CN113015814A

CN113015814A - 检测串联重复的方法

Info

Publication number: CN113015814A
Application number: CN201980052906.9A
Authority: CN
Inventors: 潘泰利斯·乔治乌; 余灵珊; 肯尼·马尔帕蒂达·卡德纳斯; 马修·C·费希尔; 耶苏斯·罗德里格兹·曼萨诺; 尼古拉斯·莫瑟
Original assignee: Imperial College of Science Technology and Medicine
Current assignee: Imperial Institute Of Technology Innovation Co ltd
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2019-06-07
Publication date: 2021-06-22
Also published as: EP3802868A1; GB201809450D0; WO2019234252A1; US20210172030A1

Abstract

本申请涉及使用引物在等温条件下检测核酸序列中的串联重复的方法。

Description

检测串联重复的方法

可以针对烟曲霉(Aspergillus fumigatus)真菌举例说明本发明的有效性，烟曲霉是全球范围存在的腐生物，由于其产生大量的风媒分生孢子而非常普遍存在于空气中。在临床上，烟曲霉引起一系列呼吸道感染和侵袭性感染，范围从哮喘样症状到免疫受损宿主中的侵袭性曲霉病。在临床上，三唑类抗真菌药因其在破坏膜结构和真菌细胞运输中的高效作用而被广泛用于控制这种真菌感染。但是，杀真菌剂也是利用固醇脱甲基化抑制剂(DMI)化合物控制农业真菌病害的重要手段，该固醇脱甲基化抑制剂(DMI)化合物是一类包括三唑类和咪唑类的化学物质，代表了全世界使用的最大的杀真菌剂种类。在环境方面，不仅在感染植物的真菌病原体中，而且栖于腐生土壤的烟曲霉中都观察到了对DMI的广泛耐药性的演变。该观察结果提示，三唑类在农业中的应用不仅在靶标作物病原体中而且在环境中共同存在并包括那些可能有机会感染人类的那些真菌物种中导致了选择出抗真菌性。

已知长期使用唑类疗法来治疗临床烟曲霉感染患者导致耐药性的从头演变(denovo evolution)(Snelders等人,Future Microbiology,6(3),335–347,2011)。但是，先前未用医用唑类药物治疗的未用药患者(

patient)越来越多地被诊断为耐多唑性感染，导致以下假设：这些患者可能因其暴露于环境中的农业DMI而染上了对唑类演变出耐药性的感染因子(infectious agent)(Snelders等人,Applied and EnvironmentalMicrobiology,75(12),4053–4057,2009)。烟曲霉的耐唑性(azole resistance)与编码药物靶标羊毛甾醇14-α-脱甲基酶的cyp51A基因的启动子内的串联重复和突变有关。具体而言，在表现为感染耐唑性烟曲霉的患者中，越来越多地发现以cyp51A中的34bp串联重复(TR34)和亮氨酸-组氨酸取代(L98H)为特征的唑类耐药机制，而在最近的一些研究中，超过90％的耐三唑性烟曲霉感染患者携带TR34/L98H等位基因(Rivero-Menedez等人,Journalof Fungi,2(3),21,2016；Verweij等人,Clinical Infectious Diseases,62(3),362–368,2016)。重要的是，具有TR34/L98H组合的烟曲霉还广泛存在于环境样本中，包括土壤、堆肥、植物球茎和空气中(Rivero-Menedez等人,2016；Verweij等人,2016；Chowdhary等人,Journal of Antimicrobial Chemotherapy,67(2),362–366,2013)。使用高辨识度的遗传学和基因组学方法进行的流行病学研究显示，在自然界和临床感染中均存在含有TR34/L98H等位基因的密切相关的烟曲霉基因型，这使人们更加怀疑由于DMI抗真菌剂的双重使用，自然界中这种真菌的耐唑性分离株在临床上引起耐药性感染(Snelders等人,2009)。因此，迫切需要在临床和现场情况下检测和管理耐多唑性烟曲霉的快速诊断方法。通常使用常规的诊断方法(例如培养、显微镜检查和放射学)来检测由烟曲霉引起的感染(De Pauw等人,C.Clinical Infectious Diseases,46(12),1813–1821,2008)。但是，这些方法需要几天才能观察到真菌，仅具有中等特异性，并且需要进一步测试才能检测出耐唑性等位基因(Cuenca-Estrella等人,Journal of Antimicrobial Chemotherapy,66(SUPPL.1).2011)。已经开发了基于抗体的测试来快速检测感染，但是尚不能确定耐唑性的发生(Miceli&Maertens,Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine,36(5),650–661,2015；White等人,Journal of Clinical Microbiology,51(5),1510–1516,2013)。基于PCR的分子方法由于其与传统方法相比灵敏度和特异性更高并且还能够检测耐唑性等位基因的存在而得到开发(Costa等人,Journal of Clinical Microbiology,40(6),2224–2227,2002；Donnelly,Clinical Infectious Diseases,42(4),487–489,2006；Kawazu等人,Journal of Clinical Microbiology,42(6),2733–2741,2004；Loeffler等人,TheJournal of Infectious Diseases,185(8),1203–1206,2002；Marr&Leisenring,ClinicalInfectious Diseases,41(S6),S381–S386,2005；Pickering等人,Journal of ClinicalMicrobiology,43(12),5957–5962,2005；Raad等人,Cancer,94(4),1032–1036,2002；White等人,Clinical Infectious Diseases,61(8),1293–1303,2015)。但是，基于PCR的检测需要实验室设备和经验丰富的人员。耐唑性的持续增加，加上缺乏快速诊断方法，引起了对适用于现场和临床背景下简单、快速、准确诊断抗真菌突变的需求。

作为快速、灵敏且简单的检测病原体的技术，已开发了环介导的等温扩增(LAMP)。该技术在等温条件下以高度特异性、有效且快速的方式扩增DNA(Notomi等人,NucleicAcids Research,28(12),E63,2000)。该技术基于自动循环和链置换DNA合成的原理，使用DNA聚合酶和识别靶标DNA模板上的六个不同区域的特别设计的引物集进行。LAMP反应速度的进一步提高是引入了两个额外的环引物(Nagamine等人,Molecular and CellularProbes,16(3),223–229,2002)。LAMP产物可以通过不同的方式可视化，包括测量浊度、pH敏感的染料和金属指示剂。因此，该技术具有很大的早期诊断潜力，并且可以利用芯片实验室技术促进对即时(point-of-care)设备的开发。

发明内容

本文描述了一种检测串联重复的新方法。该新方法可以涉及LAMP化学的应用，这对于快速检测直接的长串联重复特别有效。本文描述的方法可称为TR-LAMP，实现引物设计以更广泛地检测串联重复。

发明人还设计了靶向烟曲霉的显性耐三唑性基因型的特异性LAMP引物，并证明本文公开的方法对检测最普遍的cyp51A突变TR34具有高分析灵敏度和特异性。由于可靠性高和识别快速，TR34-LAMP测定可以用作侵袭性曲霉病(IA)感染的新型诊断法，并且可以与即时诊断平台结合。

根据第一方面，本发明提供了一种检测核酸序列中的串联重复的方法。

根据第二方面，本发明提供了一种检测生物体中的耐药性的方法，该方法包括检测核酸序列中的串联重复。

根据第三方面，本发明提供了一种诊断传染病或耐药性感染的方法，该方法包括检测核酸序列中的串联重复。

根据第四方面，本发明提供了一种治疗有需要的对象的传染病或耐药性感染的方法，该方法包括检测核酸序列中的串联重复。

根据第五方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含在本发明的第一方面至第五方面中使用的引物。

根据第六方面，本发明提供了一种反应混合物，其包含在液体介质中的根据本发明第六方面的试剂盒的组分。

参考如下所示的若干附图：

图1-用于TR-LAMP测定的工作流程。(A)选择耐药性相关基因；(B)在NCBI核苷酸数据库中搜索同源性并建立比对。该比对用作引物设计的参考(LAMP引物设计网站：https://primerexplorer.jp/e/)；(C)手动设计针对特定串联重复检测的FIP或BIP；(D)目视检测和阈值调整，得出二进制结果。

图2-cyp51A基因的示意图，显示了用于扩增串联重复区的TR-LAMP引物的位置和组成。正向外部引物(F3)、反向外部引物(B3)、正向内部引物FIP(F1c+F2)、反向内部引物BIP(B1c+B2)、环正向(LF)和环反向(LB)。

图3-通过使用TR34-LAMP测定来检测TR34串联重复区的示意图。显示了TR34(EU626235.1)、TR46(MF070878.1)和野生型(KJ210331.1)的部分序列。标记的框表示TR34重复单元1(TR34-1)，另一个标记的框表示TR34重复单元2(TR34-2)，另一个标记的框表示TR46重复单元。突出显示了三个序列之间的相似性水平并将其进行分类：高度保守(黑色)、突变体之间保守(灰色)以及仅在序列之一中呈现(白色)。黑线显示了TR34-LAMP测定中使用的FIP引物(F1c+F2)。由于在F2的3'端引入了错配(小写字母表示的核苷酸)，我们开发了一步是/否反应(one step yes/no reaction)，从而通过使用一个LAMP引物集将TR34与其他菌株区分开来。打勾表示阳性反应(F2连接到靶标上并引发反应)，而打叉表示阴性反应。黑色短竖线表示引物与模板DNA完全匹配。

图4-实时TR34-LAMP测定扩增图和标准曲线。(a)检测不同浓度的合成TR34 DNA。低至10个拷贝/反应在22分钟内检测到。(b)TR34-LAMP测定的标准曲线，由TR34合成DNA的连续10倍稀释液之间的扩增图生成。每个浓度使用三个重复样。包括保持阴性30分钟的阴性对照。误差棒表示标准偏差。

图5-特异性TR34-LAMP测定。(a)通过比色LAMP方法使TR34-LAMP产物可视化。(b)通过调整iPhone 6相机拍摄的照片的阈值获得的二进制结果。(c)评估基于TR34-LAMP产物的凝胶电泳分析。(d)限制酶消化阳性TR34-LAMP产物。

图6-检测TR46串联重复区的示意图。显示了TR34(EU626235.1)、TR46(MF070878.1)和野生型(KJ210331.1)的部分序列。标记的框表示TR34重复单元(TR34)，另一个标记的框表示TR46重复单元(TR46)。突出了三个序列之间的相似性水平并将其进行分类：高度保守(黑色)、突变体之间保守(灰色)、仅在序列之一中呈现(白色)、空位(短划线)。由于在TR46和TR34之间的未对齐区引入了错配，我们开发了一步是/否反应，从而通过使用一个LAMP引物集将TR46突变体与其他菌株区分开来。突出显示模板和引物之间未对齐区。打勾表示阳性反应(F2连接到靶标上并引发反应)，而打叉表示阴性反应。黑色短竖线表示引物与模板DNA完全匹配。

图7-从TR46 DNA模板的连续10倍稀释液之间的扩增图生成的TR46-LAMP测定的标准曲线。每个浓度使用三个重复样。包括保持阴性30分钟的阴性对照。误差棒表示标准偏差。

