HU189578B - Process for preparing narasin - Google Patents

Description

A találmány tárgya új mikrobiológiai eljárás a narazin antobiotikum előállítására.

A narazin ismert poliéter-típusú antibiotikum. A narazin Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 vagy Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 mikroorganizmusokkal való előállításait Berg és munkatársai írják le (4 038 384. sorszámú amerikai szabadalmi leírás, 1977. július 26; lásd továbbá Berg és munkatársai, J. Antibiot., 31, 1-6, 1978).

Boeck és munkatársai is leírják a vegyületet; „Narazin, A New Polyether Antibiotic: Discovery and Fermentation Studies, 38. fejezet, 471-485. oldal, 18. kötet, Developments In Industrial Microbiology, a Society fór Industrial Microbiology, 1977. kiadása).

A narazin gram-pozitív festődésű baktériumokkal, aerób baktériumokkal és gombákkal szemben hatékony, kokcidiózis-ellenes szerként és a kérődző állatok takarmányhasznosításának növelésére használják fel.

A találmány tárgya új eljárás a narazin antibiotikum előállítására. Ügy járunk el, hogy az újonnan felfedezett Streptomyces granuloruber NRRL 12 389 letéti számú mikroorganizmus törzset, vagy ennek egy narazint termelő mutánsát vagy variánsát felhasználható szénforrásokat, nitrogénforrásokat és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon sülylyesztett, levegőztetett körülmények között addig tenyésztjük, míg a mikroorganizmus a táptalajban jelentős mennyiségű narazint választ ki, amit kívánt esetben elkülönítünk.

A találmány szerinti eljárás során használt új mikroorganizmus a Surinam River közelében, Surinam, Dél-Amerika, gyűjtött földmintából izolált, biológiailag tiszta tenyészet. A tenyészetnek jelzési céllal az A-39 912 jelet adtuk, de - ahogy azt az előzőkben megadtuk - a letéti számon, NRRL 12 389 jellel is jelöljük.

Az A-39 912 tenyészetet Streptomyces granulorubernak határoztuk meg Streptomyces griseoruber és a Streptomyces griseoaurantiacus törzsekkel való együttes tenyésztés alapján, és a Shirling és Gottlieb módszereit és táptalajait használva (Methods of Characterization of Streptomoyces species, Int. Bull. of Systematic Bacteriol., 16, 313-340, 1966), továbbá bizonyos más vizsgálati módszereket is használva. Az A-39 912 törzset öszszehasonlítottuk a Gerber által leírt Streptomyces longispororuber törzzsel is (J. Antibiot., 28, 194-199, 1975).

Az A-39 912 törzs különbözik a Steptomyces rubra mikroorganizmustól abban, hogy granulátumokat is termel, ezek undecil-prodiginin kristályok, az általa termelt színanyag színe bíborszínűvörös, bíborszínű-vörös-fekete színű vegetatív mi₅ céliumot fejleszt, és a nitrátot redukálja. Az A-39 912 törzs vörös és szürke színű légmicéliumot fejleszt a Streptomyces griseoruber szürke színű légmicéliumával összehasonlítva. A bibor-vörösfekete színű légmicélium az A-39 912 törzs esetén szintén különbözik a Streptomyces griseoruber sárgásbarna-vöröses-narancs színű vegetatív micéliumától. A Streptomyces griseoaurantiacus nem fejleszt bíborszínű-vöröses-fekete színű vegetatív micéliumot, ahogy az A-39 912. A Streptomyces gri1₅ seoruber és a Streptomyces griseoaurantiacus törzsek sem termelnek bíbor-vöröses színű undecilprodiginin kristályokat, ahogy az A-39 912 törzsnél megfigyelhetjük.

így az A-39 912 törzs összehasonlítása a fenti

2Q tenyészetekkel jelentős különbségeket mutat. így tenyészetünket új fajnak írjuk le, és Streptomyces granulorubernak nevezzük.

Az alábbiakban megadjuk a narazint termelő törzs tulajdonságait.

