KR20120081129A - 헬리코박터 피로리 및/또는 클래리스로마이신 내성 프로필을 검출하기 위한 펩티드 핵산 프로브, 키트 및 방법 및 적용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헬리코박터 피로리의 검출 및/또는 클래리스로마이신에 대한 헬리코박터 피로리 균주의 반응 분석을 위한 4개 펩티드 핵산 프로브 (PNA)에 관한 것이다. 이들 프로브는 분자생물학적 방법 즉, 임상 단리물 및 생검물을 포함하는 여러 유형의 샘플에서 H. 피로리 클래리스로마이신 감수성 진단에 사용되는 형광 동소 하이브리드화 (FISH)를 기초로 한다. 이들 구조의 고유의 물리적 및 화학적 특징으로 인해, 이들 프로브는 더욱 신속하고 더욱 민감한 하이브리드화를 허용한다. 본 발명의 제 2 양태는 본원에 기술된 하나 또는 수개의 프로브, 및 검출 및 정량화의 관련 공정의 사용을 가능하게 하는 키트의 개발에 관한 것이다. 이러한 키트의 목적은 H. 피로리 및 임상 샘플에서 클래리스로마이신에 대한 이의 반응을 확인하기 위한 것이다.

Description

헬리코박터 피로리 및/또는 클래리스로마이신 내성 프로필을 검출하기 위한 펩티드 핵산 프로브, 키트 및 방법 및 적용 방법 {PEPTIDE NUCLEIC ACID PROBES, KIT AND METHOD FOR DETECTING HELICOBACTER PYLORI AND/OR CLARITHROMYCIN RESISTANCE PROFILE AND APPLICATIONS}

본 발명은 임상 관련 미생물의 검출 공정 및 항생제 내성 프로필 분야에 관한 것이다. 클래리스로마이신 존재에 대한 H. 피로리 (H. pylori) 및/또는 균주 반응 (내성/감수성)을 검출하기 위해 네개의 펩티드 핵산 프로브 (PNA)를 개발하였다.

본 발명의 또 다른 양태는 생물학적 샘플에서 H. 피로리의 클래리스로마이신 내성을 검출하기 위한 키트로의 이들 프로브 및 관련 검출 공정의 적용 및 EK라서, 임상적 적용에 관한 것이다.

H. 피로리는 인간 위 점막에서 서식하여, 위 감염 예컨대, 만성 위염, 위궤양, 위측성 위염 및 위암과 관련된 병원성 박테리아이다.

H. 피로리 감염 진단은 침습성 방법 예컨대, 위생검 (내시경 검사) 또는 비침습성 방법 예컨대, 요소 호기 검사, 혈청학적 검사 또는 변항원 검사에 기초할 수 있다. 후자의 것이 덜 비싸며 환자에 더 편하기 때문에 임상시 더욱 빈번하게 사용된다.

가장 일반적으로 사용되는 테스트/키트는 특정 H. 피로리 효소 즉, 우레아제를 검출할 수 있다 (US200306853 및 EP0920531). 그러나, 바람직하게는, 침습성 방법이 표준 방법에 존재하는 민감성/특이성의 결여에 의해 더욱 상세한 진단법으로서 여전이 이용되고 있다.

사실, 위생검으로, 배양 기초 테스트 예컨대, E-테스트 및 한천 희석법을 이용하여 또는 PCR (폴리머라아제 연쇄 반응)에 기초한 분자적 방법을 통해 H. 피로리 존재에 대한 더욱 신뢰할 만한 정보를 획득하는 것이 가능하다. 그러나, 이는 까다로우며 시간 소모적이며, 잘못된 양성 또는 잘못된 음성을 유도할 수 있는 가능한 DNA 오염을 방지하기 위해 특별한 주의가 요구된다.

더욱 최근에는, 펩티드 핵산 프로브 (PNA)가 개발되었으며, 박테리아 검출에 최적으로 사용되었다. PNA 분자는 DNA 미믹 (mimic)이며, 이의 네거티브 하전된 당-인산염 백본 구조는 아키랄 (achiral) 및 전기적으로 중성인 반복적인 (2-아미노에틸)글리신 유닛에 의해 형성된 것에 의해 대체된 것이다.

PNA 분자에는 펩토스가 결여되어 있으나, PAN와 상보적인 DNA 서열간의 하이브리드화가 왓슨-클릭 룰에 따라 수소 결합에 의해 발생할 수 있다.

PNA의 전기적으로 중성인 특징은 전통적으로 사용된 전형적인 DNA 프로브와 비교하여 PNA와 표적 서열 (rRNA 및 이중 가닥 DNA) 사이의 더욱 강한 하이브리드화를 유도한다. 이의 높은 친화도로 인해, PNA 프로브는 비교적 짧은 뉴클레오티드 서열 (8 - 17 뉴클레오티드)을 갖는다. DNA 프로브는 일반적으로 이의 약한 안정성 및 낮은 용융 온도 (Tm)로 인해 18개 이상의 뉴클레오티드를 가지며, 이는 추가적인 고정 및 효소 및 다른 제제로의 침투 공정을 요구한다. PNA 분자는 DNA 분자보다 프로테아제 및 뉴클레아제에 대한 더 높은 저항성을 지닌다.

PNA 프로브는 플루오로크롬에 부착시 형광 동소 하이브리드화 (fluorescent in situ hybridization) 기법에 의해 현미경 또는 유세포 분석에 의해 검출될 수 있다.

전형적인 배양법과 비교하여, 이러한 기법은 임상 샘플에서의 더욱 신속한 결과를 유도하며, 또한, 증가된 효율, 민감성 및 특이성을 갖는다. 넓은 적용 분야가 존재하며, 다양한 미생물 영역 예컨대, 인간, 환경 및 음식 샘플에서의 미생물 검출에 적용될 수 있다.