图8-检测不同浓度的TR46 DNA模板。低至10个拷贝/反应在25分钟内检测到。

图9-MAT型PCR产物电泳可视化图像，证实了在不同条件(有或没有60℃孵育步骤)下DUB41(TR34)、DUB48(TR46)和47-236(WT)的扩增。还测试了阴性对照、水和阳性对照(已知的纯净烟曲霉gDNA)。

图10-未修改的CMOS技术和等效宏观模型中ISFET的结构。

图11-使用基于CMOS的芯片实验室平台进行核酸扩增的实验装置。集成了78×56传感器阵列的芯片安装在暗盒上，使用丙烯酸歧管作为反应室。

图12-从平均传感器输出中提取扩增曲线的处理算法。

图13-使用pH敏感的TR-LAMP测定进行芯片上扩增和检测。绘制的数据表示从集成电路获得的TR34突变体样本(C287，C288和Hyde42)、TR46突变体(C87和C93)和非模板对照(阴性)的信号。(A)TR34、TR46突变体和非模板对照的芯片上pH敏感的TR34-LAMP扩增曲线。(B)TR34、TR46突变体和非模板对照的芯片上pH敏感的TR46-LAMP扩增曲线。neg表示非模板对照。

具体实施方式

根据第一方面，本发明提供了一种检测核酸序列中的串联重复的方法，其中串联重复包含两个或更多个重复单元，两个或更多个重复单元中的每个重复单元包括至少两个碱基对，其中所述方法包括：

(a)在等温条件和严格条件下，在反应混合物中从样本扩增核酸序列，该反应混合物包含：

(i)核酸序列，

(ii)核酸聚合酶，

(iii)核苷三磷酸混合物，

(iv)正向内部引物(FIP)，和

(v)反向内部引物(BIP)，

其中FIP或BIP退火至靶区域，该靶区域包含来自两个重复单元中的每个重复单元的一个或多个核苷酸，其中所述两个重复单元是相邻的，和

(b)检测扩增的核酸序列，其中检测到扩增的核酸序列指示串联重复的存在。

核酸扩增在等温条件下发生。因此，该方法还可包括将反应混合物保持在等温条件的步骤。与传统的聚合酶链反应(PCR)相比，等温条件可以是用于DNA扩增的任何合适的条件，而不需要在扩增反应中针对不同步骤在不同温度之间循环。可以使用实验室水浴或加热块维持等温条件。选择的温度可以为30℃至95℃。温度可以为50℃至70℃。温度可以为约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃。温度可以为60℃至65℃。例如，温度可以为约63℃。

扩增步骤的持续时间可以为约1至150分钟。扩增步骤的持续时间可以为约5至60分钟。扩增步骤的持续时间可以为约20至40分钟。扩增步骤的持续时间可以为约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40分钟。例如，扩增步骤可以为约30分钟。扩增步骤可以至少为约30分钟。扩增步骤可以为约35分钟。

可以将如上定义的扩增步骤的任何持续时间与如上定义的任何反应温度组合，只要反应条件允许扩增并且可以检测到扩增产物。可以通过与阳性和/或阴性对照进行比较来优化温度和持续时间。例如，可以选择反应温度和持续时间以使允许在阳性对照中和/或用来自样本的核酸进行产物的可检测扩增，而不允许在另一个样本和/或阴性对照中进行可检测扩增。

扩增可包括退火步骤和延伸步骤。因此，扩增可包括使FIP和BIP退火至核酸序列并延伸FIP和BIP以产生扩增的核酸序列。扩增可包括包含退火步骤和延伸步骤的起始阶段。起始阶段可以包括FIP退火到核酸序列F2c区的F2区和BIP退火到核酸序列B2c区的B2区。扩增还可包括使额外引物退火至核酸序列，如下文进一步描述。

扩增可以是环介导的等温扩增(LAMP)。由于该方法涉及检测串联重复的改良LAMP测定，因此该方法可称为“串联重复LAMP”或TR-LAMP。

当扩增为LAMP时，温度可能为50℃至70℃。当扩增为LAMP时，温度可能为60℃至65℃。

当扩增为LAMP时，扩增步骤可以为约5至60分钟。

当核酸序列是RNA或cDNA时，扩增可以是逆转录环介导的等温扩增(RT-LAMP)。由于该方法涉及检测串联重复的改良LAMP测定，因此当扩增为RT-LAMP时，该方法可称为“串联重复RT-LAMP”或TR-RT-LAMP。

可以通过任何合适的手段进行检测。例如，通过测量浊度，通过使用pH敏感的染料，使用核酸嵌入剂和通过使用金属指示剂，来检测扩增产物。反应混合物可包含检测剂。检测剂可以是pH敏感的染料或金属指示剂或核酸嵌入剂。

检测可以是比色检测。比色检测可以通过肉眼或手机进行。检测可以是与肉眼或手机兼容的比色检测。手机可以使用相机和/或应用程序来检测扩增。该应用程序可以是被设计用于本发明的方法的应用程序。该应用程序可能由第三方提供。该应用程序可能是手机随附的软件。该应用程序可以是图像处理应用程序。手机或其他合适的相机设备可以捕获图像以进行检测。然后可以在另一台设备或同一设备上处理图像。

检测可以是基于pH的检测。例如，反应混合物可以包含pH敏感的指示剂，例如染料。pH敏感的指示剂可以是酚红pH指示剂。酚红pH指示剂可允许对扩增反应过程中的质子积累进行目视检测，使溶液颜色从粉红色(阴性)变为黄色(阳性)。

可以通过一个或多个离子传感器进行检测。例如，可以通过一个或多个基于半导体的离子传感器进行检测。在即时情况下使用基于半导体的离子传感器进行检测可能特别有利。离子传感器(尤其是基于半导体的离子传感器，例如离子敏感场效应晶体管(ISFET))的使用为化学感测提供了一种便宜且易于使用的诊断平台，这适用于即时应用。离子敏感场效应晶体管(ISFET)是化学敏感晶体管。IFSET可用于测量溶液中的离子浓度。这样的传感器的阵列可以创建用于化学感测的平台。因此，可以根据英国申请第1809420.1号或国际申请第PCT/GB2019/051597号的方法执行检测，其全部内容通过引用在此并入。

可以通过一个或多个基于互补金属氧化物半导体(CMOS)的离子传感器进行检测。因此，可以通过基于CMOS的检测系统进行检测。基于CMOS的检测系统采用无标记的扩增偶联检测方法来测量核苷酸掺入过程中释放的氢离子，而不是依靠诸如荧光染料的间接测量。由于不需要庞大的设备，因此CMOS技术降低了测定的成本和仪器尺寸/价格。此外，CMOS技术每个微芯片集成了数千个传感器，从而使机器学习和分析方法成为可能，以减少反应报阳时间(time-to-positive reaction)，提高灵敏度/特异性，并增强定量。可以结合英国申请第1809418.5号或国际申请第PCT/EP2019/065039号的方法来实现这些效果，其全部内容通过引用在此并入。

关于机器学习领域，英国专利申请第PCT/EP2019/065039号或国际申请第PCT/EP2019/065039号的方法采取多维视图，结合多个特征(例如线性特征)，以便利用现有方法背后的信息和原理并在其基础上改进来分析实时扩增数据。公开的方法涉及两个新概念：多维标准曲线及其“原点”(特征空间)。它们共同扩展了标准曲线的功能，允许同时进行绝对定量、离群点检测并提供对扩增动力学的洞察力。本公开描述了一种通用方法，该方法首次展示了多维标准曲线，从而增加了数据分析的自由度，从而能够揭示现有qPCR仪器(例如来自Roche Life Science的LightCycler 96System)获得的实时扩增数据中的趋势和模式。据信，本公开重新定义了分析实时核酸扩增数据的基础，并在核酸研究领域中实现了新的应用。

提供了一种定量包含靶核酸的样本的方法，该方法包括：为多个靶标浓度中的每个靶标浓度获得第一实时扩增数据集；从第一数据集中提取多个N个特征，其中每个特征使第一数据集与靶标的浓度相关；通过特征对在N维空间中定义的多个点拟合成线，每个点与多个靶标浓度中的一个相关，其中该线定义了核酸靶标特有的多维标准曲线，所述多维标准曲线可用于定量靶标浓度。

可选地，该方法还包括：获得与未知样本相关的第二实时扩增数据；从第二数据中提取相应的多个N个特征；和通过相应的多个N个特征，计算N维空间中的线与N维空间中定义的点的距离度量。可选地，该方法还包括：根据距离度量来计算扩增曲线之间的相似性度量，该相似性度量可以可选地用于识别离群点或对靶标进行分类。可选地，每个特征不同于其他特征中的每个特征，并且可选地其中每个特征与靶标的浓度线性相关，并且可选地其中特征的一个或多个特征包括C_t、C_y和-log₁₀(F₀)中的一个或多个。可选地，该方法进一步包括将N维空间中的线映射到与靶标浓度相关的一维函数M₀，并且可选地其中一维函数与靶标浓度线性相关，和/或可选地其中一维函数定义了用于定量靶标浓度的标准曲线。可选地，映射使用降维技术来执行，并且可选地，其中降维技术包括以下中的至少一种：主成分分析；随机样本一致性；偏最小二乘回归；和投影到单一特征上。可选地，映射包括对特征中的每个特征应用各自的标量特征权重，并且可选地，其中各自的特征权重由优化目标函数的优化算法确定，并且可选地，其中目标函数被布置以用于优化量化性能。可选地，计算距离度量包括将N维空间中的点投影到与N维空间中的线垂直的平面上，并且可选地，其中计算距离度量还包括基于投影点计算欧氏距离(Euclidean distance)和/或马氏距离(Mahalanobis distance)。可选地，该方法还包括基于距离度量来计算相似性度量，并且可选地，其中，计算相似性度量包括将阈值应用于相似性度量。可选地，该方法还包括基于相似性度量来确定N维空间中的点是在群点(inlier)还是离群点。可选地，该方法还包括：如果N维空间中的点被确定为离群点，则从在N维空间中定义的多个点拟合成线的步骤所基于的训练数据中排除该点，并且如果N维空间中的点未被确定为离群点，则另外基于N维空间中的点在N维空间中重新拟合成线。可选地，该方法包括：基于多维标准曲线，并且可选地进一步基于距离度量，以及可选地基于定义标准曲线的一维函数，确定靶标浓度。可选地，该方法还包括在显示器上显示靶标浓度。可选地，该方法还包括以下步骤：对第一数据集拟合成曲线，其中特征提取基于曲线拟合的第一数据，并且可选地，其中曲线拟合使用5参数S型模型、指数模型和线性插值中的一种或多种来执行。可选地，预处理与熔解温度有关的第一数据集，并且在处理后的第一数据集上进行曲线拟合，并且可选地，其中预处理包括以下中的一种或多种：减去基线；和归一化。可选地，与熔解温度有关的数据来自对应样本温度而采得的一个或多个物理度量，并且可选地其中一个或多个物理度量包括荧光读数。