Morfológia

Spirális spóratartókat fejleszt. A spórák az elektronmikroszkopikus vizsgálat alapján sima felületűek, ovális - enyhén hengeres alakúak. A spórák átlagos nagysága 1,3 pm x 2,015 pm, azaz 1,3 pmtől 2,6 pm-ig terjed.

Tenyésztési tulajdonságok

A Streptomyces granuloruber különböző táptalajokon megfigyelt növekedési tulajdonságait az alábbi, I. táblázaton adjuk meg.

A színeket az ISCC-NBS módszer szerint adjuk meg (Kelly és Judd, „The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Nantes,” U.S. Department of Commerce Circ., 553, 1955, Washington, D.C.). A zárójelek közé tett ⁴⁵ betűk a Tresner és Backus színsorozatra utalnak (Tresner és Backus, „System of Color Wheels fór Streptomycete Taxonomy,” Appl. Microbiol., 11, 335-338, 1956). A színekre utaló jeleket aláhúzzuk. A Maerz és Paul szerinti színtáblákat szögletes ⁵θ zárójelek között adjuk meg (Maerz és Paul, „Dictionary of Color,” McGraw-Hill Book Co., Inc.,

New York, N. Y., 1950).

I. Táblázat

A törzs növekedési tulajdonságai különböző táptalajokon

Táptalaj _ Tulajdonságok_

Paradicsompaszta-zabliszt-agar igen jó növekedés, a hátoldal színe bíbor-fekete [56E8]; a légmicélium jól fejlett és spórák láthatók (GY) 5fe, színe viíágosszürkésbarna-vörösestől (R) 5 de szürkés-sárgásrózsaszínig. Enyhén barna színű, vízben oldódó színanyag keletkezik, esetenként nem figyelhető meg.

189 578

Táptalaj Tulajdonságok

Glicerin-glicin-agar

Élesztőkivonat-malátakivonat-agar (ISP no. 2. táptalaj)

Zabliszt-agar (ISP no. 3. táptalaj)

Szervetlen-só-keményítő-agar (ISP no. 4. táptalaj)

Glicerin-aszparagin-agar (ISP no. 5. táptalaj)

Tápagar

T ripton-élesztőkivonat-agar Kalcium-maláta-agar

Emerson-agar

Glükóz-aszparagin-agar

Bennett-agar

Tirozin-agar

Czapek-oldat-agar igen jó növekedés, a hátoldal sötét bíborvörös színű [55H4]; a légmicélium és a spórák fejlettek (R) 5 de, szürkés-sárgásrózsaszín színű. Oldódó színanyag nincs.

igen jó növekedés, a hátoldal színe fekete-feketésvörös [56Cl]-töl [56H12]-ig. A légmicélium és a spórák igen jól fejlettek (W) b, fehértől (GY) d, világosszürkéig; enyhén barna színű, vízben oldódó színanyag keletkezik, esetenként nem figyelhető meg. igen jó növekedés, a hátoldal színe vörösesbarna [7J7]; a légmicélium és a spóraképzés jó (GY) d, színe világosszürke; világosbarna színű, vízben oldódó színanyag képződik.

igen jó növekedés, a hátoldal középvöröses-barna színű [7J9]; a légmicélium és a spórák igen jól fejlettek (R) 5dc, szürkés-sárgásrózsaszín színűek; vízben oldódó színanyag nem képződik, igen jó növekedés, a hátoldal színe vörösesbarna [6G9]; jól fejlett légmicéliumok és spórák (R) 5dc, szürkés-sárgás-rózsaszín színű. Vízben oldódó színanyag nem képződik.

jól növekedik, a hátoldal szürkés-sárga színű [I2B2]; légmicélium vagy spórák nem képződnek, színtelen; vízben oldódó színanyag nem képződik.

jó növekedés, a hátoldal szürkéssárga színű [ 12B2]; légmicélium és spórák nem képződnek, színtelen; vízben oldódó színanyag nincs, jó növekedés, a hátoldal halványsárga színű [10B2], Jól fejlett légmicélium és spórák (GY) 2ge, világosnarancs-barna színű. Vízben oldódó színanyag nem képződik.

