DE2143945B2 - Verwendung eines Enzym-Addukts in Wasch- und Reinigungsmitteln - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines wasserunlöslichen, hautverträglichen, getrockneten Enzym-Addukts aus mikrobiellen proteasehaltigen Enzymen und Polyphenolen pflanz!¹'"her Herkunft in Wasch- und Reinigungsmitteln, die auch Perverbindungen enthalten können.

Enzyme werden in vielen Bereichen des täglichen Lebens benutzt, wie z. B. bei der Herstellung von Käse, Bier, Wein und anderem. Seit einigen Jahren werden auch speziell ausgewählte Enzyme in Waschmitteln eingesetzt, um Eiweiß- und Stärkeverschmutzungen zu entfernen. Unter den vielen bekannten Proteasen haben sich insbesondere die durch Fermentation bestimmter Stämme der Bacillus subtilis und Bacillus lichenifoi mis Gruppe erzeugten durchgesetzt. Diese haben ein pH-Aktivitätsoptimum bei pH 94 und ein Temperaturoptimum von 60 bis 70⁰C.

Ähnlich werden auch «-Amylasen in Waschmitteln eingesetzt, wenn auch das pH-Optimum nicht im stark alkalischen Gebiet, sondern zwischen pH 5,5 und 7,0 liegt, während die Temperatur les Optimums bei 75⁰C gefunden wurde. Im allgemeinen enthalten auch die a-Amylaseprodukte aus Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis begleitende proteolytische Aktivität. Zwar steht der Nutzen der Enzyme in Waschmitteln außer Frage; doch besitzen die Waschmittelenzyme gewisse Nachteile, wie z. B. die Reizung der Haut und der Schleimhäute, was eintritt, wenn Enzymstaub auf die Haut, besonders wenn sie feucht ist, gelangt. Personen, die mit Enzymstaub in Berührung kamen, klagen über Feuchtwerden und Rötung der Haut und Auftreten von Blutungen. Dadurch können unter Umständen Störungen bei der Verarbeitung von Enzymen auftreten.

Durch Verfahrensumstellungen ist bereits erreicht worden, daß die heute benutzten Enzymprodukte in granulierter Form praktisch staubfrei geworden sind. Dadurch werden zwar Irritationen und Erytheme beim Endverbraucher vermieden, dennoch bestehen vor dem Erhalt der granulierten Form und beim Verwender der

pulverigen Produkte nach wie vor starke Probleme in der Vermeidung von Kontakt zwischen Mensch und Enzym.

Es wurde nun gefunden, daß diese Störungen nicht auftreten, wenn die Enzyme in eine unlösliche Form gebracht werden. Sie können dann ihre hydrolytische Wirkung auf die Haut wegen mangelnder Beweglichkeit der Moleküle nicht ausüben.

Da aber andererseits die Enzyme ihre rrwünschte schmutzlösende Wirkung nur entfalten können, wenn diese Beweglichkeit vorliegt galt es Bedingungen zu finden, unter welchen das Enzym auf der Haut unlöslich und in der Waschflotte löslich, d. h. enzymatisch aktiv ist

Die Lösung des Problems gelingt erfindungsgemäß durch Verwendung eines wasserunlöslichen, hautverträglichen, getrockneten Enzym-Addukts aus mikrobiellen proteasehaltigen Enzymen und Polyphenolen pflanzlicher Herkunft in Wasch- und Reinigungsmitteln, die auch Perverbindungen enthalten können.

Zur Gewinnung der erfindungsgemäß zu verwendenden proteasehaltigen unlöslichen Enzym-Addukte werden einer Enzymlösung, vorzugsweise der filtrierten Fermenterbrühe, Polyphenole pflanzlicher Herkunft zugesetzt Dabei fällt ein gut filtrierbarer Niederschlag aus, der von der Lösung abgetrennt wird.

