PT1516067E - Detecção de algas tóxicas - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "DETECÇÃO DE ALGAS TÓXICAS" A invenção refere-se com relação à detecção de algas tóxicas para sondas de captura específicas de sequência para a detecção de alga por hibridização selectiva de um complementar, os que se realizam em sequência de ácido nucleico que caracterizam claramente as algas em condições de hibridização as quais podem ser detectadas. Um outro objectivo da invenção é um procedimento à prova de eletroquímica para a rápida detecção in si tu de algas tóxicas em um teste líquido com a utilização pelo menos de uma sonda de captura específica para a sequência, imobilizada, Outros objectivos da invenção são um dispositivo para a realização do procedimento de prova e uma utilização do dispositivo.

Estado da Técnica A ocorrência de espécies de contaminação que formam toxinas em sistemas ecológicos marinhos são há muito tempo bem conhecidas. Depois de contacto com tais organismos ou o consumo de organismos do mar enriquecidos com toxinas, o dano fisiológico pode ocorrer com seres humanos, que pode conduzir na pior das hipóteses até à morte. Somente durante os dez a vinte anos passados a florescência de algas tóxicas que podem implicar em sérios problemas ecológicos e de saúde são observadas cada vez maís. Os sistemas ecológicos marinhos podem ser perturbados, o crescimento maciço de algas e as síndromas de veneno de algas podem aparecer. Também as consequências económicas resultam para as áreas afectadas. No entanto, o local em que aparecem as algas tóxicas muitas vezes 2 ocorre extremamente repentinamente e só temporariamente, pelo que as investigações são complicadas. Nos últimos anos um número de novas substâncias bioactivas, tóxicas foram isoladas. Uma possibilidade de análise qualitativa e quantitativa das diferentes causas marinhas para a produção de toxinas é, por isso, urgentemente necessária. No entanto, os métodos de investigação convencionais são muito demorados e difíceis, pelo que eles só podem ser executados em laboratórios de teste por pessoal especialista. Na publicação 1 "Unbekanntem Leben auf der Spur" de R. Aman et al., revista científica 45, caderno 9/92, 348-351, são descritas sondas de ADN para a identificação por bactérias não cultiváveis. Uma sonda de captura na forma de uma sequência de ADN de cordão singular liga em condições de hibridízação da sequência exactamente definidas, especificamente a uma sequência complementar de ADN ou de ARN. Para se hibridizar duas moléculas de ácido nucleico, o princípio da junção de base específica de adenina (A) e timina (T) (uracil (U) no caso de ARN) e de guanina (G) com citosina (C) é apropriado na base. Actualmente, por conseguinte, as sondas de ácido nucleico moleculares disponíveis, que reconhecem certas sequências de alvo, em particular o ARN ribossomal indicado, os anticorpos, que ligam certas moléculas de superfície de célula e/ou biomoléculas citoplãsmicas, e outros procedimentos moleculares e bioquímicos para a detecção de espécies de contaminação são de importância. Em adição, acima de tudo também as investigações genéticas moleculares contam e na construção do estabelecimento de uma em sequências de ADN que claramente caracterizam as espécies que é a taxonomia de base, que permite um reconhecimento possível de potenciais algas e bactérias micro tóxicas. Em consequência destas investigações podem ser definidas espécies, sequências de ADN específicas por classes e específicas por tipo que podem ser usadas como sondas de ADN específicas para a elevada identificação inequívoca dos respectivos microrganismos. 3 0 valor de uma sonda de ADN existe assim para a clara identificação de um organismo ou de um grupo de organismos. Cada organismo eucariótico possui uma sequência de gene de codificação para a subunidade 18S pequena e para a subunidade 28S grande no ribossoma. Esses são usados para a identificação por organismos, uma vez que a sua sequência para cada organismo é altamente específica. Não é suficiente no entanto seleccionar qualquer fragmento longo do ADN 18S ou 28S, ele deve mais ser encontrada uma secção de sequência especial, do que os critérios exigidos tais como a especificidade que corresponde claramente a uma classe, um tipo ou uma espécie. Um trabalho de desenvolvimento longo e laborioso, por isso, é necessário para a determinação de sondas moleculares que podem ser vistas como específicas. A partir do documento US 5 582 983 (Anderson, Scholin) as sondas de captura específicas para a sequência são conhecidas para a identificação de algumas espécies Alexandrium (dinophyceae). No documento US 5 958 689 (Scholin, Haydock, Cangelosi) são reveladas sondas de captura específicas de sequência para algumas algas castanhas marinhas tóxicas do tipo Pseudo-Nitzschia. Devido à diversidade de espécies de algas marinhas mencionadas pelos dois documentos e adicionalmente, pelo banco de genes NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov, Stand 23./26.01.2001) a lista de sondas dada para as algas marinhas não está no entanto até agora completa. Sondas adicionais para a detecção de algas tóxicas foram descritas na publicação de Simon, N. et. al .: "Qligonucleotide of probes for the Identification OF three algal groups by DOT blot and fluorine cent whole cell hybridisation" JOURNAL OF EUKARIOTIC MICROBIOLOGY, volume 47, número 1, Janeiro de 2000, páginas 76-84. Com a presente invenção algumas novas sondas de captura específicas para a sequência são chamadas para a detecção pelas algas que se distinguem pela sua toxicidade. Por causa de um aparecimento epidémico possível estas algas tóxicas estão em relação com os 4 novos problemas de interesse especial jã apelados no topo para as terras costeiras. A sonda de captura trabalha por meio de hibridização selectiva que tem lugar em condições de hibridização, de uma sequência complementar de ácido nucleico que caracteriza claramente as algas tóxicas, da subunidade 18S pequena de ARNr ou da subunidade 28S grande de dos ribossomas específicos de algas, que podem ser detectados. As caracterizações das sondas de captura singulares devem ser tomadas a partir do protocolo de sequência incluído.