因此，检测可以是使用离子传感器阵列检测生物样本中的扩增反应的方法，该扩增反应指示病原体的存在。该方法可以包括监测来自离子传感器阵列的每个相应传感器中的信号。该方法可以进一步包括检测来自离子传感器阵列的第一传感器的信号的变化。该方法可以进一步包括将来自第一传感器的信号与至少一个相邻传感器的信号进行比较，该相邻传感器与阵列中的第一传感器相邻。甚至进一步，该方法可以包括，基于比较，确定在第一传感器附近已经发生了扩增事件。

检测可以使用核酸嵌入剂。核酸嵌入剂可以是荧光嵌入剂。荧光嵌入剂可以是例如花青染料，例如

Green(IUPAC ID：N',N'-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-鎓-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺)、

(CAS编号：913830-62-3)、SYTOTM-9、SYTOTM-13、SYTOTM-82和

Gold、SYTOTM-9(CBN编号：CB6328526)、SYTOTM-13(CAS编号：173080-69-8)、SYTOTM-82和

Gold(CAS编号：163795-75-3)。

检测可以是使用金属指示剂的检测。金属指示剂可以是例如羟萘酚蓝、铬黑t、钙镁石、姜黄色素、嗍砜固黑、苏木精、骨螺紫或二甲酚橙。

检测可以实时或在终点执行。实时检测可以例如通过使用LC96系统(

96系统，瑞士Roche)来进行。终点检测可以例如通过使用终点PCR仪，例如VeritiTM Dx 96孔快速热循环仪(美国Thermo Fisher Scientific)，然后进行比色或荧光检测。

可以参考一个或多个对照或与其比较来进行检测。对照可以是阳性和/或阴性对照。可以参考阳性对照和/或阴性对照或通过与其比较来进行检测。在阴性对照中未检测到扩增。在阳性对照中可以检测到扩增。在阳性对照和/或阴性对照的存在下，反应混合物可称为测试反应混合物。通过发现与阳性对照和/或阴性对照相比扩增的显著差异，可以进行检测。扩增的显著差异可能是检测扩增产物所花费的时间上的显著差异。可替代地，扩增的显著差异可以是待检测扩增产物到达阈值水平所花费的时间上的显著差异。阈值水平可以是任何合适的阈值水平，以允许发现扩增的显著差异。扩增的显著差异可以是在限定的时间后反应混合物的颜色上的显著差异。

阴性对照可以使用与测试反应混合物对应的反应混合物，不同之处在于，不存在核酸序列。可替代地，阴性对照可以使用与测试反应混合物对应的反应混合物，不同之处在于，核酸序列被替换为已知不会被反应混合物中的引物扩增的不同的核酸序列；在这种情况下，测试反应混合物中的核酸序列可以称为测试核酸序列，而阴性对照反应混合物中的核酸序列可以称为阴性对照核酸序列。

阳性对照可以使用与测试反应混合物对应的反应混合物，不同之处在于，核酸序列被替换为已知被反应混合物中的引物扩增的不同的核酸序列；在这种情况下，测试反应混合物中的核酸序列可以称为测试核酸序列，而阳性对照反应混合物中的核酸序列可以称为阳性对照核酸序列。阳性对照核酸序列可以例如是包含串联重复的化学合成核酸序列。

在替代定义中，检测步骤可以不涉及检测到扩增的核酸序列指示串联重复的存在。因此，上述方法的步骤(b)可以替代地陈述为：

(b)检测扩增的核酸序列。

核酸序列可以是DNA或RNA。当核酸序列是DNA时，核酸聚合酶是DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶或大片段Bst DNA聚合酶。因此，当核酸聚合酶是DNA聚合酶时，核苷三磷酸混合物包含dNTP。dNTP包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP。

当核酸序列是RNA时，该方法还可以包括RNA逆转录以产生cDNA，例如通过添加逆转录酶(例如AMV逆转录酶)。因此，核酸序列也可以是cDNA。当核酸是cDNA时，核酸聚合酶是DNA聚合酶，并且核苷三磷酸混合物包含dNTP。

反应混合物可以是核酸扩增可以在其中发生的任何合适的介质。反应混合物可以是液体介质。反应混合物可包含去离子水。反应介质可以包含等温缓冲液、MgSO₄、BSA、甜菜碱和/或Syto9。反应混合物可以具有任何合适的体积。

反应混合物可以在容器中。容器可以被称为反应容器。容器可以是任何合适的容器。该容器可以是顶部敞开的。例如，容器可以是试管或板，例如96孔板。容器可以例如通过添加盖子而封闭。盖子可以是整体的或分开的。例如，容器可以是微量离心管，例如Eppendorf管。容器可以具有任何合适的容积。

反应混合物的最佳体积可以由本领域技术人员确定，例如考虑容器的大小。例如，当容器是96孔板时，反应体积可以是5μL至50μL。例如，反应体积可以是5μL。

本发明的方法可以以多个重复样进行。例如，该方法可以一式两份或一式三份地执行。

如本文所用，“严格条件”是本领域技术人员已知的，并且可以在《分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)》,John Wiley&Sons,N.Y.,6.3.1-6.3.6,1991中找到。严格条件可以是杂交的严格条件。严格条件可以是退火的严格条件。严格条件可以定义为等效于等温缓冲液中的退火。等温缓冲液(1×)可以包含20mM Tris-HCl；10mM(NH₄)₂SO₄；50mM氯化钾；8mM MgSO₄；甜菜碱0.8M；0.1％

20；并且在25℃下的pH值可以为8.8。

如本文所用，“核酸序列”可以指双链或单链核酸分子。因此，核酸序列可以替代地定义为核酸分子。核酸分子包含两个或更多个核苷酸。核酸序列可以是合成的。核酸序列可以指在收集时存在于样本中的核酸序列。可替代地，核酸序列可以是扩增的核酸序列或核酸序列扩增中的中间体，例如哑铃状中间体或茎环中间体，这将在下文进一步描述。

如本文所用，“退火(anneal/annealing)”和“杂交(hybridise/hybridising)”是指核酸的单链区域的互补序列通过氢键配对形成双链多核苷酸。如本文所用，“退火”和“杂交”可以指主动步骤。可替换地，如本文所用，“退火”和“杂交”可以指退火或杂交的能力；例如，引物被配置为退火至靶标或与靶标杂交和/或引物与靶标互补。因此，例如，在本发明的方法中，提及与核酸序列或核酸序列的区域退火的引物或引物的区域可能意味着退火是该方法的必需步骤；所述引物或引物的区域与所述核酸序列或核酸序列的区域互补；或者引物或引物的区域被配置为退火至核酸序列或核酸序列的区域。

如本文所用，术语“引物”是指这样一种核酸，无论该核酸是天然存在(如以纯化限制性消化的方式)还是合成产生的，该核酸在置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下(即在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶存在下并在合适的温度和pH下)时能够充当合成的起始点。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，核酸引物通常含有15至25个或更多的核苷酸，尽管它可以含有更少或更多的核苷酸。根据本发明，核酸引物通常含有13至30个或更多个核苷酸。

退火至模板核酸分子的相反链并且可以各自在其两个靶位点之间引发核酸序列合成的两个引物可以被称为引物集。FIP和BIP可以称为引物集，因为它们可以引发F1/F1c和B1/B1c之间的核酸序列合成。

由于DNA合成是在5'到3'方向上发生的，因此，当引物集的3'端退火至模板核酸链时，引物集的3'端指向彼此，并且引物在模板核酸链的相反链上退火。例如，BIP可以退火至模板(-)链，并且与模板(+)链(的一部分)相同。同样，FIP可以退火至模板(+)链，并且与模板(-)链(的一部分)相同。正向、反向、(+)和(-)表示基因的转录；(+)DNA链的取向与由DNA转录的信使RNA相同。换句话说，正向取向指向基因的末端。

FIP可以包括F1c区和F2区。FIP可以由F1c区和F2区组成。F2区可以相对于FIP中的F1c区在3'方向上被置换。FIP的F2区可以包含与串联重复互补的核酸。FIP的F2区可以与靶区域互补。靶区域因此可以被称为F2c。可替代地，当BIP的B2区与靶区域互补时，FIP的F2区可以与靶区域不互补。

FIP的F1c区与靶区域不互补。因此，在严格条件下，FIP的F1c区不会退火至靶区域。相反，FIP的F1c区包含为核酸F1区的反向互补序列的序列。核酸F1区从核酸F2区开始在3'方向上被置换。因此，在严格条件下，FIP的F1c区将退火至核酸F1区。

FIP可掺入一个或多个错配核苷酸。相对于在严格条件下FIP所退火的串联重复的序列，确定一个或多个错配核苷酸是否存在。一个或多个错配核苷酸可以增强与靶区域结合的特异性。相对于与第二重复单元末端和/或串联重复末端的脱靶结合，可以增强与靶区域结合的特异性。

因此，FIP的F2区可以与靶区域100％互补。如果掺入一个或多个错配，则FIP的F2区与靶区域互补可小于100％。例如，FIP的F2区可以与靶区域互补99％至60％。FIP的F2区可以与靶区域互补99％至80％。FIP的F2区可以与靶区域互补99％至85％。FIP的F2区可以与靶区域互补99％至90％。FIP的F2区可以与靶区域互补98％至92％。FIP的F2区可以与靶区域互补96％至94％。FIP的F2区可以与靶区域互补约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％。

在FIP的F2区中掺入多于一个核苷酸的情况下，所述错配核苷酸可以是顺序的或非顺序的。错配核苷酸在数目上可以与F2c序列中的相应核苷酸相等。可替代地，错配核苷酸在数目上可以比F2c序列中的相应核苷酸多或少。发明人已经确定，不相等数目的核苷酸影响对照和测试反应的特异性，并影响扩增靶标的延迟时间(或无法扩增靶标)。

一个或多个错配核苷酸可以在FIP的F2区中。一个或多个错配核苷酸可以位于FIP的3'端附近和/或F2区的3'端附近。因此，该错配可以被称为“3’错配”。3'端附近可以是与F2的5'端相比更靠近F2的3'端的任何点。例如，一个或多个错配核苷酸可以在F2的3'的一半处，F2的3'的三分之一处，F2的3'的四分之一处，F2的3'的五分之一处，F2的3'的六分之一处，F2的3'的七分之一处，F2的3'的八分之一处，F2的3'的九分之一处或F2的3'的十分之一处。同样，3'端附近可以是与FIP的5'端相比更靠近FIP的3'端的任何位置。例如，一个或多个错配核苷酸可以在FIP的3'的一半处，FIP的3'的三分之一处，FIP的3'的四分之一处，FIP的3'的五分之一处，FIP的3'的六分之一处，FIP的3'的七分之一处，FIP的3'的八分之一处，FIP的3'的九分之一处或FIP的3'的十分之一处。

