PT104744A - Sondas de ácido péptido nucleico, estojo e método para detectar helicobacter pylori e/ou da sua resposta à claritromicina e respectivas aplicações - Google Patents

Abstract

O PRESENTE INVENTO REFERE-SE À CONCEPÇÃO DE QUATRO SONDAS DE ÁCIDO PÉPTIDO NUCLEÍCO (PNA) PARA DETECTAR A HELÍCOBACTER PYLORI E/OU A ANÁLISE DA RESPOSTA DE ESTIRPES DE HELICOBACTER PYLORI À CLARITROMICINA. ESTAS SONDAS SÃO APLICADAS A UM PROCESSO BASEADO EM TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR, NOMEADAMENTE DE HIBRIDAÇÃO FLUORESCENTE IN SITU (FISH), APLICÁVEIS NO DIAGNÓSTICO DE SUSCEPTIBILIDADE À CLARITROMICINA DE H. PYLORI EM DIVERSOS TIPOS DE AMOSTRAS, INCLUINDO ISOLADOS CLÍNICOS E BIOPSIAS. DEVIDO ÀS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS INERENTES À SUA ESTRUTURA, ESTAS SONDAS PERMITEM UMA ANÁLISE MAIS RÁPIDA E SENSÍVEL DO QUE USANDO SONDAS DE ADN. OUTRO DOS ASPECTOS DA PRESENTE INVENÇÃO RELACIONA-SE COM O DESENVOLVIMENTO DE UM ESTOJO, UTILIZANDO UMA OU VÁRIAS SONDAS DE PNA AQUI DESCRITAS E NO REFERIDO PROCESSO DE DETECÇÃO OU QUANTIFICAÇÃO, QUE TEM COMO OBJECTIVO A IDENTIFICAÇÃO DE H. PYLORI E DA SUA RESPOSTA À CLARITROMICINA EM AMOSTRAS CLÍNICAS.

Description

DESCRIÇÃO

"SONDAS DE ÁCIDO FEFTIDD DUCLSICO - ESTOJO 1 MÉTODO SARA mmasMí a mzzccmcmt .ptlúrz &/m m sm reskssta â CDAEITBOMICIMA E SESPECTXYAS APLICAÇÕES''

Campo da Xnvaxxçáo

Esta invenção inoere~se no âmbito de um processo do detecçâo do microrganismos clinicamente relevantes e sues resistências a antibióticos, tendo sido desenvolvidas quatro sondes de ácido pectioo nucleico íPún.) paca a detestar a vali coraster pylozi e/ou a da resposta de estirpes de Helicobaater pylori (resistentes ou sensíveis) à ciaritromicina.

Ostro dos aspectos da presente invenção relacionasse coo a. aplicação destes sondas e referido processo de detecçâo a sc estojo para a se recaio da resistência à olaritromicina de n. pylori em amostres biológicas tendo, portanto, ap i .1 o a ç a o c i i n 1 c a *

Antecedentes d& Invenção A Eelicohãcter pylori è ama bactéria patogénica que colorira a mucosa gástrica humana, estando associada a intenções gástricas corso gastrite crónica, úlceras pépticae, gastrite atrófica e cancro gástrico, 0 diagnóstico de infecoao por ,Hi pylori pode ser baseado em métodos invasivos, que implicam uma biopsia gástrica durante um e;. a mo endcseópioe, ou uno invasivos, que englobem o to s se respiratório da ureia, os testes serológicos e teste; de an ti génio nas feres. Estes últimos sáo meia usados em termos clínicos cor serem mero baratos e mais convenientes para o paciente. Os testes/esiojos mais utilizados são os que deteciam uma encima ureticamente especifica da pylo.':i.f a arcase piSzuu b.e?eéòb o EP092053!}. No entanto, a iaita de sensibiiidade/aspeciftcidade destes testes, continua a considerar determinante a utilização de métodos invasivos para a realização de um diagnostico mais pormenorizado,

De facto, analisando-se uma biopsia por endoscopia é possível obter com maior fiabilidade informações sobre a presença da bei.;, cr ir crer pylori, quer através da utilização de testes baseados no cultivo da bactéria, como o £-test e o método do diluição do agar, quer através de métodos moioculares, normaimente baseados em PCR ("Poiymerase Chain Reaction" - reaoção em cadeia pela pclimerase), No entanto, enquanto os primeiros são bastante demorados e fastidiosos, os segundos exigem alguns cuidados ao nivei do contaminação do ÂDÇ que, caso não sejam seguidos, se podem traduzir num falso positivo ou falso negativo,

Maia reoentemente, tem sido desenvolvidas e optimizadas sondas de ácidos péptido nucleioos (PHA) para a detenção bacteriana, As moléculas de PDA séo mímicas nas do ADN, na qual a estrutura, carregada negaiivamente de açúcar-·fosfato è substituída por uma aquiral e electricamente neutra formada por unidades repetidas do N -(z-aminoetil) oliolna,

Embora a molécula de PNA não possua pentoaes, ocorra? nibridaçâo especifica entre as sequências de PNA e as sequências complementares de ãcidos nucleicos, por ligações de hidrogénio. Esta híbridação obedece as regras de vê&tson-uri c.k A natureza electricamente neutra tio PNA o responsável pelas caracteristioas de híbridação maís robustas cesta molécula, no que respeita à alta estabilidade nas ligações PNn/seqoência alva {rARN ou DNA de dupla cadeia), quando sa compara com as sondas de ADh, tradicíonalmonte usadas. Assim, devido â sua afinidade elevada, as sondas de PNA têm sequências de nucledtxdos reiaticamente curtas, preferivelmente entre B a 1? nucieótídos. Uma sonda de A.Dh tem, normaimente, pelo .menos 18 nuciedtidos, devido á sua fraca estabilidade e inferior temperatura de fusão (Tm), requerendo também processos adicionais ae fixação e permeabiiisaçao com enzimas ou outros agentes. As moléculas de PRA apresentam também moa maior resistência a processas e nucleares que a molécula natural de ADR,

Quando acopladas a um fluorooromo, as sondas de PHA podem ser detecoadas por mioroscopia ou cisometria de fluxo através da técnica de hibndaçao fluorescente in ai tu ÍPISH). Esta técnica produs resultados maís céleres em amostras clinicas, quando comparados com os métodos de cuitivo tradicionaj.s, tendo sroo tu.ovadas a sua et.toscra, rapi.desensibilidade e especiíiciáade< A sua aplicação é também muito abrangente, podendo ser usada em diversas áreas da microbíoiogia, incluindo a detenção de mdororgardsmos patogénicos em amostras de origem humana, al.jjoent.ares e ambientais.