Com a finalidade de se detectar uma molécula de ácido nucleico usada como sonda depois da hibridização com um ADN ou ARN complementar, as sondas de ácido nucleico são marcadas por meio de uma molécula repórter. Por exemplo um oligonucleótido marcado por fluorescência pode ser usado, para detectar especificamente o ARN (ARNr) ribossomal de uma espécie como sonda. Uma espécie pode, por isso, ser especificamente detectada devido à sua sequência de ARNr específica de um qualquer biótopo por exemplo através de amostras da água do mar. A partir do documento US 5 344 757 podem ser verificados os ácidos nucleicos de acordo com a sua hibridização com uma sonda de ADN marcada (hibridização de sanduíche). Além disso, é usada a sonda de ADN com a molécula repórter, por exemplo, um antigénio incompleto de esteróide, como a digoxígenina, de ligação covalente a qual pode ser detectada mais uma vez com um ajuda de um anticorpo de molécula de anti-receptor marcado. A detecção de ácidos nucleicos depois de uma hibridização com uma sonda de ADN marcada por enzima é descrita no documento US 5 867 928, pelo qual a β-galactosidase da enzima está presente directamente, por sonda de ADN ligada, e a partir da reacção com o produto desenvolvido da β-galactosidase como o substrato se torna o-nitrofeniΙ-β-D-galactopiranoside ê detectado opticamente por UV. 5 A partir do documento DE 100 32 042 AI é bem conhecido um bio sensor de um sentido eletroquímico para a regulação quantitativa da concentração de substância a analisar em líquidos. Com o procedimento de detecção subjacente ele actua em volta de um procedimento de verificação eletroquímico que usa uma sonda de captura imobilizada, específico de sequência para a hibridização selectiva de uma sequência de ácido nucleico complementar das substâncias a analisar que podem ser provadas como tendo lugar em condições de hibridização. No entanto, de acordo com o exemplo 4 das publicações mencionadas uma detecção ocorre através de uma hibridização simples, enquanto que o cordão de ADN a ser comprovado é marcado directamente com digoxigenina. Depois de ter ocorrido a hibridização do cordão singular complementar para a imobilização do cordão singular como uma sonda de captura a verificação ocorre depois da adição de um conjugado de enzima que existe a partir de um anticorpo e de uma enzima que reconhecem o marcador de digoxigenina. Através da oxidação e da redução de uns mediadores circundantes posteriormente a avaliação da medição ampérica ou da medição de ciclo voltagem tem lugar pela criação de uma dada medição de voltagem. No entanto, por causa da marcação directa da sequência de ADN a ser comprovada o procedimento de verificação eletroquímico conhecido é levado a cabo de forma relativamente dispendiosa. Além do mais ele tem só uma resposta de detecção relativamente pequena. Como objectivo do procedimento de verificação de acordo com a invenção é, por conseguinte, um claro aumento da eficiência a ser considerada com a possibilidade de verificação de algas tóxicas durante uma simplificação do procedimento simultânea.

Como solução para isto o procedimento de verificação eletroquímico reivindicado é entendido de acordo com a reivindicação 1, admitida como base de acordo com o documento DE 100 32 042 AI para os 6 procedimentos de verificação eletroquímicos como dois procedimento de treino essenciais incluídos. Por um lado uma hibridização de sanduíche tem lugar com a participação de uma sonda de detecçâo com o procedimento de verificação de acordo com a invenção. Assim a marcação directa do ADN que pode ser detectado ou o ARN da espécie de alga que pode ser provada é nula. A marcação, por exemplo, com um antigénio, é feita de uma forma fácil e geralmente preparatória na sonda de detecçâo. 0 princípio fundamental da hibridização de sanduíche está por exemplo em conexão com um procedimento de verificação através de amplificação da enzima da publicação II de B. Wicks et al.·. "A Sandwich Hybridization Assay Employing Enzyme Amplification for Determination of Specific Ribosomal RNA from Unpurified Cell Lysates" (Analytical Biochemistry 259 (1998), páginas 258-264). Ele oferece a grande vantagem em relação à hibridização simples de que também as amostras não limpas podem ser analisadas.

Além disso com um procedimento de acordo com a invenção uma terceira sonda é usada na forma de uma sonda auxiliar. Isto permite a prova em alguns tipos de espécies, por exemplo em Alexandrium tamarense, em primeiro lugar. Com outros tipos de algas o emprego de uma sonda auxiliar aumenta o limite de detecçâo de forma importante. A função de uma sonda auxiliar a qual consiste no facto de que são evitados por acumulação aos cordões de ADN ou de ARN também detectáveis do cordão é geralmente conhecida, por exemplo, a partir da publicação III de B. M. Fuchs: "Unlabeled Helper Oligonucleotides Increase the In Situ Accessibility to 16S rRNA of fluorescently Labeled Oligonucleotide Probes" (Applied and Environmental Microbiology, Agosto de 2000, páginas 3603-3607). A introdução simultânea da hibridização de sanduíche usando tanto uma sonda de detecçâo como a utilização de uma sonda auxiliar adicional com o procedimento de verificação de acordo com a invenção fornece 7 o claro aumento desejado de eficiência em relação ao procedimento de verificação eletroquímico bem conhecido.