BIP可以包括B1c区和B2区。BIP可以由B1c区和B2区组成。BIP的B2区可以相对于BIP中的B1c区在3'方向上被置换。BIP的B2区可以包含与串联重复互补的核酸。BIP的B2区可以与靶区域互补。靶区域因此可以被称为B2c。可替代地，当FIP的F2区与靶区域互补时，BIP的B2区可以与靶区域不互补。

BIP的B1c区与靶区域不互补。因此，在严格条件下，BIP的B1c区不会退火至靶区域。相反，BIP的B1c区包含为核酸B1区的反向互补序列的序列。核酸B1区从核酸B2区开始在3'方向上被置换。因此，在严格条件下，BIP的B1c区将退火至核酸B1区。

可替代地，BIP而不是FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含来自两个重复单元中的每个重复单元的一个或多个核苷酸。因此，通过BIP加以必要的修改，可能具备与FIP有关的上述特征和效果。

例如，BIP可以包括B1c区和B2区。BIP的B2区可以退火至靶区域。BIP的B2区可以包含相对于靶区域的一个或多个错配核苷酸。一个或多个错配核苷酸可以位于BIP的B2区的3'端附近。BIP的B2区可以包含18至30个核苷酸。

扩增可包括形成“哑铃状”中间体。哑铃状中间体是核酸序列。哑铃状中间体可以是单个核酸分子。术语“哑铃状”是指中间体的可能的二级结构。单个核酸分子可包含一个或多个茎环结构。

哑铃状中间体可以在5’至3’方向上包括B1c区、B2区、LBc区、B1区、F1c区、LF区、F2c区和F1区。由于B1c区和B1区是互补的，它们可以形成茎环结构，其中B1c区和B1区退火形成茎，而B2区和LBc区形成环。形成环的B2区和LBc区是单链的。由于F1c区和F1区是互补的，它们可以形成茎环结构，其中F1c区和F1区退火形成茎，而F2区和LF区形成环。形成环的F2区和LF区是单链的。

类似地，哑铃状中间体可以在5’至3’方向上包括F1c区、F2区、LFc区、F1区、B1c区、LB区、B2c区和B1区。由于B1c区和B1区是互补的，它们可以形成茎环结构，其中B1c区和B1区退火形成茎，而B2区和LBc区形成环。形成环的B2区和LBc区是单链的。由于F1c区和F1区是互补的，它们可以形成茎环结构，其中F1c区和F1区退火形成茎，而F2区和LF区形成环。形成环的F2区和LF区是单链的。

扩增可以进一步包括形成茎环中间体。茎环中间体是核酸序列。茎环中间体可以是单个核酸分子。术语“茎环”是指中间体的可能的二级结构。单个核酸分子可包含一个或多个茎环结构。

茎环中间体可以在5’至3’方向上包括B1c区、B2区、LBc区、B1区、F1c区、LF区、F2c区和F1区。由于F1c区和F1区是互补的，它们可以形成茎环结构，其中F1c区和F1区退火形成茎的一部分，而F2区形成环。形成环的F2区和LF区是单链的。由于B1c区和B1区是互补的，它们可以形成茎环结构，其中B1c区和B1区退火形成茎的一部分，而B2区和LBc区形成环。形成环的B2区和LBc区是单链的。

类似地，茎环中间体可以在5’至3’方向上包括F1c区、F2区、LFc区、F1区、B1c区、LB区、B2c区和B1区。由于B1c区和B1区是互补的，它们可以形成茎环结构，其中B1c区和B1区退火形成茎的一部分，而B2区形成环。形成环的B2区和BF区是单链的。由于F1c区和F1区是互补的，它们可以形成茎环结构，其中F1c区和F1区退火形成茎的一部分，而F2区和LFc区形成环。形成环的F2区和LFc区是单链的。

不受理论的束缚，茎环中间体可以通过将核苷酸添加到哑铃状中间体的3'端而形成。因此，哑铃状中间体可以从3'端延伸。从哑铃状中间体的3'端延伸会打开在哑铃状结构的5'端的环，从而将哑铃状中间体转换为茎环中间体。

扩增可以进一步包括LAMP循环。LAMP循环可以通过FIP和可选的与茎环中间体的环杂交的LB来引发。FIP的F2区可以与茎环中间体的环的F2c区杂交，并且可选地LB可以与茎环中间体的环的LBc区杂交。从FIP的F2区延伸可以置换茎环中间体的3'端(已合成新的B1c和B1区；新的B1区将置换茎环中间体的B1区)。然后，新的B1区可以与新的B1c区形成新的茎环结构，新的B1区与新的B1c区被相邻的B2区分开。然后，B2区可以形成单链环。

然后可以将核苷酸添加到茎环中间体的F1区的3'端。茎环中间体的F1区的延伸将置换通过从FIP的F2区域的延伸而新合成的区域。然后，该延伸可以置换从FIP延伸的链。一旦被置换，从FIP延伸的链可形成哑铃状中间体。这是因为从FIP延伸的链可以以5'到3'方向包含F1c区、F2区、LFc区、F1区、B1c区、LB区、B2c区和B1区。另外，将核苷酸添加到B1的3'端可以形成另一个茎环中间体。

新合成的哑铃状中间体(即从FIP延伸的链)和新的茎环中间体都可以用作后续LAMP循环中BIP引发的链置换反应的模板。

类似地，可以通过BIP和可选的与茎环中间体的环杂交的LF来引发LAMP循环，该茎环中间体以5'至3'方向包括F1c区、F2区、LFc区、F1区、B1c区、LB区、B2c区和B1区。在该情况下，新合成的哑铃状中间体(即从BIP延伸的链)和新的茎环中间体都可以用作后续LAMP循环中FIP引发的链置换反应的模板。

反应混合物可以进一步包含正向外部引物(F3，也称为FOP)和/或反向外部引物(B3，也称为BOP)。

F3包含与核酸F3c区互补的序列。F3被配置为在严格条件下退火至核酸F3c区域。核酸F3c区从核酸F2c区开始在3'方向上被置换。

B3包含与核酸B3c区互补的序列。B3被配置为在严格条件下退火至核酸B3c区域。核酸B3c区从核酸B2c区开始在3'方向上被置换。

F2c和F3c之间的距离(从3'到3')约为20到40个碱基对。B2c和B3c之间的距离(从3'到3')约为20到40个碱基对。

本发明人已经确定，在不存在F3和/或B3的情况下可以发生可检测的核酸扩增。不受理论的束缚，由于FIP的5'部分(例如FIP的F2区)在由核酸聚合酶延伸后的随机解离，这被认为是可能的。延伸的FIP的5'部分的随机解离可允许未延伸的FIP的退火。然后，可以延伸未延伸的FIP，从而置换先前延伸的FIP。同样，不受理论的束缚，BIP的5'部分(例如BIP的B2区)在由核酸聚合酶延伸后也可能发生随机解离。延伸的BIP的5'部分的随机解离可允许未延伸的BIP的退火。然后，可以延伸未延伸的BIP，从而置换先前延伸的BIP。但是，包含F3和/或B3增强了扩增效率。这是因为F3不需要与FIP竞争结合核酸。同样，B3不需要与BIP竞争结合核酸。

反应混合物可以进一步包含正向环引物(LF)和/或反向环引物(LB)。

LF包含对应于核酸的LF区的序列。核酸的LF区从F2c区开始在5'方向被置换，并且从F1c区开始在3'方向上被置换。因此，LF区位于核酸F1c区和F2c区之间。LF与LFc区互补，该LFc区通过退火至核酸F2区的FIP延伸而形成。因此，LF在严格条件下退火至延伸的FIP的LFc区。因此，LF引发延伸的FIP从另外的位点延伸。

LB包含对应于核酸的LB区的序列。核酸的LB区从B2c区开始在5'方向被置换，并且从B1c区开始在3'方向上被置换。因此，LB区位于核酸B1c区和B2c区之间。LB与LBc区互补，该LBc区通过退火至核酸B2区的BIP延伸而形成。因此，LB在严格条件下退火至延伸的BIP的LBc区。因此，LB引发延伸的BIP从另外的位点延伸。

在不存在LF和LB的情况下可以发生可检测的扩增。但是，包含LF和LB增强了扩增效率。这可能是因为环引物与茎环的环区域杂交，而该区域远离已经与其他LAMP引物杂交的区域。

引物FIP、BIP、F3、B3、LF和/或BF可以作为引物混合物储存，因此可以被一起添加到反应混合物中。

样本可以是包含核酸的任何合适的样本。例如，样本可以是环境样本或临床样本。样本也可以是合成DNA的样本(例如gBlocks)或质粒的样本。质粒可以包括所关注的基因或基因片段。

环境样本可以是来自空气、水、动物物质、植物物质或表面的样本。来自水的环境样本可以是咸水、微咸水或淡水。例如，来自咸水的环境样本可以来自大洋、海或盐沼。来自微咸水的环境样本可以来自河口。来自淡水的环境样本可以来自自然来源，例如水坑、池塘、溪流、河流、湖泊。来自淡水的环境样本也可能来自人为来源，例如供水系统、储罐、运河或水库。来自动物物质的环境样本可以例如来自死动物或活动物的活检组织。来自植物物质的环境样本可以例如来自食物、植物球茎或植物种子。来自表面的环境样本可以来自室内或室外的表面。例如，室外表面是土壤或堆肥。室内表面可以例如来自医院(例如手术室或手术设备)或来自住宅(例如食物制备区、食物制备设备或器皿)。环境样本可能含有或被怀疑含有病原体。因此，核酸可以是来自病原体的核酸。

临床样本可以是来自患者的样本。核酸可以是来自患者的核酸。临床样本可以是来自体液的样本。临床样本可以来自处于健康或疾病状态的血液、血清、淋巴液、尿液、粪便、精液、汗液、眼泪、羊水、伤口渗出液或任何其他体液或分泌物。临床样本可以是细胞样本(sample of cells)或细胞相关样本(cellular sample)。临床样本可以包含细胞。临床样本可以是组织样本。临床样本可以是活检组织。

临床样本可以来自肿瘤。临床样本可以包含癌细胞。因此，该核酸可以是来自癌细胞的核酸。

样本可以通过任何合适的方法获得。因此，本发明的方法可以包括获得样本的步骤。例如，环境空气样本可以通过液体冲击、固体表面撞击、沉降、过滤、离心、静电沉淀或热沉淀来获得。水样本可以通过使用倾倒板、扩散板或膜过滤进行封闭来获得。表面样本可以通过样本/冲洗方法、通过直接浸入、通过封闭或通过生物体琼脂直接接触培养(replicateorganism direct agar contact，RODAC)获得。

来自患者的样本可能含有或被怀疑含有病原体。因此，核酸可以是来自病原体的核酸。可替代地，该核酸可以是来自宿主的核酸。

本发明的方法可以是体外方法或离体方法。

病原体可以是包括包含串联重复的核酸的任何实体。病原体可以是真核生物、原核生物或病毒。病原体可以是动物、植物、真菌、原生动物、色藻界(chromist)、细菌或古细菌。