이미 설계되고 공개/특허된 임상 미생물 예컨대, 살모넬라 (Salmonella), 바실루스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 스타필로코커스 논-아우레우스 (Staphylococcus non-aureus) 종, 인간 파필로마바이러스 (human Papillomavirus) 및 캔디다 속 (Candida genus)에 대한 프로브의 일부 예는 본 기법에 대한 증가되는 관심을 보여준다.

H. 피로리의 특정 검출을 위한 PNA 프로브는 이미 이용가능하다 (Azevedo N.F. et al., 2003). 게다가, 또 다른 프로브에 대한 특허가 청구되었다 (WO2008155742-A2; PT103767-A1). 후자는 매우 높은 특이성 및 민감성을 보여주며, 이용되던 표준 방법을 극복하였다 (Guimaraes N. et al., 2007). H. 피로리 검출도 중요하지만, H. 피로리 항생제 내성을 확인하는 것이 요망되며, 이는 상기 언급된 프로브를 사용하여서는 불가능하다.

사실, H. 피로리 박멸을 위한 가장 통상적으로 이용된 처치법은 삼중 치료법으로서, 7 내지 14일 동안의 프로톤 펌프 억제제 및 2개의 항생제 (예를 들어, 클래리스로마이신, 메트로디나졸, 아목시실린)를 포함한다. 이러한 치료법은 항생제 과다 사용 및 이들이 초래할 수 있는 이차 효과로 인해 환자에 불편을 초래할 수 있다. 또한, 이러한 치료법의 성공은 클래리스로마이신에 대한 H. 피포리 내성의 증가로 인해 방해를 받는데, 이러한 클래리스로마이신은 이들 경우에 사용되는 탁월한 항생제에 해당한다. 현재, 클래리스로마이신 내성은 배양법 또는 PCR에 의해 검출되나, 이들 방법은 H. 피로리 검출에 대해 이용되고 상기 기술된 것과 동일한 한계를 지닌다. 따라서, 신속하고 신뢰할만하며 실용적인 방법의 결여로 인해, H. 피포리의 각 균주의 클래리스로마이신 내성은 일반적으로 치료의 시작 후 또는 이의 비효능이 입증된 후에 일반적으로 알 수 있다. 본 발명은 내성 균주 확인의 신뢰할만하며 실용적이며 확실한 적용법을 기술하고 있으며, 환자에 대한 적합한 처치법 선택, 성가심, 위험성, 처치 시간 및 비용에 대한 현저한 기여를 제시한다.

FISH 기법은 H. 피로리에서 클래리스로마이신 내성을 검출하기 위한 대안적 방법이다. 사실, H. 피로리 클래리스로마이신 내성을 검출하는 DNA 프로브에 대한 일부 연구가 있었다 (Trebesius et al., 2000). 클래리스로마이신 내성은 H. 피로리의 23S rRNA의 도메인 V의 펩티디딜트랜스퍼라아제 영역에서의 점 변이와 관련있다. 연구에서 언급된 가장 빈번한 점 변이는 A2143G에 이어서 A2142G 및 A2142C이다. 한 연구에서, 여러 나라로부터의 데이타를 편집하였으며, 이들 세 점 변이에서 클래리스로마이신 내성의 관련 분포율이 84%인 것으로 계산되었다 (Megraud, 2004).

발명의 요약

본 발명은 헬리코박터 피로리의 검출 (확인/정량화) 및 클래리스로마이신에 대한 이의 반응 (내성/감수성)을 검출하기 위한 펩티드 핵산 (PNA) 프로브 또는 PNA 프로브 세트에 관한 것이다. 이러한 프로브는 미생물 23S rRNA 또는 이러한 rRNA에 상응하는 게놈 서열을 인식할 수 있다.

PNA 프로브는 이의 구조에 대해 고유의 이화학적 특징을 가지며, 이들이 FISH 기초 방법에 적용되는 경우, DNA 프로브와 비교하여 더욱 신속하고 확실하고 특이적인 분석을 가능하게 한다. 이러한 점은 매우 중요한데, H. 피로리 내성 및 감수성 균주 사이의 차이가 하나의 염기일 수 있기 때문이다.

본 발명에 의해 해결된 문제점중 하나는 H. 피로리 및/또는 클래리스로마이신 반응 (감수성 또는 내성)의 검출/정량화이다. 이는 생물학적 샘플내의 H. 피로리 존재를 측정하기 위한 믿을만하며 신속한 방법을 제공하며, 신속하고 안전한 방식으로 가장 편리한 치료법을 결정하게 하기 위해 클래리스로마이신에 대한 이들의 반응의 정량화 및 측정을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태는 형광 동소 하이브리드화 (FISH)에 대한 이들 프로브의 적용에 기초에 키트의 개발에 관한 것이며, 이는 생물학적 샘플내의 H. 피로리의 신속하고 용이한 방식으로 클래리스로마이신 내성의 검출을 가능하게 한다. 프로브는 복합되어 또는 개별적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 클래리스로마이신에 대한 H. 피로리의 반응을 검출하거나 H. 피로리 존재를 확인/측정하거나, H. 피로리 및 클래리스로마이신에 대한 이의 반응을 검출하는 PNA 프로브 세트로서, SEQ ID NO. 1-4와 구조적으로 86% 이상 유사한 누클레오티드 서열중 하나 이상을 포함하는 PNA 프로브 세트를 기술한다.

본 발명의 바람직한 구체 예에서, 본원에 기술된 PNA 프로브는 헬리코박터 피로리의 rRNA, rDNA 또는 rRNA의 상보적 서열에서 표적 서열을 검출한다.

