PL129644B1 - Process for preparing narazine - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku Jeet eposób wytwarzania narazyny.Narazyna jeet znanym antybiotykiem polieterowym. Wytworzenie narazyny przez fer¬ mentacje Streptomyces aureofecienee NRRL 5758 lub Streptomyces aureofacienes NRRL 8092 opieall Berg 1 Wep. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 038 384 /patrz równiez: Berg i wsp., O.Antibiot., 31 1-6 /1978//.Boeck 1 wep. ee autorami publikacji pod tytulem "Naraein, A New Polyet har Antibio- ticj Dlecovery and Fermentation Studiee", Rozdzial 38, etr. 471-485, tom 18, Develop- ¦ente In Induetrial Microbiology /A Publication of the Society for Induetrial Micro- biology /1977//. Narezyna wykazuje aktywnosc wobec bakterii Gram-dodatnich, bakterii beztlenowych oraz grzybów i jest uzyteczna jako srodek przeciwbakteryjny orez srodek wzmagajecy wykorzystanie paezy u przezuwaczy.Ceche sposobu wedlug wynalazku jeet to, ze prowadzi sie hodowle Streptomyces gra¬ nulo ru ber NRRL 12389 w podlozu hodowlanym zawierajecyn zródlo przyswejelnego wegle, azotu 1 eoll nieorganicznych, w warunkach tlenowej fermentacji glebinowej, ez do wy¬ tworzenia przez mikroorganizm w podlozu hodowlanym produktu o znacznej aktywnosci antybiotycznej, po czym ewentualnie wyodrebnia eie narazyne z podloza hodowlanego.Nowy drobnouetrój, Streptomyces granuloruber NRRL 12369, jest biologicznie czyste kulture wyodrebnione z próbki gleby zebranej kolo rzeki Surinem w Surinamie w Ameryce Poludniowej. W celu identyfikacji kulturze nadano nr A-39912.Kulture A-39912 sklasyfikowano Jako Streptomyces grenuloruber ne podetawle wlasci¬ wosci hodowlanych podobnych do Streptomyces rubra, Streptomycee grieeoruber i Strepto¬ myces grieeoaurentiocus przy uzyciu metod i podlozy polecenych przez Shirlinge i Got- tlleba /"Methode of Characterization of Streptomycee epeciee", Int.Buli. of Syetematic Becteriol., 16, 313-340 /1966//, wraz z pewnymi teetami uzupelniejecymi. Kulture1~° A-39912 porównano równiez z opisem Streptomyces longispororubsr z doniesienia Gerbera, O.Antibiot., 28, 194-199 /1975/.KuitL;r£. A-33312 rc±.;i eic cd Ct. iplomyccs rjbrc t..crzsniein granulek, te j09t kry¬ sztalków undecyloprodiginy, barwnika o barwie purpurowo-czerwonej, tworzenie* grzybni wegetatywnej o barwie purpurowo-czerwonej do czarnej i redukowaniem azotanu* Kultura A-39912 tworzy grzybnie powietrzne o barwie czerwonej i szarej, w przeciwienstwie do grzybni powietrznej Streptomyces grieeoruber o barwie szarej. Grzybnia wegetatywna o barwie purpurowo-czerwonej do czarnej tworzona przez kulture A-39912 rózni sie takze od grzybni wsgetatywnej o barwie zólto-brezowej do czerwonawo-ponaranczowej Streptony¬ ces grieeoruber. Streptomyces grlssoaurantiacus nis tworzy charakterystycznej grzybni wegetatywnej o barwie purpurowo-czerwonej do czarnej, jak to zachodzi w przypadku kul¬ tury A-39912. Ani Streptonyces griseoruber, ani Streptonyces grlseoaurantiacus nie tworze krysztalów undscyloprodiginlny, jak to na miejsce w przypadku A-39912.Tak wiec, porównanie kultury A-39912 z wyzej wymieniony*! kulturami wykazuje wyra¬ zne róznice. Tak wiec opieywane kulture uwaza sie za nowy gatunek 1 zostala ona opisa¬ na jako Streptomyces granuloruber.Ponizej podano charakterystyke szczepu wytwarzajecego