CN110846420B - 一种快速突变y染色体str分型系统、下一代测序分型试剂盒及分型方法和应用 - Google Patents
一种快速突变y染色体str分型系统、下一代测序分型试剂盒及分型方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110846420B CN110846420B CN201911206540.4A CN201911206540A CN110846420B CN 110846420 B CN110846420 B CN 110846420B CN 201911206540 A CN201911206540 A CN 201911206540A CN 110846420 B CN110846420 B CN 110846420B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- generation sequencing
- library
- typing
- next generation
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种快速突变Y染色体STR分型系统、下一代测序分型试剂盒及分型方法和应用。该分型体系覆盖了19个基因座，能够从长度多态性和序列多态性两方面对样品进行全面分析，系统效能高，男性个体单倍型差异度大，可大大提高男性亲缘个体识别的灵敏度，并可应用于男性同卵双生子辨别。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种快速突变Y染色体STR 分型系统、下一代测序分型试剂盒及分型方法和应用。
背景技术
在涉及男性犯罪嫌疑人的案例中，Y-STR(Y染色体STR)可以用于排查男性家系，缩小侦查范围，但常规Y-STR在同一男性家系中大多表现一致的单倍型，所以不能用于男性亲缘个体识别，包括同卵双生兄弟。据文献报道，RM Y-STR(快速突变Y染色体STR)经群体研究发现，其突变率高，具有男性亲缘个体辨别能力，仅13个位点经过毛细管电泳分型技术便可区分近70％的父子，56％的兄弟和67％的堂兄弟。但RM Y-STR具有高突变率、多拷贝和复杂核心重复结构等特点，毛细管电泳技术仅能够发现其长度多态性，而不能发现其序列多态性信息，尚未报道能应用于成功区分男性同卵双生兄弟。
发明内容
针对现有RM Y-STR不能区分男性同卵双生兄弟的技术问题，本发明提供了一种快速突变Y染色体STR分型系统。
以及，本发明还提供了一种快速突变Y染色体STR下一代测序分型试剂盒。
以及，本发明还提供了一种快速突变Y染色体STR的下一代测序分型方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种快速突变Y染色体STR分型系统，包括19个基因座，所述19个基因座为：DYS630、DYS464、DYF403S1a、DYF403S1b1、DYF403S1b2、DYF399S1、DYS518、DYS527、DYS713、DYS612、DYS627、DYS526a、DYS526b、DYF404S1、 DYF387S1、DYS449、DYS547、DYS570、DYS576。
本系统覆盖了19个基因座，能够从长度多态性和序列多态性两方面对样品进行全面分析，与毛细管电泳分析技术相比，增加了位点数目、序列多态性信息，提高了系统效能，增加了男性个体单倍型差异度，从而大大提高男性亲缘个体识别的灵敏度，并可应用于男性同卵双生子辨别，为涉及男性个体识别甚至男性同卵双生个体鉴别提供了科学方法。
以及，本发明还提供了一种快速突变Y染色体STR下一代测序分型试剂盒，所述下一代测序分型试剂盒包括下一代测序定制panel试剂盒，所述下一代测序定制panel试剂盒中包括上述19个基因座的68条PCR扩增特异性引物，所述PCR扩增特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.68所示。上述PCR扩增特异性引物高度覆盖该19个基因座，覆盖度>99％。
优选地，所述下一代测序分型试剂盒还包括FuPa试剂、Ampliseq CD Indexes和Lib Amp Mix。Ampliseq CD Indexes是以孔为唯一单位的双端标签接头预混液，即每个孔内为两种标签序列和通用接头序列，每一个孔道两种标签序列代表唯一组合，能够帮助区分和确定唯一样本。FuPa试剂和Lib Amp Mix 均适用于利用上述68条PCR扩增特异性引物构建文库的过程。
优选地，所述下一代测序分型试剂盒还包括血液DNA提取试剂盒、DNA 定量试剂盒和实时荧光定量检测试剂盒。
优选地，所述下一代测序分型试剂盒还包括MiSeq上机测序试剂，使该试剂盒能够在MiSeq平台进行下一代测序分型。
以及，本发明实施例还提供了一种快速突变Y染色体STR下一代测序分型方法，所述方法中用上述试剂盒进行样品检测。
优选地，所述下一代测序分型方法至少包括以下操作步骤：
步骤a、提取待测血液的DNA，定量，采用上述试剂盒中的68条PCR扩增特异性引物构建文库；
步骤b、对所述文库进行检测，定量；
步骤c、根据步骤b的定量结果，对文库中的样本进行均一化，然后变性、稀释，测序；
步骤d、将测序结果进行序列对比，得到分型结果。
本方法利用上述68条PCR扩增特异性引物对待测样品的DNA进行扩增，能够使所得文库中显示出待测样品质检的等位基因差异，从而能够鉴别待测样品的个体来源。该方法能够用于男性同卵双生子的鉴别。
优选地，步骤a中构建文库的操作包括靶片段扩增，扩增子部分消化，连接标签接头序列，文库一次清洗，文库扩增，文库二次清洗；所述靶片段扩增的引物为所述68条扩增特异性引物。
优选地，所述靶片段扩增的PCR反应循环参数为：99℃，2min；99℃，15s， 60℃，4min，21次循环；10℃，4min～24h。该参数条件能确保使用上述68条扩增特异性引物顺利进行PCR扩增。
优选地，所述扩增子部分消化的方法为用FuPa试剂进行扩增子部分消化，消化的参数为：50℃，10min；55℃，10min；62℃，20min；10℃，＜1h。
优选地，所述文库扩增的程序为：98℃，2min；98℃，15s，64℃，1min， 7次循环；10℃，4min～24h。
优选地，步骤c中所述稀释为将所述文库的样本浓度稀释至18pM。该浓度为最适合本方法的最佳上机浓度。
