ 3 PS I K -- -H φ rH G-Htn3 ·Η O Ή H I LO G Pj Φ3-Η3 3 -P 3 G G -h -h g tn tn c > ε Φ i

•HOG -H G -H PS 3 3 3 -H K

TO -P O tn -H G 3 >j -P 3 Ή 3 tn Pj

•H Pj -P Pj O -Ρ Ή G Ή 3 tn -H -P

O >iPjCO P 3 -H 3 3 φιΗΡ-Ρ -P G G

G Ρ ΦΗ >j3-P GPSPS Φ0:0 -H · 3 GEhPj'-'EhPGGPSPS I :3 Pj Ρ ή > ή -Ριπρρρικαε o u tn φ · -H φ Φ O ;3 CO W :3 333

SrHtN roKO&jPjE-iM—' K K 52 K

8 70595

Hiilen hyväksikäyttö määritettiin käyttämällä Pridhamin ja Gottliebin peruselatusainetta, johon hiilen-lähteet lisättiin 1,0 %:n loppukonsentraationa, Shirlingin ja Gottliebin, supra, mukaisesti. Hiilenlähteet steriloi-5 tiin ennen peruselatusaineeseen suoritettua lisäystä. Levyt tarkastettiin kahdeksan ja neljäntoista vuorokauden pituisen, 30°C:ssa suoritetun inkuboinnin jälkeen, lopulliset tulokset esitetään.

Hiilen hyväksikäytön tulokset, jotka on saatu käyt-10 tämällä viljelmää A-39912, esitetään taulukossa III.

Taulukko III Hiilen hyväksikäyttö

Substraatti: hiilenlähteet A-39912:n reaktio 14 päi- lisätty Pridhamin ja Gott- vän kuluttua liebin peruselatusaineeseen__ L-arabinoosi ++ D-fruktoosi ++ D-glukoosi ++ 2q i-inositoli ++ D-mannitoli D-raffinoosi + L-ramnoosi * ++ sakkaroosi + 25 D-ksyloosi ++ D-galaktoosi ++ kontrolli-hiili )

Kansainvälisen Streptomyces-projektin hiilenlähteet (Shirling ja Gottlieb, supra).

30

Taulukko III:n selitykset: ++ = voimakkaasti positiivinen hyväksikäyttö + = positiivinen hyväksikäyttö + = epäselvä hyväksikäyttö 35 negatiivinen hyväksikäyttö 9 70595

Solunseinämiä koskevat tutkimukset Käyttämällä organismin hydrolysoituja kokonaisia soluja, määritettiin tiettyjen diagnostisten sokereiden läsnäolo. Eristettyjä solunseinämiä käytettiin diamino-5 pimeliinihapon isomeerien määrittämiseen.

Solunseinämän sokerit määritettiin käyttämällä M.P. Lechavalierin menetelmän muunnosta /"Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera". Näitä menetelmiä kehitettiin työryhmissä, joita rahoitti 10 the Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology, (Dr. Thomas G. Pridham, Convenor), ja jotka toimivat Mikrobiologian laitoksessa, Rutgerin yliopisto, New Jerseyn valtionyliopisto, New Brunswick, N.J., (1971)/7.

Diaminopimeliinihapon isomeerit määritettiin käyttämällä 15 Beckerin et ai. menetelmää, Appi. Microbiol. 11 (1964) 421-423. Kaikki levyt tarkastettiin kahdeksan-neljäntoista vuorokauden kuluttua 30°C:ssa suoritetun inkuboinnin jälkeen. Tulokset näistä soluseinämätutkimuksista on esitetty alempana.

20 _Koe_Havaittu tulos_ 2,6-diaminopimeliinihapon LL-isomeeri isomeerit

Havaitut diagnostiset Glukoosi, riboosi sokerit 25 Kannan A-39912, Streptomyces (chainia) rubra ATCC 17755:n, Streptomyces griseoruber ATCC 23919:n sekä Streptomyces griseoaurantiacus ATCC 19840:n hiilen hyväksikäytön vertailu on esitetty seuraavassa taulukossa IV.