Alguns exemplos de sondas já desenhadas e purdicadas/patenteadas para alguns microrganismos de interesse clinico, como as sondas desenvolvidas para a detecção do género Sal.monel.ia, Bacíllus anthrâcis, espécies de Staphyloooccus diferentes do ArophvtArcoccns eu rous, Papi Ilomsvisus hú:un:.:ç e o género Csndida, entre outras, demonstrara o crescente interesse que esta técnica proporciona.

Para o Hl pyiori já foi divulgada rua sonda de EGA para a sua. detecção especifica (Azevedo b.F. st ai. , 2003), Adioionalmente, outra soada foi. também objeeto de ao pedida de patente lN0200Blbt742-bâ2; ΡΤΐ037ν7?--Α1) . Hfsfca últinia provou ter una especificidade e sensibilidade bastaste elevadas, superando assim os métodos tradicionalmente asados (Guimarães Nl et al., 2007). No entanto, para além da detecção do H, pylorit é também desejável a identificaçáo das suas resistências a antibióticos·., o que nâo é possi vei utilizando apenas as sondas acima mencionadas -

De tacto, 0 tratamento da intenção com dl pylori passa frequentemente por uma terapia tripla, que envolvo um inibi.dor da homfoa de protões em associação com dois antibióticos (eg, ciaritromioina, mstrodinazoie, amoxicilina) por um período de 7 a li dias. Esta terapia implica um. desconforto sério do doente, associado á utilização intensa de antibióticos e aos efeitos secundários que estes provocam., Adicd.cnalmente, o sucesso desta terapia tem vindo a ser ssriamente afoutado devido ã crescente resistência da .81 pylcxri aos antibióticos, ospeciaimente no que diz respeito à ciaritromi.cina, que é o antibiótico de eleição administrado nestas patologias. Neste momento a resistência é detestada através dos métodos de cultivo ou de PCR, que também neste caso apresentam as limitação descritas anteriormente para a detecção de H. pylori. Assim, devido à falta da métodos rápidos, fiáveis e práticos, a informação cobre a resistência a ciaritromícína para seda estirpe de dl pyloii é geraimente obtida após se ter dado início ao tratamento ou após se ter verificado a ineficácia deste, A presente invenção descreve um método fiável e ereqnivei ce aplicação sistemática. de identificação de estirpes resistentes é pois um contributo signi.f i.cativo para a escolha de um tratamento adequado, poupando incomodes, riscos, prolongamento de tratamentos e custos ao doente. 0 outro método molecular que pode permitir a detecção de resistências em d, pyiori é o FISH, De rosto, existem estudos eíectaados com sondas de ADR que detestam orecisamente a resistência à elaritromi.ci.na por parte desta bactéria (Tre.besias. et ai., 2000). Mutações pontuais na regido peptidiltransferase do domini.o V do 23S rARO estão associadas coo a resistência à claritrom.icina pela IA pyiori. A mutação pontual riais itoq..mcA.o:tanae colorida nos estudos é a mutação A21iib. seguida da A2142G e da A.2l42Ct dum estudo efecruado ior calculado, para um conjunto de vários países, que estas mutações apresentavam uma prevalência associada com. a resistência à claritromícína de cerca de 84% (Hegraud, 2004}.

Sumário da invenção O presente invente refere-se a sondas de ácido péptido nucleico ÍPGAs ou conjuntos oe sondas de PdA, para a detestar a Reiicedaccor pyiori (isto é identificar ou quantificar) e/ou da sua resposta (resistence/seneivel) à ciaritromícina. De acordo com as reivindicações, as acedas reconhecem, o 23S rARN do mic.rorgani.smo em questão ou as sequências qenómicas correspondentes ao rARd mencionado. As sondas cie PdA têm característicac físico-químicas inerentes à sua estrutura que, .quando aplicadas a um método baseado na tecnologia íTXSH, permitem uma análise maia rápida, robusta e especifica do que usando uma sonda de ADR, Para esta caso, este factor assume particular importância, uma ver que a diferença entre estirpes de B. pyiori resistentes e sssceptiveis a ciaritromícina pode ser de apenas ama

Pase, um doe problemas resolvidos pela presente .invenção é a detecçào ou quantiaioaçao da H. pyiori e/ou da reaposta (sensível ou resistente) à ciarltromrcina, Alem de ox oporcionur um método fiável e expedito para a determinação da pxeseoça da Hi pilori o um a amostra biológica, quantificação e determinação da asa resposta à clarifromieina de form.a a se poder determinar o tratamento conveniente de forma .rápida o .segura,.