narazyne.A. Morfologia.Wytwarza eporofory zwiniete w spirale. Zarodniki, jak to ustalono za ponoce mikro¬ skopii elektronowej, se gladkie, ksztaltu owalnsgo lub lekko cylindrycznego. Zarodniki mierze srednio 1,3 ^jm x 2,015 yun w zakresie: 1,3/jh x 1,3 yum x 2,6/jn.B. Charakterystyka hodowli.Charakterystyke wzrostu Streptomyces granulorubsr na róznych podlozach przedstawia tablica 1. Nazwy barw przytoczono zgodnie z netode ISCC-NBS /K.L.Kelly i D.B.Oudd, "The ISCC-NBS Methods od Dssignatlng Colors and a Dlctionary of Color Neraes", U.S.Department of Comnerce Circ., 553, 1955, Washington, D.C./. Znaki w nawiasach odnosze sie do serii barw Tresnera 1 Backuea /H.D. Tresner i E.O.Backus, "System od Color Wheels for Strsptomycsts Taxonomy"f Appl.Microbiol., 11, 335-338 /1956//. Oznaczenia barw se podkreslone. Zbitki odnoszece sie do barwy, wedlug Meerza i Paula /A.Maerz i M.R.Paul, "Dlctionary of ColorM, McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, N.Y. /1950// zamkniete se w nawiasach kwadratowych.129 644 Tablica 1 I Podloze 1 Agar owsiany 1 z paste I pomidorowe 1 Agar z gliceryne I 1 glicyne 1 Agar z ekstraktem 1 drozdzowym 1 elo- 1 dowym 1 /Podloze ISP 2/ 1 Agar owsiany 1 /Podloze ISP 3/ 1 Agar ekrobiowy I z solami nie- 1 organicznymi /Podloza ISP 4/ 1 Agar z gliceryne 1 1 esparaglne 1/Podloze ISP 5/ 1 Agar odzywczy 1 Agar z ekstraktem 1 drozdzowym 1 1 tryptonem 1 Agar z Jeblczenem 1 wapniowym 1 Agar Emersona 1 Agar z glukoze 1 esparaglne Agar Bennetta Agar z tyrozyne Agar z roztworem Czapka Charakterystyka Wzrost obfity, od dolu barwa purpurowo-czerne |56E8_J, dosc dobrze rozwinieta grzybnia powietrzna 1 zarodniki /GY/ 5fe jesnoszarawo- -brezowo-czerwone do /R/ 5dc ezarawo-zóltawo-rózowych. Brak pig¬ mentu lub slaby brazowy pigment rozpuszczalny w wodzie. wzrost obfity, od dolu barwa ciemnopurpurowo-czerna [55B4J, dosc dobrze rozwinieta grzybnia powietrzne 1 zarodniki /R/ 5dc szarawo- -zóltawo-rózowe. Brak rozpuszczalnego pigmentu. wzrost obfity, od dolu barwa czarne do czarnawo-czerwonej [56ClJ do [56H12]. Obfita grzybnia powietrzna i zarodniki /W/ b biale do /GY/ d jasnoszarych, brak pigmentu lub slaby brezowy pigment rozpuszczalny w wodzie.Wzrost obfity, od dolu podloze czerwonewo-brezowe [737], dobrze 1 rozwinieta grzybnia powietrzna i zarodniki /GY/ d jasnoszara, slaby brezowy pigment rozpuszczelny w wodzie. wzrost obfity, od dolu barwa umiarkowanie czerwonawo-brezowa (/739JJ obfita grzybnia powietrzna 1 zarodniki /R/ 5dc ezarawo-zóltewo-ró- zowe, brak pigmentu rozpuszczalnego w wodzie.Wzroet obfity, od dolu podloze czerwonawo-brezowa [6G9J, dobrze 1 rozwinieta grzybnie powietrzna 1 zarodniki /R/ 5dc szarawo-zóltawo-| -rózowa. Brak pigmentu rozpuszczalnego w wodzie. I Wzrost dosc dobry, od dolu barwa szarawo-zólta fl2B2l, brak grzy- 1 bni powietrznej i zarodników, brak oznaczania barwy, brak pigmentu 1 rozpuszczalnego w wodzie. I Wzrost dosc dobry, od dolu barwa szarawo-zólta £l2B2l, brak grzyb- 1 ni powietrznej 1 zarodników, brak oznaczenia barwy, brak pigmentu 1 rozpuszczalnego w wódzia. 1 Wzrost dosc dobry, od dolu barwa bladozólta [lOB2J. Dosc dobrze 1 rozwinieta grzybnia powietrzna 1 zarodniki /GY/ 2ge jasnoollwkowo- 1 -brezowe. Brak pigmentu rozpuszczalnego w wodzie. 