10 70595 Ö

O

oo en

I—I

U

- u c 3 ·· <

LO

LO en r·** d o rH ro

•H

L> 4J

g § § C M co d en ft3 rö Ή + + jj § H ί ί 1 ί ί ί ' J * fÖ •H co en -5 8 S? . 5 I atiiiitiii.

^ 2§ o a o

O CO (D H

S 8 ϋ *

3 I W ml S

3 n m m 4-i 03 -P ·η Γ- >i EH a Γ" + :rfl

033 r-H-i- I + + +I+ + + +I

•Ö σι u en co ή p -ro < ’> G cm S, · x cm n

1—I O O :Q

en K 3 4-> :0

σ < e 4-> -P

ro cn X in 4-> I S-ι ^ > :o3 :0 >,

< 03 σ ·Η X 4J :oJ

| Ϊ t ♦ t t t , t ♦, | g § |

•ä SI ! * I I

tn X +3 e > CO :¾] $ C X § 8 3 $ > X 5 & CO 3 -H > >

q 5¾ 03 to -H -H E "-D a! -H

-P S X -H O -H -H CO rH -H -H -H CO 4-3 & XCOQlOIO'HQQ CO O (0 OT 03 S * 38588^25-08 > a l· S' 8 S δ·3·80^5·3§85 c ^dägjaseSiiti 11 11 11. 11 x BoirailiHiiilS ί + + 1 70595 li

Taulukossa V on esitetty samankaltaisuuksien ja erilaisuuksien vertailu A-39912:n ja Ctreptomyccs (chainia) rubran ATCC 17755,Streptomyces griseoruberia ATCC 23919 sekä Streptomyces griseoaurantiacuksen ATCC 19840 välillä.

i2 70595 m m Q) p u O (3

>- ft G <D

ε 1 2

5 -P £ im I

o q -h jj 3 p

-Piin 3 m d <3 q -P

Qi 3 Hr oi E -p g o o d -p λ: B c o p m 2! S d a <e 3 m

X d 00 O (3 ?£ > -P I

p* ^ φ <3 HCratö C

co -P -P rn P 2 -H Pj G +| O

C -H Ή :fÖ 3 ί> t E -f -P

^ (rt U k ^ Φ -h ·Η 3 H di+J

·, ι,Γ O &1 Q-ι r-j rH ·Η C ίϋ (DP

2 H*cn ·ηφ<η3κ Cu C

<co co o a

in G r~ O

<" <D ai m I

1-1 .¾ ij £ (3 -P

. ii σι p -H (Up

O ί^-, I—I M J3 .M £ :P I

u σ» Q e m 3 > -h

E-ι m £ $ -p p > £ O

^mOvimi-j h g -p ^ n -p <3 g -p m ra -h U U U (3 :G 3 P m G £ (3 > ynp Qj-H<uri s i + o 4-> i PS Β| · ·Ρ rp .-P £ 3 £ P -P p _QO <C CO CB -H 11 p p φ G &, £ "P jj co co^&ock a>3 p a λ -p