Para a utilização eficaz das sondas de detecção e auxiliares, a sua estrutura molecular é decisiva. Também estas sondas são da mesa forma específicas, mas não tão específicas para a elevada caracterização das espécies como as sondas de captura. Elas ligam-se, por conseguinte, não à sequência de ácido nucleico que caracteriza claramente as algas que podem ser detectadas, mas às sequências relativamente próximas na vizinhança em adição ao ARNr (ou ao cordão singular de ADN, se este estiver presente) . Para a produção de sondas de detecção e auxiliares adequadas uma distância máxima permitida das duas sondas adicionais do lugar de acoplamento da sonda de captura deve ser definido. Recebem-se bons resultados, se esta distância de sequência for especificada tão pequena quanto possível com uma diferença máxima de 150 a 200 bases. Com conhecimento das sondas de captura que caracterizam as algas, como com o procedimento de verificação de acordo com a reivindicação 2 da invenção a ser utilizada, na subunídade pequena ou grande dos ribossomas é assim devido ao conhecimento da sequência inteira pelo menos dentro desta variedade de acordo com as sondas de detecção e auxiliares convenientes para as espécies de alga individuais pode facilmente ser possível. A acumulação das sondas adicionais às algas que podem ser detectadas tem lugar depois nas mesmas condições de hibridização que com a acumulação da sequência de ácido nucleico característica para a sonda de captura.

Para a realização do procedimento de verificação eletroquímico bem conhecido, do documento DE 100 32 042 Al, aí são descritos chips bio sensores de um sentido, de baixo preço e um dispositivo manual de indicação com uma unidade de potenciómetro, no qual os chips de sensor são puxados para a execução da medição. 0 chip de bio sensor 8 de um sentido comercialmente disponível está equipado com um dispositivo de três eléctrodos (eléctrodo de funcionamento, de referência e auxiliar). Ele é inserido para utilização leve sobre uma faixa de contacto no dispositivo manual. O eléctrodo de funcionamento do chip bruto é modificado dependendo da substância a ser detectada de um modo diferente. Com a finalidade de determinar a concentração de um analito, is to é pipetado num eléctrodo de funcionamento. A medição amperométrica ou ciclo voltaica efectuada com a ajuda da unidade de potenciómetro integrada no dispositivo manual, por cima do qual as voltagens de medição são dadas com antecedência. A concentração do teste de análise pode ser medida facilmente depois de um tempo muito curto de exposição do dispositivo manual que pode também ser só servido por utilizadores não treinados. Os chips de bio sensor de um sentido e um dispositivo manual com uma unidade de potenciómetro são do mesmo modo componentes do dispositivo reivindicado para a realização do procedimento eletroquímico. Com este dispositivo, um jogo completo que contém só um ou vários recipientes para o processamento do teste líquido a ser examinado tanto em ambos os chamados componentes principais como os reagentes necessários também é posto à disposição do utilizador ignorante, que com ele facilmente o procedimento de verificação de algas tóxicas no local pode ser levado a cabo. 0 jogo pode conter um ou vários bio sensores de um sentido com sondas de captura específicas de sequência na forma de sequências de base. Possível é também uma combinação de várias sondas de captura diferentes num chip de bio sensor de um sentido, com a finalidade de receber só pela utilização de um chip de sensor pelo menos uma afirmação qualitativa sobre a presença de um espectro de algas tóxicas na amostra que pode ser examinada, Actualmente a verificação de algas tóxicas é relativamente demorada por meio de 9 sondas de ácido nucleico (comparar os documentos US 5 582 983 e US 5 958 689) e necessita do conhecimento especial do especialista. Pode ser realizado só em laboratórios de teste de pessoal treinado. Com o procedimento de verificação de acordo com a invenção o gasto de tempo com o emprego de bio sensores de um sentido pré-fabricados com quantidades de sondas de captura imobilizadas assim como sondas de detecção e auxiliares apropriadas disponíveis leva só mais aproximadamente três horas e pode ser realizado também por pessoal não treinado.

Na publicação IV de M.I. Pividori et al.: "Dot-blot amperometric genosensor for detecting novel on determinant of β-lactamase resistance in Staphylcoccus aureus" (do analista, 2001, 126, páginas 1551-1557) é do mesmo modo aqui descrito um procedimento de verificação eletroquímico, no entanto com uma estrutura do sensor fundamentalmente diferente à do bio sensor de um sentido bem conhecido para o dispositivo manual. Uma hibridização de mancheamento de ponto em um diafragma é realizada, que fica estirado no sensor depois para detecção. Assim, tem lugar uma hibridização simples, indirecta. A sequência de ácido nucleico específica de alga da alga que pode ser provada é imobilizada depois de uma primeira amplificação necessária através de reacção de cadeia nuclear de polimerase (PCR) no diafragma e provado na conexão por meio de uma sonda de captura biotinilada. Além disso ê informada na publicação uma hibridização dupla com sondas diferentes.