1 Wzrost obfity, od dolu barwa umiarkowanie zólto-brezowa [l3B7l. 1 Brak grzybni powietrznej i zarodników, brak oznaczenie barwy. Brak 1 pigmentu rozpuszczalnego w wodzie. 1 Wzrost dobry do obfitego, od dolu barwa czernawo-czerwona 1 ["56010J, dobrzs rozwinieta do obfitej grzybnia powietrzna i zaro- 1 dniki /GY/ 5fe Jesnoszarawo-czerwonewo-brezowe. Slaby brezowy pi- 1 gment rozpuszczalny w wodzie. 1 Wzrost dobry, od dolu berwa szarawo-zólta [l235j, brak grzybni po- 1 wietrznej i zarodników, brak ozneczenle barwy, brak pigmentu roz- 1 puszczalnego w wodzie. I Wzrost obfity, od dolu barwe ciemnopurpurowo-czerwona [5406], dosc I dobrze do dobrze rozwinietej grzybnie powietrzna i zarodniki /W/ b 1 biale do /R/ 6ec ezarawo-zóltawo-rózowe. Brezowawy pigment rozpu- I szczelny w wodzie. 1 Wzrost dosc dobry, od dolu barwa bledopomerenczowo-zólte f9B2j, 1 dosc dobrze rozwinieta grzybnia powietrzne 1 zarodniki /GY/ 2dc 1 zóltawo-szare. Slaby brezowy pigment rozpuszczalny w wodzie. 14 j.2.^ o-*4 Organizm badano pod wzgledem wybranych wlasciwosci fizjologicznych zwyklymi meto¬ dami. Zmh^oi r»o»»ar,£ wla£„iiwwci i J^r.e charakterystyczne podano w tablicy 2.Tablica 2 1 Badane wlasciwosci 1 Podloze, na którym wytwarza sie pigment 1 podobny do melanoidu 1 1* Podloza z ekstraktem drozdzowym 1 i tryptonem /ISP nr 1/ 1 2. Skosy z peptonem, ekstraktem drozdzo- 1 wym i zelazem /ISP nr 6/ 1 3. Skosy agarowe z tyrozyne /ISP nr 7/ 1 Redukcja azotanów 1 Uplynnianie zelatyny Kawalek ziemniaka Kawalek marchwi 1 Hydroliza skrobi Uzywac podloza ISP nr 4 /skrobiowe z solami nieorganicznymi/ Wymagania co do temperatury Mleko odtluszczone Tolerancja na NaCl Zakres pH, przy którym nastepuje wzrost Wlasciwosci i dane charakterystyczne 1 stwierdzone Brak pigmentu podobnego do melanoidu Brak pigmentu podobnego do melanoidu Brak pigmentu podobnego do melanoidu Reakcja dodatnia Reakcja dodatnia - 100 % po 14 dniach Brak wzrostu Brak wzrostu Hydrolizuje Wzrost obfity i wytwarzanie zarodników od 25°C do 43°C. Brak wzrostu przy < 25°C i 43°C. 1 Peptonizuje ^ 3,5 % lecz < 4,0 % | Wzrost od pH 5,5 do pH 9,5 1 Wykorzystanie wegla okreslano przy uzyciu podloza podstawowego Pridhama i Gottllebe, do którego dodano róznych zródel wegla do koncowego stezenia 1,0 %, zgodnie ze wskazów¬ kami Shirlinga 1 Gottlieba, jak wyzej. Zródla wegla przed dodaniem do podloza podsta¬ wowego wyjalowiono* Plytki odczytywano po 6 i 14 dniach inkubacji w temperaturze 30°C i koncowe odczyty zarejestrowano.Wyniki testów wykorzystania wegla przeprowadzonych z hodowle A-39912 zamieszczono w tablicy 3.Tablice 3 1 Substrat: zródla wegla dodane do podloza 1 podstawowego Pridhama 1 Gottlieba L-Arabinoza D-Fruktoza D-Glukoza I-Inozyt D-Mannit D-Raflnoza L-Ramnoza Sacharoza 1 D-Ksyloze D-Galaktoza Kontrola - wegiel Reakcja A-39912 po ++ ++ + ? ?+ - + ++ + ++ + ? - 14 dniach1^.9 Ó44 5 zródla wegla wedlug: International Streptomyces Project /Shlrllng and Gottlieb, jak wyzej/ Znaczenie: ?