igen jó növekedés, a hátoldal középsárga-barna színű [13H7], Légmicélium és spórák nem képződnek, színtelen. Vízben oldódó színanyag nincs.

jó, igen jó növekedés, a hátoldal feketésvöröses színű [56J10]; jól-igen jól fejlett légmicélium és spórák (GY) 5fe, világosszürkésvörösesbarna színű. Enyhén barnás színű, vízben oldódó színanyag képződik.

jól növekedik, a hátoldal szürkéssárga színű [ 12J5]; légmicélium és spórák nem képződnek, színtelen; vízben oldódó színanyag nincs, igen jó növekedés, a hátoldal sötétbíbor-vörös színű [54J6]; közepesen jól fejlett-légmicélumok és spórák (W) b, fehértől (R) 6ec szürkés-sárgásrózsaszínig. Barnás, vízben oldódó színanyag képződik.

közepes növekedés, a hátoldal halványnarancs-sárga színű [9B2]; közepesen fejlett légmicélium és spórák (GY) 2dc sárgás-szürke színű. Enyhén barnás színű, vízben oldódó színanyag képződik.

A mikroorganizmust standard, élettani tulajdon- 45 tettük alá. A megfigyelt tulajdonságokat a II. tábláságok megállapítására használt vizsgálatoknak ve- zatban adjuk meg.

II. Táblázat

Az A-39 912 mikroorganizmus élettani tulajdonságai

Melanoid-típusú színanyag termelése

1. tripton-élesztőkivonat-leves (ISP no. 1.)

2. Pepton-élesztőkivonat-vas-agar (ISP no. 6.)

3. Tirozin-agar (ISP no. 7.)

Nitrát-redukció

Zselatin-elfolyósítás

Burgonyaszelet

Répaszelet melanoid típusú színanyag nem képződik melanoid típusú színanyag nem képződik melanoid típusú színanyag nem képződik pozitív-reakció pozitív reakció-100% a 14. napon nincs növekedés nincs növekedés

189 578

Keményítő-hidrolízis (1SP 4. táptalaj), szervetlen sók-keményítő Hőmérséklet-igény hidrolizál

H. Táblázat folytatása

Fölözött tej

N átrium-klorid-tolerancia Növekedési pH-érték igen jó növekedés és spórázás figyelhető meg 25 ’C és 43 ’C között. 25 *Cnál alacsonyabb és 43’C-nál magasabb hőmérsékleten nincs növekedés, peptonizáció

3,5%, de < 4,0%

5,5 és 9,5 közötti pH-értékeken növekszik.

A szénforrás-hasznosítást Pridham és Gottlieb alaptáptalaján határoztuk meg, a szénforrást Shirling és Gottlieb szerint 1,0%-os végkoncentráció- 15 bán adagoltuk. A szénforrásokat az alaptáptalajhoz adagolásuk előtt sterilizáltuk. A lemezeket 8-14 napos, 30 ’C hőmérsékleten való növekedést követően olvastuk le, a végső eredményt adjuk meg.

Az A-39 912 törzs szénforrás-hasznosítási vizsgálatainak eredményeit a III. táblázatban adjuk meg.

III. Táblázat

Szénforrás-hasznosítás

Szubsztrátum: a Pridham és Gottlieb alaptáptalajhoz adagolt szénforrás*	Az A-39 912 törzs reakciója a 14. napon
L-arabinóz
D-fruktóz	+ +
D-glükóz	+ +
iinozit	+ +
D-mannit	-
D-raffinóz	+
L-ramnóz	+ +
szacharóz	±
D-xilóz	+ +
D-galaktóz	+ +
Kontroli-szén	—

*= Az International Streptomyces Project (Shirling és Gottlieb, lásd előbb) szénforrásai.

Jelek: + + : erősen pozitív hasznosítás, + : pozitív hasznosítás, ± : kétséges hasznosítás,

- : negatív hasznosítás.