본 발명의 추가의 바람직한 구체 예에서, PNA 프로브는 하기 서열을 포함한다:

- SEQ ID NO. 1-3에 구조적으로 86% 이상 유사한 뉴클레오티드 서열중 하나 이상으로서, H. 피로리 및 클래리스로마이신에 대한 이의 내성을 검출;

- SEQ ID NO. 1-4에 구조적으로 86% 이상 유사한 뉴클레오티드 서열중 하나 이상으로서, H. 피로리 및 클래리스로마이신에 대한 이의 감수성을 검출.

본 발명의 더욱 바람직한 구체 예에서, 서열은 하나 이상의 유형의 검출가능한 단편에 연결된다. 사용된 검출가능한 유형의 단편은 하기 군중 하나로부터 선택될 수 있다: 특히, 컨주게이트, 분지된 검출 시스템 (branched detection system), 크로모포어, 플루오로포어, 방사성동위원소, 효소, 햅텐 또는 루미네슨스 화합물.

본 발명의 더욱 바람직한 구체 예에서, 플루오로포어 그룹은 하기중 하나 이상일 수 있다: 특히, 알렉사 시리즈 (Alexa series) 플루오로포어, 알렉사 플루오르 시리즈, 시아닌, 5- (및 6-) 카르복시-2',7'-디클로로플루오레세인, 5-ROX (5-카르복시-X-로다민, 트리에틸암모늄 염).

본 발명의 또 다른 주제는 H. 피로리 검출, 또는 H. 피로리 클래리스로마이신 반응 검출 또는 H. 피로리 및 생물학적 샘플에서 클래리스로마이신에 대한 이의 반응을 검출하기 위한 키트로서, 상기 언급된 하나 이상의 프로브를 포함하는 키트이다.

본 발명의 더욱 바람직한 구체 예에서, 키트는 하기 용액중 하나 이상을 제공할 수 있다: 고정 용액, 하이브리드화 용액 및 세정 용액.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체 예에서, 고정 용액은 파라포름알데히드 및 에탄올 즉, 2-8% (wt/vol)의 파라포름알데히드 및 25-75% (vol/vol)의 에탄올을 포함할 수 있고/거나, 하이브리드화 용액은 포름아미드를 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 주제는 H. 피로리 검출, 또는 H. 피로리 클래리스로마이신 반응 또는 H. 피로리 및 생물학적 샘플에서 클래리스로마이신에 대한 이의 반응 검출을 위한 방법으로서, 상기 기술된 PNA 프로브중 하나 이상을 이용하며, 하기 단계를 포함하는 방법이다:

- PNA 프로브와 생물학적 샘플의 접촉;

- 생물학적 샘플내의 미생물의 표적 서열과 PNA 프로브의 하이드리드화;

- 생물학적 샘플에서 검출 및 정량화의 표시로서 하이브리드화 검출.

생물학적 샘플을 특히 혈액, 공기, 음식, 물, 생검물로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 추가의 구체 예에서, 하이브리드화는 형광에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 주제는, 상기 기술된 PNA 프로브의 용도, 상기 기술된 키트의 용도, 및 H. 피로리의 검출 또는 클래리스로마이신에 대한 H. 피로리 반응의 검출, 또는 H. 피로리의 검출 및 생물학적 샘플에서 클래리스로마이신에 대한 이의 반응의 검출의 용도이다.

발명의 일반적 설명

본 발명은 헬리코박터 피로리 균주의 검출 및 정량화, 또는 클래리스로마이신에 대한 헬리코박터 피로리 반응의 검출 및 정량화, 또는 헬리코박터 피로리 및 클래리스로마이신에 대한 이의 반응 (내성 및 감수성)의 검출 및 정량화를 위한 PNA 프로브, 시제, 방법 및 키트를 포함한다. (DNA 프로브와 관련하여) PNA 프로브의 가장 높은 특이성은 하나 또는 두개의 상이한 뉴클레오티드와 관련된 뉴클레오티드 서열의 더욱 우수한 식별을 가능하게 할 것이다. 본 발명에서, 이러한 양태는 H. 피로리 클래리스로마이신 감수성 및 내성 균주사이의 차이가 정확히 하나의 염기에 있기 때문에 특히 적절하다.

본 발명에 기술된 PNA 프로브는 rRNA, rRNA에 상응하는 게놈 서열 (rDNA) 또는 이의 상보적 서열을 검출 가능하게 하며, 이는 표적 종의 특이적 검출을 허용하며, 심지어 존재하는 항생제에 대한 반응을 측정한다.

본 발명의 프로브는 동소 하이브리드화, 바람직하게는, 형광 동소 하이브리드화에 의해 샘플내의 H. 피로리의 분석에 이용된다. 본 발명에 기술된 PNA 프로브의 뉴클레오티드 서열은 하기 서열에 구조적으로 86% 이상 유사한 군으로부터 선택된다:

5'- GGG TCT CTC CGT CTT -3' (SEQ ID NO.1),

5'- GGG TCT TCC CGT CTT -3' (SEQ ID NO.2),

5'- GGG TCT TGC CGT CTT -3' (SEQ ID NO.3),

5'- GGG TCT TTC CGT CTT -3' (SEQ ID NO.4).

신규한 PNA-FISH 프로브의 개발은 현재 실험적으로 수행된다. 이러한 특별한 경우에, 먼저 프로브 적용에 이상적인 많은 염기를 시험하였다.

프로브내의 높은 수의 뉴클레오티드는 표적에 대한 높은 프로브 친화성을 허용하며, 매우 고온에서도 작업가능하게 하는 반면, 낮은 뉴클레오티드 수는 결합 유리 에너지가 하이브리드화가 발생하기에는 충분치 않음을 나타낸다. 이러한 경우, 가장 우수한 결과는 12-18개 뉴클레오티드에 대해 달성되었다.