病原体可以来自子囊菌(Ascomycota)门。病原体可以来自散囊菌(Eurotiomycete)纲。病原体可以来自散囊菌(Eurotiales)目。病原体可以来自发菌(Trichocomaceae)科。病原体可以来自曲霉(Aspergillus)属。病原体可以是烟曲霉。

病原体可以来自放线菌(Actinobacteria)门。病原体可以来自放线菌(Actinomycetales)目。病原体可以来自棒杆菌(Corynebacterineae)亚目。病原体可以来自分支杆菌(Mycobacteriaceae)科。病原体可以来自分支杆菌(Mycobacterium)属。

在用于本发明的方法之前，可以从样本中分离、提取和/或纯化核酸。分离、提取和/或纯化可以通过任何合适的技术来进行。例如，核酸分离、提取和/或纯化可以分别使用核酸分离试剂盒、核酸提取试剂盒或核酸纯化试剂盒来进行。

本发明的方法可以进一步包括从样本中分离、提取和/或纯化核酸的初始步骤。因此，该方法可以进一步包括从样本中分离核酸。该方法可以进一步包括从样本中提取核酸。该方法可以进一步包括从样本中纯化核酸。可替代地，该方法可以包括从样本直接扩增，而无序从样本中分离、提取和/或纯化核酸的初始步骤。因此，该方法可以包括裂解样本中的细胞或扩增游离的循环DNA。

分离、提取和/或纯化后，可立即使用核酸或可在在合适的条件下保存核酸然后使用。因此，本发明的方法可以进一步包括在提取步骤之后并且在扩增步骤之前储存核酸的步骤。

获得样本的步骤和/或从样本中分离、提取和/或纯化核酸的步骤可以在相对于该方法的后续步骤不同的位置发生。因此，该方法可以进一步包括运输样本和/或运输核酸的步骤。

该方法有可能在即时情况下执行。如本文所用，“在即时情况下(at the point-of-care)”是指在与样本起源位置相同或其附近的位置处。换句话说，可以不必运送样本或核酸，和/或在与获得样本的位置远离的位置执行任何方法步骤。当样本是临床样本时，即时可以是临床样本所获自的患者的位置或其附近的位置。当样本是环境样本时，即时可以是从中获得环境样本的空气、水、动物物质、植物物质或表面的位置或附近的位置。本发明的方法可以适合于即时情况下使用。因此，该方法可被描述为在即时情况下检测核酸序列中的串联重复的方法。可以将一个、多个或所有方法步骤描述为在即时情况下执行。扩增步骤可以在即时情况下执行。检测步骤可以在即时情况下执行。获得样本的步骤和/或从样本中分离、提取和/或纯化核酸的步骤可以在即时情况下执行。

因此，该方法可以临时地执行。如本文所用，“临时地”是指一经获得样本，在获取样本后没有延迟，无需运输样本，在与样本来源的地方相同处或附近处或在即时情况下。该方法可以在样本上临时地进行。该方法可以由采集样本的同一个体临时地执行。例如，该方法可以由采集样本的执业医师临时地执行。

串联重复包含两个重复单元。两个重复单元在核酸序列中彼此相邻。串联重复可以是直接串联重复。因此，重复单元可以以相同取向出现(即每个重复单元的序列在5'至3'方向上对应)，而不是以相反取向出现(即，序列在一个以5'到3'方向阅读而另一个以3'到5'方向阅读时对应)。

串联重复可以是“反向(inverted)”串联重复。反向串联重复包含以彼此相反的方向彼此相邻的DNA序列拷贝。因此，重复单元可以以相反取向出现(即，每个重复单元的序列在一个以5'到3'方向阅读而另一个以3'到5'方向阅读时对应)，而不是以相同取向出现(即每个重复单元的序列以5'至3'方向对应)。

串联重复可以包含多于两个重复单元。串联重复可以包含两个至50个重复单元。串联重复可以包含两个至30个重复单元。串联重复可以包含两个至20个重复单元。串联重复可以包含两个至10个重复单元。串联重复可以包含3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复单元。串联重复可以包含两个或三个重复单元。

串联重复可以是微卫星、小卫星、可变数目串联重复(VNTR)、MIRU-VNTR(分枝杆菌散在重复单元-可变数目串联重复序列)、Alu元件或短散在核重复元件(SINE)。

重复单元也可以称为重复核酸序列基序。

重复单元可以是长度为约2个碱基对至约200个碱基对的任何核苷酸序列。

重复单元的长度可以是约2至100个碱基对。重复单元的长度可以是约2至80个碱基对。重复单元的长度可以是约2至60个碱基对。重复单元的长度可以是约2至40个碱基对。重复单元的长度可以是约2至20个碱基对。重复单元的长度可以是约2至10个碱基对。

重复单元的长度可以是约2至6个碱基对。长度是约2至6个碱基对的重复单元可以称为微卫星。

重复单元的长度可以是约5至200个碱基对。重复单元的长度可以是约5至100个碱基对。重复单元的长度可以是约5至80个碱基对。重复单元的长度可以是约5至60个碱基对。重复单元的长度可以是约5至40个碱基对。重复单元的长度可以是约5至20个碱基对。重复单元的长度可以是约5至10个碱基对。

重复单元的长度可以是约7至200个碱基对。重复单元的长度可以是约7至100个碱基对。重复单元的长度可以是约7至80个碱基对。重复单元的长度可以是约7至60个碱基对。重复单元的长度可以是约7至40个碱基对。重复单元的长度可以是约7至20个碱基对。重复单元的长度可以是约7至10个碱基对。

重复单元的长度可以是约10至200个碱基对。重复单元的长度可以是约10至100个碱基对。重复单元的长度可以是约10至80个碱基对。重复单元的长度可以是约10至60个碱基对。重复单元的长度可以是约10至40个碱基对。重复单元的长度可以是约10至20个碱基对。

重复单元的长度可以是约13至200个碱基对。重复单元的长度可以是约13至100个碱基对。重复单元的长度可以是约13至80个碱基对。重复单元的长度可以是约13至60个碱基对。重复单元的长度可以是约13至40个碱基对。重复单元的长度可以是约13至20个碱基对。

重复单元的长度可以是约20至200个碱基对。重复单元的长度可以是约20至100个碱基对。重复单元的长度可以是约20至80个碱基对。重复单元的长度可以是约20至60个碱基对。重复单元的长度可以是约20至50个碱基对。重复单元的长度可以是约30至50个碱基对。重复单元的长度可以是约34至46个碱基对。重复单元的长度可以是约29至39个碱基对或约41至51个碱基对。重复单元的长度可以是约31至37个碱基对或约43至49个碱基对。重复单元的长度可以是约34个或约46个碱基对。

重复单元的长度可以是约10至60个碱基对。长度是约10至60个碱基对的重复单元可以称为小卫星。重复单元的长度可以是约30个碱基对。长度是约30个碱基对的重复单元可以称为小卫星。

当重复单元的长度为约30至50个碱基对时，串联重复可包含两个或三个重复单元。当重复单元的长度为约30个碱基对时，串联重复可包含两个或三个重复单元。

重复单元的长度可以是约10至100个碱基对。长度是约10至100个碱基对的重复单元可以称为小卫星。

重复单元的长度可以是约100至200个碱基对。重复单元的长度可以是约120至约200个碱基对。重复单元的长度可以是约140至约200个碱基对。重复单元的长度可以是约160至200个碱基对。重复单元的长度可以是约180至200个碱基对。

重复单元的长度可以是约100至300个碱基对。长度是约100至300个碱基对的重复单元可以称为SINE。SINE的范围可为约100至700个碱基对。本发明的方法可以用于检测长度为约100至300个碱基对的SINE。

两个或更多个重复单元可以具有相同的核酸序列。重复单元的核酸序列可以是100％相同的。然而，两个或更多个重复单元可以不具有相同的核酸序列。重复单元的核酸序列可以不是100％相同的。重复单元可包含核酸序列的一种或多种差异，例如一种或多种插入、一种或多种缺失和/或一种或多种点突变。重复单元的核酸序列可以是50％至100％相同的。重复单元的核酸序列可以是60％至100％相同的。重复单元的核酸序列可以是70％至100％相同的。重复单元的核酸序列可以是80％至100％相同的。重复单元的核酸序列可以是90％至100％相同的。重复单元的核酸序列可以是95％至100％相同的。

靶区域包含来自重复单元中的每个重复单元的一个或多个核苷酸。靶区域可包含来自重复单元中的每个重复单元的2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或10个或更多个核苷酸。来自重复单元中的每个重复单元的靶区域的核苷酸的数目可以相同。因此，两个重复单元可以均等地促成靶区域。可替代地，来自重复单元中的每个重复单元的靶区域的核苷酸的数目可以不同。因此，两个重复单元可以不均等地促成靶区域。

促成靶区域起的两个重复单元是相邻的或连续的。两个重复单元可以被称为第一重复单元和第二重复单元。术语“第一”和“第二”相对于重复单元可以互换使用。可替代地，“第一”重复单元可以从第二重复单元在5’方向上被置换。换句话说，“第二”重复单元可以从第一重复单元在3’方向上被置换。

靶区域与两个重复单元的至少一部分重叠。因此，靶区域也可以被描述为“连接区域”。

靶区域可包含来自第一重复单元的一个或多个核苷酸和来自第二重复单元的一个或多个核苷酸。靶区域可包含来自第一重复单元的1至25个核苷酸和来自第二重复单元的1至25个核苷酸。靶区域可包含来自第一重复单元的1至25个核苷酸和来自第二重复单元的1至10个核苷酸。靶区域可包含来自第一重复单元的1至25个核苷酸和来自第二重复单元的1至5个核苷酸。靶区域可包含来自第一重复单元的1至25个核苷酸和来自第二重复单元的1至4个核苷酸。靶区域可包含来自第一重复单元的1至25个核苷酸和来自第二重复单元的1至3个核苷酸。靶区域可包含来自第一重复单元的1至25个核苷酸和来自第二重复单元的1或2个核苷酸。

靶区域可包含来自第一重复单元的两个或更多个核苷酸和来自第二重复单元的一个或多个核苷酸。靶区域可包括来自第一重复单元的3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、或25个或更多个的核苷酸以及来自第二重复单元的一个或多个核苷酸。

靶区域可包含来自第一重复单元的两个或更多个核苷酸和来自第二重复单元的两个或更多个核苷酸。靶区域可包括来自第一重复单元的3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、或25个或更多个的核苷酸以及来自第二重复单元的两个或更多个核苷酸。

靶区域可包含来自第一重复单元的两个或更多个核苷酸和来自第二重复单元的3个或更多个核苷酸。靶区域可包括来自第一重复单元的3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、或25个或更多个的核苷酸以及来自第二重复单元的3个或更多个核苷酸。

靶区域可包含来自第一重复单元的两个或更多个核苷酸和来自第二重复单元的4个或更多个核苷酸。靶区域可包括来自第一重复单元的3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、或25个或更多个的核苷酸以及来自第二重复单元的4个或更多个核苷酸。