优选地，步骤c中所述测序的操作在Illumina MiSeq FGx平台进行。
以及，本发明还提供了上述快速突变Y染色体STR下一代测序分型方法在鉴别男性同卵双生子中的应用。通过上述分型方法能够检测到待测样品质检的等位基因差异，从而能够鉴别男性同卵双生子的鉴别。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种快速突变Y染色体STR分型系统，该系统包括 19个基因座，分别为：DYS630、DYS464、DYF403S1a、DYF403S1b1、 DYF403S1b2、DYF399S1、DYS518、DYS527、DYS713、DYS612、DYS627、 DYS526a、DYS526b、DYF404S1、DYF387S1、DYS449、DYS547、DYS570、 DYS576。
实施例2
本发明实施例提供了一种快速突变Y染色体STR下一代测序分型试剂盒，包括下一代测序定制panel试剂盒、血液DNA提取试剂盒、DNA定量试剂盒、实时荧光定量试剂盒和MiSeq上机测序试剂。下一代测序定制panel试剂盒中包括19个基因座的68条PCR扩增特异性引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.68所示)，以及FuPa试剂、Ampliseq CDIndexes、Lib Amp Mix，以及常规试剂。
实施例3
本发明实施例提供了一种快速突变Y-STR下一代测序分型方法，该方法用实施例2中快速突变Y-STR下一代测序分型试剂盒进行样品检测。包括以下操作步骤：
1、样本准备
从已经建立的双胞胎样本库中挑选了11对男性同卵双生子外周血样本 DNA。样本DNA的全基因组用QIAamp DNA Blood kit(Qiagen)DNA提取及定量。应用NanoQ微型分光光度计检测基因组DNA的浓度与纯度。所有样本 DNA浓度大于50ng/μl，OD260/280在1.8～2.0之间。
取2μl血液基因组DNA样本进行1％琼脂糖凝胶电泳，验证其完整性。由 GoldeneyeBASIC试剂盒(基点认知技术有限公司)鉴定同卵卵形。
2800M DNA和9947A DNA分别作为阳性对照品和阴性对照品，购买于普洛麦格生物产品公司。
2、毛细管电泳分型
应用MicroReaderTM RM Y-STR ID system将11对MZ(monozygotic twins，同卵双生子)样本和2800M进行26个快速突变Y染色体STR基因座CE (capillaryelectrophoresis，毛细管电泳)分型。所检测的位点中包含DYS630、 DYS464、DYF403S1b、DYF399S1、DYS518、DYF403S1a、DYS527、DYS713、 DYS612、DYS626、DYS627、DYS526、DYF404S1、DYF387S1、DYS449、 DYS547，除DYS626外，CE分型结果均可以用于同NGS测序结果进行比较。
3、文库构建
应用AmpliseqTM Custom DNA Panel for
按照产品使用手册进行文库构建，文库构建流程主要包括靶片段捕获，扩增子部分消化，连接标签接头序列，文库一次清洗，文库扩增，文库二次清洗。
3.1靶片段捕获
采用10ng/pool起始DNA量进行文库构建，每个文库包含两个引物池，每个引物池中包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.68所示的68条PCR 扩增特异性引物。
1)靶片段捕获体系(10μl)
注：此步骤在冰上操作，用移液器吹打混匀。
2)PCR循环参数
3.2扩增子部分消化
将FuPa试剂(FuPa Reagent)放于冰上融化，1500rpm离心15s，始终置于冰上。
1)将3.1中的产物1500rpm离心15s；
2)将同一个样本的两个产物合并在一个tube中；
3)在每个样本的20μl扩增子池中加入2μl FuPa试剂，使体系总量达到22μl 每个样本；
4)涡旋混匀，1500rpm离心15s；
5)将装有反应体系的tube放入热循环仪器，运行FUPA程序；
6)FUPA程序参数：
注：此步骤产物至多在10℃停放1小时。
3.3连接标签接头
DNA连接酶在冰上融化，1500rpm离心15s，且始终放置在冰上。
1)将3.2中的产物1500rpm离心15s；
2)在上述22μl产物中，依次加入反应试剂至30μl；
注：确保最后加入DNA连接酶。
3)涡旋混匀，1500rpm离心15s；
4)将装有反应体系的tube放入热循环仪器，运行LIGATE程序；
5)LIGATE程序参数：
3.4文库一次清洗
Agencount AMPure XP beads使用前室温均衡30分钟。
1)将3.3中的产物1500rpm离心15s；
2)每个文库体系中加入30μl AMPure XP beads；
3)涡旋，确保液体均匀；
4)1500rpm离心15s；
5)室温孵育5min；
6)置于磁力架上，至混合物澄清(约2min)，确保此处tube于磁力架上的方位与步骤11)保持一致；
7)去除每个tube中的所有上清液体；
8)加入150μl新鲜配制的70％乙醇，室温孵育30s直至液体澄清，去除所有上清液体；
9)重复上述步骤8)；
10)从磁力架上取下，1500rpm离心15s；
11)放到磁力架上，确保此处tube放置与步骤6)中的方位一致；
12)用20μl移液器将残留乙醇全部吸净；
13)保持试管盖子打开，将乙醇完全蒸发。
3.5扩增文库
此步骤二次扩增文库以确保生成足够量的文库用于Illumina平台测序。此步扩增反应中含有上一步的磁珠。
1)配制反应体系(50μl)
注：Library Amp引物根据文库的标签i7接头序列和标签i5接头序列而设计，用于通过结合标签i7接头序列和标签i5接头序列而进行文库扩增。标签i 7接头序列为CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGG AGATGTGTATAAGAGACAG(如SEQ IDNO.69所示，其中R即为[i7])，标签i5接头序列为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGG CAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(如SEQ ID NO.70所示，其中R即为[i5])。