추가적으로, 변이 검출을 위한 가장 우수한 서열을 선택하였다. 지적된 변이는 프로브 서열의 중앙에 존재하기 때문에, 이들 프로브가 변이 사이를 더욱 정확하게 식별할 수 있음을 입증하였다. 그러나, 왼쪽으로 또는 오른쪽으로의 일부 뉴클레오티드의 전환은 프로브의 우수한 성능에 단지 약하게 영향을 끼친다.

각각의 특정한 경우에 있어서, 가장 우수한 실험적 FISH 조건을 연구하였는데, 그 이유는 프로브 하이브리드화 성공이 하이브리드화 조건 및 고정/투과 및 세정 단계에 의존적이기 때문이다. 먼저, 헬리코박터 피로리의 검출을 위해 종래 공개된 발명 (WO2008155742; PT103767-A1)에서 언급된 조건이 고려되었다. 동일한 미생물을 타겟팅하기 때문에, 고정/투과가 종래에 기술된 것과 동일한 방식 즉, 4% 파라포름알데히드 및 50% 에탄올로 수행될 수 있다. 따라서, 주요 연구 변수는 온도, 포름아미드 농도 및 하이브리드화 및 세정 시간인데, 그 이유는 이들 조건 즉, 종래 프로브로부터의 특징은 이러한 신규한 세트의 프로브에 대해 추정될 수 없기 때문이다.

어느 것이 PAN-FISH 방법에 부정적으로 영향을 주는지 알지 못하는 상황하에서 동시에 이들 변수를 최적화할 필요가 있기 때문에, 이러한 공정은 복잡하고 시간 소모적일 수 있다. 다른 저자에 의해 공개된 연구에서, 일부 프로브의 낮은 효용도로 인해 PNA-FISH 공정에 소용이 없는 것으로 밝혀졌음이 언급되었다. 이러한 경우, 가장 우수한 시간, 온도 및 포름아미드 농도는 55℃에서 60분의 하이브리드화 및 30분의 세정 단계, 및 50% 포름아미드, 또는 70℃ 및 30% 포름아미드인 것으로 확인되었다. 온도 및 포름아미드 농도가 관련있기 때문에, 중간 포름아미드 농도에 있어서, 하이브리드화 온도는 55-70℃일 수 있음이 중요하다.

매우 성공적인 하이브리드화 후, 형광 현미경, 유세포 분석 또는 실시간 PCR에 의해, 항생제에 대한 감수성에 대해 특정 미생물의 존재/부재, 농도 및 특징을 평가하는 것이 가능하다.

이와 관련하여, 존재하는 안정한 프로브/표적 콤플렉스의 검출/확인을 허용하는 PNA 프로브 단편을 고찰하는 것이 또한 중요하다. 이러한 프로브의 검출가능한 단편은 하기 그룹중 하나로부터 선택된다: 컨주게이트, 분지된 검출 시스템, 클로모포어, 플루오로포어, 방사성 동위원소, 효소, 햅텐 또는 루미네슨스 화합물.

다양한 프로브가 H. 피로리 클래리스로마이신 내성 균주를 검출하기 위해 동일한 검출가능한 그룹 (예를 들어, 플로오로포어)에 결합될 수 있으며, 상이한 검출가능한 분자에 결합된 또 다른 선택적인 프로브가 예를 들어, 클래리스로마이신 감수성 균주를 확인할 수 있다.

본 발명의 범위하에서, 검출가능한 단편이 없는 차단 프로브가 비 바람직한 서열로의 PNA 프로브 하이브리드화를 저하시키거나 제거하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 기술된 방법은 이전에 기술된 하나 이상의 PNA 프로브와 샘플을 접촉시키는 것을 포함한다. 본 방법에 있어서, 샘플내의 미생물은 적합한 하이브리드화 조건하에서 표적 서열과 PNA 서열의 하이브리드화에 상호관련되는 이들의 클래리스로마이신 프로필 (즉, 감수성 또는 내성)에 대해 검출되거나, 확인되거나 측정된다. 결론적으로, 분석은 결정적인 판단을 갖는 독특한 시험에 기초한다. 반대로, 미생물 분석에 현재 사용되는 전형적인 방법은 여러 시험을 포함하는 다양한 표현형 특징에 기초한다.

본 발명의 주제는 샘플내의 H. 피로리의 존재를 결정하기 위한 즉, 검출하거나, 확인하거나 측정하기 위한 및/또는 이의 클래리스로마이신 반응 (감수성/내성)을 결정하기 위한 시험을 수행하는데 적합한 키트이다. 키트는 하나 이상의 PNA 프로브 및 동소 하이브리드화 시험을 수행하는데 필요한 다른 선택된 시제 또는 화합물을 포함한다.

더욱 바람직한 실시에서, H. 피로리 검출, 확인 또는 측정에 적합한 키트는 고정, 하이브리드화 및 세정 용액을 포함한다.

본 방법은 환자의 샘플 및 클래리스로마이신에 대한 내성/감수성인 H. 피로리 균주의 확인으로부터 수득된 시험 결과에 따라 더욱 적합한 치료법을 유도하는, 치료 질환에 대한 진단적 보조 수단일 수 있다.

PNA 프로브는 직접적으로 슬라이드 샘플에 가해질 수 있는데, 그 이유는 프로브 적용은 하이브리드화 전의 세포 벽의 투과를 위한 시제 또는 효소를 포함하지 않기 때문이다. 그러나, 하이브리드화에 빈번하게 요구되는 몇개의 화합물이 요구된다. 따라서, 프로브는 일반적으로, 사용자에게 더욱 친숙한 키트에 포함된다.