Uma aplicação especialmente preferida do dispositivo reivindicado com a presente invenção deve ser vista na utilização como um sistema de alerta antecipado antes das algas tóxicas. Assim com a presente invenção um sistema de alerta antecipado eficaz é posto à disposição para a análise por fitoplâncton com a ênfase em 10 microorganismos marinhos tóxicos (micro algas e bactérias), uma vez que não existia até agora. Ele pode ser mantido desenvolvido economicamente e manuseado de forma extremamente simples e facilmente transportado, para que realize uma flexibilidade de elevado emprego no que se refere ao ponto de medição dopara o indivíduo, em adição, às medições de rotina. Como um resultado da integração da preparação da amostra e da hibridização surge um sistema abrangente, com o qual os elementos de ligação ou os passos de preparação em laboratórios estrangeiros são completamente nulos. Além disso o sistema de alerta antecipado ê através da tecnologia designada, no que se refere aos bio sensores usados com sondas selectivas na forma de chips de um sentido de inserção, fáceis de manusear e de forma concomitante o utilizador não treinado tem um acesso fácil. Com as sondas especiais os microrganismos marinhos perigosos podem ser capturados directamente no local também em número de células baixo com elevada sensibilidade de forma confiante e rápida. As monitorizações de rotina são assim possíveis num equipamento de mínima despesa. Com o dispositivo reivindicado na aplicação como um sistema de alerta antecipado para algas tóxicas refere-se a um produto capaz para o mercado com o qual são realizados resultados rápidos e confiantes altamente sensíveis. Por esse meio pode ser dirigido para o dinamismo da população das algas tóxicas numa base em tempo real. O dispositivo de acordo com a invenção em aplicação realçada como um sistema de alerta precoce dirigido às algas tóxicas pode ser em adição geralmente usado com estabelecimentos de pesquisa diferentes para as investigações científicas (pesquisa de bio diversidade), pode ajudar como um sistema de alerta antecipado extremamente eficaz para determinar por exemplo o comportamento de estatura da florescência de algas toxicas em tempo real antes de que estes possam povoar as costas e causar perturbações ou mesmo danos em 11 seres humanos. 0 sistema pode ser usado por exemplo por municipalidades e autoridades nas áreas do turismo, protecção do meio ambiente ou na indústria da pesca, efectivamente. Justamente por deveres de supervisão impostas de regulações legais sobre as costas e os corpos de água pode ser simplificado por uma aplicação do dispositivo de acordo com a invenção na sua conversão claramente e ser melhorado. Alám do mais uma amostra de água do mar mostrará que as algas carregam a característica, tóxica para a área de acordo com o processamento de correspondência (em circunstâncias por desenhar com a ajuda de terceiros) simplesmente num chip bio sensor de um sentido, aquele que corresponde à sequência de sondas de gotejamento. Depois de ocorrer a hibridização de sanduíche o fluxo de análise é começado por se inserir o chip bio sensor de um sentido por gotejamento. No tempo mais curto o dispositivo sem outra ajuda do exterior que custa, além do mais, tempo e caminho mesmo com a ocorrência de baixos sinais liberta uma ponta de aviso qualitativa e quantitativa segura. Assim a florescência de algas tóxicas, uma vez que elas surgiram nos últimos anos em particular em regiões costeiras, pode ser reconhecida prontamente. A prevenção de tais infecções maciças que podem entrar num tempo mais curto é somente também para áreas que vivem do turismo e/ou da economia de pesca, da significado vital. A invenção na sua forma de extensão, a sua base e expressão única com os exemplos de execução e uma figura que mostra a verificação da hibridização de sanduíche numa representação esquemática num chip de bio sensor de um sentido será explicada mais precisamente a seguir.

Na figura um desenho de detalhe aumentado de um chip bio sensor de um sentido 1 está representado na parte esquerda da figura. 0 sensor 3 com um eléctrodo de funcionamento 4, um eléctrodo de 12 referência 5 e um eléctrodo auxiliar 6 está num suporte de chip 2. 0 sensor 3 funciona por medição de ampere: entre o eléctrodo de funcionamento 4 com a sonda de captura imobilizada específica para a sequência (ADN de fase singular, ver também a parte direita da figura) e o eléctrodo de referência 5, é colocada uma dada tensão de medição; é medido depois o fluxo que flui entre o eléctrodo de funcionamento 4 e o eléctrodo auxiliar 6 no revestimento de chip e o fluxo resultante é directamente proporcional à concentração que aparece de um produto enzimático e por isso directamente proporcional à concentração das referidas algas tóxicas especiais. No exemplo de observação implementado seguinte o fluxo medido resulta da oxidação da reacção da enzima desenvolvida do produto p-aminofenol para p-iminoquinona.