Die so erhaltenen Addukte sind auf der Haut unlöslich, so daß keine nachteiliger. Wirkungen beim Kontakt mit der Haut auftreten, während in der Waschflotte die Enzyme ihre erwünschten lytischen Wirkungen voll entfalten. Eine zusätzliche Granulierung, wie sie bisher zur Vermeidung nachteiliger Effekte beim Endverbraucher vorgenommen wurde ohne dadurch die Nachteile für die in der Herstellung der Waschmittelenzyme und deren Granulierung tätigen Personen zu vermeiden, ist nicht erforderlich.

Besonders geeignete Füllmittel sind Tannin und löslich gemachtes Lignin, wie z. B. Ligninsuifonat. Unter Tannin werden dabei die Naturstoffe verstanden, wie sie im Ulimann, Enzyklopädie der technischen Chemie, 3. Auflage, Band 11, Seiten iäj bis 594 bzw. im Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 2. Auflage Vol. 12 (1967), Seiten 319 bis 325, definiert sind.

Ebenso wie die Tannine sind die verschiedenen Lignine und Ligninderivate, die durch chemische Behandlung in eine wasserlösliche Form überführt worden sind, wie beispielsweise Ligninsulfonat, geeignet.

Zur Feststellung der optimalen Fällungsbedingungen wurde Fermenterbrühe mit bekanntem Gehalt an Protease mit wechselnden Mengen an Tannin bei verschiedenen pH-Werten umgesetzt. Die Ergebnisse sind in A b b. 1 dargestellt. Daraus ist zu entnehmen, daß im pH-Bereich von 5,5 bis 63 durch 5 bis 7 g Tannin pro Liter dieser Fermenterbrühe eine praktisch quantitative Fällung des Enzyms erfolgt. In Abb.2 ist dargestellt, wie bei einem konstanten pH-Wert von 5,5 die Menge an ausgefälltem Enzym von der Menge an zugesetztem Tannin abhängt. Natürlich hängt die zur quantitativen Enzymfällung erforderliche Tanninmenge von dem Gesamtproteingehalt der Fermenterbrühe ab, da das Tannin auch mit den anderen vorliegenden Proteinen reagiert, die nicht aus dem Enzym stammen.

Analog wurde durch Zusatz von 8 g pro Liter eines technischen Ligninsulfonats zum Erstfiltrat des Kulturmediums bei verschiedenen pH-Werten ermittelt, daß das Optimum der Fällung bei etwa pH 3,5 liegt (s. A b b. 3).

Bei Verwendung von Tannin sollte daher die Protease-Fällung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 7, vorzugsweise zwischen 5 und 6,5, erfolgen, bei Lignin im pH-Bereich zwischen 3 und 5, vorzugsweise zwischen 3,3 und 3,3.

Zur Ermittlung des günstigsten pH-Wertes für die Fällung von a-Amylase wurden 1 Liter Fermentbrühe mit einer Ausgangsaktivität von 5950 DLJN/ml bei verschiedenen pH-Werten jeweils mit 8 g Tannin versetzt In Abb. 4 ist die Aktivität im überstand in ι ο Abhängigkeit vom Fäll-pH dargestellt. Daraus ergibt sich, daß bei Verwendung von Tannin zur et-Amylase-Fäflung der pH-Wert zwischen 3 und 8, vorzugsweise zwischen 5,5 und 7, liegen sollte. Die üblicherweise zur Fällung von «-Amylase ausreichende Menge an Tannin liegt zwischen 3,0 und 0,3 g pro Liter Fermentbrühe je nach Aktivität und Anwesenheit von anderen Proteinen.

Die Fälltemperatur spielt in beiden Fällen keine Rolle, d.h. die filtrierten Fennenterbrühen können bei der Temperatur, bei der sie anfallen, die je nach Jahreszeit sehr unterschiedlich sein kann, verwendet werden, eine Kühlung oder Erwärmung ist nicht erforderlich.