발명의 상세한 설명

I - 정의

a) 본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오티드"는 핵산 관련 기술을 이용하는 업자에 의해 일반적으로 공지된 천연 및 합성 분자를 포함하며, 이에 의해 핵산에 특이적으로 결합하는 폴리머를 생성한다;

b) 용어 "뉴클레오티드 서열"이 사용되는 경우, 이는 서브유닛을 함유하는 폴리머의 세그먼트로 불리는 것과 동일하며, 본 사건의 경우, 뉴클레오티드이다;

c) 용어 "표적 서열"은 본 시험에서 검출하고자 하는 헬리코박터 피로리의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 뉴클레오티드 프로브의 일부가 하이브리드화되도록 고안되었다;

d) 용어 "PNA 프로브"는 뉴클레오티드 서열을 가지며, 관심 미생물의 표적 서열과 하이브리드화되도록 특이적인 PNA의 서브유닛의 폴리머를 나타낸다. PNA 분자는 DNA 미믹으로서, 네거티브 하전된 당-인산염 백본 구조는 아키랄 및 전기적으로 중성인, 반복된 N-(2-아미노에틸)글리신 유닛에 의해 형성된 것에 의해 대체된 것이다.

e) 용어 "검출가능한 단편"이 사용되는 경우, 이는 프로브에 연결될 수 있어 기구 또는 방법에 의해 검출가능한 프로브가 될 수 있는 분자를 나타낸다;

f) 본 발명에서 용어 "클래리스로마이신에 대한 내성"은 클래리스로마이신에 대한 내성 또는 감수성과 관련된 특이적 유전자 및 점 변이에 기초하여 클래리스로마이신에 대한 미생물의 감수성 분석과 관련된다;

g) 용어 "샘플"은 검출을 위한 미생물 또는 표적 서열을 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 나타낸다. 바람직하게는, 생물학적 샘플은 액체 형태 (예를 들어, 음식, 물, 혈액, 소변 등)일 수 있거나, 조직의 샘플 (예를 들어, 위생검을 포함한 생검 샘플)로서 사용한다.

II - 설명

PNA 프로브 개념:

본 발명의 PNA 프로브는 클래리스로마이신 내성에 관련된 변이를 유도하는 영역에서 헬리코박터 피로리의 표적 서열을 갖는다. 따라서, 다양한 데이타베이스의 23S rRNA 서열이 정렬되었다. 아데닌 뉴클레오티드가 시토신 또는 구아닌에 의해 대체되는 위치 2142, 또는 아데닌이 구아닌에 의해 대체되는 위치 2143에서의 3개의 점 변이 (Taylor et al., 1997)가 23S rRNA의 도메인 V에서 엔코딩된 펩티딜트랜스퍼라아제 영역에 위치하였다. 이들 변이는 이러한 미생물에서의 클래리스로마이신 내성 메카니즘과 관련이 있다. 추가적인 프로브가 점 변이 없이 상기 기술된 동일한 표적 위치에 대해 설계되어 클래리스로마이신 감수성 균주의 검출을 허용한다.

본 발명의 PNA 프로브는 15개 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 기준에 따라,

ㆍ 5'- GGG TCT CTC CGT CTT -3' (SEQ ID No. 1);

ㆍ 5'- GGG TCT TCC CGT CTT -3' (SEQ ID No. 2);

ㆍ 5'- GGG TCT TGC CGT CTT -3' (SEQ ID No. 3);

ㆍ 5'- GGG TCT TTC CGT CTT -3' (SEQ ID No. 4)에 구조적으로 86% 이상 유사한 서열이 선택되었다. H. 피로리 또는 이들의 내성에 대한 이러한 프로브가 기술되었음에도 불구하고, 이들은 이러한 상황에 대해서만 반드시 특이적인 것은 아니다.

대안적으로, 본 발명은 프로브 뉴클레오티드 서열의 변화가 고려된다. 이러한 변화는 특히, 결실, 삽입을 포함할 수 있다. 결론적으로, 언급된 바와 같이, 프로브 뉴클레오티드 서열은 상기 언급된 서열과 86% 이상 상동성이어야 한다.

PNA 프로브의 검출가능한 단편:

하기 예에 국한되지 않으면서, PNA 프로브의 검출가능한 단편은 다양한 유형의 분자 예컨대, 특히 컨주게이팅된 덱스트란, 크로모포어, 플루오르포어, 동위원소, 효소, 햅텐, 화학루미네슨스 화합물을 포함할 수 있다.

예로서, 플루오르포어중에서, (비제한적으로) 알렉사 플루오르 시리즈, 시아닌, 5- (및 -6) 카르복시-2',7'-디클로로플루오레세인, 5-ROX (5-카르복시-X-로다민, 트리에틸암모늄 염)을 사용하는 것이 바람직하다.

방법:

본 발명은 H. 피로리 측정 및 이의 클래리스로마이신 내성에 대한 방법에 관한 것이다. 사용된 PNA 프로브는 SEQ ID NO. 1-4에 구조적으로 86% 이상 유사한 뉴클레오티드 서열중 하나 이상을 포함한다.

본 방법은 적합한 하이브리드화 조건 또는 적합한 동소 하이브리드화 조건 (실시예 1에서와 같이)하에 본 문헌에 기술된 하나 이상의 PNA 프로브를 갖는 샘플과 박테리아 표적 서열 사이의 접촉을 고려하였다. 형광 동소 하이브리드화 (FISH 또는 PNA-FISH) 또는 실시간 PCR은 H. 피로리 분석에 대한 시험 포맷이다.