Na parte direita da figura o eléctrodo de funcionamento 4 é mostrado mais uma vez aumentado para ser capaz de mostrar melhor a hibridização de sanduíche para o procedimento de detecção. A sonda de captura 7 molecular específica para a sequência é ligada sobre a biotina 8 a avidina 9. A avidina 9 é saliente na superfície do suporte de chip 2 na área do eléctrodo de funcionamento 4, para que sobre a conexão a sonda de captura 7 na superfície do chip seja imobilizada. A sequência de ácido nucleico 10 característica das algas (cordão singular de ARN ou ADN) das algas que pode ser provada foi fornecida num passo de hibridização precedente com uma conda de detecção inferior específica 11 e uma sonda auxiliar inferior específica 12. Além disso, a sonda auxiliar 12 líga-se mais perto com a sequência de ácido nucleico 10 típica das algas para tornar mais fácil a sua conexão, enquanto o desenvolvimento das estruturas secundárias nesta área pela presença da sonda auxiliar 12 são complicadas. A sonda de detecção 11 é marcada por cravação com um antigénio 13. Depois de pipetagem e de hibridização da sequência de ácido nucleico 10 característica das algas para a 13 sonda de captura 7 específica de sequência a hibridização de sanduíche está presente. A sonda auxiliar 12 trabalha tornando possível a hibridização (por exemplo com a neurotoxina Alexandrium tamarense que se forma nas algas) ou pelo menos fortificação. Por redução / oxidação (ver adicionalmente a seguir) um fluxo de corrente aparece num mediador circundante que é proporcional à concentração das sondas de captura 7 das sequências de ácido nucleico típicas das algas hibridizadas específicas para a sequência 10 e com ele a medição das algas tóxicas a ser comprovada.

No exemplo de execução precedente, a imobilização de uma sonda de captura é descrita, que é um tipo de sondas de captura no chip bio sensor de um sentido. Com uma multiplicidade de sondas de detecção imobilizadas com sequências de base especiais deve ser detectada assim uma alga tóxica e/ou uma espécie da mesma origem. Além disso, aumentou a sensibilidade do procedimento de verificação com o número das sondas de captura imobilizadas num chip de sensor. Assim os chips de sensor diferentes devem ser usados para verificações diferentes de acordo com as algas tóxicas. Possível é também a imobilização de sondas de captura diferentes para algas tóxicas diferentes num chip de sensor comum, com a finalidade de ser capaz de comprovar já numa passagem de procedimento um espectro inteiro de algas tóxicas.

Os passos de procedimento seguintes pertencem ao objectivo central para o procedimento de verificação de algas tóxicas de acordo com a presente invenção: * Preparação da amostra 0 isolamento do ARN inteiro do líquido que pode ser examinado na 14 presença de algas tóxicas para amostra, por exemplo as águas do mar, tem lugar por meio de um conjunto preparado acabado num recipiente de preparação (por exemplo da firma Qiagen (Hilden)). * Preparação dos chips de bio sensor de um sentido para a hibridização de sanduíche 0 eléctrodo de funcionamento num chip de bio sensor de um sentido como um chip em bruto é revestido primeiro com avidina. Depois a ligação da sonda de captura (captura de oligonucleõtido) é feita por biotina para o eléctrodo revestido de avidina (ver a figura). Além disso, é usual a avidina mostrar uma alta afinidade de conexão com a biotina. Os chips de bio sensor de um sentido assim preparados têm uma duração de pelo menos três meses a 4 °C. * Hibridização do ARN inteiro da amostra preparada para o chip de bio sensor de um sentido preparado

Na hibridização de base está incluído o ARN total, a sonda auxiliar(o oligonucleótido auxiliar) e a sonda de detecçãoío oligonucleõtido de detecção). A hibridização das duas sondas para as algas que podem ser provadas realiza-se na hibridização de tampão. A hibridização da sequência de ácido nucleico específica de alga para a sonda de detecção, imobilizada preparada com a sonda auxiliar e de detecção, no chip de bio sensor de um sentido tem lugar no chip de bio sensor de um sentido, depois do começo da hibridização ter sido pipetada no chip de sensor. Então uma hibridização de sanduíche está entre a sonda de captura e de detecção com a ajuda da sonda auxiliar que deve tornar mais fácil a conexão dos oligonucleótidos de captura para a sequência de alvo. *

Detecção da Hibridização de Sanduíche 15 A detecção da hibridização de sanduíche é feita por uma reacção de enzima, que da mesma forma se realiza no sensor. A enzima é ligada a um anticorpo (por exemplo, da Firma Roche Diagnostics GmbH em Mannheim) que reconhece um epítopo (as áreas de antigénio especiais que são reconhecidas especificamente por anticorpos) o qual é ligado à sonda de detecção (ver a figura). Depois da reacção de anticorpo a detecção da hibridização de sanduíche sobre a reacção de enzima ocorre depois da adição de uma mistura de substrato o qual contém o mediador e H202. Depois o chip de bio sensor de um sentido hibridizado é contactado através da inserção no dispositivo manual. 0 fluxo de electrões é medido pelo dispositivo manual durante uma reacção de oxidação. Os substratos da reacção são o H202 (peróxido de hidrogénio como meio de oxidação) e N-fenil-1, 4-fenilenodiamin-cloridrato (Mediador). A reacção do peróxido de hidrogénio à água é catalisada pela enzima "peroxidase de armoráceo (POD) que é ligada a um anticorpo que reconhece a sonda de detecção ligada perto de uma marca cavada (Digoxigenina). A peroxidase surge como uma enzima consistente das reacções, porque entra somente em estados transicionais de vida curta com os substratos. No decorrer da reacção de redox que é catalisada pela peroxidase o Mediador e o H2C>2 são modificados e os electrões vão transferi-los o que pode ser medido como uma corrente eléctrica. A corrente eléctrica medida é então a medida para a concentração existente das algas tóxicas que podem ser detectadas na amostra.