靶区域可包含来自第一重复单元的两个或更多个核苷酸和来自第二重复单元的5个或更多个核苷酸。靶区域可包括来自第一重复单元的3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、或25个或更多个的核苷酸以及来自第二重复单元的5个或更多个核苷酸。

串联重复的长度可以小于或等于300个碱基对。串联重复的长度可以是2至300个碱基对。串联重复的长度可以是20至70个碱基对。串联重复的长度可以是20至50个碱基对。串联重复的长度可以是30至70个碱基对。串联重复的长度可以是30至50个碱基对。串联重复的长度可以是50至70个碱基对。

靶区域可包含来自第一重复单元的一定数目的核苷酸，该数目等于或大于来自第二重复单元的核苷酸的数目。靶区域可包含来自第一重复单元的一定数目的核苷酸，该数目大于来自第二重复单元的核苷酸的数目。

促成靶区域的所有核苷酸可以是来自第一重复单元和第二重复单元的核苷酸。因此，促成靶区域起的所有核苷酸可以是来自串联重复的核苷酸。

包含靶区域的核苷酸总数可以是2至100。如果将靶区域定义为F1c和F2c之间的距离，则包含靶区域的核苷酸总数可以是2个至100个。包含靶区域的核苷酸总数可以是2个至50个。包含靶区域的核苷酸总数可以是2至25。包含靶区域的核苷酸总数可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。

FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共18个或更多个核苷酸。FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共19个或更多个核苷酸。FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共20个或更多个核苷酸。FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共21个或更多个核苷酸。FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共22个或更多个核苷酸。FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共23个或更多个核苷酸。FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共24个或更多个核苷酸。

FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共15至25个核苷酸。FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共16至24个核苷酸。FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共17至22个核苷酸。FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的一个或多个核苷酸；总共18至40个核苷酸。

FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的1至10个核苷酸；总共18至40个核苷酸。

FIP可以退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的1至10个核苷酸；总共19个或更多个核苷酸。

FIP的F2区可以在严格条件下退火至本文定义的任何靶区域。因此，FIP的F2区可以包含10至50个核苷酸。包含FIP的F2区的核苷酸总数可以为18至30。包含FIP的F2区的核苷酸总数可以是18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

本发明的一种实施方式提供了一种检测核酸序列中的串联重复的方法，其中串联重复包含两个或更多个重复单元，重复单元中的每个重复单元包括至少两个碱基对，其中所述方法包括：

(i)核酸序列，

(ii)核酸聚合酶，

(iii)核苷三磷酸混合物，

(iv)正向内部引物(FIP)，

(v)反向内部引物(BIP)，

(vi)正向外部引物(F3)，

(vii)反向外部引物(B3)，和

(viii)正向环引物(LF)和/或反向环引物(LB)，

其中FIP或BIP退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的1至10个核苷酸；总共18至30个核苷酸，其中两个重复单元是相邻的，以及

本发明的另一种实施方式提供了一种检测核酸序列中的串联重复的方法，其中串联重复包含两个或更多个重复单元，重复单元中的每个重复单元包括20至200个碱基对，其中所述方法包括：

(i)核酸序列，

(ii)核酸聚合酶，

(iii)核苷三磷酸混合物，

(iv)正向内部引物(FIP)，

(v)反向内部引物(BIP)，

(vi)正向外部引物(F3)，

(vii)反向外部引物(B3)，和

(viii)正向环引物(LF)和/或反向环引物(LB)，

串联重复可以与病原体的耐药性相关联、促成病原体的耐药性和/或定义病原体的耐药性。例如，当病原体是烟曲霉时，串联重复可以与耐唑性相关联、促成耐唑性和/或定义耐唑性。当病原体为烟曲霉时，串联重复可以在cyp51A基因中。例如，串联重复可以是烟曲霉的cyp51A基因中名为TR34的34个碱基对的串联重复；烟曲霉的cyp51A基因中名为TR46的46个碱基对的串联重复；烟曲霉的cyp51A基因中名为TR53的53个碱基对的串联重复。

如本文所用，术语“药物”是指治疗剂或预防剂。因此，药物可以是药物组合物中或药物制剂中的活性成分。药物可以是药物组合物或在药物制剂中。药物可以是联合疗法。

如本文所用，术语“耐药性”是指生物体如病原体在暴露在施用至患者以治疗由该病原体引起的感染或病症或疾病的药物下存活的能力。例如，这样的药物可以作为农药、杀真菌剂、杀病毒剂、抗生素、抗寄生虫药或抗微生物药而被表征。表现出“耐药性”的生物体可被描述为“耐药性的”。可以通过与已经用相同药物进行了相同处理的对照生物体进行比较来测量耐药性。与对照生物相比，怀疑具有耐药性的生物体可称为“测试”生物体。可以比较测试生物体的样本和对照生物体的样本。可以使用任何合适的测量。例如，与对照生物体相比，耐药性生物体可以存活更长时间，以更快的速率生长，以更快的速率分裂或增殖和/或以更慢的速率死亡。

耐药性可以由DNA序列和/或基因表达促成和/或限定。例如，当已知DNA序列促成和/或限定耐药性时，可以通过任何合适的技术确定DNA序列存在或不存在。同样，当已知基因表达促成和/或限定耐药性时，可以通过任何合适的技术来确定基因表达。耐药性可以由串联重复促成和/或限定。当耐药性由串联重复促成和/或限定时，根据本发明的第一方面，检测耐药性的方法可以包括检测串联重复。

如果感染具有能够在药物治疗后生存的能力，则也可以描述为耐药性的。耐药性感染可包括耐药性生物体，例如耐药性病原体。测试样本可以通过任何合适手段来自感染，例如拭子或活检组织或本文结合临床样本所述的任何方式。

当串联重复为TR34时，引物序列可包括以下引物序列(以5'至3'方向书写)：

·FIP可以包含TAATTAGGCAACTTTCATTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAATAAAT(SEQ ID NO:1)

·BIP可以包含ACTAAGGTGTAGTTCCAGCATACCGTAAGTAGATCTACCTACCGTAGT(SEQ I DNO:2)

·F3可以包含CACCACTTCAGAGTTGTCT(SEQ ID NO:3)

·B3可以包含GTATTTTATATTCACCTACCTACCA(SEQ ID NO:4)

·LF可包含CGGACCGCGTGATTCAT(SEQ ID NO:5)。

当串联重复为TR46时，引物序列可包括以下引物序列(以5'至3'方向书写)：

·FIP可以包含TAATTAGGCAACTTTCATTCCGGATGTGTGCTGAGAAAAAGGAAAGTTGTCTAG(SEQ ID NO:6)

·BIP可以包含ACTAAGGTGTAGTTCCAGCATACCGTAAGTAGATCTACCTACCGTAGT(SEQ IDNO:7)

·F3可以包含CACCACTTCAGAGTTGTCT(SEQ ID NO:8)

·B3可以包含GTATTTTATATTCACCTACCTACCA(SEQ ID NO:9)

·LB可包含ACCATACACCCTAACTCATACTACGG(SEQ ID NO:10)。

可替代地，当核酸是来自宿主的核酸时，串联重复可促成或限定宿主的特征。宿主的特征可能是对感染的易感性。

因此，该方法可替代地定义为通过检测核酸序列中的串联重复来筛选对感染的易感性的方法；通过检测核酸序列中的串联重复来诊断对感染的易感性的方法；和/或预防性治疗感染的方法，该方法包括检测核酸序列中的串联重复并在存在串联重复时预防性治疗感染。

当核酸来自临床样本时，串联重复可以促成或限定疾病、障碍或性状(trait)的风险。该疾病、障碍或性状可以是已知串联重复促成或限定风险的任何疾病、障碍或性状。

串联重复可以是人类基因组中的串联重复。

串联重复可以促成或限定串联重复多态性相关障碍的风险。例如，串联重复可以在5-HTT基因中。5-HTT基因中的串联重复可以促成或限定抑郁症、焦虑症和/或双相情感障碍的风险。

串联重复可能促成或限定神经系统事件(例如中风)的风险。例如，串联重复可以在GPIba基因中。GPIba基因中的串联重复可以促成或限定用阿司匹林治疗的中风患者的复发事件的风险。GPIba基因中的串联重复可以用是阿司匹林治疗的中风患者的复发事件的独立预测因子。

当串联重复人类基因组中的串联重复时，串联重复检测可以用于DNA指纹图谱方法。

串联重复可以是与结核分枝杆菌的耐药性相关的MIRU-VNTR(分枝杆菌散在重复单元-可变数目串联重复序列)。

本发明的另一种实施方式提供了一种检测核酸序列中的串联重复的方法，其中串联重复是烟曲霉的TR34突变，其中所述方法包括

(a)在等温条件和严格条件下，在反应混合物中从烟曲霉样本扩增核酸序列，该反应混合物包含：

(i)核酸序列，

(ii)核酸聚合酶，

(iii)核苷三磷酸混合物，

(iv)正向内部引物(FIP)，

(v)反向内部引物(BIP)，

(vi)正向外部引物(F3)，

(vii)反向外部引物(B3)，和

(viii)正向环引物(LF)和/或反向环引物(LB)，

其中FIP或BIP退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的20个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的1至10个核苷酸；总共18至40个核苷酸，其中两个重复单元是相邻的，以及

本发明的另一种实施方式提供了一种检测核酸序列中的串联重复的方法，其中串联重复是烟曲霉的TR46突变，其中所述方法包括

(i)核酸序列，

(ii)核酸聚合酶，

(iii)核苷三磷酸混合物，

(iv)正向内部引物(FIP)，

(v)反向内部引物(BIP)，

(vi)正向外部引物(F3)，

(vii)反向外部引物(B3)，和

(viii)正向环引物(LF)和/或反向环引物(LB)，

其中FIP或BIP退火至靶区域，所述靶区域包含：来自第一重复单元的15个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的1至10个核苷酸；总共18至40个核苷酸，其中两个重复单元是相邻的，以及

TR34耐药性等位基因的现场诊断非常重要，这是因为它将使临床医生能够更快地决定如何管理患者的感染。当前的侵袭性曲霉病诊断包括直接检查呼吸道标本、生物体培养、组织病理学检查、半乳甘露聚糖抗原检测、β-D-葡聚糖测定和基于分子的检测(例如PCR)技术。但是，当前的IA诊断方法的灵敏度通常较低，对于某些高风险个体甚至可能返回阴性结果。除了灵敏度和特异性低外，这些方法的其他缺点是，它们耗时且依赖基于实验室的仪器。

与当前的方法相比，基于LAMP化学的本发明的方法具有扩增时间短、灵敏度和特异性高的优势。此外，PCR和其他分子方法只能在装备完善的实验室中进行，因此在资源有限的背景中是不可行的，而LAMP不涉及热循环步骤，能够在短时间内将靶DNA扩增到可检测的水平。LAMP测定的另一个优势是结果可以通过肉眼进行定性检测，因此这使其成为对资源有限的背景而言合适的技术。与传统的基于实验室的方法和基于荧光的方法相比，LAMP测定的这些优势实现节省且成本效益的方法。