Das Fällmittel wird zweckmäßigerweise in einer solchen Menge zugesetzt, daß in dem zurückbleibenden Klarfiltrat praktisch keine oder zumindest nur eine sehr geringe enzymatische Aktivität gemessen werden kann.

Diese Fällung hat gegenüber den üblichen Fällmethoden durch Aussalzen oder Zusatz organischer Lösungsmittel den Vorteil, daß die Abwasserbehandlung beträchtlich erleichtert und ein damit wesentlicher Beitrag zur Verhinderung der Umweltverschmutzung geleistet wird.

Die Behandlung von Enzymen bzw. enzymhaltigen Lösungen mit Tannin ist an sich seit langem bekannt. Schon in der deutschen Patentschrift 128 419 wird empfohlen, durch Behandlung von Pankreatin mit Gerbsäure ein unlösliches Pankreaspräparat herzustellen, das im sauren Magensaft unlöslich ist, aber im Dann seine verdauenden Eigenschaften entfalten kann. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß dabei eine erhebliche Schädigung der Enzymwirkung eintritt, wie aus der deutschen Patentschrift 1 83 713 zu entnehmen ist.

Später sind noch weitere Vorschläge zur Fäll'ing von Enzymen mit Tannin gemacht worden. Dies.· hatten jedoch entweder den Zweck, ein möglichst reines Enzympräparat zu erhalten, indem entweder durch den Tanninzusatz die die Enzyme begleitenden Verunreinigungen ausgefällt werden sollten, oder aus dem Enzym-Tannin-Niederschlag wurde das Enzym in reiner Form mit organischen Lösungsmitteln herausgelöst. Die Enzym-Tannin-Niederschläge wurden jedoch niemals als solche isoliert, getrocknet und verwendet.

Zum Beispiel wird in der britischen Patentschrift 11 56 900 eine Fällung der Enzyme mit Tannin vorgeschlagen, um die Fällung wirtschaftlicher zu gestalten. In dieser britischen Patentschrift wird jedoch festgestellt, daß häufig mit Tannin keine Fällung zu erzielen ist. Deshalb wird der gleichzeitige Zusatz von Protein vorgeschrieben. Aus dem gefällten Produkt t,o wird das Enzym wieder mit Aceton herausgelöst, um eine reine pharmazeutische Enzympräparation zu erhalten.

Ein ähnliches Reinigungsverfahren wird in der DE-OS 16 42 619 beschrieben, bei dem als Fällmittel synthetische Gerbstoffe eingesetzt werden. Aus dem Niederschlag werden die anorganischen Salze und die Gerbstoffe durch Waschen mit Wasser bzw. mit Gemischen von Wasser mit organischen Lösungsmitteln entfernt, um so ein reines Enzym zu erhalten. Die Verwendung synthetischer Gerbstoffe hat jedoch den Nachteil, daß das Ausfallen des Enzym-Gerbstoff-Adduktes, besonders bei gealterten Gerbstoffen, verzögert wird oder gänzlich unterbleibt, wie aus der nachfolgenden Zusatzanmeldung DE-OS 19 14 309 ersichtlich. Daher wird in der DE-OS 19 14 309 vorgeschlagen, zusätzlich zu den synthetischen Gerbstoffen Salze organischer oder anorganischer Säuren einzusetzen. Die dabei anfallenden salzhaltigen Abwasser stellen ein ernstes Problem dar.

Schließlich ist aus der DE-OS 19 48177 bekannt. Addukte aus Enzymen und Polymeren in Waschmitteln einzusetzen. Als Polymere werden vorzugsweise Äthylenmaleinsäureanhydrid-Copolymere verwandt. Bei dieser Fällung tritt jedoch eine teilweise Inaktivierung des Enzyms ein, deshalb wird empfohien, ein Lösungsmittelgemisch anzuwenden, das eine organische Komponente enthält, in der das Enzym wenigstens teilweise löslich ist, wie z. B. Dimethylsulfoxid. Di· Verwendung eines organischen Lösungsmitteis beiasttt ien Prozeß natürlich wirtschaftlich und wirft ebenfalls erhebliche Abwasserprobleme auf.

