CN101386890B

CN101386890B - 一种lamin a基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

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Publication number: CN101386890B
Application number: CN2008102020822A
Authority: CN
Inventors: 裘建英; 张云福
Original assignee: Ruiqu Biotechnology Shanghai Co Ltd
Current assignee: Taizhou hehe Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2008-10-31
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2028-10-31
Also published as: CN101386890A

Abstract

本发明涉及一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种LAMIN A基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测肠癌疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用。

【背景技术】

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数160万，死亡人数近160万，患者700万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。在消化道肿瘤中，肠癌的发病率越来越高，而且年青人得肠癌的比率逐年升高。上海地区的大肠癌其发病在所有恶性肿瘤中排名第六，而如今已经跃然至第二位。其中城市结肠癌增长速度迅猛，大肠癌比上世纪九十年代上升近三分之一，农村上升了近百分之九。首都医科大学附属北京友谊医院普外科主任张忠涛教授介绍说，结直肠癌在我国也是最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈明显上升趋势，从上世纪七十年代的万分之一上升到现在的万分之二至三，居恶性肿瘤发病率第四位。全球结直肠癌每年新发病例数达94万，每年近50万人死于结直肠癌。结直肠癌死亡居癌症死因第三位。经济发展越快的地区，结直肠癌的发病率越高。同时发病年龄多在40岁以上，男性多于女性，近年来也有年轻化的趋势。预计在我国结直肠癌发病率上升的趋势还将进一步发展，目前西方国家的发病率是万分之五至六。

结直肠癌的高危人群：30～40岁以上，有消化道症状者；有结直肠癌病史者；有结直肠癌癌前病变如腺瘤、溃疡性结肠炎、血吸虫病者；有癌家族史、家族性息肉病史、遗传性结肠病者；有盆腔放疗史者；有胆囊或阑尾切除史者。特别是对于40岁以上人群，具有下述4项中1项者即可作为结肠镜定期筛查的高危对象：免疫法粪隐血试验(FOBT)阳性；1级亲属中有结直肠癌病史；既往有癌症史或肠息肉病史；具有以下2项或2项以上者：慢性腹泻、慢性便秘、粘液血便、慢性阑尾炎和精神刺激史。

结直肠癌的病因尚不清楚，其发病因素多种多样，近年来国内外学者对其发病的危险因素进行了大量深入的研究。目前认为，遗传因素、环境因素、饮食习惯、生活方式对其发病起着协同作用，特别是上述原因长久的接触和刺激，诱发致癌基因的过度表达，及抑制抑癌基因功能性表达降低，导致抑癌和致癌的平衡失调，抑癌和致癌基因的得失能紊乱，演变、产生肠癌。

癌前病变及癌症早期诊断率低，早期诊断手段缺乏，一旦肠镜和外科检测确诊肠癌患者都是晚期。肠癌早期症状很隐蔽，容易与多种疾病相混淆，农村医学知识相对缺乏，人们易忽视相关症状，延迟就医，基层卫生人员警惕性低，可能延误诊断。目前中国早期肠癌的临床诊断率约达百分之十一至十五；超过八成患者确诊时已发展至中晚期。而如能在早期发现、治疗，术后五年生存率可达百分之九十以上。因此，开展大肠癌的早查早治不仅可提高患者生存率，更能帮助患者及其家属重拾希望。由于肠癌早期症状隐匿，容易被忽视。加之患者缺乏相关医学知识，懒于做进一步检查，以至延误了病情。例如，不少人会把肠癌的大便出血，掉以轻心地当作是痔疮出血，结果延误治疗时机。其实，如果真的是肠癌的话，等到发现大便出血时，往往已晚了；华东医院消化内镜中心每年进行3000多例肠镜检查。其中，发现大肠息肉占早期癌症的有三分之一；在所有大肠息肉中，大约有10％已经出现癌变倾向。据统计，80％的大肠癌是肠上的息肉转变成的，转变过程大约5～10年。没有便血等症状者经过治疗，其生存率要比有症状者高20％以上。早期结直肠癌的5年生存率80％以上，中期结直肠癌的5年生存率70％，而晚期结直肠癌5年生存率只有少于50％。因此，早期大肠癌的治疗效果非常理想。从细胞学角度来分析，现有的临床诊断手段检测出的肠癌都是属于晚期，已有占位性的病变，如何做到真正的早期诊断(在基因水平)，是治愈肠癌的关键。

英国杜伦大学的科学家牵头，联合英格兰东北干细胞研究所(NESCI)的科学家从700名肠癌患者提内抽取组织样本，并追踪肠癌患者的发展趋势。他们发现，那些具有干细胞标记的病人癌细胞扩散的可能性比其他患者大很多，这一干细胞标记蛋白是Lamin A蛋白。研究小组经过调查研究得出的结果就是，当这一干细胞蛋白标记被检测出来就意味着肠癌还在病程的早期，必须在外科手术治疗接受额外的化学治疗以确保癌细胞不扩散。结肠癌的病程可分为4个关键的阶段.每一阶段都需要到医院进行一系列的检验才能作出判断，这些诊断结果对准确治疗具有重要的价值。在癌症前两期里，癌细胞还没有侵入淋巴结，患者需要接受外科手术摘除癌组织。通常，很少有患者在接受外科手术治疗后在接受化学治疗。主要的原因是。很多患者年龄较大，身体很脆弱，接受化疗带来的益处还不能抵消化疗带来的副作用。所以说，现在亟待解决的一个问题是，如何判断患者接受外科手术后是否还需要接受化学疗法。