+ = przyswajanie silnie dodatnie, ? ¦ przyswajanie dodatnie, * e przy¬ swajanie wetpliwe, ~ c przyswajanie ujemne.C. Badania sciany komórkowej.Obecnosc pewnych cukrów o znaczeniu diagnostycznym rozpoznano przy uzyciu zhydroli- zowanych calych komórek organizmu. Do rozpoznania izomerów kwasu dwuamlnopimellnowego uzyto wyodrebnionych scian komórkowych. Cukry sciany komórkowej rozpoznano zmodyfiko¬ wane metode M.P.Lechevaliera /"Chemical Methods as Criteria for the Separation of Acti- nomycetee Into Genera"/. Metody te rozwinieto na sesjach roboczych sfinansowanych przez Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology /Dr Thomas G.Prid- ham, Convenor/ i prowadzonych przez Inetitute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Gersey, New Brunswick, N.3. /1971//. Izomery kwasu dwuamlnopi¬ mellnowego rozpoznano metode Beckera i wsp., Appl.Microbiol., 11, 421-423 /l964/. Wszy¬ stkie plytki odczytywano po 8 do 14 dniach w temperaturze 30°C. Wyniki tych badan scia¬ ny komórkowej zamieszczono ponizej.Test Zaobserwowane wyniki Izomery kwasu 2,6-dwuaminopimelinowego Izomer LL Wykryte cukry diagnostyczne Glukoza, Ryboza Porównanie sposobu wykorzystania wegla przez szczep A-39912, Streptomyces /chainie/ rubra ATCC 17755, Streptomyces griseoruber ATCC 23919 i Streptomyces griseoeurantiacus ATCC 19840 zamieszczono w nastepujacej tablicy 4.Tablica 4 zródlo wegla D-Glukoza L-Arabinoza Sacharoza S-K8yloza Inozyt D-Fruktoza D-Mannit Ramnoza Rafinoza A-39912 + ? + * + + + + + + - + ? + ATCC 17755 + + - + + + ? + ¦f + ATCC 23919 + + ? + - + + + ? + + - + + - ATCC 23840 + + + + - + + + + ++ + + + + ¦ Znaczenie: ?+ ¦ przyswajanie silnie dodatnie, + « przyswajanie dodatnie, £ » przy¬ swajanie wetpliwe, - ¦ przyswajanie ujemne.Porównanie podobienstw i róznic miedzy A-39912 a Streptomyces /chainie/ rubra ATCC 17755, Streptomyces griseoruber ATCC 23919 i Streptomyces griseoeurantiacus ATCC 19840 przedstawiono w tablicy 5.6 129 644 Tablica 5 1 Warunki testowe Morfologia Powierzchnia zarodników Barwa grzybni wegetatywne] Barwa grzybni powietrznej Uplynnienie zelatyny Redukcja azotanów Mleko odtlu¬ szczone Wytworzenie pi¬ gmentu podobnego do melanoldu Tworzenie kry¬ sztalów ' no: Podlozu ISP nr 2 Podlozu ISP nr 3 Podlozu owsianym Iz paste pomido¬ rowe i ¦ ¦ A-39912 Zwiniete w spirale Gladka Purpurowo- -czerwona do czarnej Czerwona do szarej + ? Peptonizuje + + ATCC 17755 S./chelnla/ rubra Zwiniete w spirale Gladka Zólto-brezowa, brezowawo- -pomaranczowa Czerwona + - Hydrollzuje m ATCC 23919 S.grleeoruber Zwiniete w spirale Gladka Zólto-brezowe, czerwonawo- -pomaranczowa Szara + ? Peptonizuje w ATCC 19840 S.griseosuren- tlacu9 1 Zwinieta w spirale Gladka Zólto-brezowe, ollwkowo-szera, czerwonawo- -brezowa Szara ? + Peptonizuje » i ' Krysztaly undecylopridiginlny Pewna ilosc morfologicznych i fizjologicznych wlasciwosci tych czterech szczepów jest zgodna, z wyjetkiem barwy grzybni wegetatywnej, barwy grzybni powietrznej i two¬ rzenia granulek na róznych podlozach, jak to uwidoczniono w tablicy 5.Streptomyces granuloruber, organizm wytwarzajecy narazyne, zdeponowano, czyniec z niego czesc kolekcji kultur macierzystych Northern Regional Research Center, U.S.Department of Agriculture, Agrlcultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, gdzie Jest ogólnie dostepny pod numerem NRRL 12389.Do wytwarzania narazyny przy uzyciu Streptomyces grenuloruber NRRL 12389 mozna uzyc ezeregu róznych podlozy. Podloze te powinny zewierac zródla przyswajalnego wegla, azotu 1 soli nieorganicznych. Do odpowiednich zródel wegla naleze takie jak glikoza, skrobia i dekstryna. Do odpowiednich zródel azotu naleze takie zródla jak pepton, enzymatycznie zhydrolizowana