Um dispositivo na forma de um conjunto completo, que pode ser usado como sistema de alerta precoce para a verificação de algas tóxicas, na base de uma hibridização de sanduíche com a ajuda de uma sonda auxiliar pode conter os componentes seguintes: • Sugestões para a preparação da amostra 16 • Chips de bio sensor de um sentido revestidos com as sondas de captura específicas para a sequência das algas a serem comprovadas • Solução de hibridização (tampão de hibridização, sondas auxiliares e sondas de detecção em sequência vizinha à sonda de captura) • Recipiente de hibridização • Pipetas • Soluções para a detecção da hibridização de sanduíche • Dispositivo manual com aviso e unidade de potenciómetro para a detecção electroquímica das algas toxicas a serem comprovadas

Exemplo de observação da hibridização de sanduíche num chip de bio sensor de um sentido

Para detecção de algas tóxicas: Alexandrium ostenfeldii Sonda de captura (SEQ ID NO: 19): CAA CCC TTC CCA ATA GTC AGG T Sonda de detecção: GAA TCA CCA AGG TTC CAA GCA G

Sonda auxiliar a: TTA ATC TTT GAG ACA AGC ATA TGA AC

Sohdã auxiliar b: ACC TGA CTA TTC- GGA AGG GTT G

No exemplo de execução a sonda de captura específica para a sequência torna-se a detecção da alga tóxica "Alexandrium ostenfeldii" de acordo com a utilização da Sequência No. 19. A sonda de detecção necessária para a hibridização de sanduíche está numa distância de espaçador de um máximo de 200 bases que confinam a sequência de ADN de cordão singular e/ou de ARN complementar específico para algas e apresenta no exemplo de

observação seleccíonado a sequência de alvo mostrada em cima. A sonda auxiliar que suporta a hibridização do ARN de algas complementar específico para algas ou o ADN de cordão singular para a sonda de captura está do mesmo modo numa área de distância no máximo de 200 bases em adição e pode mostrar alternativamente a 17 sequência baseada indicada no ponto a ou b. Ambas as sondas auxiliares cumprem a tarefa que lhes é colocada do suporte da hibridização. Neste ponto seria indicado ao facto, que em particular com algas tóxicas da espécie "Alexandrium tamarense" (a sonda de captura de acordo com a Sequência No. 5, 6 ou 18) a utilização da sonda auxiliar geralmente só permite a hibridização. Estas espécies de algas altamente tóxicas assinam o desenvolvimento de neuro toxinas com responsabilidade e jã foram intensamente examinadas na pesquisa. A. Revestimento dos bio sensores de um sentido com Avidina: 1. Os bio sensores de um sentido (nos sensores curtos seguintes) a serem humedecidos com 50 pL de tampão de carbonato, (pH) 9,6. O tampão de carbonato é sugado por meio de uma bomba de vácuo. 2. Incubação dos sensores com 2 pL de Avidina em tampão de carbonato, pH 9,6 [200 pg/mL] durante pelo menos 4,5 horas a 4 °C (no refrigerador). 3. A avidina excedente é lavada com o PBS (pH 7,6), além do mais os sensores são mergulhados várias vezes numa placa de Petri com PBS (pH 7,6). Os sensores são secos por se sugar o líquido com uma bomba de vácuo. 4. Na conexão com ele os sensores com 2 0 pL de 3 % de caseína são bloqueados no PBS (pH 7,6) durante 1 hora com RT. 5. A caseína é lavada com o PBS (pH 7,6). 6. Os sensores revestidos com avidina podem ser armazenados depois de uma incubação com 2 % de Trealose em PBS (pH 7,6) pelo menos 18 durante 3 meses no refrigerador. Os sensores com 15 pL da solução de Trealose ficam armazenados a 37 °C na incubadora quente até vaporização do líquido incubado. Antes de uma outra utilização a Trealose seca é lavada com o PBS (pH 7,6). B. A imobilização da sonda de captura biotinilada nos bio sensores de um sentido revestidos com avidina 1. Os sensores são incubados durante 30 minutos com 2 pL da sonda de captura biotinilada (sonda de ADN) [0,1 pmol / pL] em "tampão de gota". 2. Os sensores são revestidos com 50 pL 1 x tampão de hibridização. 0 tampão de hibridização é sugado directamente na conexão. 3. Os sensores revestidos por ADN podem ser armazenados depois de uma incubação com 2 % de Trealose em PBS (pH 7,6) do mesmo modo que pelo menos 3 meses no refrigerador. Os sensores com 15 pL da solução de Trealose ficam incubados a 37 °C na incubadora quente até vaporização do líquido incubado. Antes de uma outra utilização a Trealose seca é lavada com o PBS (pH 7,6). C. Hibridização de sanduíche de sonda de captura imobilizada, ARNr da espécie de alga a ser comprovada e sonda de detecção marcada com digoxigenina 1. O início da hibridização típica cobre 14 pL e contêm 1 x tampão de hibridização, 0,25 pg/pL de ADN de esperma de arenque, 0,1 pmol / pL de sonda auxiliar, 0,1 pmol / pL de sonda de detecção cavada marcada e 6,5 pL de ARN (~ 500 ng / pL - 700 ng / pL) da espécie de alga que pode ser provada, o volume que falta é cheio com a água. 19 2. 0 começo da hibridização é aquecido durante 4 minutos a94 "C e imediatamente arrefecida posteriormente (metal de bloqueio -20 °C). Por sensor são aplicados 2 pL do começo da hibridização. 3. Ele fica incubado durante 30 minutos a 46 °C numa câmara húmida saturada por vapor. A câmara húmida deveria ter no início da hibridização jã uma temperatura de 4 6 °C e, por isso, deve ser colocada directamente no início do procedimento no forno de hibridização. 4. Depois de expirar o período de incubação a 46 °C os sensores são arrefecidos durante 5 minutos à temperatura ambiente. D. Detecção 1. Depois da hibridização os sensores com o tampão de POP (pH 6,45) são lavados. 2. Uma incubação dos sensores com 1,5 pL de POD Anti-cava ([7,5 U/mL] em PBSBT) segue durante 30 minutos à temperatura ambiente na câmara de incubação saturada por vapor. 3. Depois da incubação os sensores com o tampão POP (pH 6,45) são lavados. 4. Depois os sensores são secos e colocados para a realização da medição no dispositivo manual. A medição ocorre depois da adição de 20 pL da substrato de POD. Além disso, a medição deve seguir directamente o passo de lavagem.