A sejtfal vizsgálata

A mikroorganizmus teljes sejtjének hidrolizátumát használva meghatároztunk bizonyos diagnosztikai értékű cukrokat. A diamino-pimelinsav izomerjeinek meghatározását izolált sejtfalból végeztük.

A sejtfalban lévő cukrokat Lechavalier módosított módszerével határoztuk meg (Chemical Methods as Criteria fór the Separation of Actinömycetes Intő Genera), a módszert a Subcommittee on 25 Actinomycetes of the American Society of Microbiology által támogatott program alapján dolgoztuk ki (Pridham). A munka az Institute of Mikrobiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, N. J., 1971, kiad30 ványban került ismertetésre. A diamino-pimelinsav izomereket Becker és munkatársai szerint határoztuk meg (Appl. Microbiol., 11, 421-423, 1964). A lemezeket 30 ’C hőmérsékleten inkubáltuk, és a

8-1A napon olvastuk le. A sejtfal felderítésére vég35 zett vizsgálatok eredményeit az alábbiakban adjuk meg.

Vizsgálat	Megfigyelt eredmény
A 2,6-diamino-pimelinsav izomerek Megfigyelt dignosztikus cukrok	LL-izomer glükóz, ribóz

A IV. táblázatban megadjuk az A-39 912, a Streptomyces (chainia) rabra ATCC 17 755, a Streptomyces griseoruber ATCC 23 919, továbbá a Streptomyces griseoaurantiacus ATCC 19 840 törzsek szénforrás-hasznosítási sprektumát.

IV. Táblázat

A rokontörzsek szénforrás-hasznositásának összehasonlítása

Szénforrás	A-39 912	ATCC 17 755	ATCC 23 919	ATCC 19 840
D-glükóz	+ +	+ +	+ +	+ +
L-arabinóz	+		+ +	+ +
szacharóz	±	+	-
S-xilóz	+ +	+	+ +	+ + '
inozit	+ +	±	• + +	+ +
D-fruktóz	+ +	+	+ +	+ +
D-mannit	-	+	—	+ +
ramnóz	+ +	+	+ +	+ +
raffinóz	±	±	—	—

+ + = erősen pozitív hasznosítás + = pozitív hasznosítás ± = kétséges hasznosítás - = negatív hasznosítás.

189 578

Az V. táblázatban megadjuk az A-39 912, to- és a Streptomyces griseoaurantiacus ATCC 19 840 vábbá a Streptomyces (chainia) rubra ATCC törzsek közötti hasonlóságokat és különbségeket. 17 755, a Streptomyces griseoruber ATCC 23 919

V. Táblázat

A fenti törzsek között talált hasonlóságok és különbségek

Vizsgált tulajdonság	A-39 912	ATCC 17 755 S. (chainia) rubra	ATCC 23 919 S. griseoruber	ATCC 19 840 S.' griseoaurantiacus
Spóraláncok morfológiája	spirálok	spirálok	spirálok	spirálok
Spóra felülete	sima	sima	sima	sima
Vegetatív micélium színe	bíborvörös-fekete;	sárgásbarna,	sárgásbarna,	sárgásbarna,
	vörösesbarna	barnásnarancs	vörösesnarancs	narancsszürke-
				vörösesbarna
Légmicélium színe	vörös-szürke	vörös	szürke	szürke
Zselatin elfolyósítás	+	+	—	±
Nitrát-redukció	+		+	+
Fölözött tej	peptonizáció	hidrolizálás	peptonizáció	peptonizáció
Melanoid-típusú színanyag	—	—	—	—
termelése
Kristályok képződése1
ISP no. 2.	+	—	—	—
ISP no. 3.	+	—	—	—
Paradicsompaszta-zabliszt-	+	—	—	—
agar
2,6-diamino-pimelinsav	LL	LL	LL	LL
izomerek

¹ = undecil-prodiginin kristályok.