2)涡旋混匀，1500rpm离心15s；
3)将3.4中的试管从磁力架上取下，加入50μl反应体系；
4)涡旋混匀，1500rpm离心15s；
5)将tube放置于热循环仪上，运行AMP_7程序；
6)AMP_7程序参数(预热盖子加热至105℃)：
3.6文库二次清洗
Agencount AMPure XP beads使用前室温均衡30分钟。
1)将3.5中的产物1500rpm离心15s；
2)往每个～50μl文库中，加入25μl AMPure XP beads；
3)涡旋混匀，1500rpm离心15s；
4)室温孵育5min；
5)将tube放置于磁力架上，直至液体澄清，大约5min；
6)转移所有上清液体(～75μl)至新的tube中；
7)加入60μl AMPure XP beads到上述上清液体中；
8)涡旋混匀，1500rpm离心15s；
9)室温孵育5min；
10)将tube放置于磁力架上，直至液体澄清，大约5min；
11)去除所有上清液体；
12)加入150μl新鲜配制的70％乙醇，室温孵育大约30s至液体澄清，去除所有液体；
13)重复步骤12)；
14)用20μl移液器吸净所有残留乙醇；
15)保持试管盖子打开，使全部残留乙醇蒸发，大约5min；
16)将tube从磁力架上取下，加入30μl Low TE；
17)涡旋混匀，1500rpm离心15s；
18)将tube放置于磁力架上至液体澄清，大约5min；
19)转移27μl上清液体到新的tube中，此时文库构建完成。
4、文库质量检测分析
4.1 Labchip Gx Touch 24片段检测分析
使用24DNA Extended Range Labchip和DNA High Sensivity Reagent Kit对文库的片段进行检测分析。操作步骤如下：
1)胶和染料的制备
向1管DNA Gel Matrix中加入13μl的HT DNA Dye Concentrate染料，震荡混匀；并将混合液转入本试剂盒带有滤膜的离心管，常温9300rcf离心10min，取过滤液避光保存不超过三周。
2)芯片的清洗
用带有枪头的真空泵吸去芯片孔内保存液，并用超纯水(MilliQ水)润洗2 次。根据仪器固定操作步骤，用反向移液法分别向芯片3、7、8和10号孔中加入上述处理的50μl胶-染料混合液，向芯片4号孔中加入50μl的DNA Marker。
3)样本的准备
向0.2ml的Ladder Tube中加入108μl的超纯水和12μl的HT DNA Ladder，向0.75ml的Buffer Tube中加入750μl的超纯水，将Ladder Tube和Buffer Tube 分别放入相应的管槽中；将样本文库8μl加入384孔板的样本孔内。
4)Labchip Gx Touch 24仪器运行
确保样品板、Ladder Tube、Buffer Tube已放入相应位置，并将芯片放入 LabchipGx Touch 24中，点击主页面的Run按钮进行检测。
5)将样本文库的片段大小结果列表，并计算出各个文库平均长度值用于文库摩尔浓度转换。
4.2 7500实时荧光定量检测分析
应用KAPA Library Quantification Kit对样本文库进行7500Real-Time PCRsystem绝对定量。操作步骤如下：
1)用稀释缓冲液(dilution buffer)对样本文库进行1:2000稀释：
2)配制反应体系(20μl)
注：此步骤操作在冰上进行。
3)涡旋混匀，1500rpm离心15s，确保反应体系内无气泡；
4)PCR循环参数
5)将结果获得的样本定量浓度，代入到公式中，公式为(下机浓度×稀释倍数×452bp)/文库平均片段长度，得出文库最终摩尔浓度。
5、Miseq上机前样本文库和PhiX对照品的均一化、变性和稀释
使用Miseq Reagent Kit V3，600cycles试剂盒，按照说明书进行以下操作：
5.1样本文库准备：
1)按照4.2中获得的文库最终摩尔浓度，将样本文库稀释至2nM；
2)转移等体积的2nM文库至1.5ml tube中，涡旋混匀，1500rpm离心15s；
3)将上述pooled文库(10μl)和0.2N-NaOH(10μl)混匀，得到20μl变性文库；室温孵育5min；
4)加入10μl 200mM Tris-Hcl，pH7.0至上述装有2nM变性pooled文库的 tube中，涡旋混匀，1500rpm离心15s；
5)加入970μl预冷的HT1到上述pooled文库，稀释文库为20pM，涡旋混匀，1500rpm离心15s，始终放置于冰上备用。
5.2PhiX对照品
从Illumina公司购买PhiX control Kit V3，其中PhiX文库浓度为10nM，将其变性稀释至20pM，以20％比例混合到变性稀释后的pooled文库，用来均衡样本文库中的碱基比例，确保测序准确性。
1)取10nM PhiX文库(2μl)和10mM Tris-Hcl,pH8.5 with 0.1％Tween(3μl) 混合，稀释至4nM浓度；
2)将4nM PhiX文库(5μl)和0.2N NaOH(5μl)混合，涡旋混匀，以280×g 转速离心1min后，室温孵育5min；
3)加入990μl预冷的HT1到上述pooled文库(10μl)，稀释文库至20pM，涡旋混匀，1500rpm离心15s，始终放置于冰上备用。
5.3制备18pM上机文库
将变性稀释后的样本文库和PhiX文库以4:1的比例混合至600μl总体积，即20pM样本文库(432μl)+20pM PhiX文库(108μl)+预冷的HT1(60μl)，混匀离心后，始终置于冰上。
6、Illumina Miseq FGxTM平台上机测序
1)使用Illumina Experiment Manager(IEM)进行上机测序参数设置；
2)将600μl的18pM变性稀释后的混合文库加入load sample孔中。
使用RUO(Research use only Run)模式进行Miseq上机测序。
7、测序数据处理
经过下一代测序检测19个RM Y-STR基因座发现，同其毛细管电泳(CE) 分型结果相比，多个RM Y-STR基因座不仅存在长度多态性差异，而且存在序列多态性差异，表现为同一个长度的等位基因表现为多种序列多态性，即同等位基因。也就是说，多个被检测个体的RM Y-STR下一代测序(NGS)分型结果和同其毛细管电泳(CE)分型结果具有差异。同一个体的测序结果如表1和表2所示。