CU

^ (0 P 2 > ·ρ cn s o c p

y -H :n3 G q I I

2 (3 ,Ρί i—I O I -H p 3 .£ Φ -P „ xj m g H -p 1—I r i m m cco (3 (o «G ·ρ

3 „ 2 Ln -d I m > > O

ίο g -h p g q £ en £., £ P Γ" -P -h P -P -P (U >i m ·· g -p G g £ ri i ra £ ή

G > P «m m fl O ie -H O

2 ~ p ---^ -p -p p .p m 3 £ £ p -p ρ ρ ε3·α<α-ρφρρφρ >1 g

S n G CcOcOBtO^ttOGfX CC G

O (N C

4-> -P (3 äuh $ 0 O :<3 tn

P EH > | Ip I

-P < P (3 , P P

^ u?. i 11¾ § 5S 3 r^n° <N P S G g $ m m £ X! rp g 3^-Pmfö + +-h i

· 3 co σ> rd :G O. P, P P -P 3 S

p! ° ^ 0<S P p 5 53 §3 a +> Πο < coc co co>+jSäx: oig

ro -H O

1 p b . .g rf! C7i<CI q ,—^ 3 4-1 £ -P <3 g Φ q <u -h -x a S 3 p q § .§ g c | S g 2 c g i3 -d -d q I -S -h 3 3-p .p q oi 2e-P>id χία m -r? 5? α -p ui -pcDp-pp -p θ3δ m G •pqr3C04-> o e o P 9 P £ G E 4->3 (3 -P -P qcu-p j ^ S S 1¾ 3 3 3 3 b 7^ s S | ä s I 3 f s ,1 s s. s s 3 3

II

i3 7 0 5 9 5 rt •Η

-U

§ ^ o 3 lii rt

co Q σ\ Φ r-1 CO •H

u ^ # ? < cn 5-1

QJ

CTi ^ 8 j co t/) m

CM -H III

u — <1 cn to

O

V (0 (0 S-i •ro > _ O ld (0 1-3 x UO -H II I 3 3 ["· c P Γ Ή ι-H I—I rt

?o u 'S

<C co

CNI

'—I

σι ..

σ . >-+ I

co +++3 + i -5 "s I CM ro C-.

W -H

"8 I I \i\ 7 O (0 -H I I, 5-j +) a (C fc «· · to ή Pj I ?S! 31 Jo || *3 B 5-S ii-H h'-tj cn Sea·· ftfc + o (0+15-1 a)d| O T3 Φ <ocqw+>t-i-hcq; T5+’ I—I *h q to —I μη-I (OtO xi v-l Φ q -q

Ο φ -Η Ή Γ+ ί ή I -H £ 3 -V

Φ 4J E H -H ga CDHO

o -h 9 ή φ o to ^ gj cn \ 3 +5 > C EH M (M B ·Η Ή i4 70595

Joukko näiden neljän kannan morfologisia ja fy-fysiologisia ominaisuuksia täsmää paitsi kasvuston väri, ilmamassan väri ja jyvästen muodostuminen erilaisilla elatusalustoilla kuten on esitetty taulukossa V.

5 Narasiinia tuottava Steptomyces granuloruber - organismi on talletettu Northern Regional Research Centerin viljelmäkokoelmaan, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, josta se on yleisön saatavissa numerolla NRRL 10 12389.

Narasiinin tuottamiseen Streptomyces granuloruber NRRL 12389:n avulla voidaan käyttää monia erilaisia elatusaineita. Näiden elatusaineiden tulisi sisältää assimiloituvia hiilen- ja typenlähteitä sekä epäorgaani-15 siä suoloja. Sopiviin hiilenlähteisiin kuuluvat glukoosi, tärkkelys ja dekstriini. Sopiviin typenlähteisiin kuuluvat peptoni, entsyymihydrolysoitu kaseiini, puuvil-lansiemenjauhe sekä lihapeptoni.

Organismin kasvulle ja kehitykselle välttämät-20 tömiä hivenalkuaineita saattaa esiintyä elatusaineen muiden aineosien epäpuhtauksina riittävissä määrin tyydyttämään organismin kasvu- ja biosynteottiset vaatimukset. Kuitenkin saattaa olla hyödyllistä sisällyttää elatusaineesecn muita liukoisia, epäorgaanisia suo-25 loja sisältäviä ravintoaineita, jotka voivat tuottaa natrium-, kalium-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, fosfaatti-, sulfaatti-, nitraatti- y. m.s. ioneja.