따라서, 본 방법은 샘플 제조, 세포 고정, 하이브리드화, 세정 및 결과 시각화로 나누어질 수 있다 (실시예 1 참조). 본 방법은 부착된 또는 부유된 세포에서 수행될 수 있다.

하이브리드화 조건:

표적 서열로의 PNA 프로브 하이브리드화의 엄격성을 부여하거나 조정하는 여러 인자가 있다. 이들로는 사용된 포름아미드 (또는 다른 화학 변성 시제)의 백분율, 염 농도 및 결론적으로, 이온 강도, 하이브리드화 온도, 세정제 농도, pH 등을 포함한다. 하이브리드화 최적 조건을 결정하기 위해, 바람직한 정도의 차별성이 달성될 때까지 다양한 인자를 정하고, 개별적으로 각각의 인자를 변화시켜야 한다.

표적 서열이 샘플에서 다른 비 표적에 더욱 근접할 수 록, 하이브리드화에 영향을 미치는 다양한 인자를 규정하는데 요구되는 엄격성 정도가 더 커져야 한다. 본 발명에서, 비 표적 서열은 표적 서열에 대한 단지 하나의 상이한 뉴클레오티드를 가질 수 있으며 (내성이 감수성 균주와 내성 균주 사이의 단일의 뉴클레오티드의 차이와 관련되기 때문에), 따라서, PNA 프로브와 비 표적 서열간의 비 특이적 하이브리드화를 피하기 위해 증가된 수준의 차별성이 요구된다. H. 피로리 감수성 균주와 하이브리드화되는 본 발명의 프로브는 클래리스로마이신 내성을 검출할 수 있는 나머지 3개의 프로브와 함께 이용될 수 있다. 그러나, 선택적으로, 프로브는 검출가능한 단편 예컨대, 차단 프로브 없이 사용될 수 있어, 최적화된 하이브리드화 조건과 함께, 경쟁을 통한 나머지 프로브의 단지 하나의 뉴클레오티드만 상이한 비-표적 서열로의 비-특이적 결합을 배제시킬 수 있다 (실시예 2에 설명된 바와 같음).

하나의 차단 프로브가 PNA 프로브와 동일한 서열 (검출가능한 단편을 갖는 PNA 프로브에 대한 비-표적) 사이에 형성된 것 보다 더욱 열역학적으로 안정한 착물을 형성하는데 영향을 줄 수 있어, 후자의 연결을 피하고, 잠재적인 긍정 오류를 제거할 수 있다.

샘플 제조:

분석하고자 하는 샘플은 특히, 생검물, 혈액, 물, 음식으로부터 획득할 수 있다. 생검물에서, 샘플은 3 내지 5㎛ 조각으로 자르고, 슬라이드상에 놓았다. H. 피로리가 부유 상태로 존재하는 경우, 물, 공기 및 혈액의 샘플에서와 같이, 샘플을 블랙 콜리카보네이트 막 또는 등가물을 통해 여과한다. 그 후, 막을 슬라이드에 위치시킨다. 음식 샘플에 있어서, 음식 매트릭스로부터 H. 피로리를 추출해야 하며, 샘플을 침수시키거나 멸균 완충액중에 담근 후에 스토마처 패들 블렌더 (stomacher paddleblender)로 또는 초음파 처리로 재분류한다. H. 피로리가 부유되는 시점부터 적용된 기법은 물, 공기 또는 혈액에 대한 것과 유사하다. 대안적으로, H. 피로리 부유 샘플이 하이브리드화 공정에 직접적으로 제공될 수 있다.

키트 :

본 발명은 H. 피로리 검출 및 이의 클래리스로마이신 내성을 시험 가능하게 하는 키트에 관한 것이다.

본 키트에 사용하기 위한 PNA 프로브, 이의 특징 및 관련 방법인 본원에서 이미 언급되었다.

본 발명의 키트는 SEQ ID NO. 1-4와 구조적으로 86% 이상 유사한 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 시험을 수행하기 위해 선택된 또 다른 시제 또는 조성물을 포함한다.

본 발명의 PNA 프로브, 이의 특징, 방법 및 키트는 관심 유기체의 세포내에 존재하거나 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열의 분석에 적합하다. 마찬가지로, 본 발명은 관심 유기체로부터 유래되거나 추출된 핵산의 분석 또는 유기체의 분석 모두에 이용될 수 있으며, 표적 서열의 공급원이 본 발명에 기술된 것으로 제한되지 않음을 의미한다.

실시예

실시예 1: 헬리코박터 피로리 클래리스로마이신 감수성 및 내성 균주의 검출

PNA 프로브 서열
Alexa 488 - 0 - GGG TCT CTC CGT CTT (SEQ . ID No. 1)	헬리코박터 피로리 클래리스로마이신 내성 균주 검출
Alexa 488 - 0 - GGG TCT TCC CGT CTT (SEQ . ID No. 2)
Alexa 488 - 0 - GGG TCT TGC CGT CTT (SEQ . No 3)	헬리코박터 피로리 클래리스로마이신 감수성 균주 검출
Alexa 594 - 0 - GGG TCT TTC CGT CTT (SEQ . ID No. 4)

O = 8-아미노-3,6-디옥사옥타네이트 (두 분자 사이를 연결).

Alexa 488/594 - 플루오로포어 (검출가능한 단편).

박테리아 균주:

PCR에 의해 확인된 클래리스로마이신 내성 상태의 수개의 임상 분리물을 사용하였다. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (Manassas) (ATCC)에 의해 획득된 비교 균주를 또한 사용하였다. 각 균주 배양물 소적을 8mm 웰 슬라이드에 첨가하고, 55℃에서 건조시켰다.

고정

하이브리드화 동안 23S rRNA의 손실을 방지하기 위해, 샘플을 4% 파라포름알데히드 (wt/vol) 및 50% 에탄올 (vol/vol) 용액에 각 10분 동안 노출시켰다.