表1 RM Y-STR CE和RM Y-STR NGS长度多态性差异
表1的结果说明，对于同一个体，两种分析方法的结果存在等位基因数量上的差异，现有的CE方法可能存在着覆盖位点不全面或者是检测灵敏度低等问题。而本专利中的68条PCR扩增特异性引物可以高度覆盖这19个基因座，并且兼顾NGS技术的灵敏度。
表2同一个体RM Y-STR CE和RM Y-STR NGS序列多态性差异
表2的结果说明，对于同一个体，两种分析方法存在序列上的差异，用相同的等位基因命名结果时，NGS方法可以发现等位基因序列上的差异，从而提高多态性程度和体系的分辨能力。
对男性同卵双生子采用RM Y-STR NGS方法测序，结果如表3所示。
表3
表3的结果说明，男性同卵双生子两个个体之间的NGS结果存在基因座上的等位基因差异，这些差异仅使用CE方法没有被检测到的。目前获得11对 MZ应用本方法的分析结果，可检测到其中8对MZ存在差异，鉴别成功率为 73％。该结果说明，本方法提供的RM Y-STR NGS下一代测序方法能够增加区分男性同卵双生子的可能性，能够为男性同卵双生子涉嫌的案件提供科学的个体鉴别方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北医科大学
<120> 一种快速突变Y染色体STR分型系统、下一代测序分型试剂盒及分型方法和应用
<130> 2019.11.22
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS526a-1-Forward
<400> 1
tcgccagaag gtaaagagaa ggaag 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS526a-1-Reserves
<400> 2
tggatcagtt caccagaagg taaag 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS526b-2-Forward
<400> 3
aaggttcgag tcagttcacc agaag 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS526b-2-Reserves
<400> 4
atcagtttcc cagaaggtaa agaga 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1a1-1-Forward
<400> 5
ttctcttttt ctccctccct tcttc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1a1-1-Reserves
<400> 6
aatattttta gatggaatcc tgctc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1a1-2-Forward
<400> 7
ctttcttcct ttcctctatc tctgt 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1a1-2-Reserves
<400> 8
tgtttctttt ctcagtgatc tctcc 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1a2-1-Forward
<400> 9
gagcaggatt ccatctaaaa atatt 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1a2-1-Reserves
<400> 10
actcattatc cacatgaatt ttgaa 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1b1-1-Forward
<400> 11
ctttcattct ctttctcctt ccttc 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1b1-1-Reserves
<400> 12
aatattttta gatggaatcc tgctc 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1b1-2-Forward
<400> 13
ttctttcctc taactctgta tctct 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1b1-2-Reserves
<400> 14
tcttctcagt gatctgtcct gtcta 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1b2-1-Forward
<400> 15
agagcaggat tccatctaaa aatat 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF403S1b2-1-Reserves
<400> 16
tgattttgct cattatccac atgaa 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS570-2-Forward
<400> 17
acatcttggg acttaaaata aaatt 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS570-2-Reserves
<400> 18
gacagttcta tatatgacag ctgta 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS576-1-Forward
<400> 19
acatagtcaa accatatcag tatgg 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS576-1-Reserves
<400> 20
gctcatacat taaaaacaaa aagca 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS713-1-Forward