A négy törzs több morfológiai és élettani tulajdonsága hasonló, a vegetatív micélium színe, a légmicélium színe és a különböző táptalajokon való granulátum-termelés kivételével, ahogy azt az V. táblázatban megadtuk. A narazin-termelő Streptomyces granuloruber mikroorganizmust a Northern Régiónál Research Center, U. S.Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61 604 törzsgyűjteményében letétbe helyeztük, NRRL 12 389 számon.

Ahogy az más mikroorganizmusoknál is szokásos, a narazint termelő Streptomyces granuloruber NRRL 12 389 törzs tulajdonságai variálnak. így például az NRRL 12 389 törzs vagy indukált mutánsai, vagy ezen törzsekből származó sejtek; ha narazin antibiotikumot termelnek, a találmány oltalmi köréhez tartoznak.

A narazin Streptomyces granuloruber NRRL 12 389 törzzsel való előállításához különböző táptalajokat használhatunk. A táptalajok felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmaznak. Szénforrásként glükózt, keményítőt és dextrint használhatunk. Nitrogénforrásként például peptont, enzimmel hidrolizált kazeint, gyapotmag-lisztet vagy szárított húspeptont adagolhatunk.

A mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges nyomelemeket a táptalaj többi összetevője szennyező anyagként olyan koncentrációban tartalmazza, hogy az elegendő a sejtek növekedésének és bioszintetikus igényeinek kielégítésére. Ugyanakkor a táptalajt előnyösen további oldódó szervetlen sókkal egészítjük ki, olyanokkal, amelyek nátrium-, kálium-, magnézium-, kálcium-, ammónium-, klorid-, karbonát-, foszfát-, szulfát- vagy nitrát ionokra disszociálnak.

Az NRRL 12 389 törzzsel nagyobb mennyiségű narazint úgy állítunk elő, hogy süllyesztett, levegőztetett fermentációt végzünk. Kis mennyiségű narazin előállítására rázott lombikokban tenyésztünk A tankfermentációkor előnyösen vegetatív inokulumot használunk. A vegetatív inokulum előállítására kis mennyiségű táptalajt beoltunk a mikroorganizmus spóráival, micéliumaival vagy fagyasztva-szárított tenyészetével, ily módon friss, aktívan növekvő tenyészetet kapunk. A vegetatív inokulummal ezután nagyobb mennyiségű táptalajt oltunk, ahol, megfelelő idő eltelte után a narazin antibiotikum termelése megindul.

A még be nem oltott fermentációs táptalaj pHját általában 6,5 és 7,5 közötti értékekre állítjuk be.

A narazint termelő mikroorganizmust széles hőmérsékletintervallumban növeszthetjük, részletesebben 25 °C és 43 °C között. Az NRRL 12 389 sorszámú mikroorganizmussal 30 °C hőmérsékleten kapjuk az optimális narazintermelést.

Ahogy az a süllyesztett, levegőztetett fermentációknál szokásos, a tenyészeten steril levegőt vezetünk át. A mikroorganizmus jó növekedését úgy biztosítjuk, hogy a fermentoron a táptalaj egységnyi térfogatára számítva percenként 0,2-1,0 térfogategységnyi levegőt vezetünk át. Egy 10 liter térfogatú fermentorba előnyösen 0,2 térfogat/táptalaj/perc levegőt vezetünk át abban az esetben, ha a keverő szokásos méretű és percenként 400-at fordul. Esetenként kevés (literenként 0,2 ml) habzásgátló anyagot, például propilén-glikolt adagolunk

189 578 a nagytérfogatú fermentációs táptalajhoz, ha a habzás nehézségeket okoz.

A fermentáció során a narazin antibiotikum termelését vagy agar-diffúziós vagy turbidimmetriás módszerrel követjük. A biológiai értékmérést például Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis vagy Micrococcus luteus mikroorganizmussal végezzük.

Az antibiotikumos aktivitás általában a fermentáció 40. órájában mérhető, és legalább két vagy több napon át mérhetjük. Az antibiotikum termelés csúcsa a 2-4. napon tapasztalható.