Huomattavien narasiinimäärien tuottamiseen NRRL 30 12389:n avulla käytetään hyväksi nesteenalaista, aero bista käymistä säiliöissä. Kuitenkin saatetaan saada pieniä määriä narasiinia ravistuspulloviljelmien avulla. Säiliökäymistä varten on suotavaa käyttää vegetatiivi-ymppiä. Vegetatiiviymppi valmistetaan ymppäämällä pieni 35 tilavuus elatusaineita iliöillä, huovaston palasilla tai is ”0595 lyofilisoiduilla organismin palloilla, jotta saadaan tuore, aktiivisesti kasvava organismin viljelmä. Vegeta-tiiviymppi siirretään sitten suurempaan säiliöön, jossa sopivan inkubointiajän jälkeen narasiinia tuotetaan op-5 timisaannoin.

Ymppäämättömän käymiselatusaineen pH vaihtelee tuottamiseen käytetyn elatusaineen mukaisesti, mutta kaikkien käymiselatusaineiden pH sattuu noin pH 6,5-7,5:n alueelle.

10 Tämä narasiinia tuottava organismi voi kasvaa laajalla lämpötila-alueella, joka on noin 25°-43°C. Narasiinin optimituotto NRRL 123 89:n avulla näyttää sattuvan lämpötilassa noin 30°C.

Kuten on tavallista aerobisissa, nesteenalaisis-15 sa viljelymenetelmissä, steriili ilma dispergoidaan elatusaineen läpi. Jotta organismi kasvaa tehokkaasti, säiliötuotossa käytetyn ilman määrä on noin 0,25-1,0 tilavuutta ilmaa elatusaineen tilavuutta kohti minuutissa (tilav./tilav./min). Optiminopeus 10-litran ve-20 toisessa astiassa on noin 0,2 tilav./tilav./min käytettäessä ravistelua, joka aikaansaadaan tavanomaisen siipirattaan avulla, joka pyörii noin 400 kierrosta/min. Saattaa olla tarpeellista lisätä pieniä määriä (se on 0,2 ml/1) vaahdonestoainetta, kuten esim. propvleenigly-25 kolia, suuressa mittakaavassa suoritettavaan käymis- elatusaineeseen, jos vaahdonmuodostus tulee ongelmaksi .

Narasiini-antibiootin tuottamista voidaan käymisen aikana seurata joko agar-diffuusio - tai turbidi-30 metrisin menetelmin. Käyttöön soveltuviin koeorganis- meihin kuuluvat Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis ja Micrococcus luteus.

Antibioottiaktiivisuutta on yleensä läsnä noin 40 tunnin kuluttua ja sitä on ainakin kahden tai useam-35 man päivän ajan käymisjakson kuluessa. Antibiootin tuoton huippu sattuu noin 2-4 päivän kohdalle käymisen aikana.

____ - ΤΓ~ 705 9 5

Narasiini-antibiootti voidaan ottaa talteen käy-miselatusaineesta yleisesti tunnetuin menetelmin, joita ovat kuvanneet Berg et ai. US-patenttijulkaisussa 4 038 384 .

Uusi, narasiinia tuottava organismi Streptomyces 5 granuloruber, NRRL 12389, tuottaa huomattavia määriä narasiinin tekijä A; a sekä vähäisiä määriä narasiinin tekijöitä B ja D. Yhdisteitä saatetaan haluttaessa saada yksinkertaisina antibiootteina puhdistamalla kompleksia edelleen esim. pyiväskromatografiatekniikan avulla.

10 Näitä tekijöitä kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 038 384, joka on tähän sisällytetty ja muodostaa osan tästä patenttihakemuksesta .

Seuraavat esimerkit, joissa käytetään erilaisia elatusaineita, esitetään valaisemaan täydellisemmin 15 keksinnön toimintaa.