已经建立了用于TR34检测的快速且高特异性的LAMP反应。该TR34-LAMP测定仅在30分钟的反应内即显示出极高的灵敏度(10个拷贝/反应)。这可以通过应用靶向DNA模板六个区域的四种引物以及一种环引物以加速反应来实现。通常认为DNA模板和引物序列之间的完全互补性对于特异性扩增是必不可少；因此，在引物的3'端引入引物-模板错配具有显著增加相似靶标之间的扩增分辨力的潜力。在该研究中，设计引物的挑战是将它们放置在一个长的直接串联重复区段中，该区段的两侧是高度保守区域。为了增加扩增分辨力，根据串联重复突变与保守区之间的接合序列构建了引物F2，并在F2的3'末端引入了引物-模板G-A错配。结果显示，通过替换F2的3'端的单个错配，只扩增了TR34菌株，而非显示出TR34和TR46扩增之间的报阳时间(TTP)延迟。本文公开的TR-LAMP方法可以应用于其他串联重复突变的检测，例如TR46和TR53 cyp51A突变。TR-LAMP的另一可能用途是用于现场取证检测，该检测通常检测个体之间的高变串联重复、小卫星(每个重复单元约30bp)变异。本文公开的与芯片实验室平台结合的方法还使“指纹”检测设备能够用作数字取证工具。本发明的方法与芯片实验室平台的结合允许所有分析步骤以快速、有效和自动化的方式进行。

本文公开的TR34-LAMP一步测定可用于快速诊断烟曲霉的cyp51A基因中的TR34突变。由于其可靠性高、识别快速和易用性，该方法可以在环境和临床背景中确定TR34突变的普遍性。

根据第二方面，本发明提供了一种通过检测核酸序列中的串联重复检测生物体耐药性的方法，其中串联重复包含两个或更多个重复单元，两个或更多个重复单元中的每个重复单元包括至少两个碱基对，其中所述方法包括：

(i)核酸序列，

(ii)核酸聚合酶，

(iii)核苷三磷酸混合物，

(iv)正向内部引物(FIP)，和

(v)反向内部引物(BIP)，

其中FIP或BIP退火至靶区域，该靶区域包含来自两个重复单元中的每个重复单元的一个或多个核苷酸，其中两个重复单元是相邻的，和

因此，该检测生物体耐药性的方法可以被定义为这样一种检测生物体耐药性的方法，该方法包括根据本发明的第一方面的方法检测核酸序列中的串联重复。

串联重复可以限定和/或促成耐药性。因此，串联重复可以是本领域已知的限定和/或促成耐药性的任何串联重复。例如，串联重复可以选自由以下组成的组：烟曲霉的cyp51A基因中的TR34；烟曲霉的cyp51A基因中的TR46；和烟曲霉的cyp51A基因中的TR53。

根据第三方面，本发明提供了一种通过检测核酸序列中的串联重复诊断传染病或耐药性感染的方法，其中串联重复包含两个或更多个重复单元，所述两个或更多个重复单元中的每个重复单元包括至少两个碱基对，其中所述方法包括：

(i)核酸序列，

(ii)核酸聚合酶，

(iii)核苷三磷酸混合物，

(iv)正向内部引物(FIP)，和

(v)反向内部引物(BIP)，

因此，该诊断传染病或耐药性感染的方法可以被定义为这样一种诊断传染病或耐药性感染的方法，该方法包括根据本发明的第一方面的方法检测核酸序列中的串联重复。

串联重复可以促成和/或限定传染病或耐药性感染。

串联重复可以是传染病或耐药性感染的生物标志物。例如，串联重复可以选自由以下组成的组：烟曲霉的cyp51A基因中的TR34；烟曲霉的cyp51A基因中的TR46；和烟曲霉的cyp51A基因中的TR53，它们中的每种是耐药性烟曲霉的生物标志物。作为传染病或耐药性感染的生物标志物的串联重复是已知的。

“生物标志物”是可以用于识别特定的病理过程或生理过程、疾病等的天然存在的分子、基因或特征。生物标志物可以是可以用于识别特定的病理过程或生理过程、疾病等的可测量指示物。因此，生物标志物可以是传染病或耐药性感染的存在的可测量指示物。当存在传染病或耐药性感染时，生物标志物的浓度可以升高或降低。例如，当样本来自患有传染病或耐药性感染的对象时，串联重复可以按比对照样本中更高的浓度存在。相关的对照样本可以来自不同的对象。可替代地，对照样本可以是来自同一对象的不同样本，例如来自另一位置或时间点的样本。另一位置可以是例如同一对象的非感染区域或不同感染区域。其他时间点例如可以是传染病或耐药性感染不存在和/或没有症状的较早或较晚的时间点。

该方法可以进一步包括如果存在串联重复，则诊断为传染病或耐药性感染。

诊断的方法可以是体外方法或离体方法。

根据第四方面，本发明提供了一种治疗有需要的对象的传染病或耐药性感染的方法，该方法包括检测核酸序列中的串联重复，其中串联重复包含两个或更多个重复单元，所述两个或更多个重复单元中的每个重复单元包括至少两个碱基对，其中所述方法包括：

(i)核酸，

(ii)核酸聚合酶，

(iii)核苷三磷酸混合物，

(iv)正向内部引物(FIP)，和

(v)反向内部引物(BIP)，

(b)检测扩增的核酸序列，其中检测到扩增的核酸序列指示串联重复的存在，和

(c)向有需要的对象施用药物。

因此，该治疗传染病或耐药性感染的方法可以被定义为治疗有需要的对象的传染病或耐药性感染的方法，该方法包括根据本发明的第一方面的方法检测核酸序列中的串联重复，还包括向有需要的对象施用药物。

该治疗传染病或耐药性感染的方法也可以被定义为治疗有需要的对象的传染病或耐药性感染的方法，该方法包括根据本发明的第三方面的方法诊断传染病或耐药性感染，并进一步包括向有需要的对象施用药物。

治疗耐药性感染可包括施用治疗剂。治疗剂可以是替代的治疗剂，例如感染对其不具有抗性的治疗剂。执业医师可以基于对治疗剂的抗性不与串联重复相关、不促成串联重复和/或不被串联重复限定来选择治疗剂。

例如，当耐药性感染是耐唑性感染时，例如当串联重复是TR34或TR46时，则治疗剂可以是非唑类治疗剂。可用于治疗曲霉菌感染的非唑类治疗剂的实例包括脂质两性霉素制剂、卡泊芬净和米卡芬净。

传染病可以由一种或多种病原微生物引起，例如细菌、病毒、寄生虫或真菌。传染病可以直接或间接地从一个人传播到另一个人。传染病可以是人畜共患病，人畜共患病是当传染给人类时会引起疾病的动物传染病。

传染病可以选自由以下组成的组：急性弛缓性脊髓炎(AFM)、无形体病、炭疽病、巴贝西虫病、肉毒中毒、布鲁氏菌病、鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽病)、假鼻疽伯克霍尔德菌(类鼻疽)、弯曲杆菌病(弯曲杆菌)、耐碳青霉烯感染(CRE/CRPA)、软性下疳、基孔肯雅病毒感染(基孔肯雅病)、衣原体、鱼肉毒、艰难梭菌感染、产气荚膜梭菌(ε毒素)、球孢子菌病真菌感染(溪谷热)、克雅氏病(传染性海绵状脑病)(CJD)、隐孢子虫病(Crypto)、环孢子虫病、登革热(1型、2型、3型、4型)(Dengue)、白喉、大肠杆菌感染(E.Coli)、东方马脑炎(EEE)、埃博拉、出血热(埃博拉)、埃立克体病、脑炎(虫媒病毒性或副感染性)、肠病毒感染(非脊髓灰质炎型)(非脊髓灰质炎肠病毒)、肠病毒感染(D68型)(EV-D68)、贾第虫病(贾第鞭毛虫)、淋菌性感染(淋病)、腹股沟肉芽肿、流感嗜血杆菌病(B型)(Hib或H-流感)、汉坦病毒性肺综合征(HPS)、溶血性尿毒症综合征(HUS)、甲型肝炎(Hep A)、乙型肝炎(Hep B)、丙型肝炎(HepC)、丁型肝炎(Hep D)、戊型肝炎(E型)、疱疹、带状疱疹(带状疱疹VZV)(Shingles)、组织胞浆菌感染(组织胞浆菌病)、人免疫缺陷病毒/艾滋病(HIV/AIDS)、人乳头瘤病毒(HPV)、流行性感冒(流感)、军团菌病(军团病)、麻风病(麻疯病)、钩端螺旋体病、李斯特菌病(李斯特菌)、莱姆病、性病淋巴肉芽肿(LVG)、疟疾、麻疹、脑膜炎(病毒性)(病毒性脑膜炎)、脑膜炎球菌病(细菌性)(细菌性脑膜炎)、中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)、腮腺炎、诺如病毒、麻痹性贝类中毒(麻痹性贝类中毒、鱼肉毒)、虱病(头虱和体虱)、盆腔炎性疾病(PID)、百日咳(疫咳)、鼠疫(黑死病鼠疫、败血症鼠疫、肺炎鼠疫)(Plague)、肺炎球菌病(肺炎)、小儿麻痹症(脊髓灰质炎)、波瓦生、鹦鹉热、阴虱病(阴虱；阴虱侵染)、脓疱疹病(天花、猴痘、牛痘)、昆士兰热、狂犬病、蓖麻素中毒、立克次氏体病(落基山斑疹热)、风疹(包括先天性风疹)(德国麻疹)、沙门氏菌肠胃炎(沙门氏菌)、疥疮侵染(疥疮)、鲭鱼毒素、严重急性呼吸系统综合症(SARS)、志贺氏菌病肠胃炎(志贺氏菌)、天花、葡萄球菌感染(耐甲氧西林性)(MRSA)、葡萄球菌食物中毒(肠毒素B中毒型)(Staph Food Poisoning)、葡萄球菌感染(万古霉素中度耐药性)(VISA)、葡萄球菌感染(万古霉素耐药性)(VRSA)、A型链球菌病(侵袭性)(Strep A)、B型链球菌病(Strep B)、链球菌中毒性休克综合症STSS、中毒性休克(STSS、TSS)、初期梅毒、二期梅毒、早期隐性梅毒、晚期隐性梅毒、先天性梅毒、破伤风感染(破伤风)(Lock Jaw)、毛线虫感染(毛线虫病)、结核病(TB)、潜伏性结核(LTBI)、兔热病(兔热)、伤寒症、D型伤寒症、斑疹伤寒、阴道病、细菌性阴道病(酵母菌感染)、水痘(Chickenpox)、霍乱弧菌(霍乱)、弧菌病(弧菌)、病毒性出血热(埃博拉型、拉沙型、马尔堡型)、西尼罗河病毒、黄热病、耶尔森氏鼠疫(Yersinia)和寨卡病毒感染(Zika)。