<400> 21
tactggagtc caaattagtc aggag 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS713-1-Reserves
<400> 22
caagcgtgaa taaatctatt tctgg 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS713-2-Forward
<400> 23
aagaaagaca agcgtgaata aatct 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS713-2-Reserves
<400> 24
tatttctacc tgggccaacc tcttg 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS449-2-Forward
<400> 25
ccggataatt gcttaaagcc tggaa 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS449-2-Reserves
<400> 26
tattcataga acaggcttga gagac 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS627-1-Forward
<400> 27
ttctttctcc ctgtgtctct ctttg 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS627-1-Reserves
<400> 28
tgcatttatc tcttcagtga tctct 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS627-2-Forward
<400> 29
aatgagcaaa tggcaagttt ttatt 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS627-2-Reserves
<400> 30
atttttgttt ttagatggaa tcctg 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF399S1a-2-Forward
<400> 31
cacatctcca tgttttggga cattc 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF399S1a-2-Reserves
<400> 32
acgtgctttt tagtaacaca gtttg 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF399S1b-1-Forward
<400> 33
ttttgggaca ttcctcttca atgca 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF399S1b-1-Reserves
<400> 34
acgtgctttt tagtaacaca gtttg 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF399S1c-1-Forward
<400> 35
aggagaatca aactgtgtta ctaaa 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF399S1c-1-Reserves
<400> 36
tgcattgaag aggaatgtcc caaaa 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS612-2-Forward
<400> 37
caaacagaat aatctaccag caaca 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS612-2-Reserves
<400> 38
gacttgttct ctttttaacc cttcc 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS518-1-Forward
<400> 39
tttttcgaga agcagtttca cttgt 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS518-1-Reserves
<400> 40
acaagattca gtggaaaggt caccc 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS518-2-Forward
<400> 41
accatgggtg atttctttct tttct 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS518-2-Reserves
<400> 42
agcagtttca cttgtgttgc ccagg 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS547-1-Forward
<400> 43
acagagcata aacgtgtctc aaaaa 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS547-1-Reserves
<400> 44
gaagaaggaa gggatgaagg aaaaa 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS630-2-Forward
<400> 45
cttctaccaa gattgtgagg acttc 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS630-2-Reserves
<400> 46
actttctttt gaggtggagt cttgc 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS464a -1-Forward