Esimerkki 1

Seuraavat elatusaineet valmistettiin käytettäviksi Streptomyces granuloruberin NRRL 12389, agar-vinopin-taviljelminä: 20 Aineosa Määrä (g/1)

Perunadekstriini 10,0

Entsyymihydrolysoitu kaseiini 2,0

Naudanlihauute 1,0 25 Hiivauute 1,0

Agar 2,0 2

Czapekin mineraaliliuos 2,0 ml/1

Deionisoitu vesi q.s. 1,0 litraan 30 ^N-Z-amiini A (Humbo Sheffield Chemical co., Memphis, Tenn.) 2

Czapekin mineraaliliuos valmistetaan seuraavista aineista : 17 70595

Aineosa Määrä (g/100 ml) KC1 10,0

MgS04’7H O 10,0

FeS04-7H20 0,2 5 Deionisoitu vesi q.s. 100 ml:aan S treptcrcyces granuloruberin NRRL 12389 itiöitä ympättiin ravinneagar-vinopinnalle, joka oli valmistettu yllämainituista aineosista, ja täten ympättyä vinopintaa in-10 kuboitiin noin 7 päivän ajan noin 30°C:n lämpötilassa.

Kypsä vinopintaviljelmä peitettiin sitten vedellä ja sitä raaputettiin steriilillä työkalulla itiöiden ja huovaston irroittamiseksi. Itiösuspensiota käytettiin yksi millilitra ympättäessä 100 ml:aan kasvatuselatus-15 ainetta, jolla oli seuraava koostumus:

Aineosa Määrä (g/1)

Dekstroosi 15,0

Soijapapujauho 15,0

Maissinliotusneste 5,0 20 CaC03 2,0

NaCl 5,0

Czapekin mineraaliliuos 2,0 ml/1

Deionisoitu vesi q.s. 1,0 litraa 25 Vegetatiiviymppiä inkuboitiin 500 ml:n vetoisessa suurisuisessa erlenmeyer-pullossa, noin 30°C:ssa 48 tun- -3 nm ajan täryravistimessa, jossa iskun pituus oli 50,8 . 10 m ja 108 heilahdusta minuutissa. Tätä ympättyä elatusainet-ta käytetään joko ympättäessä pieniä käymisastioista (ym-30 pin ollessa arviolta noin 1 % käymiselatusaineen tilavuutta kohti) tai ympättäessä toisen vaiheen käymispulloja, joissa tuotetaan suurempi tilavuus huovastoa.

Kahdensadan millilitran erät tuotantoelatusainet-ta pantiin 1 litran vetoisiin erlenmeyer-pulloihin, ja niitä ie 7°595 steriloitiin l21°C:ssa noin 30 minuutin ajan. Tuotanto-elatusaineella oli seuraava koostumus:

Aineosa Määrä (q/1)

Dekstroosi 10,0 5 Syötävä melassa 20,0 3acto-peptoni 5,0

CaC03 2,0

Czapekin mineraali- liuos 2,0 ml/1 10 Deionisoitu vesi g.s. 1,0 litraa Jäähdyttämisen jälkeen pullot ympättiin ve-getatiiviympin 5 %:lla ympillä. Viljelmää inkuboitiin täryravistimessa, jossa iskun pituus oli 50,8 .10 ^m ja 108 heilahdusta minuutissa. Käymisen pH 72 tun-15 nin päätyttä oli noin 7,5. Käyminen suoritettiin 30°C:ssa

Esimerkki 2

Narasiinia tuotettiin käyttämällä steriiliä tuo-tantoelatusainetta, jolla oli seuraava koostumus: 20 Aineosa Määrä (g/1)