Outro dos aspectos da presente invençlo reiacioaa-se com o desenvolvimento de um estojo, baseado na aplicação destas sondes à técnica de hibridaçao fluorescente ir siiu íFIEB}, que permite a detecçào da H. pyiori e das suas resistências à claritromicina em amostras biológicas, de uma forma simpi.es e rápida. As sérias sondas podem ou não ser utiiiradas em simultâneo. f. ore sente .invenção descreve um conjunto de sondas de PUA as quais deteciam, isto é identificam e/ou quantificam, a presença de Helicobacter pyiori ou, deuectam r ; rospossa da deiicocacror pyicri à claritromlcina ou, detectam a Helicobacter pyiori e a sua resposta; à clerifcromboina, Ã qual compreende uma das sequências de aucleòtidos pelo menos S6s estrufuraimente semelhante às SEQ IF dos, 1 a 4, A presente invenção descreve ainda um conjunto de sondas eo PHA que· detestam a presença de felccobacter pyiori ou, de·: ao rum a resposta da de.; iocimctor pyiori è ciaritromioi.ua ou, detectam a Helicobacter pyiori e a sua resposta. 1 cd.usritronúcinãf a qual compreende pelo menos uma das sequências do ηαeh.eótidos peio menos ifít estrutura imante semelhante àe SEQ ID Hos. 1 a 4. duma realização preferencial as sondas de uNA descritas na prosa ruo invenção detectam a sequência alvo no rnRU, no i/WlS OU liâíi sequências complementares do Ho ixcotacter pylorí,

Sondo que numa realização ainda nu:o preferencial a presente invenção engloba. ao seguintes sequências: polo menos uma das sequências de nucleotidos, pelo nonos; 86% estruturalmente semelhante ás SEQ ID Nos. 1 a 3, que deteciam a Helroobacter e/ou a sua resistência à oiaritromicina; • polo menos uma das sequências de nucleótidoei peio menos S6% estruturalmente semelhante â SBO ID Nos, a que de teciam a Helicobacter e/ou a sua. sensibílidado à ciaritromlcins.

Numa realisaçao ainda maia preferencial, as sequências se encontrarem ligadas a peio menos um tipo de fraoçoo detestável.· Sendo quo, o tipo de fracçâo detectávei a utilizar poderá ser selecci criado a partir de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de detenção ramificado, um cromoforo, um fiuordforo, radioisótopo, uma encima, um hapteno ou um composto ] ...minasoer.se, entre outros.

Numa realização ainda ma is preferencial o grupo fiuoróforo poderá ser pelo monos um dos seguintes: tiuoróforos de alena series, cianinse, 5-íe ~6) Csrboni"-2*, ? -díciorotiuoresceina, o a-ROX iS~carboxi~X~rodamina, sal trietiismónio;, entre outros. nte invenção um estojo ue uetec çso ;up de detenção da resposta da ri a r í t remi nina ou, de detenção da ; nua resposta à ciari tromicina era

Feircarbaeter pyiori à amostras biológicas, o qual compreende polo menos uca da o condas anteriormente descritas.

Sendo que numa realiaaçáo mais pteíeenc.la 1 o estojo poderá ainda apresentar pelo nonos uma das seguintes soluções: una solução de fixaçao, una soluça o do hibridapâo e uma solução de lavagem.

Ora numa realiraçào ainda mais preferencial a solução do fixação poderá com.praonder paraformaldeido o etanol, nomeadamerve 2-81 (peso/col; do paraformaldeido e 25—75% ívol/rol} de etanoi e/oa a solução de hibridação poderá c oap r o e nd e r f o rm a ab. d a . £ também obiecto da presente intenção a descrição de um método de detecção da belicobaccer ovlori ou, de detenção da resposta da .Molico.baor.or pylori a Clarisromicina, ou de detecção da beiicobacter pydc.ri o da sua resposta á claritromicina et: amostras biológicas, o qual utilíta pelo manos uma das sondas de PbA anteriormente e que compreender os seguintes passos: o contacte da sonda de PbA com. amostras biológicas; o hibridação da sonda do PN.A com a sequência alvo dos mnerorganismos preserves nas amostres biológicas; o detecção da hibridação como indicativo da referida detecção e quantificação nas amostras biológicas.

Ora, as referidas amostras biológicas podam ser provani.ente os sangue, ar, alimentos,, água, biopsias ou biopsias gástricas, entre outras.

Sendo que numa realização ainda mala preferencial a hibridaçâo poderá sor feita por fluorescência. E ainda objecto da presente invenção a utilização das sondas de SNA anteríornente descritas, a utilização dos estojos anteriormiente descritos e da metodologia para sares aplicadas nuca metodologia de detecçâo da Helícabactcz pylozi ou, de detecçâo da resposta da Helícobact&z pylozi â olaritromicína, ou de detecçâo do Helícohactez' pyl.czi e do sua resposta à clar.itromioi.na em amostras biológicas. A presente invenção engloba sondas de PNA, reagentes, métodos e estojo destinados à detecçâo ou quantificação de estirpes de Heiecodacter pylozi ou, detectar ou quantificar

a resposta do E&licobactez pylozi à clazítròmicina ou, detestar ou quantificar a Helicohãctez pylozi e o sua resocs::o (resistentes e sensíveis: d claritromícína . A maior especificidade das sondes de PNA (reiatívsmente è.s sondas de ADNd permite uma melhor discriminação de sequências de núcleos idos relacionadas com um ou dois nucleótldos de diferença, Ea presente invenção este aspecto assume particular relevância, uma ver que a diferença entre estirpes de H. pyiori resistentes ou sensiceis á ciaritromicrna s de precisamente uma base.

As sondas de PNA, descritas na presente invenção são capazes de detestar ròRN, sequências qenómi.cas correspondentes ao rARH (rADKM, ou ainda sequências complementares às mesmas, permitindo a detecçâo especifica da espécie alvo e ainda determinar as respostas a presença de antibióticos.