In keiner dieser Veröffentlichungen ist jedoch die Isolierung und Trocknung eines Enzym-Tannin-Adduktes beschrieben, und es ist auch niemals in Waschmitteln eingesetzt worden, da befürchtet werden mußte, daß die Waschwirkung durch die Unlöslichmachung des Enzyms beeinträchtigt werden würde und daß bei eisenhaltigem Wasser eine Verfärbung der Waschflotte ■auftreten würde.

Überraschenderweise treten bei Einsatz des erfindungsgemäßen Produktes in Waschmitteln diese Störungen nicht auf. Wie Waschversuche gezeigt haben, ist die Reinigungswirkung eines Waschmittels, dem das erfindungsgemäße Enzym-Tannin-Addukt zugesetzt wurde, gleich der eines Waschmittels, das das herkömmliche freie Enzym enthält. Wider Erwarten wurde bei Versuchen mit einer Waschflotte, die 1 g FeCb ■ 6 H2O pro Liter enthielt, das ist ein Vielfaches jes höchsten überhaupt vorkommenden Eisengehaltes von Trinkwasser, keine Verfärbung der Waschflotte festgestellt. Auch bei starker Überdosierung des Enzym-Tannin-Adduktes im Waschmittel trat keine Tintenfärbung auf.

Ein wesentlicher bisher nicht beobachteter Vorteil der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzym-Addukte ist ihre ausgezeichnete Hautverträglichke't. Die unlöslich gemachten Enzyme können ihre hydrolytische Wirkung auf die Haut wegen mangelnder Beweglichkeit der Moleküle nicht ausüben. Die sonst im Umfang mit staubförmigen Enzymkonzentraten eingangs beschriebnen Reizungen der Haut und Schleimhäute treten daher nicht auf. Da bereits bei der Herstellung ein nicht hautreizendes "nzym-Polyphenol-Addukt anfällt, ist somit die Gefahr einer Hautaffektion ausgeschaltet.

Die Hautverträglichkeit der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzym-Addukte wurde wie folgt getestet:

50 mg des nach Beispiel 1 erhaltenen Enzym-Tannin-Adduktes mit einer enzymatischen Aktivität von 150 000 DU wurden als Pulver auf 2,5 χ 2,5 cm große Zellstoffstreifen aufgebracht bzw. Zellstoffstreifen gleicher Größe wurden mit 0,5 ml einer Suspension des Enzym-Tannin-Atiduktes getränkt, deren Aktivität 450 000 DU betrug. Diese Zellstoffpflaster wurden mit Klebestreifen auf der rasierten Haut von männlichen

Kaninchen (weiße Neuseeländer, Durchschnittsgewicht: 2500 g) befestigt. Parallel wurden an dem gleichen Tier Pflaster befestigt, die analog mit löslicher Protease beaufschlagt waren.

Nach 24 Stunden wurden die Pflaster entfernt und die behandelte Stelle nach folgender Skala bewertet:

Gut begrenzte Rötung
Mittel- bis hochgrad. Erythem
Schweres Erythem mit Schorf

2 Gut begrenztes Ödem

3 Mittelgrad. Ödem

4 Schweres Ödem

Keine Rötung
Geringe Rötung

0 Kein ödem

1 Geringes Ödem

Nach jeweils 24 Stunden wurden die behandelten Stellen wieder beobachtet und neu bewertet.