A narazin antibiotikumot a táptalajból ismert módszerekkel izoláljuk (lásd Berg és munkatársai, 4 038 384. sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

Az új narazin-termelő mikroorganizmus, a Streptomyces gronuloruber NRRL 12 389 jelentős mennyiségű narazin A-komponenst termel kevés Bés D-komponensekkel együtt. Ezeket a komponenseket a komplex tisztításával egyébként is elkülöníthetjük, például oszlop-kromatográfiás módszerekkel. Ezeket a komponenseket a 4 038 384. sorszámú amerikai szabadalmi leírásban leírják.

A találmány szerinti eljárást a továbbikban, különböző fermentációs táptalajokkal részletesen szemléltetjük. A találmány szerinti eljárást azonban nem szűkítjük a megadott példákra.

1. példa

A Streptomyces granuloruber NRRL 12 389 mikroorganizmus tenyésztéséhez előállítjuk az alábbi összetételű agart.

összetevő	Mennyiség (g/1)
burgonya-dextrin	10,0
enzimesen hidrolizált kazein1	2,0
húskivonat	1,0
élesztökivonat	1,0
agar	2,0
Czapek ásványi só-oldata2	2,0 ml
ionmentes víz	1,0 literre feltöltve
1 = N-Z-Amine A (Humko Shefiield Chemical Co., Memphis, Tenn.)
2 = Czapek ásványi só-oldata, ezt az alábbi összetételekből állítjuk össze:
Összetevő	Mennyiség (g/100 ml)
kálium-klorid	10,0
magnézium-szulfát-7H2O	10,0
vas-szulfát-7-H2O	0,2
ionmentes viz	100 ml-re feltöltve

A Streptomyces granuloruber NRRL 12 389 mikroorganizmus spóráival beoltjuk a fenti összetételű tápagarokat, a beoltott táptalajt pedig 7 napon át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az érett ferdeagar-tenyészetre vizet töltünk, felületét steril kacs segítségével a spórák és micéliumok felszaba6 dítására megkaparjuk. 1 ml így előállított spóraszuszpenzióval 100 ml, alábbi összetételű vegetatív táptalajt oltunk.

Összetevő	Mennyiség (g/1)
dextróz	15,0
szójababliszt	15,0
kukoricalekvár	5,0
kalcium-karbonát	2,0
nátrium-klorid	5,0
Czapek ásványi só-oldata	2,0 ml
ionmentes víz	1,0 literre kiegészítve

A vegetatív tenyészetet 500 ml térfogatú, szélesszájú Erlenmeyer-lombikokban tenyésztjük 30 °C hőmérsékleten, 48 órán át olyan rázóasztalon, amely percenként 108-at mozdul el 5 cm átmérőjű kör mentén. Az inkubált táptalajjal vagy kis fermentorokat oltunk (az oltóanyag mennyisége a fermentációs táptalaj 1 %-a) vagy második fázisú inokulum táptalajt oltunk nagymennyiségű micélium előállítására.

1,0 liter térfogatú Erlenmeyer-lombikokba 200 ml termelő táptalajt töltünk, a táptaljt 121 °C hőmérsékleten streilezzük 30 percen át. A termelő táptalaj összetétele a következő:

Összetevő	Mennyiség (g/1)
dextróz	10,0
ehető melasz	20,0
Bakto pepton	5,0
kálcium-karbonát	2,0
Czapek ásványi só-oldata	2,0 ml
ionmentes víz	1,01-re kiegészítve

Lehűlést követően 5% vegetatív inokulummal oltjuk be a főfermentációs táptalajokat. A tenyészeteket percenként 108-at forduló (5 cm átmérőjű kör mentén) rázóasztalon inkubáljuk. A táptalaj pH-ja a fermentáció végén (72. óra) 7,5. A fermentációt 30 °C hőmérsékleten végezzük.

2. példa

A narazin előállítására az alábbi összetételű, steril, termelő táptalajt használjuk:
Összetevő	Mennyiség (g/1)
szilikon habzásgátló anyag*	0,2
glükóz	10,0
melasz	20,0
pepton (Difco)	5,0
kálcium-karbonát	2,0
ionmentes víz	9,0 l-re kiegészítve

¹ = Dow-Corning Antifoam A.