As sondas desta invenção são usadas para análise por hibridaçâo in ai tu de B. pylozi opcionaimente presente na amostra, preferiveimenie através da técnica de hibridaçdo i n si tu fla o r esconte. és sequências da nuci.ebtro.os das sondas de PMA descritas nesta invenção sao seiecoíonadas de um grupo formado coo peio menos 86% estruturalmente semelhante as seguintes sequências: â'~ GGG TCT CTC CGT CTT ~3f (sEQ ID do. 1} o!" Goo TCI TCP CGT ,··> cmp "3' (SEQ 11 dO. ··) \ 5Í- GGG TCT TGC CGT CTT ·· .1? (SEQ 1D dO. 3) U' - ibavs TCT TTC CGT GTÇ ... V >' ÍSEQ 10 do. i) e ter um comprimento entre 8 a 16 nacleóridos. 0 desenvolvimento de novas sondas de PhA-FTSH é neste momento realizado ds forma empírica, deste caso, começou-se por testar o numero de bases ideai para o funcionamento da sonda. 0.m numero elevado de bases faz com que a sonda tenha urra grande afinidade para o alvo e funcione assim a temperaturas demasiado elevadas, enquanto que um numero demasiado pequeno implica que a energia livre de .ligação •tão seja suficiente para ocorrer uma hibridaçâo, Para este caso, os nelucres resultados foram para o intervalo de 12" 18 pares de basee. Adicionaimensa, tiveram que ser escolhidas as melhores sequências para a detecçao da muiacac. Verificou-se que quando as sondas continham a base que ligara à base matada na nona centrai, estas eram capares ds discriminar entre as mutações ds uma forma maís robusta, do entanto, um desvio de algumas· bases para a esquerda ou para a direita aresta apenas de uma forma ligeira o bom funcionamento das sondas.

Para cada caso tiveram, também que ser estudadas as condições óptimas do processo de FTSH, uma vez que o ι \ sucesso das hibridacdes das sondas do PNA-FISH o dependente d&e condições do hibridação, bem como da firaçéo/permeabiiisaçáo e lavagem. InioiaLroente foram consideradas as condições referidas na invenção previamente publicada ÍWo20081557i2"-A2; 07103757--711), que se destina á detecçdo de Helrcebacter pylori, Previsivelmente, a firação/permeabiiicação poderia ser feita da mesma forma que anteriormente, i,s, com paraformaldeído a -4-1 e epanol a 503, uma ver que se trata do mesmo microrganismo.

Assim, oc principais parâmetros estudados foram a temperatura, a concentração de formamida e c senos de hibridação e lavagem, uma vec que as condições para o funcionamento da sonda anterior nâo sao adaptáveis ao noto conjunto de sonde:::. Uma ver que έ necessário optimitar os parâmetros em simultâneo sem ter uma ideia de qual deles {ou se até mesmo um dos outros) está a af estar negativamente o método de PUA-FISK, este processo é bastante complicado e moroso. De resto, era alguns trabalhos publicados por outros autoras é possível torrficar que murtas sondas testadas acabam por não se revelar eficientes e como tal inúteis para o processo de PNÃ-FIS.H. beste caso, as condições de tempo e temperatura, concentração de íormamida maia favoráveis foram identificadas: cromo sendo 60 minutos de hibridação e 30 de lavagem, 35 °C ε 50 i de formamida, ou 70 *0 e 30 1 de tormanica. De referir que, devido a relaçáo entre a temperatura e a form.ami.da, έ erpectàvel que para concentrações intermédias de formamida a hibridação também funcione a um Intervale de temperaturas de 5 5-"70 :;vd

Uma hibridação bem sucedida permite depois, por exemplo, por mioroscopia de fiuoresoênc PCR em tempo real, a, aferir cltornetria de fio da ou p re s a n ça/a u s ência concentração e caracterização ao nível da susceptibilidude a antibióticos do microrganismo em questão.

Para tal também é i.mportanre considerar a frscçâo da soada do Pdd que permita a detecçéo/ identificação da e.sistência do um complexos estâvci formado; peia sonda e o alvo, dosa fracçâo detestável da sonda é seieccionada a partir de um doo seguintes grupos:, um conjugado, um sistema de de teco ao ramificado, um cromoforo, um fiaoroforo, radtoisótopo, uma enzima,, uxn hapte.no ou um composto luminesoente.

Diferentes sondas podem estar acopladas e um mesmo grupo d et estiver (por ersmpio um fluoròforo) , de forma a derectar estirpes do H, pylori resistentes á ciar itromícina, enquanto uma outra sonda opcional com outra diferente molécula detectátel, do forma a identificar, por exemplo, Pu pq/iori sensível è claritramicina,

No âmbito da presente invenção podem ser também usadas sondem ele que a der ar som fraeção detestável para reduzir ou eliminar a híru;idaçao das sondas de ΡΝΆ a sequências não desejáveis. 0 método descrito na presente invenção compreende o contacto de uma amostra cot; uma ou maia sondas de Pua descritas anteriormente, De acordo com o me to to, os microrganismos numa amostra sao oetectados, identiíiçados ou quantificados, reiativ&mente á sua susceptibrlidade ; resposta, i.sto é seus i seis ou resistentes: é ciaritromícina, correlacionando a hibridaçáo, realizada nas conda coes de hr.òr ioaçao adequacas, ria sernrâncsa Oe Pior com. a sequência alvo. Conseqaentenente, a análise e baseada num único ensaio com um. parecer .definitivo·. Em contraste, os métodos de rotina acPuais para a análise de microrganismos são baseados em caractetisticas ienotipicas múltiplas envolvendo múltiplos testes, È ainda objecto da presente invenção um estojo adequado â execução do ensaio para determinar, Isto è detsotar, identificar ou quantificar, Ab p.pio.ru presente em amostras e/ou a determinação da resposta fsensibiiídadelresistêruda) i ciaritremi eina, 0 estojo da invenção inclui uma ou mais sondas de P.NA e outros reagentes ou compostos seieccionados para a realização dos ensaios de hifcridaçâ.o in sita.

Numa realização ainda ma is preferencial, o de um estojo adequado à execução do ensaio para detectar, identificar cu quantificar /1, p-ylorí contem ainda· una solução de fixação,, hibridação o lavagem,

Preferivelmente, o método pretende ser um meio de diagnóstico coadjuvante para a decisão terapêutica, permitindo deste modo, a partir da obtenção de uma amostra do paciente e a determinação da presença e identificação de estirpes o.e Hl pyiori resistentes/susceptiveis à ciaritromioina, ao clinico adequar o tratamento de acordo com. os resultados do teste obtidos.