Die Lage der Plaster war den Beurteilern nicht bekannt. Insgesamt wurden 6 Versuchstiere getestet. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Tabelle 1

Hautreizung von löslicher und unlöslicher Protease

Applikation

'ulvcr
Pflaster mit 150 000 Dl)

Suspension
Pflaster mit 450 000 DU

Stunden nach Beginn der Applikation

24 h 48 h 72 h 96 h 120 h

24 h 48 h 72 h 96 h 120 h Lösliches lin/ym
Addition der
funkle von
6 Kaninchen

13

5
6

10
6
8
4
2

Unlösliches Hn-/ym-Tannin-Addukt Addition der Punkte von 6 Kaninchen

5
0
0
0
0

6
0
0
0
0

Die Werte zeigen deutlich, daß das erfindungsgemäße unlösliche Enzym-Addukt kaum die Haut angreift, während durch lösliche Protease deutliche Hautreizungen hervorgerufen werden, die erst nach längerer Zeit abklingen.

Andererseits wurde überraschenderweise festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Produkte in der Waschflotte ihre volle Aktivität entfalten. Unter den in der

■ ι; l_fl ** I" J DJ^- * Λ Λ' Α

pH-Wert entsprechende Aktivität des Ausgangsenzyms freigesetzt.

Zur Prüfung der Abhängigkeit der Aktivität des erfindungsgemäßen Produktes vom pH-Wert wurde ein Enzym-Tannin-Addukt in bidestilliertes Wasser eingebracht und nach 15 Minuten die Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind aus der nachfolgenden Tabelle 2 zu ersehen.

Tabelle 2

Abhängigkeit der Aktivität des unlöslichen Enzym-Adduktes vom pH-Wert

Gefundene Aktivität
im Überstand

PUN/ml

In Lösung gegangene Aktivität

% der Ursprungsaktivität

60 000

75 000

263 000

6 8

27

pH Gefundene Aktivität

im Überstand

PUN/ml

In Lösung gegangene Aktivität

% der Ursprungsaktivität

622 000
768 000

64 79

60

Beispiel 1

100 Liter einer filtrierten Fermenterbriihe von einer Temperatur von 25° C, die alkalische Protease aus Bacillus subtilis in einer Konzentration von 36 800 DU/ml enthielt, wurden mit 600 g Tannin bei pH 53 versetzt Die Filtration erfolgte nach 30 Minuten in einer Filterpresse. Das Enzym-Tannin-Addukt wurde mit Wasser gewaschen, mit Aceton vom anhaftenden Wasser befreit und abschließend im Vakuum bei 45°C getrocknet.

Ausbeute: 750 g eines beige-farbenen unlöslichen Protease-Enzym-Adduktes mit 3 340 000DU/g = 68% der Ausgangsaktivität.

Gegenüber der üblichen Fällung mit Natriumsulfat, bei der die Ausbeute 60% beträgt, wurde also eine erhebliche Ausbeuteverbesserung erzielt

Beispiel 2

1 Liter einer fillriertcn Lösung, die eine proteasehaltige Λ-Amylase au.· Bacillus subiilis mil einer Aktivität von 5000 DUN/ml enthielt, wurde mit einer wäßrigen Lösung von 10 g Tannin bei pH 6 versetzt. Es entstand sofort ein flockiger, gut filtrierbarer Niederschlag, der mit V.sscr gewaschen, anschließend mit Aceton und zum Schluß im Vakuum bei 45^r C getrocknet wurde.

Ausbeute: 7,2 g mit 436 000 DUN/g = 63% des
Ausgangs wertes.

Beispiel 3

1 Liter einer filtrierten klaren Lösung, enthaltend bakterielle Protease und Λ-Amylase mit 92 000 DU/ml und 400 DUN/ml wurde mit 8 g Tannin in 100 ml Wasser bei pH 5.5 versetzt. Der helle flockige Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Nach der Trocknung im Vakuum wurde ein helles gcrucharmes Pulver erhalten.

Ausbeute: 1 5.3 g unlösliches Protease-Amylase-Tanin-Addukt
Protease = 5 430 000 DU/g

= 88% vom Ausgangswert
Amylasc = 18 000DlJNZg

= 69% vom Ausgangswert.