A 6,8 pH-jú termelő táptalajt 30 percen át 121 °C

189 578 hőmérsékleten sterilezzük. A sterilizált táptalaj pHja: 6,9. Ezt a steril táptalajt 2,0%, az 1. példában megadottak szerint előállított második fázisú inokulummal oltjuk be. A beoltott termelő táptalajt 101 térfogatú fermentorban fermentáljuk, 3 napon át, 30 °C hőmérsékleten. A fermentációs táptalajon 0,2 térfogat/táptalajtérfogat/perc steril levegőt vezetünk át, és hagyományos keverővei keverjük, ennek fordulatszáma percenként 400.

3. példa

Izolálás és tisztítás

1 fermentlevet elkülönítünk, és pH-ját 1 normál vizes kénsavval 3-ra állítjuk be. 1 órán át keverjük a szuszpenziót. Ezután szűrjük, a szűrést Hyflo Supercel szűrési segédanyag (diatomaföld, JohnsManville Corporation) jelenlétében végezzük. A szűrési maradékot vízzel mossuk. Ezután 913% kálium-hidrogén-karbonátot tartalmazó metanollal extraháljuk a szűrési maradékot, az extrakciót 1 órán át való keveréssel végezzük. Ezután szűrjük. A szűrési maradékot 9 1 metanollal újraextraháljuk. Egyesítjük a metanolos extraktumokat, és 2 1re töményítjük. A sűrítmény pH-ját 1 normál vizes kénsavval 7,5-re állítjuk be. Kétszer 2 1 etil-acetáttal extraháljuk az oldatot. Egyesítjük az extraktumokat, és csökkentett nyomású térben töményítjük. A desztillációs maradékot 150 ml acetonban oldjuk. 150 ml vizet adunk az acetonos oldathoz, pH-ját 1 normál vizes hidrogén-klorid-oldattal 3,0ra állítjuk be. 1 órán át keverjük az elegyet. Szűréssel elkülönítjük az olajos kristályokat, és 150 ml acetonban oldjuk, az oldathoz 150 ml vizet adunk. Egy éjszakán át szobahőmérsékleten tartjuk az oldatot, a kivált kristályokat szűréssel elkülönítjük, vízzel mossuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután olyan kristályos anyagot kapunk, amely olajos filmmel borított.

Az olajos kristályokat 5 ml benzolban oldjuk, és

1,8 x 40 cm méretű, szilíkagéllel (Grace Grade 62) töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot benzollal egyenlítjük ki. A kromatográfiát 250 ml benzollal kezdjük, benzol és etil-acetát 9 : 1 arányú elegyének 250 ml-ével folytatjuk, majd 250-250 ml benzol-etil-acetát 4 : 1, 7 : 3 és 1 : 1 arányú elegyével folytatjuk, végül etil-acetáttal fejezzük be. 20-25 ml térfogatú frakciókat különítünk el. Az antibiotikum eluálódását biológiai értékméréssel és vékonyréteg-kromatográfiával követjük. A vékonyréteg-kromatográfiát szilikagél lemezeken végezzük, futtató-oldatként etil-acetátot használunk. Az előhívást vanilin-kénsav permettel vagy Bacillus subtilis mikroorganizmussal végezzük.

Az egyetlen komponensként narazint tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomású térben szárazra desztilláljuk. A desztillációs maradékot 50 ml acetonban oldjuk, 50 ml vizet adunk az oldathoz, ezt szobahőmérsékleten hagyjuk állni, a kristályosodás megindítására. A kivált kristályos anyagot szűréssel elkülönítjük és csökkentett nyomású térben szárítjuk. Ily módon fehér, kristályos anyagként 172 mg terméket kapunk, ennek olvadáspontja 75-78 °C.

A kristályos anyag a mágneses magrezonancia spektroszkópiás, infravörös spektroszkópiás és ultraibolya spektroszkópiás, továbbá tömeg-spektrometriás, vékonyréteg- és papír-kromatográfiás vizsgálat szerint narazinnal azonos.

A biológiai adatok, az antimikrobiális és anticoccidiális hatékonyság szintén azonos az autentikus narazin mintáival.

Az A-39 912 mikroorganizmus által termelt bíborvörös színű kristályos anyag azonosítására a 4. példában megadott kísérleteket végezzük el.

4. példa

Az undecil-prodiginin előállítása, azonosítása cm x 45 cm méretű 10 mm magas sarkokkal rendelkező műanyag kromatográfiás lemezekre 250 ml paradicsom-paszta-zabliszt agart öntünk. Az eljárást Pridham és munkatársai szerint végezzük (Antibiot. Ann., 1956-1957, 947-953. oldal). A lemezeket 48 órás inokulummal oltjuk, az inokulumot tripton-élesztő-levesből készítjük. Az oltást Shirling és Gottlieb (lásd előbb) keresztoltásos módszerével végezzük. A triptonélesztő-leves az alábbi összetételű.

Összetevő	Mennyiség (g/1)
Trypton (Difco)	5,0 g
élesztökivonat	3,0 g
desztillált víz	1,0 1-re feltöltve

A táptalaj pH-ja autoklávozás előtt 7,0-7,2. Oltást követően a lemezeket 14 napon át, 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, ezalatt az idő alatt az agáron bíbovörös színű kristályok keletkeznek.

A bíborvörös színű kristályokat tartalmazó agart a periféria mentén kivágjuk az agárból, és négyszer 500 ml alábbi összetételű eleggyel extraháljuk :

kloroform és metanol 4 : 1 arányú elegye.

Az extrakciót keveréssel végezzük 15 percén át, jégfíirdő felett. Egyesítjük az extraktumokat, és csökkentett nyomású térben szárazra desztilláljuk. A desztillációs maradékot 12 ml kloroformban oldjuk, az oldatot 1,2x52 cm méretű, szilíkagéllel (Grace 62) töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot kloroformmal készítjük el. Az eluálást is kloroformmal végezzük, 10 ml térfogatú frakciókat különítünk el. A 34. frakció elkülönítése után az eluáló oldószert kloroform és metanol 95 : 5 arányú elegyével cseréljük fel. Az eluálódó frakciókat szilikagél lemezen vékonyréteg-kromatográfiával vizsgáljuk, a futtatást kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyével végezzük. A megfigyeléskor a bíborszínű színanyagot keressük. A 9-14. frakciók tartalmazzák a legintenzívebb bíborszínü foltot adó anyagot (a vékonyréteg-kromatogrammon egyel len foltot látunk), ezeket egyesítjük és szárazra desztilláljuk. A desztillációs maradékot dioxánban oldjuk és fagyasztva szárítjuk, ily módon

10,3 mg bíborszínü, poralakú termékhez jutunk. A termék nagyfeloldású tömegspektrometriával mért molekuláris tömegion-száma: 393,27764. Ta7

189 578 pasztalati képlet: C_2SH₃₅N₃O. Ez az adat- és az ultraibolya-, infravörös- és mágneses magrezonancia-spektroszkópiás vizsgálatok alapján azt jelzi, hogy a termék az undecil-prodigininnel azonos (Agr. Bioi. Chem., 31, 481, 1967; továbbá J. Antibiot., 28, 194, 1975).

Claims (3)

1. Eljárás a narazin antibiotikum előállítására, azzaljellemezve, hogy a Streptomyces granuloruber NRRL 12 389 letéti számú mikroorganizmus törzset, vagy ennek egy narazint termelő mutánsát vagy variánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikus aktivitás halmozódik fel, majd a kapott narazint kívánt esetben elkülönítjük a táptalajtól.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás,mikroorganizmusként a Streptomyces granuloruber NRRL 12 389 letéti számú mikroorganizmus törzset használjuk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a narazint elkülönítjük a táptalaj„ ból.