Silikoni-yaahdonesto- aine^ 0,2

Glukoosi 10,0

Melassi 20,0 25 Peptoni (Difco) 5,0

CaC03 2,0

Deionisoitu vesi q.s. 9,0 litraan

'''Dow-Corning Antifoam A

30 Tätä tuotantoelatusainetta, jonka pH oli 6,8, steriloitiin noin 30 minuutin ajan 121°C:ssa 110-124 kPa:n paineessa. Steriloidun elatusaineen pH oli 6,9. Steriloitu elatusaine ympättiin 2,0 % ympillä, joka oli saatu toisen vaiheen elatusaineesta esimerkis-55 sä 1 kuvatulla tavalla. Ympätyn tuotantoelatusaineen an- 19 70595 nettiin käydä 10 litran vetoisessa käyraissäiliössä noin 3 päivän ajan, noin 30°C:n lämpötilassa. Käymiselatus-ainetta ilmastettiin steriilillä ilmalla nopeudella 0,2 tilavuus/tilavuus/min, ja sitä sekoitettiin tavan-5 omaisilla ravistelijoilla, nopeudella 400 kierrosta minuutissa.

Esimerkki 3

Eristys ja puhdistaminen 18 litran erä käymislientä säädettiin pH 3:ksi IN 10 rikkihapon vesiliuoksella, ja sitä sekoitettiin yhden tunnin ajan. Liemi suodatettiin käyttäen suodatuksen apuainetta (Hyflo Supercel suodatuksen apuaine, piimää, valmistanut Johns-iManville Corporation) , ja suodatuskakku pestiin vedellä. Suodatuskakku uutettiin 1 1:11a meta-15 nolia, joka sisälsi 3 % hapanta kaliumkarbonaattia, ja sekoitettiin samalla yhden tunnin ajan ja suodatettiin. Suodatuskakku uutettiin sitten uudelleen 9 litralla me-tanolia. Metanoliuutteet yhdistettiin ja väkevöitiin noin 2 litran tilavuuteen, ja pH säädettiin 7,5:ksi IN 20 rikkihapon vesiliuoksella. Seos uutettiin kaksi kertaa 2 litran suuruisilla etyyliasetaattierillä. Uutteet yhdistettiin ja väkevöitiin tyhjössä jäännökseksi, joka liuotettiin 150 ml:aan asetonia. Asetonilluokseen lisättiin 150 ml vettä, ja pH säädettiin 3,0:ksi käyttäen IN 25 suolahapon vesiliuosta. Seosta sekoitettiin noin yhden tunnin ajan.

Muodostuneet öljymäiset kiteet suodatettiin ja liuotettiin 150 ml:aan asetonia ja lisättiin 150 ml vettä. Liuosta pidettiin yön yli huoneenlämpötilassa ja 30 muodostuneet kiteet suodatettiin, pestiin vedellä ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin kiteitä, joilla oli öljymäinen kalvo.

Öljymäiset kiteet liuotettiin 5 ml:aan bentseeniä ja pantiin bentseeniin valmistettuun piihappogeelipylvää-35 seen (1,8 x 40 cm- "Grace grade 62" piihappogeeli). Pylväs pestiin peräkkäin 250 ml:n tilavuuksilla bentseeniä, bentseeni: 20 70595 etyyliasetaattia (9:1), (4:1), (7:3), (1:1), sekä etyyliasetaatilla, kooten jakeet, joiden tilavuudet olivat 20-25 ml. Aktiivisuuden eluoitumista tarkkailtiin biologisen tehonmäärityksen avulla sekä ohutlevykromato-5 grafialla, jossa käytettiin piihappogeelilevyjä ja etyyliasetaattia kehitysliuottimena. Vanilliinirikkihapposuih-ketta käytettiin täplien havaitsemiseen ja Bacillus subtllista käytettiin ilmaisuorganismina. Jakeet, jotka sisälsivät vain yhden komponentin, joka identifioitiin nara-10 siiniksi, yhdistettiin ja väkevöitiin kuivaksi tyhjössä. Jäännös liuotettiin 50 ml:aan asetonia, lisättiin 50 ml:aa vettä, ja liuoksen annettiin seistä huoneenlämpötilassa kiteytymisen tapahtumiseksi. Muodostuneet kiteet suodatettiin ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 172 mg valkoisia 15 kiteitä, joiden sulamispiste oli noin 75-78°C.