<400> 47
actctttcac ggaagaaaag aaaaa 25
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS464a -1-Reserves
<400> 48
agtttcggtt tcagaggtat gtttt 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS464b-2-Forward
<400> 49
agagactctt tcacggaaga aaaga 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS464b-2-Reserves
<400> 50
tgacacaagt aaaacttcca gcatg 25
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS464c-2-Forward
<400> 51
aaaacatacc tctgaaaccg aaact 25
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS464c-2-Reserves
<400> 52
gtctctctgt tacccaggta tggtg 25
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS464d-1-Forward
<400> 53
aaaacatacc tctgaaaccg aaact 25
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS464d-1-Reserves
<400> 54
gtctctctgt tacccaggta tggtg 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF387S1a-1-Forward
<400> 55
tgtgagaagt gctaccacag ttttt 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF387S1a-1-Reserves
<400> 56
taccaccacg actcaaacat ttttg 25
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF387S1a-2-Forward
<400> 57
agcagaacat ctgtgtatca gtgct 25
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF387S1a-2-Reserves
<400> 58
ggtaaaatgg aatctagctc tgtca 25
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF387S1b-1-Forward
<400> 59
tgacagagct agattccatt ttacc 25
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF387S1b-1-Reserves
<400> 60
aaaacagttg caactttggc cctga 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF404S1a-1-Forward
<400> 61
tagccaggta ttctggttga ggcta 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF404S1a-1-Reserves
<400> 62
cgattttgga agattaccag gtaca 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF404S1b-2-Forward
<400> 63
aaagtgtacc tggtaatctt ccaaa 25
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> DYF404S1b-2-Reserves
<400> 64
tagcctcaac cagaatacct ggcta 25
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS527a-2-Forward
<400> 65
aagattagcc acaacataag taagg 25
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS527a-2-Reserves
<400> 66
gctatgtttg cgatcttggc tcact 25
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS527b-2-Forward
<400> 67
agagcaaaac tctatcaaaa taaaa 25
<210> 68
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS527b-2-Reserves
<400> 68
aaatatttgt ttcaactgag aagtg 25
<210> 69
<211> 59
<212> DNA
<213> 标签i7接头序列
<400> 69
caagcagaag acggcatacg agatrgtctc gtgggctcgg agatgtgtat aagagacag 59
<210> 70
<211> 53
<212> DNA
<213> 标签i5接头序列
<400> 70
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacr tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 53
Claims (8)