As sondas de PNâ. podem set apli.oad.as dírectamente na amostra preparada em lâmina, já que a aplicação destas sondas não envolve o uso de reagentes ou encimas para a permeabi i.lzação das membranas celulares aru.es da hibridaçÃO. No entanto, necessita de alguns dos compostos m,aís ut 11 irecos: nas te. ir ida coes. Assim, as sondas sâo normsiirente .incluídas em estojos que permitem um meis fácil manuseamento oor parte dos uri.lisado.res, X ™ Pefrnrçbss δ) Como usado nesta documento, termo Arjcleôtido" inclui moléculas naturais e não na tu. raie normalmente conhecidas por quem otiiioa tecnologia relacionada coo ácidos neoleicns, para desse rodo gerar polímeros que se ligam especificaae.ote a ácidos nacieicos. b}> Quando usado o termo "sequência de nucieótidcs'', é o mesmo que referir um segmento de nm polímero que contém, subnnidades, neste caso os nucieótidcs., c; 0 termo "sequência aluo'·' significa uma sequência da nucieótidcs da ríel:,cocúctcr pylori que se pretende que seja detestada no ensaio, onde a porção de nucieótidcs da sonda é desenhada para híbridar. 0 terno "s onda cua PnA/’ significa um polímero de subunidades de PM. que apresenta uma sequência de nocieéticos e é eapecif ica para hibri dar com ume. sequência alvo do microrganismo de interesse. As moléculas de PUA sao mímicas das de ADN, na qual a estrutura carregada negativemente de açucar-iosíato é substituída por uma aquiral e erectr.icam.ente neutra formada por unidades repetidas de h ~(i-aminoetii) glioina e} Quando é usado o termo "fraeção detectável'% este refere-se a moléculas que podem ser ligadas à sonda, 'Si para, assim, tornar a sonda desectávei por um ins trument o o u móto do, 0 termo ''resistente à ciarítromicina"' na presente invenção é referente á análise de susceptiMiid3.de do microrganismo à c laritromí eira baseado em genes espoeiricos e mutações pontuais associados com a rosost insta ca. sosceptibiiidade á clarltromàcina, g? 0 termo "amostra" refere-se a qualquer amostra biológica que pode conter o microrganismo ou sequência aluo para a detecçâo. Preferivelmente as amostras biológicas estio na forma liquida (por exemplo: água, alimentos, sangue, urina, etc...; ou coam amostra de tecido (por erempio: amostras de biopsias, nomeadamente biopsias gástricas;* IX ~ Descrição

Concepção das sondas de ΡΜΆ: fts sondas de PM desta invenção têm como sequências alvo da lie licoba ater pylori zonas com oiigonucl.eòtidos responsáveis por mutações referentes à resistência s ciaritromiclna, Assim, sequências de 233 r.ARN de várias bases de dados foram alinhadas. Trêa mutações pontuais ma posição 2142, onde o nucie6ti.de adenina é substituído por citosisa ou por guan.ina, ou na posição 2143 onde um nucieòtido de adenina è substituído por guanina (Taylor et al, 1937} , lo ca li rio :m na região peptiuiltr&nsieraae codificada no domínio V do gene do 233 rAbb. listas mut-rçoes enoontram--se re hmlionadas com o mecanismo de resistência á claritrom.icin.a por sete microrganismo, lira sonda adicionai foi desenhada tendo em conta a locaiisação a Imo referida anter iorseente, mas sem. 16 qualquer itutaçao pontual, permitindo a detenção de estirpes sensioeis a ciaritroríiicína>

De preferência, as sondas de eNA desta invenção eontemla.c sequências de 15 nucieotidos, De acordo cora estes critérios , as sequências pelo cecos 86! estrutura iroants· Sfènifôl canses: ···. ·' ,w Ό\;: :-p TCT CTC CCT CTT ~ 3 {SEQ ID Eo * Í5 / :V f TCT ò CGT _ ·> f (SEQ XD No. 2); > tlrO TCT TGC CGT CTT ... '-· f (SEQ ID No. 3; ; 5 * w GGG TCT TTC CGT CTT ... '*< * ÍGiQ Tc No. 4} . toras, oelecotonadas» Embota estas sendas tenham sido descritas para a 1E pylori ou para as suas resistências, elas não sso necessariamente especificas apenas para esta situecao.

Ai leme ii comente , esta in tenção ccn sempre t asilem cariacies nas sequências núcleos idicas das sondas, cariacoes podem incluir deiec coes, inserções ent re outras. Ccn s e qa e n t eme n c e , tal como foi referido a sequência de nucieotidos da sonda deverá ter pelo menos 86 % de hocoicgia eoc as sequências referidas anteriormente.

Fr&eçâo ds fceotaval da sonda, do ΡΚΆ: Não liadeado aos seguintes e set pios, a sraccão detectéeal da sonda de PNA. pode incluir diferentes topos de se lesai as. cerne conjugados de dextrano, crocòfocos, fluorcAoros, ractioisd topos, enricas, hapteno, coco cato galeiol umine-s cente en ire outr os.

Coco exemplo, ontre a classe dos fluordíoros são preferíveis para uiilisacao (mas nio licitados a] ; flcorai ores de ãiexa series, cioae Fluor series, cianinae, 5·" {e -6} CarPozi---2? .-diclorof luoreseeina, carboxi-X-nrodamireq sal trietilamonio; - ο

5-POX Método; A presente invenção apresenta ura método para a determinação de E< pyiúrí a aaa resistência à clari.trord.cina. As sondas da ?MÃ usadas compreendem pelo menos uma das sequências de nueieófcidos pelo .menos 861 estruturaimente semelhante às SEP I.D boa. 1 a d 0 .método podo contemplar o contacto ie uma amostra com uma ou maia sondas de PM.A descritas neste documento com a .sequência alvo da ba c terás sob condições de hibrídaçao adequadas ou condições do hibrídaçao in-situ adequadas {como abordado no EXEMPLO' 1). Preferivelmente, a hibrídaçao in sita fluorescente (EXSH ou PHA-PISH} ou PCE em tempo real são os formatos de ensaio para a análise de d. pylori, 0 método pode assim ser dividido esc preparacao das amostras, r inacao das células, hibrídaçao, lavagem e visualização dos resultados (ver exemplo 1). 0 método pode ser realizado em células aderidas ou em suspensão.

Condições de Hibrídaçao;

Existem vários tacteies que impõem ou controlam o rigor da hibridaçdo cia sonda ta PfíA a sequências alvo. Estes incluem a percentagem de for.moerei da usada (ou outro reagente químico desnaturante)f a concentração salina o oonsequentemente a força íònica, a temperatura de hibrídaçao, a concentração de detergente, o pH entre outros.

Para deteetar as condições óptimas de híbridaçâc pode ser necessário fixar os diferentes factoras e variar cada

IS facsor isoladamente até se encontrar u:n grau de d i a c i' ia i. n a ç S o d e reja d o,

Quanto mais próxima ae encontra ume sequência alto de outra não-alvo no amostra, maior terá que ser o grau de rigor na definição doe diferentes factores coe iniiaenci&a a hibridaçao. Nesta intenção sequências náo-elvo podem ter apenas um nucieótido de diferença em relação ás sequências alvo (uma ver que a resistência ae encontra associada a um nucieótido do diferença entre uma estirpe sensível e uma estirpe resistente), sendo necessário um elevado nivei de descrl.mlnaçao de forma a evitar hibridaooes nao especificas da sonda de PNA a sequências não-alvo. A senda desta invenção que híbrida com sequência alvo relativa a estirpes de d. pylorí sensíveis, pode ser usada em conjunto com as restantes três sendas que detectam resistência à ciariiomicina. No entanto, opcionaimante, esta sonda pode ser usada sem. fracçlo detestável, como sonda bloqueadora, de forma a, a par de condições de hibridaçao optimitadas, suprimir ligações nao especificas das restantes sondas a sequências nao alvo com apenas um nuoiecti.de do ciferança. em relação a sequência alvo através de competição (como referido no EXEMPLO 2) , È ceraimente aceite que uma sonda bloqueadora acfsa formando complexos te rmodi nano. comente maia estáveis que aqueles formados entre a sono a do PNA e essa mesma sequências, não-alvo para a sonda com fraeçáo. detestável, evitando eesa ultima ligação e suprimindo um potencial falso positivo.

Preparação d® amostras: H, pylori se encontrar em

As amostras a analisas podam ser provenientes do biopsias, sanqus, égua, alimentos entro outros. No caso das biopsias, as amostras são cortadas, em tiras de 3 a g μμ e colocadas em 1 Saunas, No caso de a

Suspensão, tal oomo om amostras cie água, ar e sangue, as amostras sá o filtradas por uma membrana negra de policarbonato ou equivalente,. As membranas sao αβροίs colocada» ara laminas, Para amostras de alimentos, e necessário retirar a Po pylori da marrir dos aliciantes, recorrendo-se para Isso a nltrasonicação ou a um processo mecânico ao batimento de pás pianas na aros Lr a estando, esta embebida em. água ou numa solução tampão estéril, A partir do momento em que o d, pylori ao encontra em suspensão, a técnica aeiioaaa é semelhante à da água, ar e sangue, Aiternativamente, as amostras cedo o Pé pylori se onoentra em suspensão podam som submetidos ao ρroces te de hibridaç:áo d.1 recta:rento,

Estojo;: A presente invenção contempla um estojo que permite a reai.i:taçáo do ensaio que deter erre? A. pylori o a sua resistência ê claritromicina.

As sondas de PbA o usar no estojo, as suas caracteristícas, o método envolvido lucram anterdormente referidos neste documento. O estore nesta invenção compreende pelo menos uma sonda a qual compreende peio menos uma das sequências de auciaótidos peio menos 861 estruturalmente semelhante és SSQ 1.0' Pios. 1 s 8 . a outros reagentes ou composições que são seieccionados para realisar o ensaio.

As sondas de FáA, as suas caracter ísticas, os métodos a estojo desta invenção são apropriados à análise oe ácidos nucleioos presentes, ou não, internamento no organismo da interesse. Assim, esta invenção pode ser usada para ambas, análise do organismo ou análise dos ácidos nucleioos 20 extraídos ou derivados do organismo de interesse, iasendo com que a fonte da sequência, alvo niio safa uma limitacao n e s t a na ve π ç a o.

Os seguistes exemplo ilustram diferentes situações e diversos passos de aplicação da invenção, são reaiiaações preferencias da presente invenção, soe ter a intenção de ser limitativo em qualquer um dos deles:

d© Eelicoh&etez pylozí fO^,*wvwwvyvww«>w.raOTV^vy»iiCTW^v<^wwrw«»^«i^»wxvw»f»«W«x«.y»Aw^wvw.‘ sensíveis e resistentes à cleritromcins.

Tabela 1 - Sequência d&é sondes de jAlexa 4 íí o " 0 ~ Oe<e> <*J V >* V •.“'M CTC iCGT C?T ;......................... {SEQ, ID No. 1} àlexa 4 BB ™ 0 ~ trGlv TCT TCC Detesta Beiicofcaoter pylori CGT CTT (SEQ > ID Ho. 2; resistente á sí&ritromici.na éJ.oxa i 8S ~ Q ... p\ /- ' ··· · Ví'vp Qu TCT TGC CGT CTT ídnÇp No 3} Â.j. exa 0 Si - 0 ... .•V ;:>·,···* η'.,νν.; TCT TTC De t e c t a H e 1 i o oba crer p y1 o r i. v ;'x ip qo (SSCu ID No. 4} sensível è oiarítromicina 0 - S ··;; mino-i, 6~u !1GX; ootanato (ias a ligação entre as daas moléculas}.

Aiexa 488/594 ~ fluoroioro (frasçâo detestável;

Estirpes baeterrenas:

Foram adquiridas diferentes estirpes resistentes a claritromisina a partir de isolados clínicos, sendo comprovado o seu estado de ausoeptibrildade em relação s claritromicina, com as sequências previamerte comprovadas por PCP>

Foram usadas também, estirpes de referencia obtidas de American Type Culture Coliection, Manasses ÍATCf;.

Para cada estirpe, fci colocada ama gota da cultura em lâminas de poços de 8 mm de diâmetro, A lâmina foi depois colocada cerca de 30 minutos na estufa a 5 a w 0',

Com o objeeoiso de prevenir a parda de 23S rAEb durante o processo de hibridaçâo, expôs-se a amestra a uma solução de is (peso/xol} de para formaldeido e de dO!(vol/rol) etancd durante das minutos cada,

Hibridaçáo:

Durante esta etapa, foi colocada uma gota de solução de hifcridação em contacto com a amostra, contendo 10% ;peso/col; sulfato de dextrano, 10 mM NaCl, 50% {veil/vol; formamida, 0,11 (peso/vol; piroíosfato de sódio, 0,2% (wt/voli polrviràlpirrolidona, 0,21 (poso/vold Ficol, 5 mH dl"sódio EDTA, 0,11 (νοί/νοί; Triton X-100, 50 mb Trrs-HCl ;pH 7,5} e 200 nM das sondas de PHA sondas, A amostra foi coberta com uma lamala para garantir o espalhamento uniforme da sonda. Do seguida as lâminas· foram colocadas na estufa durante 60 minutos. Durante este período de tempo, aa sondas puderam penetrar nas membranas celulares e ligar-se a sequências complementares do 25$ rARD. Durante o período de hibridaçáo, á essencial que a solução cie hibridaçáo não evaporo, sara tal, a presença da lamela e de papal humedecido a volta da lâmina foram necessários»

Após o tempo de hibriduçao as lamelas: foras, removidas e as lâminas imersas eo. solução de lavagem pré--aquecida. contendo 5 mid Tris Base, 15 ob FaCi e 1% (vol/vol; Triton X (pH 1G) , colocando ca estufa à temperatura do hibridaçao durante 30 rd.nu tos -

Resultados:

Os resultados foram obtidos através de obsorveoao oo microscópio de fluorescência cosi filtros adequados para a datecçâo dos fiuorocrortos li.gados às sondas (ou seja, que conteoplao os comprimentos· de onda. em que emitem os r I.u oro cr orno s acoplados à sonda), não tendo ardo detestado qualquer sinal eu situações eia que a sequência aluo não se encontra, presente.

Ts.bela 2 ~ Resultados ao microscópio de íluorescència coo. filtros adequados para a detenças dos rlnorocromos ligados às sondas j iEstirpes X- .o .3 1, . 's 4 b i> Filtro 594 ;Estirpes resistentes á ciaritrooi-cina ] R. pyion 3.83 ‘b't H, pylori 16? 4 .1. H. pylori 6231 r H. pv.lor.1 166 ; ou .............1.1....................................i.................................................. q........................... 1 rtst. irpes | 3 0 n S1VO .1S à ! ΐolarítromioina i H. pylori 968 . .-n .d ; RI pylori HCTC í- r _......... Ϊ biltre 388 permite captar fluorescência promovida pelo flucrocromo tlc/u 138, que é revelador de resistência à ciaritroriicíaa. 0 filtro 598 permite captar fluorescência pro.oov.ida peio fluerocrooo ãlexa 594,- que é revelador cie s e n s 1 b .11 idade à c l a r :i. t r oo i c i. n a, *\ -¾

Este exemplo pretende ilustrar a possibilidade de que, ursa vez identificada a H\ pylori, por exemplo utilizando a invenção· previ«mente publicada (WO2Q08155742-A2; 8T1G3787-M; , .que se refere a ama sonda de PKA capas de detecfar l;i pylori, esta invenção permite aferir se essa mesma estirpe, identificada coaxo 7x1 ppior.i, é ou xxao resistente a coar isroaucxna. Táb&lã 3 ~ Sequência das sondas da Mâ usadas: mies a 48 3 - 0 .'V " Ο'.,ϊΟ TCT CTC ....................................................................................... CGT CTT (SBQ 115 do, 1 ; M.exa 48 8 ~ pi " ipv,::v Oq···' p; Detecta Helicobacter pylori CGT CTT (SEQ :n:> No, 2) resistente à ciariaroaxieina Ales a 4 88 c " onC TCT TGC CGT CTT :GEQ ID No, 3 \ Conde biooueadora

Mexa 534 ~GGG TCT TTC CGT CTT ;ScQ ID do- 4) 0 MamlnoM, uMioxaoctanato (fas a iicaçao entre as doa. moléculas;„

Mexa 438/594 - fluoroforo úfraeçao detectável;

Uma vez identificada E, pylori pelo método previamente publicado, é possível realizar o estudo relativo a possível resistência.

Forem usadas estirpes de dl pylori (que foram iáexxtii içadas através da sonda prevlamente descrita) e testada a sua resistência a ciaritromíclne coxa as sondas referidas ta tabeia 3. 0 protocolo do hibrídaçao usado foi o mesmo cio exemplo 8 íque é diferente do protocolo da invenção prévia que permite oefectar .7, pylori, do entanto poderão ser realizadas alarmas alterações que permitam a utilização da sonda, rsferida anteriormente em conjunto com as sondes de presente invenção, permitindo identificação s determinação oes resistências de Hl pylori no mesmo ensaíoi .

Resultados:

Os resultados foram ottioss através de observação ao microscópio de fluorescência com filtros adequados para a detecção dos iluorocromos ligados as sondas.

Tabela 4 - Filtro 488 permite captar fluorescência promovida polo fiuorocromo A lena 418, que é revelador de r es i a - ên c:i. a à o.1 a r 1.1 i: om.i.ci.na

Estirpes Filtro 488 estirpes H.. pylori 6.231 •>s resistentes à H. pylori 7,002 4' q- c0.a.ri tremi, crina Ho pylori 168 ......................................................... 4 -i- H. pylori 7,11 ;..f Estimes ··· n, pylori .1.69 ~ sensíveis à H. pylori. NCTC .............................................| cl ard.tr omieina I

Lisboa, 11. de Setembro de 2009

Claims (6)

1. RSIVXEDIC&ÇÕES 1, Sonda de PEft oararstajriaad» por detectar a presença de .Heiico.bscter pylori ou, det&ctar a raspoata da .Heiicobacrer pylori à clariuromícina oip detectar a deiico.becter pylori o a sua rorpocte ú cl&ritromicina, a qual coinprecn.de pelo menos une das sequências de nucleòtidoe pelo menos 8ee estruturalmente semelhante as P.vQ IP tos. r a 4.
2. 2. Sonda de j?N&, de acordo com a reivindicação l, ear&oterisí&da por detectar a sequência alvo no rARN, no rADN ou nas sequências complementares do rMN de Hei icobac tor pyiori , Sonda de adi,. de acordo com a reivindicação i, caractari *a<t* por detectar a resistenora à olanitromicina, quando compreende peio menos uma · das sequências de nucieôtídos, pelo menos 8 6¾ estruturaXnente' oemeihante ès SdQ II) dos. 1 a 3* •íi. Sonda ae P3A, de acordo com a reivindicação 1 car&cteriz&da. por detectar a sensibilidade à clarrtromici.ua, quando compreende pelo menos uma dos sequências de nncieòti.dos, peio menos 8 61 estruturalmente semelhante à SEQ ID Ho. 4, 5. <. Sonda de PdA, de acordo com qualquer uma das rei vindic.açdes de 1 a 4, caracter iaada por se encontrar ligada a pelo menos um tipo de fraeçao detestável..
3. 6. Sonda de eHA, de acordo com a reivindicação 5, c&racterix^ada pelo tipo de fraeçao de rectivei da sonda ser seleccionada a partir de um. dos seguintes; grupos: um conjugado, om sis testa de detecçao ramificado, um crombioro,. um fluorõforo, radioísótopo, irra encima, um haptens ou um composto lundnesoenta, ·'> sonata Oa rãu, ote acordo com a reivsndioaçao 6, e&racterizada per o grupo fiurofo ser paio menos um doa sagu lutes: i lute; cloros de á iexa serias, AI era Fluor series, cianinas, 5~(e -f; Carboxi-i',lf- dlclorofiuoresoaina, o o-ROA (5-carboxi-X-roáaminsf sai trietilamonio),
4. 8, Esteio detecçao tis Helícobãctei pylori ou tie qualquer uma das detecçao da resposta da Heiicobáciex' pylori à ri a ritrordeira o sde deteoçào da Ealicobacxar pylori e da sua resposta â olaritrorticina ao. amostras biológicas., caracteriaado por compreender peio .menos uma das sondas descritas em reivindicações de 1 a 7.
5. 9- Eatojo de acordo com a reivindicação 8, caracterirado por compreender ainda pelo menos uma das seguintes soluções: uma soluçam de fixação, uma solução da hibri.daçào e um.a solução de lavagem, , Estojo de acordo com a reivindicação 9, csr&cteriKado pç la solução de fixação compreender pare forma ideido e eta.nol, nomeadamente 2-81 (peso/vol: de pararormmd.deido e 25-75% (rol/rol} de etanol, estojo de acordo com. a reivindicação 9, ca ra c t er i s ado peia solução de rn. corda os o compreender Método do detecçao da Heiixobacter pylori ou, cie detecçao da resposta da Belicohãctsz: pylori è. ci&risrom.icina, ou do detecçdo da H&iícobact&r pylori e da sua resposta à ciaritromioina em amostras biológicas, earacteri rado por utilizar poio menos assa das sonda a as sbii descrita em qualquer ama das reivindicações anteriores s por compreender os seq uint es passas ; a, contacto da sonda do PUA com nas referidas amostras; b, hibndaçao da sonda de PNA com a sequência alvo dos microrganismos presentes nas referidas amostras; c, detenção da Mfcridaoâo como icoicativo da referida detecçao e quanti.fi.caçào nas referidas amostras. , ditodo de acordo com a reivindicação 10, c&r&ct«ri*adto peia referida amostra bioiógi ca ser proveniente de sangue, ar, alimentos, égua, biopsias on biopsias qastricas. » bstodo de acordo com a reivindicação 12, c&xactexix&do peia hibrldação ser por fluorescência. utili ração das sondas de ΡΡΆ como descritas eia qualquer uma das reicnumsicacdes de 1 a 7, caraotaxiaada por ser ap.li.cada. nume metodologia de detecçao da Helicobact&r pylori ou, de detecçao da rexpsosta da Belicobacter pylori à clêrizrotnicinã, ou de detecçao da t'en; cot a o ver pylori e da sua ressoais; s οIa ri tror;ioina em amostrss bioiloisas.
6. 16. Utilização do estojo descrito em qualquer uma das reivindicação dê B a 11, csr&cteris&do por ser aplicado na detecçâo da H&licobacter pylori ou, na detecçâo da resposta da delicoPactar pylori a olaritrooicina > ou na detecçâo da .Seiico.daote.r pylori e da aaa resposta a clazitromicina em amostra»· biológicaa. *: '·> , Utilização do método descrito em qualquer uma das reivindicações de 12 a 11, caraotarizado por ser aplicado na detecçâo da Helicobactar pylori ou,, na détecçâd da resposta da IPIicòidsoiier pylori â claritronticinâ, ou na detecçâo da âeiicobacter pylori e da sua resposta a ciar itromici.ua ea: amostras biológicas. Lisboa, 11 de Setembro de 200S