然而。新的研究发现1/3的患者表达Lamin A干细胞蛋白标记，这表明癌症病情正在恶化。病人们可能会要求医生赶紧给予化学治疗，针对癌症干细胞进行化疗，可能有助于癌症治疗和提高患者生存率。

文章的共同作者杜伦大学和英格兰东北干细胞研究所的Chirs Hutchison教授说，现在的医院使用标准的检测方法可诊断癌症患者的病程，并以次为依据判断是否要进行化疗。不过，现在我们可以更准确的诊断患者的癌症发展情况，并用于指导化学治疗。

共同作者杜伦大学和英格兰东北干洗报研究所的Stefan Przyborski博士说，我们现在的目标是开发一种预后诊断工具。不仅可用于诊断肠癌患者，还可用于常规的健康检查。

早期发现，早诊早治是提高肠癌治愈率、降低死亡率的关键。

2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告，“认为人类在抗癌大战中是失败”，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。

本发明人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另一个重要原因是，不能做到真正的早期诊断。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一概念值得认真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上已证实：一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此，在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时已经是晚期了，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到早期预测诊断。

目前对LAMIN A基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这一方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化检测应用在我国现阶段尚未见报道。根据现有的文献资料及查新报告LAMIN A基因的检测技术及检测试剂盒未见报道。

【发明内容】

本发明的目的是，提供一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测肠癌疾病药物中的应用。

本发明的再一的目的是，提供一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒。

本发明的再一的目的是，提供一种LAMIN A基因原位杂交检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒，在制备检测肠癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。LAMIN A基因序列见SEQ ID NO.1，LAMIN A基因的核苷酸序列长度是3243bp，CDS是250..2244，位于染色体1q21.2”-1q21.3”位点上。

所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

所述的非放射性标记物优选自地高辛。

其中，所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种LAMIN A基因原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

所述a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以LAMIN A基因为检测对象，合成探针是LAMIN A基因的DNA或RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供LAMIN A基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上两基因的表达量，正常人LAMIN A基因在胎儿发育高表达，成年人低表达或不表达，LAMIN A基因在肠癌晚期病人超高表达，和正常人有显著差异。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明优点在于：

1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。克服了目前对LAMIN A基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用的缺陷。

3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测肠癌发生、侵润转移动态过程，同时可检测肠癌治疗后的转移复发状况，以及用于癌症预防医学检测。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上(肠癌变前期或癌细胞增殖)检测基因(LAMIN A基因)异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床肠癌病患一个真正的早期诊断和转移侵入以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施肠癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治肠癌恶疾。

【附图说明】

图1是本发明实施例中肠癌病人LAMIN A基因过量表达图。

图2是本发明实施例中正常人LAMIN A基因表达图。

【具体实施方式】

下面结合图对本发明提供的一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的具体实施方式做详细说明。

实施例1

一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

消化液 100μl/管 1管/盒无色透明液体

保护液 100μl/管 1管/盒无色透明液体

预杂交液 1300μl/管 2管/盒无色透明液体

正义杂交液 10μl/管 1管/盒无色透明液体

反义杂交液 10μl/管 1管/盒无色透明液体

封闭液 1000μl/管 1管/盒无色透明液体

碱性磷酸酶抗体 1μl/管 1管/盒无色透明液体

显色剂A 175μl/管 1管/盒黄色液体

显色剂B 320μl/管 1管/盒无色透明液体

缓冲液I 10x 90ml/瓶 1瓶/盒浅黄色或无色透明液体

缓冲液II 10x 80ml/瓶 1瓶/盒浅黄色或无色透明液体

缓冲液III 10x 20m/瓶 3瓶/盒浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV 10x 90ml/瓶 1瓶/盒浅黄色或无色透明液体

固定液 90ml/瓶 1瓶/盒无色透明液体

阳性对照标本 6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O 5ml；

2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液 I；

3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml

50×D 3ml

10mg/ml yest t-RNA 750ul

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

0.04M EDTA 3ml

50％ formamide 15ml

4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml1×缓冲液III；

5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO₄ ^·12H₂O 360g

KCl 2g

KH₂PO₄ 2g

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

6、10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl 175.3g

柠檬酸钠 88.2g

HCl 几滴

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

7、缓冲液III：(PH7.9)

Tris 121.1g

NaCl 87.66g

HCl 60ml左右

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

8、缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl₂.6H₂O加水至1l，并高压灭菌；

9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例2

一种LAMIN A基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用

一、标本处理

1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血：淋巴细胞分离液＝1:1.5)的离心管中，2000r/min离心10 min；

2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10 min；

3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10 min；

4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3 ml血，可以做4张片子；

5、用40ml 4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1、将10×缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液I；

2、将20×缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液II；

按1:100稀释成0.2×缓冲液II；按1:200稀释成0.1×缓冲液II；

3、将10×缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液III；

4、10×缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

三、实验步骤：

1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％1封闭液(1ml封闭液加5ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

四、结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

肠癌病人LAMIN A基因过量表达图见图1。正常人LAMIN A基因表达图见图2。

地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的LAMIN A基因表达量，用来确定肠癌是否发生、或转移，临床研究表明，LAMINA基因是肠癌干细胞基因，它的表达增高表明有肠癌细胞存在，因为LAMIN A基因在正常人中低表达或不表达，如果LAMIN A基因表达增高，说明肠癌已经发生，从而获得肠癌的诊断信息。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

<130>/

<160>1

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>3243

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Claims

1.一种LAMIN A基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物；所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种；所述的非放射性标记物为地高辛；所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。