1.一种快速突变Y染色体STR下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序分型试剂盒包括下一代测序定制panel试剂盒，所述下一代测序定制panel试剂盒中包括扩增19个基因座的68条PCR扩增特异性引物，所述PCR扩增特异性引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1~SEQ ID NO.68所示，所述19个基因座为DYS630、DYS464、DYF403S1a、DYF403S1b1、DYF403S1b2、DYF399S1、DYS518、DYS527、DYS713、DYS612、DYS627、DYS526a、DYS526b、DYF404S1、DYF387S1、DYS449、DYS547、DYS570、DYS576。
2.根据权利要求1所述的快速突变Y染色体STR下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序定制panel试剂盒还包括FuPa试剂、Ampliseq CD Indexes和Lib Amp Mix。
3.根据权利要求1所述的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序分型试剂盒还包括MiSeq上机测序试剂。
4.一种快速突变Y染色体STR下一代测序分型方法，其特征在于：用权利要求1~3任一项所述快速突变Y染色体STR下一代测序分型试剂盒进行样品检测。
5.根据权利要求4所述的快速突变Y染色体STR下一代测序分型方法，其特征在于：所述方法至少包括以下操作步骤：
步骤a、提取待测血液的DNA，定量，采用上述试剂盒中的68条PCR扩增特异性引物构建文库；
步骤b、对所述文库进行片段检测，定量；
步骤c、根据步骤b的定量结果，对文库中的样本进行均一化，然后变性、稀释，测序；
步骤d、将测序结果进行序列对比，得到分型结果。
6.根据权利要求5所述的快速突变Y染色体STR下一代测序分型方法，其特征在于：步骤a中构建文库的操作包括靶片段扩增，扩增子部分消化，连接标签接头序列，文库一次清洗，文库扩增，文库二次清洗；所述靶片段扩增的引物为所述68条扩增特异性引物；和/或
步骤c中所述稀释为将所述文库的样本浓度稀释至18pM；和/或
步骤c中所述测序的操作在Illumina MiSeq FGx平台进行。
7.根据权利要求6所述的快速突变Y染色体STR下一代测序分型方法，其特征在于：所述靶片段扩增的PCR反应循环参数为：99℃，2min；99℃，15s，60℃，4min，21次循环；10℃，4min~24h；和/或
所述扩增子部分消化的方法为用FuPa试剂进行扩增子部分消化，消化的参数为：50℃，10min；55℃，10min；62℃，20min；10℃，＜1h；和/或
所述文库扩增的程序为：98℃，2min；98℃，15s，64℃，1min，7次循环；10℃，4min~24h。
8.权利要求4~7任一项所述的快速突变Y染色体STR下一代测序分型方法在鉴别男性同卵双生子中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911206540.4A CN110846420B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 一种快速突变y染色体str分型系统、下一代测序分型试剂盒及分型方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911206540.4A CN110846420B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 一种快速突变y染色体str分型系统、下一代测序分型试剂盒及分型方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110846420A CN110846420A (zh) | 2020-02-28 |
| CN110846420B true CN110846420B (zh) | 2023-06-02 |
Family
ID=69606673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911206540.4A Active CN110846420B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 一种快速突变y染色体str分型系统、下一代测序分型试剂盒及分型方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110846420B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106029902A (zh) * | 2013-12-24 | 2016-10-12 | 中央兰开夏大学 | 用于多重分析13个mr y-str的试剂盒和方法 |
| CN106755340A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-05-31 | 公安部物证鉴定中心 | 一种利用26个y‑str基因座对男性个体进行y‑str分型的方法和系统 |
| CN107841566A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-03-27 | 苏州阅微基因技术有限公司 | 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 |
| CN109554453A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-04-02 | 河北医科大学 | 43个str位点的下一代测序分型试剂盒及方法 |
-
2019
- 2019-11-29 CN CN201911206540.4A patent/CN110846420B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106029902A (zh) * | 2013-12-24 | 2016-10-12 | 中央兰开夏大学 | 用于多重分析13个mr y-str的试剂盒和方法 |