kazeina, meka z nasion bawelny 1 pepton miesny.Zasadnicze pierwiastki sledowe niezbedne do wzrostu i rozwoju orgenizmu moge znaj¬ dowac ele w zanieczyszczeniach Innych ekladników podlozy w Ilosciach odpowiednich do zaspokojenie wymagan organizmu dotyczecych wzrostu 1 biosyntezy. Dednakze, moze oka¬ zac eie korzystne wleczenie do podlozy hodowlanych dodatkowych rozpuszczalnych odzyw¬ czych soli nieorganicznych zdolnych do dostarczania jonów sodu, potasu, magnezu, amo¬ nowych, chlorkowych, weglanowych, fosforanowych, siarczanowych, azotanowych i podo¬ bnych.129 644 7 W celu wytworzenia znecznej ilosci narazyny przy uzyciu NRRL 12389 stosuje sie tlenowe fermentacja glebinowe w tkankach. Dedr.ckzo, rr.cle iloóci ^erezyny mozna otrzy¬ mac przez hodowle w butlach wstrzasanych. Korzystne Jeet uzycie do fermentacji w tkan¬ kach inokulum wegetatywnego. Inokulum wegetatywne przygotowuje sie przez posianie ma¬ lej objetosci podloza hodowlanego zarodnikami, fragmentami grzybni lub grudke zllofi- lizowanego organizmu w celu otrzymania swiezej, bujnie rosnecej hodowli organizmu.Nastepnie przenosi sie inokulum wegetatywne do wiekszego tanku, gdzie po odpowiednim okresie inkubacji antybiotyk narazyna Jest wytwarzany z wydajnoscie optymalne. Nie po¬ siane podloze fermentacyjne rózni sie wartoscie pH od podloza produkcyjnego, lecz pH wszystkich podlozy- fermentacyjnych znajduje sie w zakresie od okolo 6,5 do okolo 7,5.Hodowle organizmu wytwarzajacego narazyne mozna prowadzic w szerokim zakresie temperatury, od okolo 25°C do okolo 43°C. W przypadku stosowania szczepu NRRL 12389 optymalna temperatura wytwarzania narazyny wynosi okolo 30°C.Oak to sie zwykle stosuje w procesach tlenowej hodowli glebinowej, przez podloze hodowlane przepuszcza sie jalowe powietrze. Wydajny wzrost organizmu uzyskuje sie wte¬ dy* gdy objetosc powietrza stosowana przy wytwarzaniu w tanku, miesci sie w zakresie od okolo 0,25 do okolo 1,0 objetosci powietrza na objetosc podloza hodowlanego na mi¬ nute /obj/obj/min/. Optymalna szybkosc w naczyniu 10 litrowym wynosi 0,2 obj/obj/mln, przy mieszaniu za pomoce zwyklych mieszadel obracajacych sie z szybkoscie okolo 400 obr/min. Gdy pienienie staje sie problemem, moze okazac sie korzystne dodanie do podlozy fermentacyjnych stosowanych w duzej skali, niewielkich ilosci /to jest okolo 0,2 ml/litr/ czynnika przeciwpiennego, takiego jak glikol propylenowy.Wytwarzanie antybiotyku narazyny mozna sledzic w czasie fermentacji zarówno za pomoce dyfuzji w agarze, jak 1 metodami turbidymetrycznymi. Do odpowiednich organizmów testowych naleze organizmy takie, jak Staphylococcus eureus, Baclllus subtilis i Nl- crococcus luteue. Ogólnie, aktywnosc antybiotyczna wystepuje po okolo 40 godzinach 1 pozostaje przez co najmniej 2 lub wiecej dni w czesie fermentacji. Szczyt wytwarza¬ nie antybiotyku objawia sie po od okolo 2 do okolo 4 dniach trwania fermentacji. Anty¬ biotyk narazyne mozna odzyskac z podloza fermentacyjnego metodami znanymi 1 opisanymi przez Berga 1 wsp. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 038 384.Nowy, wytwarzajecy narazyne organizm Streptomyces granuloruber NRRL 12389, wytwa- rze znaczne Ilosci czynnika A narazyny, jak i niewielkie ilosci czynników BID nara¬ zyny. Oesll Jest to pozedane, komponenty mozne otrzymac jako pojedyncze antybiotyki przez dalsze oczyszczanie kompleksu, na przyklad ze pomoce chromatografii kolumnowej.Czynniki te opisano w opisis patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 038 384, który * podano tu jako zródlo literaturowe.W celu pelniejszego objasnienia sposobu wedlug wynalazku, podano nastepujece przy¬ klady, z uzyciem róznych podlozy fermentacyjnych. Oednekze, nie jest tym zemierzone ograniczenie zakresu wynalazku.Przyklad I. Przygotowano nastepujece podloze do uzycia do hodowli Stre¬ ptomyces granuloruber NRRL 12389 na skosach agarowych: Skladnik Dekstryna ziemniaczana Kazeina hydrolizowana enzymatycznie ' Ekstrekt miesny Ekstrakt drozdzowy Agar Podstawowy roztwór soli mineralnych Czapka ' Woda dejonlzowana Ilosc /g/litr/ 10,0 1 2,0 1,0 1.0 2,0 2,0 ml/litr q.8. do 1.° lltre 1 N-Z-Amine A /Humko Sheffield Chemical Co., Memphis, Tenn./ Podstawowy roztwór soli mineralnych Czapka przygotowuje sie z nastepujacych skladników:8 129 644 1 Skladnik KCl MgS04 • 7H20 FeS04 • 7H20 Woda dejonlzowana Ilosc /g/100 «1/ 10,0 10,0 0,2 q.s. do 100 ni Zarodnikami Streptomyces granuloruber M*RL 12389 posiano skos agarowy przygotowany za eklednlków powyzej zdefiniowanych i tak posiany skos inkubowano przez okolo 7 dni w temperaturze okolo 30°C# Nastepnie dojrzale hodowle na skosie pokryto wode i zdrapa¬ no jalowym narzedziem w celu uwolnienia zarodników oraz grzybni. Oednego milllitra tak otrzymanej zawiesiny zarodników uzyto do posiania 100 ml podloza wzrostowego o nastepu- Jecym skladzie: 1Skladnik Glukoza Meka sojowa Namok kukurydziany CaC03 NaCl Podstawowy roztwór soli mineralnych Woda dejonlzowana Czapka | Ilosc /g/litr/ 15,0 1 15,0 5.0 2,0 5.0 2,0 ml/litr q.s. do 1 litra Inokulum wegetatywne inkubowano w 500 ml szerokoszyjnej kolbie Erlenmeyera w tempe¬ raturze okolo 30°C przez okolo 48 godzin na wstrzesarce posuwisto-zwrotnej przy dlugo¬ sci suwu 5,08 cm 1 108 uderzeniach/min* Takiego inkubowanego podloza uzywa sie do po¬ siania albo malych fermentorów /inokulum stanowi okolo 1 % objetosci podloza w fermen- tatorze/, albo butli w drugim stadium w celu wytworzenia wiekszej ilosci grzybni. 200 ml próbke podloza produkcyjnego umieszczono w 1-litrowej kolbie Erlenmeyera i wyjalowiono w temperaturze 121° przez okolo 30 minut. Podloze produkcyjne mialo sklad nastepujecy: 1 Skladnik Glukoza Melas jadalny Pepton Bacto Ca CO Podstawowy roztwór soli mineralnych Czapka Woda dejonlzowana Ilosc /g/litr/ 10,0 20,0 5,0 2,0 2,0 ml/litr q,s. do 1,0 litra Po oziebieniu, butle posiano 5 % Inokulum, bedecym inokulum wegetatywnym. Hodowle inkubowano na wstrzesarce posuwisto-zwrotnej przy 108 uderzeniach/min 1 dlugosci suwu 5,08 cm. Wartosc pH srodowiska fermentacji przy koncu 72 godziny wynosila okolo 7,5.Fermentacje prowadzono w temperaturze 30°C.9 Przyklud IT. Norozyne wytworzano przy uzyciu Jalowego podloza produkcyj¬ nego o naot ^puj ecyr* oklodzif?: Skladnik Silikonowy czynnik przeciwpienny ' Glukoza Melas Pepton /Difco/ CaCO Woda dejonlzowana Ilosc /g/litr/ 1 q.s. do 0,2 10.0 20,0 5.0 2.0 9,0 litra ' Dow-Corning Antlfoam A To podloze produkcyjne o pH 6,8 wyjalowiono przez okolo 30 minut przy okolo 121°C i 110,24 do 124,02 KPe. Wyjalowione podloze mialo pH 6,9. Po wyjalowieniu podloze po¬ siano 2,0 % inokulum z podloza drugiego stadium otrzymanym jak opisano w przykladzie I. Posiane podloze produkcyjne poddano fermentacji w 10-litrowym tanku fermentacyjnym przez okolo 3 dni w temperaturze okolo 30°C. Podloze fermentacyjne napowietrzano ja¬ lowym powietrzem z szybkoscie 0,2 obj/obj/min i mieszano zwyklymi mieszadlami przy okolo 400 obr/min.Przyklad III. 18 litrów brzeczki fermentacyjnej doprowadzono do pH 3 za pomoce IN kwasu siarkowego 1 mieszano przez 1 godzine. Brzeczke odseczono z zastoso¬ waniem pomocy filtracyjnej /pomoc filtracyjna Hyflo Super, ziemia okrzemkowa produk¬ cji Oohns-Manville Corporation/ i placek na filtrze przemyto wode. Placek filtracyjny ekstrahowano 9 litrami metanolu, zawierajecego 3 % wodoroweglanu potasowego, przez mieszenie w ciegu okolo 1 godziny i odseczono. Nastepnie placek filtracyjny ekstraho¬ wano powtórnie 9 litrami metanolu.Ekstrakty metanolowe poleczono, zatezono do objetosci okolo 2 litrów i doprowadzo¬ no pH do 7,5 za pomoce IN wodnego roztworu kwasu siarkowego. Mieszanine ekstrahowano dwa razy 2-litrowymi porcjami octanu etylu. Ekstrakty poleczono i zatezono pod zmniej¬ szonym cisnieniem z otrzymaniem pozostalosci, które rozpuszczono w 150 ml acetonu. Do roztworu acetonowego dodano 150 ml wody i pH doprowadzono do 3,0 za pomoce IN wodnego roztworu kwasu solnego. Mieszanine mieszano przez 1 godzine. Utworzone oleiste krysz¬ taly odseczono, rozpuszczono w 150 ml acetonu i dodano 150 ml wody. Roztwór pozosta¬ wiono w temperaturze pokojowej przez noc, utworzone krysztaly odseczono, przemyto wode 1 wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem z uzyskaniem krysztalów pokrytych warstewke oleju.Oleiste krysztaly rozpuszczono w 5 ml benzenu i naniesiono na kolumne zelu krze¬ mionkowego /l,8 x 40 cm - zel krzemionkowy Grece Grede 62/ zrównowazone oenzenem. Ko¬ lumne wyplukiwano kolejno 250 ml objetosciami benzenu, ukladów: benzen - octan etylu /9:1/; /4:1/, /7:3/, /1:1/ i octanem etylu, zbierajec frakcje o objetosci 20-25 ml.Elucje zwiezków czynnych sledzono za pomoce metody biologicznej i chromatografii cien¬ kowarstwowej, stosujec w przypadku TLC plytki z zelem krzemionkowym i octan etylu ja¬ ko rozpuszczalnik rozwijajecy. Do wykrycia plam uzywano natrysku wanilina - kwas siar¬ kowy, a jako organizmu sluzecego do wykrywania uzywano Bacillus subtilis. Frakcje za¬ wierajece tylko jeden skladnik, zidentyfikowany jako narazyna, leczono i odparowywano do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszczono w 50 ml acetonu, doda¬ no 50 ml wody i roztwór odstawiono w temperaturze pokojowej w celu krystelizacji.Utworzone krysztaly odseczono i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem uzyskujec 172 mg krysztalów o barwie bialej, wykazujecych temperature topnienie okolo 75-78°C.Wykazano identycznosc krysztalów z narazyne przez porównanie widm NMR, IR, UV i ma¬ sowego, oraz danych z chromatografii cienkowarstwowej i bibulowej. Dane biologiczne - aktywnosc przeclwbakteryjna i przeciwkokcydialna byly takie same jak w przypadku auten¬ tycznej narazyny. Dla zidentyfikowania krysztalów o barwie purpurowo-czerwonej wytwa¬ rzanych przez A-39912 zastosowano metode opisane w nastepujecym przykladzie IV.io 129 644 V rzyklod IV. Undocyloprodiglnlno - wytworzenia i identyfikacja.Plastykowe plytki chromatograficzne o wymiarach 23 en x 45 cm z 10 mn górne kra¬ wedzie, z 250 ni agaru owsianego z paste pomidorowe, przygotowane zgodnie ze wskazów¬ kami Pridhama i w»p., Antibiot.Ann., 1956-1957, str. 947-953, posiano 48-godzinnym lnokulum, otrzymany* z uzyciem bulionu z ekstraktem drozdzowym i tryptone przy zasto¬ sowaniu metody kreskowania krzyzowego Shirlinga 1 Gottlieba, jak wyzej. Bulion z eks¬ traktem drozdzowym 1 tryptone mial sklad nastepujacy: Skladnik Tryptone /Difco/ Ekstrakt drozdzowy Woda destylowania Ilosc /g/litr/ 1 5#° 3,0 q.s. do 1,0 litra pH bulionu wynosilo 7,0-7,2 przed wyjalowieniem poprzedzajacym uzycie. Po posianiu plytki Inkubowano 14 dni w temperaturze 30°C i w tym czasie w agarze obserwowano kry¬ sztaly barwy purpurowo-czerwonej.Agar zawierajecy krysztaly o barwie purpurowo-czerwonej wyciety wzdluz brzegów wzrostu hodowli 1 ekstrahowano cztery razy po 500 ml mieszaniny chloroform: metanol /4:1/ przez mieszanie w ciegu 15 minut na lazni parowej. Ekstrakty poleczono i zete- zono do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszczono w 12 ml chloro¬ formu i poddano chromatografii na kolumnie /l,2 x 52 cm/ zelu krzemionkowego /Grece 62/ upakowanej przy uzyciu chloroformu. Kolumne eluowano chloroformem, zbierajec fra¬ kcje po 10 ml. Przy frakcji 34 rozpuszczalnik eluujecy zmieniono na chloroform: meta¬ nol /95:5/. Eluowane frakcje sledzono za pomoce chromatografii cienkowarstwowej na plytkach z zelem krzemionkowym przy uzyciu ukladu chloroform: metanol /9:1/ i obser- wujec plamy zabarwione purpurowo. Frakcje 9-14, o najintensywniejszym zabarwieniu pur¬ purowym /pojedyncza plama w TLC/ poleczono i zatezono do sucha. Pozostalosc rozpusz¬ czono w dioksanie i liofilizowano, w wyniku czego otrzymano 10,3 mg proszku o barwie purpurowej.Proszek o barwie purpurowej dawal jon molekularny 393,27764 w wysokorozdzielczej spektrometrii masowej z zastosowaniem zderzen z elektronami 1 wzór empiryczny C25H35N3° Przez dobranie szczytu. Dane te, wraz z porównaniem z widmami undecyloprodi- gininy w nadfiolecie, podczerwieni i NMR z doniesienia w Agr.Biol.Chem., 31, 481 /1967/ i w d.Antibiot., 28, 194 /1975/, posluzyly do identyfikacji proszku o barwie purpurowej jako undecyloprodigininy.Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania narazyny, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle Streptomyces granuloruber NRRL 12389 w podlozu hodowlanym zawierajecym zródla przyswa¬ jalnego wegla, azotu i soli nieorganicznych, w warunkach tlenowej fermentacji glebino¬ wej, az do wytworzenia przez mikroorganizm w podlozu hodowlanym produktu o znacznej aktywnosci antybiotycznej, po czym ewentualnie wyodrebnia sie narazyne z podloza hodo¬ wlanego.Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 cgz.Cena 100 zl PL PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania narazyny, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle Streptomyces granuloruber NRRL 12389 w podlozu hodowlanym zawierajecym zródla przyswa¬ jalnego wegla, azotu i soli nieorganicznych, w warunkach tlenowej fermentacji glebino¬ wej, az do wytworzenia przez mikroorganizm w podlozu hodowlanym produktu o znacznej aktywnosci antybiotycznej, po czym ewentualnie wyodrebnia sie narazyne z podloza hodo¬ wlanego. Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 cgz. Cena 100 zl PL PL PL PL