Deve ser seguido: 20 * Os passos únicos devem ser executados rapidamente sucessivamente.

Os sensores são lavados por se mergulharem num prato de Petri cheio com o respectivo tampão de lavagem.

Tampão e soluções: 1. Tampão de carbonato, pH 9,6

Concentração NaHC03 50 mM O tampão é filtrado estéril por um filtro de membrana de 0,22 pm (filtro de resolução de seringa). 2. 10 x PBS (0,5 M de NaH2P04*H20, 1,54 M de NaCl, pH 7,4)

Concentração NaH2P04*H20 0,5 M NaCl, pH 7,4 1,54 M

Depois da diluição de 10 x PBS a 1 x PBS o pH deve ser novamente examinado. 3. "Tampão de gota"

Concentração NaCl 0,3 M Tris, pH 7,6 0,1 M O tampão fica na ligação da autoclave. 21 4. 4 x Tampão de hibridização

Concentração NaCl 0,3 M Tris, pH 8,0 00 o a s SDS 0,04 %

Antes da utilização o tampão deve ser autoclaviado. 5. 10 x Tampão de POP, pH 6,45

Concentração NaH2P04*H20 0,5 M NaCl, pH 6,45 1 M A solução fica na ligação da autoclave. 6. PBS-BT, pH 7,4

Concentração PBS 1 x BSA 0,1 % [p/v] TWEEN 20, pH 7,4 0,05 % [v/v] 0 tampão é filtrado estéril por um filtro de membrana de 0,22 μτη (filtro de resolução de seringa)

7. Substrato de POD 1,1 mg de N-fenil-1,4-fenilenodiamin-cloridrato (Mediador ADPA de Aminodifenilamina) é dissolvido em 110 pL de EtOH. Esta solução é 22 misturada com 25 0 pL de 100 mM de H202 (concentração de 12 pL de H202 + 988 μL de H20) e ê cheia com 1 x tampão de POP ípH 6,45) até 25 mL, Isto corresponde a 1 mM de H202 e 0,2 mM de ADPA. Lista de símbolos de referência 1 chip bio sensor de um sentido 2 portador de chip 3 sensor 4 eléctrodo de funcionamento 5 eléctrodo de referência 6 eléctrodo auxiliar 7 sonda de captura específica de sequência 8 biotina 9 avidina 10 sequência de ácido nucleico específica de sequência da alga que pode ser provada 11 sonda de detecção 12 sonda auxiliar 13 antigénio 14 enzima 15 anticorpo

Protocolo de sequência

<110> Doação do Instituto de Alfred Wegener para a exploração polar e do mar, Columbusstrasse, 27568 Bremerhaven, Alemanha <120> Detecção de algas tóxicas <130> AWI 01/0602DE <160> 20 <210> 1 <211> 18 23

<212> ADN <213> hetero carga, toxicidade <4 00> 1

acgacttcac cttcctct 18 <210> 2 <211> 18 <212> ADN <213> Priranésio glOlA, toxicidade <400> 2

tgctcgccaa cgaggtgt 18 <210> 3 <211> 18 <212> ADN <213> Primnésio gl02B, toxicidade <400> 3

aagaagtgct cgccaacg 18 <210> 4 <211> 18 <212> ADN <213> Pseudo Nitzschia <4Q0> 4

cagtacagcg caatcact 18 <21Q> 5 <211> 18 <212> ADN tamarense/ <213> complexo de espécies de Alexandrium fundyense/catenella, toxicidade <400> 5

ttcaaggcca aacacctg 18 <210> 6 <211> 18 <212> ADN <213> Alexandrium tamarense (América do Norte) <4Q0> 6

aacactccca ccaagcaa 18 <210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> complexo de espécies de Gymnodinium mikimotoi <400> 7

ttccgggcaa ggtcgaaa 18 <210> 8 <211> 18 <212> ADN <213> Prorocentrum lima <400> 8

ccttctgcta agtcgggt 18 <210> 9 <211> 18 <212> ADN <213> Prorocentrum lima <400> 9

ctctagcatt tccacggg 18 <210> 10 <211> 18 <212> ADN <213> espécie de Prorocentrum lima <400> 10

acaccccaat tgcctcgt 18 <210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> grupo da espécie de Prorocentrum lima 25

gcaatcagaa cccatcct 18 <210> 12 <211> 18 <212> ADN <213> Alexandrium ostenfeldii (G + 15) <400> 12 caccaaggtt ccaagcag 18 <210> 13 <211> 18 <212> ADN <213> Alexandrium ostenfeldii (D) <400> 13 tccargtagc aatcgacc 18 <210> 14 <211> 17 <212> ADN