Beispiel 4

10 Liter einer Lösung, enthaltend Baktcricn-Protcase (Aktivität 30 800 DU/ml) wurden mit 80 g Ligninsulfonat versetzt. Der pH-Wert wurde mit Säure auf 3.5 eingestellt. Das ausgefällte unlösliche Enzym wurde abfiltriert und getrocknet. Es wurden 48 g eines Protease-Lignin-Adduktes mit 4 500 000 DU/g erhalten. Die Ausbeute beträgt also 70% der Ausgangsaktivität.

Ähnliche Ergebnisse wurden mit anderen Enzymen, wie z. B. Glucoamylase aus Aspergillus niger, Cellulase aus Aspergillus niger, Glucoseoxydase aus Aspergillus niger und Glucoseisomerase. erhalten.

Waschversuche

Das erfindungsgemäße Enzym-Addukl wurde auf seine Waschwirkung im Vergleich mit einem löslichen auf dem Markt befindlichen Enzymprodukt sowohl im Vorwaschmittel ohne Perborat wie auch im Vollwaschmittel mit Perborat getestet.

Die Waschmittel hatten etwa folgende Zusammensetzung:

llcslaiultcili:	Vorwasch-	Vollwasch
	miltcl	mittel
Waschaktive Substanz	17%	11%
Silikat	6%	4%
Perborat	■-	35 %
Sulfat	6%	12%
Natriumtripoly-	51%	32 %
phosphat
Rest: Optische Aufheller, C'arhoxym	clhylccllulnsi
Seile und Wasser

In das Waschmittel wurden unlösliche bzw. lösliche Enzyme in einer solchen Menge eingemischt, dall 3000 DU/g Waschmittel vorlagen, für Versuch 1 wurde das nach Beispiel I hergestellte Protcase-Tannin-Addukt verwendet, für Versuch 2 wurde lösliche Protease der gleichen l'artie verwandt, /um Vergleich wurden auch Versuche mit den Waschmittel ohne Enzymzusatz durchgeführt.

Die Waschmitteldosicrung betrug 4 g pro Liter, el. h. 12 DU/ml Waschflotte, die einen pH-Wert von 9.5 hatte.

Für die Versuche wurde das Linilcstgcrät und das Testgewebe EMPA 112 (Kakaoverschmutzung) verwandt.

Waschprogramm

Zunächst wurde 30 Minuten auf 60"C aufgeheizt und dann 30 Minuten bei dieser Temperatur gewaschen. Anschließend wurde in etwa 15 Minuten auf 90"C aufgeheizt und weitere 15 Minuten bei dieser Temperatur gewaschen.

Die Ergebnisse wurden mit dem lichtelektrischcn Remissionsphotometer gegen MgO = 100% gemessen. Es wurden folgende Werte erhalten:

WeiUgradc MgO 100%

ohne mit lös-

I'n/ym lichem

F.n/ym

mit unlöslichem En/yni-Tannin-Acldukt

Vorwaschmittel
EMPA 112*)

Vollwaschmittel
EMPA 112*)

32,4

41,6

40,6

38,0 44,0 43,6

*) Standardisiertes verschmutztes Testgewebe.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Waschwirkung der Enzyme durch die Unlöslichmachung in keiner Weise beeinträchtigt wird.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verwendung eines wasserunlöslichen, hautverträglichen, getrockneten Enzym-Addukts aus mikrobiellen proteasehaltigen Enzymen und Polyphenolen pflanzlicher Herkunft in Wasch- und Reinigungsmitteln.

2. Verwendung eines Enzym-Addukts nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das Enzym eine alkalische Protease ist

3. Verwendung eines Enzym-Addukts nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß es eine «-Amylase enthält

4. Verwendung eines Enzym-Addukts nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß das Polyphenol Tannin ist

5. Verwendung eines Enzym-Addukts nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyphenol ein wasserlöslich gemachtes Lignin ist

6. Verwendung eines Enzym-Addukts nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet daß das wasserlöslich gemachte Lignin Ligninsulfonat ist

ίο