하이브리드화 :

본 단계에서, 10% (wt/vol) 덱스트란 설페이트, 10mM NaCl, 50% (v/v) 포름아미드, 0.1% (wt/vol) 나트륨 피로포스페이트, 0.2% (wt/vol) 폴리비닐피롤린, 0.2% (wt/vol) FICOLL, 5mM 디소듐 EDTA, 0.1% (vol/vol) 트리톤 X-100, 50mM 트리스-HCl 및 200nM의 PNA 프로브를 포함하는 하이브리드화 용액의 소적을 샘플에 첨가하였다. 샘플을 커버슬립으로 덮어 프로브가 균일하게 스프레딩되게 하고, 60분 동안 인큐베이션하였다. 이러한 기간 동안, 프로브는 세포 막으로 유입되어, 23S rRNA 상보 서열에 결합할 수 있다. 하이브리드화 용액의 증발을 방지하기 위해 커버슬림 및 샘플 둘레의 휴미드 페이퍼 (humid paper)가 필수적이다.

세정:

하이브리드화후, 커버슬립을 제거하고, 슬라이드를 5mM 트리스 베이스 (Tris Base), 15mM NaCl 및 1% (vol/vol) 트리톤 X-100 (pH 10)으로 이루어진 미리 가온처리된 세정 용액에 침수시켰다. 세정 단계를 동일한 하이브리드화 온도에서 30분 동안 수행하였다.

결과:

결과는 프로브내의 플루오로크롬 시그날링 분자에 적합한 필터가 장착된 형광 형미경에서의 관찰을 통해 얻었다 (즉, 프로브에 결합된 플로오로크롬을 방사하는 파장을 포함). 표적 서열이 부재하는 경우 어떠한 시그널링도 검출되지 않았다.

프로브에 결합된 플루오로크롬의 검출을 위한 적합한 필터가 장착된 형광 현미경에 의해 수득된 결과
클래리스로마이신 내성 균주	균주	필터 488	필터 594
	H. 피로리 7.83	++	-
	H. 피로리 167	++	-
	H. 피로리 6231	+	-
	H. 피로리 166	++	-
클래리스로마이신 감수성 균주	H. 피로리 968	-	++
	H. 피로리 NCTC	-	++

필터 488은 플루오로크롬 알렉사 488에 의해 조장된 형광물의 포획을 허용하며, 이는 클래리스로마이신에 대한 내성의 표식이다. 필터 594는 플루오로크롬 알렉사 594에 의해 조장된 형광물의 포획을 허용하며, 이는 클래리스로마이신에 대한 감수성의 표식이다.

실시예 2: 이미 확인된 헬리코박터 피로리 균주에서 클래리스로마이신 내성 검출

본 실시예는 H. 피로리가 예를 들어, H. 피로리를 검출할 수 있는 PNA 프로브에 관한 PT103767-A1으로서 또한 공개된 문헌 WO2008155742-A2의 방법을 이용하여 확인되면, 본 발명이 H. 피로리로서 확인된 균주가 클래리스로마이신 내성 또는 감수성인지를 평가가능하게 함을 예시하기 위한 것이다.

사용된 PNA 프로브 서열
Alexa 488 - 0 - GGG TCT CTC CGT CTT (SEQ . ID No. 1)	클래리스로마이신 내성 헬리코박터 피로리 균주 검출
Alexa 488 - 0 - GGG TCT TCC CGT CTT (SEQ . ID No. 2)
Alexa 488 - 0 - GGG TCT TGC CGT CTT (SEQ . No 3)
Alexa 594 - 0 - GGG TCT TTC CGT CTT (SEQ . ID No. 4)	차단 프로브

O = 8-아미노-3,6-디옥사옥타네이트 (두 분자 사이를 연결).

Alexa 488/594 - 플루오로포어 (검출가능한 단편).

H. 피로리가 종래의 공개된 방법에 의해 확인되면, 균주의 감수성 상태를 연구하는 것이 가능하다. H. 피로리 (종래 기술된 프로브를 사용하여 확인됨)의 균주를 표 3에 기술된 프로브를 사용하여 클래리스로마이신 내성에 대해 시험하였다.

이전 실시예로부터의 동일한 하이브리드화 프로토콜을 사용하였으나, H. 피로리의 검출을 가능하게 하는 종래 인용된 문헌 WO2008155742의 프로토콜과는 상이하다. 그러나, 본 발명의 프로브와 함께 상기 언급된 프로브를 사용하기 위해 일부 변화를 줄 수 있으며, 이는 동일한 시험에서 H. 피로리의 확인 및 내성의 결정을 가능하게 한다.

결과:

본 결과는 프로브내의 플루오로크롬 시그날링 분자에 적합한 필터가 장착된 형광 현미경에서의 관찰을 통해 얻었다.