<213> Pseudo nitzschía australis <4 00 > 14 aacgtcgttc cgccaat 17 <210> 15 <211> 18 <212> ADN <213> Pseudo nitzschía de muiti série <4Q0> 15 cgccgccaaa aggcatgc 18 <210> 16 <211> 18 <212> ADN <213> Pseudo nitzschía pungens <400> 16 gggcaccctc agtacgac 18 <210> 17 26

<211> 18 c212> ADN <213? Alexandrium minutum <4 00> 17

tccaggcaag gttgcaaa 18 <210> 18 <211> 23 <212> ADN <213> Alexandrium tamarense <400> 18 tgcacctctg ttggtrrtac att (R=A/G) 23 <210> 19 <211> 22 <212 > ADN <213> Alexandrium ostenfeldii (captura) <400> 19 caacccttcc caatagtcag gt 22

Lisboa, 5 de Abril de 2007

Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de detecção electroquímica para detecção rápida no local de algas tóxicas numa amostra líquida por se utilizar pelo menos uma sonda de captura específica de sequência, imobilizada para hibridização que é selectiva sob condições de hibridização da sequência de ácido nucleico complementar que unicamente caracteriza as algas a serem detectadas a partir do ARN da subunidade 18S pequena ou da subunidade 28S grande do ribossoma específico de alga, pelo menos uma sonda auxiliar e pelo menos uma sonda de detecção, ambas as quais estão localizadas perto da sonda de captura específica de sequência com a distância de sequência tão pequena quanto possível, com uma diferença máxima de 150 a 200 bases, que compreende os passos de processo principais: Processar a amostra líquida a ser analisada para libertar o ARN total de todas as algas contidas na amostra, Criar um grupo de hibridização por se misturar o ARN total assim libertado com a sonda auxiliar e a sonda de detecção a qual é marcada com um antigénio, num tampão de hibridização para hibridização a sequências de ácido nucleico completares do ARN do ribossoma específico de algas das algas a serem detectadas na amostra, Humidificar a sonda de captura específica de sequência com o grupo de hibridização para hibridização de sanduíche da sequência de ácido nucleico que unicamente caracteriza as algas a serem detectadas, pelo que a sonda auxiliar permite ou aumenta a hibridização de sanduíche e a sonda de detecção marca a sequência de ácido nucleico a ser detectada, 2 Humidificar a sonda de captura específica de sequência depois de hibridização de sanduíche com sucesso com um conjugado de enzima com um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio da sonda de detecção e com uma enzima que catalisa a reacção de detecção, Enxaguar o conjugado da enzima não ligada, Detecção amperométrica ou ciclovoltaica da reacção da enzima que ocorre em hibridização de sanduíche com sucesso da alga a ser detectada a uma voltagem de medição pré-seleccionada.

2. Método de detecção electroquímica de acordo com a reivindicação 1 com a utilização pelo menos de uma sonda de captura específica de sequência de acordo com a tabela seguinte: Nome Específico para ... *) Base SEQ ID NO: Classe HETEROOl Heteroconta 18S ACGACTTCACCTTCCTCT 1 Género PRYMGLQ1 A Prymnesium 18S TGCTTCGCCAACGAGGTGT 2 PRYMGL02 B Prymnesium 18S AAGAAGTGCTCGCCAACG

3 PSEUDONIT ZSCHIA Pseudo-nitzschia 18S CAGTACAGCGCAATCACT

4 Espécie ATAM01 complexo de espécies de Alexandrium tamarense/ fundyense/catenella 18S TTCAAGGCCAAACACCTG

5 ATNA02 Alexandrium tamarense (América do Norte) 28S AACACTCCACCAAGCAA

6 GMIKI01 complexo de espécies de Gymnodinium mikimctoi 18S TTCCGGGCAAGGTCGAAA

7 PLIMA Prorocentrum lima 18S CCTTCTGCTAAGTCGGGT 8 3 PLIMA Prorocentrum lima 18S CTCTAGCATTTCCACGGG 9 PLIMA Espécie de Prorocentrum lima 28S ACACCCCAATTGCCTCGT 10 Proro de grupo 01 grupo da espécie de Prorocentrum lima 28S GCAATCAGAACCCATCCT 11 AOST18S G + 15 Alexandrium ostenfeldii 18S CAC CAAGGTTCCAAGCAG 12 AOST 18S D Alexandrium ostenfeldii 18S TCCARGTAGCAATCGACC 13 PSNAUS A-B Pseudo-nitzschia australis 18S AACGTCGTTCCGCCAAT 14 PSNMUL A+4 Pseudo-nitzschia de multi-série 18S CGCCGCCAAAAGGCATGC 15 PSNPUN A-12 Pseudo-nitzschia pungens 18S GGGCACCCTCAGTACGAC 16 AMIN D+l Alexandrium minutum 18S TCCAGGCAAGGTTGCAAA 17 Alex Relax Alexandrium tamarense 18S TGCAC CTCTGTTGGTRRTACATT (R=A/G) 18 AOST de captura Alexandrium ostenfeldii 18S CAACCCTTCCCAATAGTCAGGT 19 *) Subunidade do ribossoma específico de algas na qual a sequência de ácido nucleíco de caracterização ocorre Lisboa, 5 de Abril de 2007