Vertailemalla NMR-, IR-, UV- sekä massaspektri- ja ohutlevy- ja paperikromatografisiä tietoja kiteiden osoitettiin olevan identtisiä narasiinin kanssa. Biologiset tiedot - mikrobien- ja kokkien vastainen teho - olivat 20 identtisiä aidon narasiinin kanssa. Sinipunertavien A-39912:n tuottamien kiteiden identifioimiseksi käytettiin seuraavassa esimerkissä 4 kuvattua menetelmää.

Esimerkki 4

Undekyyliprodiginiini - valmistus ja identifiointi 25 Muoviset kromatografialevyt, mitoiltaan 23 cm x 45 cm, 10 mm:n korkuisin reunoin ja sisältäen 250 ml tomattitahna-kaurajauhoagaria ja jotka oli valmistettu Prihamin et ai. ohjeiden mukaisesti, Antlbiot. Ann. 1956-1957, ss. 947-953, ympättiin 48 tunnin ikäisellä ympillä käyttäen tryptoni-30 hiivalientä sekä Shirlingin ja Gottliebin, supra, risti-viivoitusmenetelmää. Tryptoni-hiivaliemellä oli seuraava koostumus: 70595 21

Aineosa Määrä (g/1)

Tryptoni (Difco) 5,0

Hiivauute 3,0

Tislattu vesi q.s. 1,0 litraksi 5

Ennen käyttöä suoritettua autoklavointia edeltävä liemen pH oli 7,0-7,2. Ymppäyksen jälkeen levyjä inku-boitiin 14 päivän ajan 30°C:ssa, jona aikana havaittiin agarilla sinipunertavia kiteitä.

10 Sinipunertavia kiteitä sisältävä agar leikat tiin irti viljelmän kasvun ulkokehää pitkin ja uutettiin neljä kertaa 500 ml:11a kloroformi: metanoli (4:1) - seosta sekoittaen 15 minuutin ajan höyryhauteen yläpuolella. Uutteet yhdistettiin ja väkevöitiin kuivaksi 15 tyhjössä. Jäännös liuotettiin 12 ml:aan kloroformia ja kromatografoitiin piihappogeelipylväässä (Grace 62", 1,2x52 cm), joka oli pakattu kloroformiin. Pylväs elu-oitiin kloroformilla kooten 10 ml:n suuruisia jakeita.

Jakeen 34 kohdalla eluointiliuos muutettiin kloroformi: 20 metanoli-liuokseksi (95:5). Eluoituja jakeita tarkkailtiin ohutlevykromatografiän avulla, piihappogeelilevyillä, käyttäen kloroformi: metanoliseosta (9:1) sekä havaitsemalla sinipunertavanväriset täplät. Jakeet 9-14, jotka sisälsivät voimakkaimman sinipunertavan värin (yksinkertainen 25 täplä ohutlevykromatografiassa), yhdistettiin ja väkevöitiin kuivaksi. Jäännös liuotettiin dioksaaniin ja lyo-filisoitiin, ja saannoksi saatiin 10,3 mg sinipunerta-vanväristä jauhetta. Sinipunertavanvärinen jauhe antoi molekyylimassaionin 393.27764 suuren erotuskyvyn omaavan 30 valintatörmäysmassaspektrometrian avulla ja huippujen yhteensopivuuden perusteella empiirisen kaavan Cj^H^N^O. Nämä tiedot yhdessä undekyyliprodiginiinin ultravioletti-, infrapuna- ja NMR-spektrin, jotka on esitetty julkaisuissa Agr. Biol. Chem. 31 (1967) 481, ja J. Antibiot. 28 (1975) 35 194, kanssa suoritetun vertailun kanssa soivat mahdollisuu den identifioida sinipunertavanvärinen jauhe undekyylipro-dig