| EP3087200B1 (en) * | 2013-12-24 | 2019-01-30 | University of Central Lancashire | Kits and methods for multiplex analysis of 13 mr y-strs |
| CN106755340A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-05-31 | 公安部物证鉴定中心 | 一种利用26个y‑str基因座对男性个体进行y‑str分型的方法和系统 |
| CN107841566A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-03-27 | 苏州阅微基因技术有限公司 | 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 |
| CN109554453A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-04-02 | 河北医科大学 | 43个str位点的下一代测序分型试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Longitudinal case-control studies using NGS;QIAGEN;《QIAGEN网站》;20160930;1-4，图1-2 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110846420A (zh) | 2020-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11952623B2 (en) | Simultaneous determination of aneuploidy and fetal fraction | |
| RU2708337C2 (ru) | Способы и композиции для днк-профилирования | |
| Piotrowski et al. | Somatic mosaicism for copy number variation in differentiated human tissues | |
| CN112037860B (zh) | 用于非入侵性性染色体非整倍性确定的统计分析 | |
| CA2450479A1 (en) | Method for detecting diseases caused by chromosomal imbalances | |
| US20050037388A1 (en) | Method for detecting diseases caused by chromosomal imbalances | |
| US20210123102A1 (en) | Single Nucleotide Polymorphism in HLA-B*15:02 and Use Thereof | |
| US20190338362A1 (en) | Methods for non-invasive prenatal determination of aneuploidy using targeted next generation sequencing of biallelic snps | |
| KR20180098412A (ko) | 종양의 심층 서열분석 프로파일링 | |
| CN110218781B (zh) | 21个微单倍型位点的复合扩增体系、下一代测序分型试剂盒及分型方法 | |
| CN111440896A (zh) | 一种新型β冠状病毒变异检测方法、探针和试剂盒 | |
| US20200040390A1 (en) | Methods for Sequencing Repetitive Genomic Regions | |
| WO2012099397A2 (ko) | 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 방법 및 이를 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 키트 | |
| CN110846420B (zh) | 一种快速突变y染色体str分型系统、下一代测序分型试剂盒及分型方法和应用 | |
| Bayés et al. | Overview of genotyping | |
| US20060084095A1 (en) | Compositions, methods, and systems for determining bovine parentage and identity | |
| CN111793623A (zh) | 62个多等位snp-ngs的分型遗传标记组合物、试剂盒、鉴定体系以及分型方法 | |
| CN115948574B (zh) | 一种基于三代测序的个体识别体系、试剂盒及其应用 | |
| Gallardo et al. | Application to Assisted Reproductive of Whole-Genome Treatment Technologies | |
| Matar Almheiri | Study of Insertion-Deletion Polymorphisms (INDELS) In the UAE Population | |
| CN116377084A (zh) | 一种高效能常染色体微单倍型遗传标记体系及其检测引物和试剂盒 | |
| Gallardo et al. | Application of Whole-Genome Technologies to Assisted Reproductive Treatment | |
| Grohme et al. | Open architecture PCR-based methods for differential gene expression analysis | |
| AU2002315401A1 (en) | Method for detecting diseases caused by chromosomal imbalances |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |