CS227700B2 - Production of narasine antibiotic - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby narasinu mikrobiologickou cestou.

Neresin je známé «ntibioiiUm polyeterového typu. Výroba narasinu fermen^ací Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 nebo Streptomyces aureofaeiens NRRL 8092 byla popsána Bergem a dalšími v US patentu δ. 4 038 384 z 26. července 1977. Popis tohoto způsobu je podán také v publikaci· Berg a další J. Attbiot. 31. 1 až 6 (1978).

_? Boček a další popisují podrobně . toto antibiotkum v publikaci ”Nsa*asin, A New Polyeter j АНЫоtic: D-scovery and Pe^eena^^ Studies kapitola 38, str. 471 až 485, sv. . 18, | Developmmnts In Induusrial Microbiology [Publication of the Society for Induutrial Microi biology (1977)].

, Naaasin je účinný proti gramcc^^^^ bakteriím, anaerobním bakteriím a houbám a mimoto je anttiticidiálním prostřddkem a dále zvyšuje vyiUití krm Iv v přežvýkavců.

Vynález se týká nového způsobu výroby шпИИ^С-Ов narasinu tak, že se pěstuje nový kmen Streitomnces granulo™^^ NRRL 12389 v živném prostředí s obsahem využitelných zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických solí v submmrzní kultuře za aerobních podmínek do nahromadění dostatečného nerazinu, načež se antilioiiUm ze živného prostředí izoluje.

Pěstováni se tedy provádí při pouUžtí biologicky čisté kultury · mikroorganismu Strepto' myces granul^u^г NRRL 12389, využitelných ·zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických solí.

Nový mikroorganismus, užívaný k převádění způsobu podle vynálezu je · biologicky čistou kULturou, získanou ze vzorku půdy, který byl odebrán . v blízkosti Su^nam Rivenr, SurinEm,

Jižní Amerika. Kultura byla pro identifikaci označena číslem A-39912 s uložena ve sbírce pod číslem NRRL 12389.

KRtun A-39912 je možné klasifikovat jako Streptomyces granHoruber, podkladem tito klasifikace bylo současné pěstování Strepoomyces rubra, Strepoomyces grisscruber a - Straptomyyes grii^^an-tiscus při pouHtí způsobů o prostředí, doporučených v publikaci Shirling a Goolieb Mehods of Chiarakteization of Strepoomyces species, Int. BUL. of Systematic Bacteeiol. 16, 313 až 340 (1966), mimoto byly provedeny ještě některé doplňkové zkoušky* KRtuTa A-39912 byla - také srovnávána s popisem Str^^myc^ ltogisptrtruber, tak jak byl podán v publikaci Gerber J. An^bot. 28, 194 až 199 (1975).

Kuutura A-39912 se liší od Strepoomyces rubra produkcí granul, kterými jsou krysta- * ly undeeylprodigininu, purpurově červeného barviva, tím, že produkuje purpurově červené až černé vegetativní mnoHom a mimoto kultura redukuje dusičnany. &utura A-39912 produkuje červené a šedé mysliím na vzduchu na rozdíl - od šedého у^Пс Streptomyces gri- seoruber.- Purpurově červené až černé vegetativní ^ιοΙ!^,· produkované kulturou A-39912 se rovněž liší od žlutohnědého až červenooramžového vegetativního m^ceia Streptoyytes gris^eoruber. Strepoomyces grisrtauicntiacur neprodukuje odlišitelné purpurově červené až černé vegetativní myelium, jako tomu je u kultury A-39912. Ani Strepoomyces griseoruberani Strepoomyces gri8ctcurcnticcus neprodukuj purpurově červená krystaly undecylprodigininu jako kultura A-39912.

Při srovnání kultury A-39912 se shora uvedenými kulturami je tedy možno prokázat podstatné rozdíly. Kuutura byla tedy považována za nový druh, který byl nazván Streptomrces granu^^be^

Vlastnooti kmene, pгodulklítího narasin

Morfologie

Kuutura produkuje spirální sporofory. Spory jsou při pozorování elekroonovým mikroskopem hladké- a tvar ssCí vejčitý až válcovitý. Rozměry spor jsou v průměru 1,3 x 2,015 /im při rozmezí 1 ,3 x 1 ,3 až 2,6/tm.