필터 488은 플루오로크롬 알렉사 488에 의해 조장된 형광물의 포획을 가능하게 하며, 이는 클래리스로마이신에 대한 내성의 표식이다.
클래리스로마이신 내성 균주	균주	필터 488
	H. 피로리 6.236	+
	H. 피로리 7.002	++
	H. 피로리 168	++
	H. 피로리 7.11	++
클래리스로마이신 감수성 균주	H. 피로리 169	-
	H. 피로리 NCTC	-

SEQUENCE LISTING

<110> UNIVERSIDADE DO MINHO

<120> PEPTIDE NUCLEIC ACID PROBES, KIT AND METHOD FOR DETECTING HELICOBACTER PYLORI AND/OR CLARITHROMYCIN RESISTANCE PROFILE AND APLLICATIONS

<130> PPI 42507-10

<160> 4

<170> Patentln version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> Helicobacter pylori

<400> 1

gggtctctcc gtctt

15

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> Helicobacter pylori

<400> 2

gggtcttccc gtctt

15

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> Helicobacter pylori

<400> 3

gggtcttgcc gtctt

15

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> Helicobacter pylori

<400> 4

gggtctttcc gtctt

15

SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSIDADE DO MINHO <120> PEPTIDE NUCLEIC ACID PROBES, KIT AND METHOD FOR DETECTING HELICOBACTER PYLORI AND/OR CLARITHROMYCIN RESISTANCE PROFILE AND APPLICATIONS <130> PPI 42507-10 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 1 gggtctctcc gtctt 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 2 gggtcttccc gtctt 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 3 gggtcttgcc gtctt 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 4 gggtctttcc gtctt 15

Claims (17)

1. 헬리코박터 피로리 균주의 존재를 검출하거나, 클래리스로마이신에 대한 헬리코박터 피로리 반응을 검출하거나, 헬리코박터 피로리 및 클래리스로마이신에 대한 이의 반응을 검출하기 위한 PNA 프로브로서, SEQ ID NO. 1-4에 구조적으로 86% 이상 유사한 뉴클레오티드 서열중 하나 이상을 포함하는 PNA 프로브.
2. 제 1항에 있어서, rRNA, rDNA 또는 헬리코박터 피로리 상보적 rRNA 서열에서 표적 서열을 검출할 수 있는 PNA 프로브.
3. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO. 1-3에 구조적으로 86% 이상 유사한 뉴클레오티드 서열중 하나 이상을 포함하는 경우, 클래리스로마이신 내성을 검출할 수 있는 PNA 프로브.
4. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO. 4에 구조적으로 86% 이상 유사한 뉴클레오티드 서열중 하나 이상을 포함하는 경우, 클래리스로마이신 감수성을 검출할 수 있는 PNA 프로브.
5. 제 1항 내지 제 4항중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 검출가능한 단편에 연결되는 PNA 프로브.
6. 제 5항에 있어서, 프로브의 검출가능한 단편의 유형이 하기 그룹으로부터 선택되는 PNA 프로브:
   컨주게이트 (conjugate), 분지된 검출 시스템 (branched detection system), 크로모포어 (chromophore), 플루오로포어 (fluorophore), 방사성 동위원소, 효소, 햅텐 또는 루미네슨스 화합물.
7. 제 6항에 있어서, 플루오로포어 그룹이 하기중 하나 이상인 PNA 프로브:
   플루오로포어 알렉사 시리즈 (fluorophores Alexa series), 알렉사 플루오르 시리즈 (Alexa Fluor series), 시아닌, 5- (및 -6) 카르복시-2',7'-디클로로플루오레세인, 5-ROX (5-카르복시-X-로다민, 트리에틸암모늄 염).
8. 제 1항 내지 제 7항중의 어느 한 항에 따른 프로브중 하나 이상을 포함하는, 생물학적 샘플에서 헬리코박터 피로리 균주의 존재를 검출하거나, 클래리스로마이신에 대한 헬리코박터 피로리 반응을 검출하거나, 헬리코박터 피로리 및 클래리스로마이신에 대한 이의 반응을 검출하기 위한 키트.
9. 제 8항에 있어서, 하기 용액중 하나 이상을 포함하는 키트:
   하나의 고정 용액, 하나의 하이브리드화 용액 및 하나의 세정 용액.
10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 고정 용액이 파라포름알데히드 및 에탄올 즉, 2-8% (wt/vol)의 파라포름알데히드 및 25-75% (vol/vol)의 에탄올을 포함하는 키트.
11. 제 9항에 있어서, 하이브리드화 용액이 포름아미드를 포함하는 키트.
12. 헬리코박터 피로리를 검출하거나, H. 피로리 클래리스로마이신 반응을 검출하거나, H. 피로리 및 생물학적 샘플에서 클래리스로마이신에 대한 이의 반응을 검출하기 위한 방법으로서,
    제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 기술된 PNA 프로브중 하나 이상을 사용하는 것을 포함하며, 하기 단계를 포함하는 방법:
    a. 관련 샘플을 PNA 프로브와 접촉시키는 단계
    b. 관련 샘플에 존재하는 미생물의 표적 서열과 PNA 프로브를 하이브리드화시키는 단계
    c. 관련 샘플의 측정 및 관련된 검출의 표지로서 하이브리드화를 검출하는 단계.
13. 제 12항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 공기, 음식, 물, 생검물 (biopsies) 또는 위생검물로부터 유래되는 방법.
14. 제 12항에 있어서, 하이브리드화가 형광에 의해 발생되는 방법.
15. 헬리코박터 피로리의 검출, 또는 헬리코박터 피로리 클래리스로마이신 반응의 검출, 또는 헬리코박터 피로리 및 생물학적 샘플에서 클래리스로마이신에 대한 이의 반응의 검출을 위한 방법에 적용되는 제 1항 내지 제 7항중의 어느 한 항에 따른 PNA 프로브의 용도.
16. 헬리코박터 피로리의 검출, 또는 헬리코박터 피로리 클래리스로마이신 반응의 검출, 또는 헬리코박터 피로리 및 생물학적 샘플에서 클래리스로마이신에 대한 이의 반응의 검출에 적용되는, 제 8항 내지 제 11항중의 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
17. 헬리코박터 피로리의 검출, 또는 헬리코박터 피로리 클래리스로마이신 반응의 검출, 또는 헬리코박터 피로리 및 생물학적 샘플에서 클래리스로마이신에 대한 이의 반응의 검출에 적용되는, 제 12항 내지 제 14항중의 어느 한 항에 따른 방법의 용도.