Vlastnooti kultury

Růstové vlastnosti Streptomyces granuloruber na různých živných prostředcích jsou uvedeny v následnici tabulce I.

Jména barev byla užita v - souladu a metodou ISCC-NBS podle publikace Κ. K. Kelly a D. B. Judd, - The ISCC-NBS Methode of D^e^i^jp^i^iti^ng Colors and a Dieílona^ o^ Color Name, U. S. Dep^rtmenb o^ Coummece Circ. 553, 1955, Wachingtro, D. C.) Čísla v závorkách odpo- vídají číslům -barev, kterými jaou jednotlivě barvy označeny v pubbikaci H. D. Treaner a E. J. Badma, Syetem Color Whels for Streptom^rcete Taxmorny, Appp. Miirobiol.

, 335-338 (1956)- Označení barev podle - běžně užívaných tabulek - je podtrženo. Označenío barevných bloků podle publikace A. Merz a M. -R. Paul, ЫсО^огг, o^ CCoor, - McGGaw.-Hill ' '

Book Co., lne., New York N. - Ϊ., (1950), - jsou uvedena v hranatých závorkách. 0 - - ' .

* ' e ..

W ..

* - 0

N

Tabulka I

Vlastnosti kultury na různých Živných prostředcích

Prostředí	Vlastnosti
Agar s rajským protlakem a ovesnou moukou	Růst je bohatý, zadní strana kultury purpurově černá [56E8], mycelium na vzduchu je průměrně vyvinuté, spory (GY) světle šedohnědé až červenavé až (R) 5dc Šedožlutorůžové. Pigment se netvoří nebo se tvoří nepatrné množství hnědého Ve vodě rozpustného pigmentu·
Agar s glycerolem a gycínem	Růst bohatý, zadní strana kultury tmavě purpurově červená [55H4] , průměrné mycelium na vzduchu a spory (R) 5dc šedožlutavě růžové, rozpustný pigment se nevytváří
Agar s extraktem z kvasnic a sladů (ISP prostředí 2)	Bohatý růst, zadní strana kultury černá až černavě červená, [46Cl] až [56Н12]. Bohaté vzdušné mycelAum a spory (W) b bílé až (GY) £ světle šedé, rozpustný pigment se netvoří nebo se tvoří nepatrné množství hnědého, ve vodě rozpustného pigmentu·
Agar s ovesnou moukou (ISP prostředí 3)	Bohatý růst, zadní strana kultury červenavé hnědá [7J7j , mycellum na vzduchu je dobře vyvinuté, spory ' (GY) & světle šedé, tvoří se malé množství hnědého, ve vodě rozpustného pigmentu·
Agar se škrobem a anorganickými solemi (ISP prostředí 4)	Bohatý růst, zadní strana kultury mírně Červenavě hnědá [7J9], mycelium na vzduchu je bohaté a spory (E) 5dc šedavé žlutavě růžové, rozpustný pigment ve vodě se nevytváří»
Agar s glycerolem a asparaginem (ISP prostředí 5)	Bohatý růst, zadní strana kultury středně červenavě hnědá [6G9] , dobře vyvinuté mycelium na vzduchu a spory, (R) 5dc šedavé žlutavě růžové. Ve vodě rozpustný pigment se nevytváří.
Živný agar	Průměrný růst, zadní strana kultury šedavé Žlutá [l2B2], vzdušné mycelium ani spory se netvoří, ve vodě rozpustný pigment se nevytváří.
Agar s tryptonem a extraktem z kvasnic	Průměrný růst, zadní strana kultury šedavé žlutá [12B2], mycelium na vzduchu ani spó у se.netvoří, ve vodě rozpustný pigment ae netvoří.
Agar 3 maleinanem vápenatým	Průměrný růst, zadní strana kultury bledě žlutá [J 0B2]. Průměrně vyvinuté mycelium na vzduchu a spory (GY) světle olivově hnědé. Va vodě rozpustný pigment se nevytváří.

Pokračování tabulky I

Prostředí	Vlastnosti
Emersonův agar	Bohatý růst, zadní strana kultury mírně žlutohnědá [13H7J, netvoří se vzdušné mycellum ani spory, ve vodě rozpustný pigment se nevytváří.
Agar s glukózou a	к/ · Růst dobrý až bohatý, zadní strana kultury černavě
aaparaginem	červená [56Л0], mycellum na vzduchu dobře vyvinuté áž bohaté a spory (GY) 5fe světle šedavé červenavě hnědé, tvoří se malé množství hnědého, ve vodě rozpustného pigmentu.
Bennettův agar	Dobrý růst, zadní strana kultury šedavé žlutá [l2J5j, mycellum na vzduchu ani spáry se netvoří, ve vodě rozpustný pigment se netvoří.
Agar s tyroainem	Bohatý růst, zadní strana kultury tmavě purpurově červená [5EJ6], průměrně až dobře vyvinuté vzdušné mycellum a spáry (W) b bílé až (R) бес Šedavé žlutavě růžové. Vytváří se hnědavý, ve vodě rozpustný pigment.
Czapkův agar	Průměrný růst, zadní strana kultury bledě oranžově žlutá 9B2 , průměrně vyvinuté vzdušné mycelium a spory (GY) 2dc žlutavě šedé. Vytváří se malé množství hnědého, ve vodě rozpustného pigmentu·

Mikroorganismus byl sledován к zjištění některých fyziologických vlastností v souladu se standardními postupy. Pozorované vlastnosti tohoto mikroorganismu jsou uvedeny v následující tabulce II.

Tabulka II _t

Fyziologické vlastnosti A-39912

Tvorba melanoidního pigmentu na následující prostředí:

1. Bujón s tryptonem a extraktem z kvasnic (ISP 1)	Melanoidní pigment se nevytváří
2. šikmý agar s peptonem, extraktem z kvas-
nic a železem (ISP 6)	Melanoidní pigment se nevytváří
3. (šikmý agar s tyrosinem (ISP 7)	Melanoidní pigment se nevytváří
Redukce dusičnanu	Pozitivní reakce
Zkapalnění želatiny	Pozitivní reakce - 100 % za 14 dní
Bramborový blok	Kultura neroste
Mrkvový blok	Kultura neroste

Pokračování tabulky II

Hfdrolýza škrobu, užito prostředí IPS 4 s anorganickými solemi a škrobem

TepPotní požadavky

OddStředěné mléko

Tolerance NaCl

Rozmezí pH

Škrob je hydrolyzován

Bohatý růst a sporulace při teplotním rozmezí 25 až 43 °C, kuLtura neroste při teplotě nižší než 25 a vyšší než 43 °C.

Dooliází k peptonizaci

-3,5 % až <4,0 %

Kultura rosta v rozmezí pH 5,5 až 9,5.

Vyyžití uhlíku bylo stanoveno na základním prostředí podle Pridhtma a Gootlieba, k němuž byly přidávány zdroje uhlíku do konečné koncentrace 1,0 %, jak je popsáno ve shora uvedené publikaci Shirlinga a Gootlieba. Zdroje byly před přidáním k živnému pro středí δΙοιΊϋζονέ^· Výsledek byl odečítán po S a po 14 ' dnech inkubace při 30 °C. Tabulka obsahuje konečnou hodnotu.

Výsledky pokusů na využití uhlíkových zdrojů při použžtí kultury A-39912 jsou uvedeny v následnicí tabulce III.

Tabulka III

Využií uhlíkových zdrojů

Suustřát: Zdroje uhlíku, přidané k základnou prostředí podle · Pridhama a GootliYa

Reakce kultury A-39912 po 14 dnech

L-arabinoza	♦+
D-fruktóza	++
D-glukOza
ivinositol	++
D-mannitol	-
^-гпГЗДп^п
Ь-НпшпОхп	++
aacharOza	+
D-xyloza	++
D-geCLaktOza	++
kontrola - uhlík	. -

x

Zlroje uhlíku odpoovddjí International Streptomyces Project (Shrling a GGotlieb supra.)

Vysvětlivky к tabule·:

♦♦ a Silně pozitivní Využití * » pozitivní využití t a pochybně využití

- a negativní využití

Vlastnosti buněčné stěny

Při použití hydrolyzovaných celých buněk mikroorganismu byla stanovena přítomnost určitých cukrů· Izolované buněčné stěny byly užity ke stanovení isomerů kyseliny diaminopimelové·

Cukry v buněčné stěně byly stanoveny při použití modifikace způsobu, uvedeného v publikaci Μ. P. Lechavalier Chemieal Methoda ae Criteria for the Separation of Actinomycetea Into Genera”· Tyto metody byly vyvinuty v laboratořích, dotovaných Subcommittee én Actionomycetes of the Američan Society of Microbiology, /Dr. Thomas G. Pridham, Convenor), laboratoře se nacházejí v Institute of Microbiology, Rutgers University, The Statě University of New Jeraey, New Brunawick, N. J., (1971). Isomery kyseliny diaminopimelové byly stanoveny při použití metody, uvedené v publikaci Becker e delší., Appl. Mikrobiol. Ц, 421 až 423 (1964)· Věechny plotny byly odečítány po 6 až 14 dnech při teplotě 30 °C. Výsledky těchto pokusů jsou dále uvedeny,

Pokus

Výsledek

Teat na isomery kyseliny

2,6-diaminopimelové

Teat na cukry

LL-isomer glukóza, ribóza

Mimoto bylo srovnáváno využití uhlíkových zdrojů kmene A-39912 a Streptomyces (chainia) rubra ATCC 17755, Streptomyces griseoruber ATCC 23919, a Streptomyces griaeoaurantiacus ATCC 19840, výsledky jsou uvedeny v následující tabulce IV.

Tabulka IV

Využití uhlíkových zdrojů kmene A-39912, Streptomyces (Chainia) rubra ATCC 17755, Střeptemyče a griseoruber ATCC 23919 a Streptomyces griaeoaurantiacus ATCC 19840

Zdroj uhlíku	A-39912	ATCC 17755	ATCC 23919	ATCC 19840
D-glukóza				++
L-arabinóza	♦	-
aacharóza	♦	♦	-	-
S-xylóza	+♦	♦	++	Ή-
inoaitol	+♦	♦	♦♦	♦♦
D-fruktóza	♦+	♦
D-mannitol	-		-

22ΊΊ00

Pokračování tabulky IV

Zdroj uhlíku A-39912

ATCC 17755

ATCC 23919

ATCC 19840 rhemnóza

+ +4++ raffinóza

Vysvětlivky . k tabulce:

++ = dobré vyižití + ³ pozitivní vyžití i = pochybné vybití

- = negativní vybití

Srovnání podobnootí a rozdílů mezi kmeny A-39912 a Streptomyces (cheinia) rubra ATCC 17755, Strepoomyces griseoruber ATCC 23919 a Strepoomyces griseoaurantiacus ATCC 19840 je uvedeno v následující tabulce V.

TabuukaV

Srovnání vlastností kmenů A-39912, Streptomyces (chainia) ^ubra ATCC 17755, Strepoomyces griseoruber ATCC 23919 a Streptomyces griseoaurantiacus ATCC 19840

Vlastnost	A-39912	ATCC 17755 S. (ch&Lnia) rubra	ATCC 23919 S. griseoruber	ATCC 19840 S. giseoaur srntiacus
Moofologie spor	spirální	spirální	spirální	spirální
Povrch spor	hladký	hladký	hladký	hladký
Barva vegetativního myyeeia	purpurově	žlutohnědá	žluto hnědá	žlutohnědá
	červená až	hnědavě oranžová	červehavě	olivově šedá
	černá červe-		oranžová	až červenavě
	navě hnědá			hnědé
Barva vzdušného myceia	červená až Sádá	červená	šedá	šedá
Zkapalnění želatiny	4·	4-	-	+
Redukce dusičnanu		- ‘		4·
Oddtředěné mléko	pepIonizace	hydrolýza	peptonizace	peptonizace
Produkce meeanoid-
ního pigmentu	- ’	-	-	-

Potaračovifaí' tabulky V

Vlastnost	A-39912	ATCC 17755	ATCC 23919	ATCC 19840
		S. (cha^ia) rubra	S. rii8eoiubei	S. griseo лгопtiacus

^Tvorba toyetalů na:¹

ISP prostředí' 24

1SP prostřádí 3 *

Agar a protlakem z rajčat a ovosnou

Mukou * isomer kyseliny 2,6diaminopimelové LL

LL

LL

LL ^{1 ) K}yyial^y undeeyl^edigintau

Celá řada moorologických a fyziologických vlastnosti uvedených'čtyř kmenů se shoduje, rozdíky jsou v barvě vegetativního media, 'vzduSného media a v tvorbě granul na různých živných prostředích, jak je uvedené v tabulce V.

Kmen ' Streptomyces grandoruber, který produkije narasin byl uložen do veřejné sbírky kultur Northern Regional Research Center, U. S. Department of Agriculture. Aricultural Research Service, Peofria, Illinois, 6160-4, odkud je možno jej běžně získat pod - číslem NRRL 1238*9.

Stejně jako je tomu u jiných mikroograňismů, některé vlastnosti kmen Streptomyces granuloruber, NRRL 12389 mohou podléhat variacím, Je tedy například - možno užít při provádění - způsobu.podle vynálezu mittoity, a to spontánní a/nebo vyvolanét transkonjuganty a rekombinaity včetně rekombinait DNA na plaemidech kmene NRRL 12389 nebo odvozených od tohoto kmene, pokud pro&ukj antibietitom narasin.

ИЧ pěstování kmene Streptomyces granuloruber za účelem získání narasinu je možno užít celou řadu živných prostředí. Teto prostředí mají obsahovat využitelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí. Vhodným. zdroji uhlíku jsou například glukóza, Škrob a dextrin. Mezi vhodnými zdroji dusíku je možno uvést pepton, enzymaaicky hydrolyzovaný kasein, mouku z bavlníkových semen a pepton z masa.

Základní stopové prvky, které jsou nutné pro růst a - vývoj produkčního organismu se mohou vyskytovat jako nečistoty v jiných složkách živného prostředí v Dmnoství» které je dostatečné pro růst a- biosyntetické požadavky organismu. Mlže však být vhodné včlenit do živného přoatředí dděí rozpustné anorganické soli s obsahem sodíku, draslíku, hořčíku., vápníku, amowých - iontů, iontů chloridových, uh-ičiLan^ových, fosforečnanových, síranových, dusičnanových a podobně.

Při výrobě větěích množtví narasinu při pouHtí kmene NRRL 12389 je vhodné tento kmen pěstovat . v submerzní kUtuře za aerobních podmínek ve větěích tancích. Malá množtví narasinu je možno získat ve třepacích lahvích. V případě fermentace v tanku je výhodné užít vege '.at víť očkovací materiál. Vegetativní očkovací materiál je možno získat tak, že se naočkuje malé možství živného prostředí sporami, mceeia nebo lyofilZzovnými pelet®!, organismu, čímž se získá čerstvá, aktivně rostoucí kULtura organismu. Takto získaný vegetativní očkovací Μθ^ιΤάΙ se pak přenese do většího tanku, v němž je možno získat po dooř antibiotium narasín v optimálním výtěžku.

Fekud Jde o hodnoty pH, liší se pH oroaočkooaoého fermentačního prostředí od pH při produkci a1rn.iЫotiit, vždy se však pohybuje pH feimentačního prostředí v rozmezí 6,5 až 7,5. .

produkující narasin . je možno pěstovat v teplotním rozmezí 25 až 43 °C.

K optimální produkci narasinu při pouužtí kmene NRRL 12389 dochází přibližně při teplotě 30 °C.

Jak je to ' ; řžné při pěstování mikroorganismu v submerzní kultuře ze aerobních podmínek, disperguje se v živném prostředí v průběhu fermentace sterilní vzduch. K dostavenému růstu mikroorganismu se pohybuje objem vzduchu při produkci v tanku v rozmezí 0,25 až 1,0 objemu vzduchu na 1 objem živného prostředí za minutu. Optimmání hodnota pro nádobu o obsahu 10 litrů je 0,2 objemu vzduchu na objem prostředí za minutu při míchání běžným způsobem rychlostí 400 otáček za· minutu. Mi že . být zapotřebí přidat malé mnžsSví, například 0,2 ml/1 tгjtipšn.ioéhj činidle, například propylenglykolu, zejména v případě většího fermentačního . ínožsSví, kdy může dojít k příliš velkému p$n<^]^2í.

Produkci narasinu je možno v průběhu fermentace sledovat difúzí na agaru nebo zákalovými zkouškami. Mitooorganismy, vhodnými pro toto použití jsou například.Stathcloeoeeus aurnu, ВиШ^ s^bstHs a Mi^rococcus totežs.

K nahromadění antibiotika dochází obvykle přibližně po 40 hodinách a jeho rninoství se zvyšuje ještě alespoň dva nebo více dnů. K nejvýšší produkci antibiotika dochází v rozmezí 2 až 4 dnů od počátku fermentace.

лсШЬ^И.® narasin Je možno izolovat z živného prostředí známým způsobem, například způsobem·, který byl popsán Bergem a dalšími v US patentu č. 4 038 384.

Nový mikroorganismus Serrpjoíycrs granuloruber,. NRRL 12389, produtožící narasin produkuje převážně množiv! faktoru A narasinu a mimoto malá minŽžtví faktoru B a D narasinu. Tyto složky Je v případě potřeby možno získat jako jedno tlivá antibiotika dalším čištěním komp^pexTu, například ehrjmítegrraií na sloupci. Uvedené faktory byly popsány v US patentu č. 4 038 384.

Vdález bude osvětlen následujícími příklady, v nichž jsou užita různá fermentační prostředí.

Příklad 1

Kužtura Serrpjoíccrs granuloruber NRRL 12389 byla připravena nejprve na šilmaém agaru následujícího složení:

Složka	Moosíví (g/1)
bramborový dextrin	10,0
enzy^8^a^:icky hydrolyzovemý
kasein1	2.0
extrakt z hovězího masa	' - 'o
extrakt z kvasnic	1,0
agar	2,0
Czapkův zásobní roztok
ano^anl.cký^ solí2	2,0 m./1
deionizovaná voda do	1 ,0 litru

N-Z-amin A (Humko dheefield Chemieal Co., Memphia, Term.) o

Czapkův zásobní roztok anorganických solí je síísí složek, uvedených v následující tabulce.

Složka MoOství g/100 ml

KC110,0

MgSO₄.7 H₂O10,0

FeS0₄.7 H₂00,2 deionizovaná voda do 100 ml

Spora Strepoomyces granuloruber NRRL 12389 se naočkují na Si^lmý agar shora uvedeného složení a takto naočkovaný Sidmý agar se inkubuje 7 dni při teplotě 30 °C. Zralá kultura na Silmém agaru se pak převrství vodou a uvolní sterinnm nástroem k získání spor a my celia. 1 ml výsledné suspenze spor se užije k naočkování 100 ml vegetativního živného prostředí následujícího složeni:

Složka

Možství (g/1)

dextróza sójová mouka k^Jtadřičný výluh uhličitan vápenatý chlorid- sodný Czapkův zásobní roztok anorganických solí deionizovaná voda do

15,0 15',.0 5,0 2,0 5,0 2,0 m./1 1 ,0 litru

Vegeeativní očkovací maaeeiál se inkubuje v Erlenmeyrově baňce o objemu 500 ml se Sioo!ým hrdlem při teplotě 30 °C přibližně 40 hodin na třepačce s výkyvem ' 5 cm při 106 výkyvech za minutu. Takto inkubované živné prostředí se užije bud k naočkování mmeních fermentačních nádob (očkovací mmatelál tvoří přibližně 1 % objemu fermentoru) nebo - k naočko vání druhého stupně za účelem získání většího objemu mcceia.

200 ml produkčního prostředí se vloží do Erlermeyerovy baňky o objemu 1,0 litru a sterilizuje se při teplotě 121 °C přibližně 30 minut. Produkční prostředí má následnicí složení.

1

Složka dextróza poživatelná melasa Bacto pepton uhličitan vápenatý Czapkův zásobní roztok anorganických látek deionizovaná voda do

Množství (g/1)

10,0

20,0

5,0

2,0

2,0 ml/1

1,0 litru

Po zchlazení a· baňky naočkují 5 % vegetativního očkovacího materiálu. Kultura se inkubuje na třepačce o 108 výkyvech za minutu při velikosti výkyvu 5 cm. Na konci 72 hodin fermentace je pH fermentačního prostředí 7,5· Fermentace probíhá při teplotě JO °C.

Příklad 2

Narasin se produkuje při použití sterilního produkčního prostředí následujícího slo- * žení:

Množství (g/1)

Složka

protipěnivé činidlo
silikonového typu	0.2
glukóza	10,0
melasa	20,0
pepton (Difco)	5.0
uhličitan vápenatý	2,0
deionizovaná voda do	9,0 litru

¹ Dow-Corning Antifoam A

Toto produkční prostředí o pH 6,8 se sterilizuje 30 minut při teplotě 121 °C při tlaku přibližně 0,01 až 0,012 MPa· Sterilizované živné prostředí má pH 6,9. Sterilizované živné prostředí se naočkuje 2,0 % očkovacího materiálu z druhého stupně, který se získá způsobem podle příkladu 1. Naočkované produkční prostředí se fermentuje ve fermentačním tanku o objemu 10 litrů 3 dny při teplotě 30 °C. Fermentační prostředí se provzduěňuje sterilním vzduchem rychlostí 0,2 objemu na objem živného prostředí za minutu a míchá se běžným způsobem rychlostí 400 otáček za minutu.

Příklad 3

Izolace a čiětění litrů fermentačního živného prostředí se upraví na pH 3 přidáním vodného roztoku kyseliny sírové o koncentraci 1 N a míchá se hodinu. Pak se směs zfiltruje při použití pomocného prostředku (Hyflo Supercel- infusoriové hlinky produkované Johns-Manville Corporation) a filtrační koláč se promyje vodou. Pak se filtrační koláč extrahuje 9 litry metanolu s obsahem 3 % hydrogenuhličitanu draselného tak, že se koláč s tímto roztokem míchá a pak se směs znovu zfiltruje. Pak se filtrační koláč ještě jednou extrahuje 9 litry metanolu.

Mentolové extrakty se slijí a zahustí na objem 2 - litry, načež se pH upraví na 7,5 přidánín vodného roztoku kyseliny sírové o koncentraci 1 N. Směs se extrahuje dvakrát vždy 2 litry etylacetátu· Extrakty se slijí a ve vakuu se odpiOř na odparek, který se rozpustí ve 150 ml acetonu· K acetonovému roztoku se přidá 150 П vody a pH ae upraví na 3,0 vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové o pH 1 N. Směs se hodinu míchá a vzniklé olejovité krystaly se odfiltrují . a rozpuutí ve 150 ml acetonu, načež se přidá 150 ml vody· Rostok se nechá stát přes noc při teplotě mííttinoti, vzniklé krystaly se odddlí filtrací, promni vodou a usuší ve vakuu, čímž se získají krystaly s olejoviým fibnem.

Tyto olejovité krystaly se rozpuatí v 5 ml benzenu a nanesou se na vrchol sloupce n rozměrech 1,8 ' x 40 cm s obsahem sililagelu (Grece Grade 62) v benzenu· Sloupec se postupné promtvá 250 ml benzenu, smésí benzenu a etylacetátu v poměrech 9:1, 4:1, 7:3 a'1:1 a nakonec etylacetátra, přičemž se odebíraaí frakce o objemu 20 až 25 m.· Vyutfvvbní účinné složky se sleduje biologicky a také chromaaogrrafí na tenké vrstvě silkkagelu při použití etylacetátu jako rozpouštědla· .

K detekci se užije postřiku kyselinou sírovou s vaniinnem a jako detekční organismus se užije Badlks zubiHs· Frakce s obsahem pouze jediné složky narasinu se slijí a odpróí do sucha ve vakuu· Odjparek se rozpuutí v 50 ml acetonu, přidá se 50 OL vody a roztok se nechá stát ' při teplotě místno o ti ke kryssalizaci· VznnkLé krystaly se zfiltrují a usuší ve vakuu, čímž se získá 172 mg bílých krystalků o teplotě tání 75 až 78 °C·

Kyytalky jsou totožné s narasinem, jak je možno prokázat srovnáním NMR spektra, spektra v infračerveném a ultrlflaOovéa světle, hmotového spektra a ch^am^e^a^ na . tenké vrstvě a na papíře· Také biologické lntialkroOíální a antikokecdiální účinnost ' je totožná s účinnootí narasinu,

K identifikaci purpurově červených krystalů, produkovaných kmenem A-39912 bylo užito postupu, uvedeného v příkladu 4·

Příklad 4

Unneeclprrdiginin - výroba a průkaz

Clh^,omaloggrl^kické plotny z plastické hmoty o rozměrech 23 x 45 cm s hranou vysokou 10 mm a obsahem 250 ml agaru s rajském protlakem a ovesnou moukou, připraveného způsobem podle publikace Pridham a daaší, АО1ЬШ₍ Ann. 1956 až 1957, str· -947 až 953 se naočkují 48 hodin starým očkovacím aaleriálea př bujónu s tryptonem a extraktem z kvasnic podle shora uvedené publikace Shirlinga a Got^lieba· Bujón s tryptonem a extraktem z kvasnic má následnici složení:

Složka

Moožsví (g/1) trypton (Difco) extrakt z kvasnic destioovaná veda do

5,0

3,0

1,0 litru

Bujón má pH 7,0 - až 7,2 před sterilizací v autoklávu· Po naočkování, se plotny inkubují 14 dní při teplotě 30 °C, po této době je možno - pozorovat v agaru krystaly purpurově červené barvy·

Agar s obsahem purpurově červených krystalů se vyřízne po obvodu kULtury a extrahuje čtyřikrát vždy 500 ml směsi chloroformu a metanolu v poměru 4:1 při míchiání 15 minut na parní lázni. Extrakty se slijí a odp^ďí se ve vakuu do sucha. OJpprek se rozpustí ve 12 ml chlorofomu a chromaáografuje na sloupci o rozměrech 1,2 x 52 cm s náplní silikagelu (Orace 62) v chloroformu. Sloupec se vymývá chlorffrrmem a ode&írají se frakce po 10 m. Po frakci 34 se eluční rozpouštědlo změní na směs chloroformu a metanolu v pommru 95:5·

Frakce se sledují chromatoorafií na tenké vrstvě silikagelu při použití chloroformu a ιτίβηοΐύ v poměru 9:1, pozoorijí se purpurově zbarvené skvrny. Frakce 9 ai 14, které oíseanijí rrtoeiál s nejintenzívnějším purpurovým zbarvením, (jediná skvrna při chrom^tojgrafii na tenké vrstvě) se slijí a ^^j^íť^rí do sucha. Oddarek se rozpustí v dtoxanu a lyofflizuje,'čími se získá 10,3 mg purpurového prášku.

Tento purpurový prášek při hmotové spektromettii má rolelkU.Lá'ní ion o hmoonooti 393,27764 a empirický vzorec ^C25^H35^N3°· T^^t0 údaje spolu se srovnáním spektra v ultrafiaocvém a iof*račevvonér světle a s Nffi-saiktrer iodecylprodirioinu způsobem podle ^ЬИkace Agr. Biol. Chem, 31 4β1 (1967) a J. Antbiot. 28, 194 (1975) prokazují, ie purpurovým práškem je undecppoddginin.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob výroby antibiotika narasinu, vyznaluící se tím, ie s® pěstuje Strepoomyces rrtnuloruíer NRRL 12389 v iivném prostředí s obsahem využitelných zdrojů uhlíku,·dusíku a anorganických solí v subrrrzní kultuře za aerobních podmínek, načei se tntiíioiiUlm ze iivného prostředí izoluje.