串联重复可以是传染病的生物标志物。作为传染病的生物标志物的串联重复是已知的。

本发明还提供了一种通过检测核酸序列中的串联重复即时诊断传染病的方法，其中串联重复包含两个或更多个重复单元，所述两个或更多个重复单元中的每个重复单元包括至少两个碱基对，其中所述方法包括：

(i)核酸序列，

(ii)核酸聚合酶，

(iii)核苷三磷酸混合物，

(iv)正向内部引物(FIP)，和

(v)反向内部引物(BIP)，

即时诊断传染病的方法可以可选地进一步包括如果存在串联重复，则诊断出传染病。

因此，可以将即时诊断传染病的方法定义为这样一种通过检测核酸序列中的串联重复即时诊断传染病的方法，所述方法包括本发明的第一方面的方法，还包括如果存在串联重复，则诊断出传染病。

根据第五方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含

(i)正向内部引物(FIP)，和

(ii)反向内部引物(BIP)，

其中FIP或BIP被配置为在严格条件下退火至靶区域，该靶区域包含来自串联重复中的两个重复单元中的每个重复单元的一个或多个核苷酸，其中两个重复单元是相邻的，并且两个重复单元中的每个重复单元包含至少两个核苷酸。

如本文所用，“试剂盒”是包装的组合，其可选地包括使用该组合和/或其他反应的说明以及用于如此使用的组分。

试剂盒可进一步包含正向外部引物(F3)和/或反向外部引物(B3)。

试剂盒可以进一步包含正向环引物(LF)和/或反向环引物(LB)。

例如，试剂盒可以包含：

(i)正向内部引物(FIP)，

(ii)反向内部引物(BIP)，

(iii)正向外部引物(F3)，

(iv)反向外部引物(B3)，和

(v)正向环引物(LF)，

试剂盒可以包含核酸聚合酶和/或核苷三磷酸混合物。

以上定义的任何试剂盒组分都可以任何组合方式组合。

根据第六方面，本发明提供了一种反应混合物，其包含在液体介质中的根据本发明第五方面的试剂盒的组分。

本发明还提供了根据本发明的第五方面的试剂盒或根据本发明的第六方面的反应混合物在病原体检测中的用途。

本发明的第二方面和后续方面的优选特征是本发明的第一方面加以必要的修改而得到的。

现在将通过参考以下实施例和附图描述本发明，所述实施例和附图仅出于说明的目的而呈现，并且不应解释为对本发明的限制。

实施例1-TR34-LAMP测定

样本和DNA提取方法

含有TR34和TR46靶标的合成DNA由Integrated DNA Technologies合成。使用MasterPure酵母DNA纯化试剂盒(威斯康辛州米德尔顿Lucigen)，根据制造商的说明，但还要进行额外的珠粒打浆(beading beating)步骤，从烟曲霉分生孢子中提取高分子量DNA。在设置为30rpm/秒的Qiagen TissueLyser II中，使用1.0mm直径的氧化锆/二氧化硅珠子(奥克拉荷马州巴特尔斯维尔BioSpec Products)破坏收获的分生孢子，持续45秒(德国希尔登Qiagen)。使用Qubit 3.0荧光计和高灵敏度双链DNA测定试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德Life Technologies)对gDNA进行定量。使用TapeStation 2200系统和gDNAScreenTape(加利福尼亚州圣克拉拉Agilent)证实了gDNA的完整性。将纯化的gDNA储存在20℃下直至需要。

TR34-LAMP引物设计

TR34 LAMP引物是基于100株包括含有TR34和TR46突变等位基因的序列的烟曲霉cyp51A基因相关菌株以及野生型分离株而设计的。序列从NCBI GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下载，并在Geneious V.10中通过MUSCLE算法(Edar，2004)进行比对(Kearse等人，2012)。通过鉴定串联重复区来验证序列比对。除34bp或46bp突变区外，所有菌株之间的整体比对均高度保守。总共250bp长的核苷酸比对用于TR34LAMP引物设计。LAMP因使用了六种识别八个不同区域的引物而表现出高特异性：正向和反向内部引物FIP/BIP在测定的特异性中起关键作用。这是因为FIP的F2引物退火至靶标中的F2c区，从而引发LAMP反应。外部引物F3/B3由较少的碱基组成，且浓度低于FIP，从而引发F3退火至靶标，从而开始链置换。除了这四种必需的引物外，环引物LF/LB还用于加快测定速度。

在该研究中，引物设计面临的挑战是在长的高度重复的位置(TR34-1和TR34-2，图2)中选择六个不同区域。由于该区域的性质，引物自退火和非特异性扩增的可能性很高。为了克服这些困难，我们修改了F2的3'末端，并为F1c引物设计选择了最佳位置。这是因为FIP(F1c+F2)对于引发反应至关重要，因此可能影响LAMP测定的特异性。TR34-LAMP引物设计的详细信息如下：(1)使用PrimerExplorer V5在线软件(https://primerexplorer.jp)自动设计两种外部引物(F3和B3)和一种内部引物(BIP)。但是，由于该软件在串联重复LAMP引物设计方面的局限性，因此手动设计了另一种内部引物(FIP)和一种环引物(LF)。(2)以第一串联重复(TR34-1)与下游区域之间的接合处为靶标来设计F2引物，因为该接合处是保守度较低的区域，因此基于该区域设计的引物可能能够区分来自其他类似菌株的TR34突变体等位基因。(3)为减少扩增第二重复区域(TR34-2)的可能性，在3'F2引物末端的第四个碱基处通过用A替换G引入了错配(图2)，以减少FIP的3'稳定性。(4)对F1c引物设计的位置进行选择以避免覆盖太多的第二重复区域(TR34区域2)，以便减少FIP(F1c和F2之间)自退火的可能性。(5)随后，使用NUPACK(http://www.nupack.org/)对所有这些新开发的LAMP引物检查二级结构和引物二聚体形成。表1显示了用于检测TR34突变的LAMP引物的详细信息。

表1 TR34-LAMP引物序列

F2引物的3'处引入的错配以粗体显示。

LAMP反应条件

为了在实时PCR仪上使用LAMP检测烟曲霉中的TR34突变，LAMP混合物含有以下物质：1.5μL 10×等温缓冲液，0.9μL MgSO₄(100mM的储备液)，2.1μL dNTP(各自10uM的储备液)，0.375μL BSA(20mg/mL)，2.4μL甜菜碱(5M)，0.6μL Bst 2.0DNA聚合酶(英国NewEngland Biolabs)(8,000U/uL)，0.375μL Syto9(20μM的储备液)，1.5μL引物混合物(20μMBIP/FIP，10μM LF和2.5μM B3/F3)，3μL各种浓度的gDNA或合成DNA(荷兰Integrated DNATechnologies)模板溶液，范围为10至10⁶个拷贝/反应，以及足量无核酸酶水使体积达到15μL。将溶液在96孔PCR板上分成5μL反应(一式三份)，并在63℃加热30分钟。

LAMP测定的分析灵敏度

在连续10倍稀释的1至10⁶个拷贝/反应的合成TR34 DNA靶标中评估了实时LAMP灵敏度。每个条件一式三份运行，实验重复两次。在LC96系统(

96System，Roche)中进行LAMP测定，并使用LC96软件(SW1.1版)进行数据分析。所有实验均使用合成DNA进行。

LAMP产物的特异性

TR34-LAMP扩增的特异性通过限制性消化LAMP产物来确定。基于共有靶序列，使用限制性内切酶MluCI(英国New England Biolabs)来消化LAMP产物。使用制造商提供的CutSmart缓冲液，将限制性消化物在37℃下孵育30分钟。通过在120伏特下在1×TAE缓冲液中在1.2％琼脂糖凝胶上进行40分钟凝胶电泳，分析消化的产物。用SYBER safe DNA GelStain(美国Thermo Fisher Scientific)对DNA条带进行染色，并使用BioSpectrum成像系统通过紫外灯(366nm)照射进行可视化。所有实验均使用来自临床分离株的基因组DNA进行。

比色LAMP法

WarmStart Colorimetric LAMP 2×Master Mix(New England Biolabs)含有酚红pH指示剂，提供对LAMP反应过程中的质子积累的目视检测，从而使溶液颜色从粉红色(阴性)变为黄色(阳性)。LAMP反应在0.2mL PCR管中以25μL反应体积进行，该25μL反应体积中含有12.5μL WarmStart Colorimetric LAMP 2×Master Mix、2.5μL TR34-LAMP引物混合物(10×)、2.5μL DNA(10⁵个拷贝/uL)、7.5μL无核酸酶水。

临床分离株的扩增和检测

使用11种临床分离株来评估TR34-LAMP引物的适用性。样本包括四个TR34、三个TR46和四个野生型菌株。实时实验使用LC96系统(

96系统，瑞士Roche)进行，而终点实验通过终点PCR仪(VeritiTM Dx 96孔快速热循环仪，美国Thermo FisherScientific)进行，然后进行比色检测。另外，包括TR46和野生型菌株以评估TR34-LAMP测定的交叉反应性。

手机成像方案和图像处理

使用iPhone 6s在室内光线条件下捕获读数。该照片是使用具有自动对焦和自动曝光默认设置的手机摄像头拍摄的。随后使用开源ImageJ软件(V.1.51)处理该图像。

TR34 LAMP测定的分析灵敏度

TR34-LAMP测定是灵敏的，其检测限为10个拷贝/反应。不同DNA浓度(范围从10⁶到10¹)的平均报阳时间(TTP)分别为10.51分钟、12.25分钟、13.67分钟、16.66分钟、17.70分钟和21.91分钟(图4a)。为了评估TR34-LAMP用于定量靶DNA的性能，分析了合成TR34合成DNA的系列稀释液。如图4b所示，TTP相当于连续稀释的对数显示线性回归，其相关系数(R2)为0.98。

通过TR34-LAMP测定来检测和定量临床样本中的DNA

通过实时和终点扩增验证了TR34-LAMP测定对检测在临床样本中的TR34突变体的适用性。使用实时仪器获得的数据仅对TR34样本显示阳性反应。该结果提示，不存在与TR46和野生型菌株的交叉反应，证实了TR34-LAMP测定的特异性高。检测含有TR34突变体等位基因的四个临床样本的实时测定均在17分钟内产生了结果。CL-Asp164的检测时间为16.45±0.31分钟，CL-Asp168的检测时间为15.85±0.17分钟，CL-Asp251的检测时间为16.03±0.13分钟，E076的检测时间为15.92±0.20分钟(表2)。通过使用图4中的回归公式，使用获得的报阳时间结果来估计每个临床样本的浓度(y＝-2.18x+23.08)。所获得的值分别为1.10E+03、2.07E+03、1.71E+03和1.92E+03个拷贝/反应(表2)。

比色终点实验显示，反应20分钟后，肉眼和/或使用手机摄像头可以成功使TR34LAMP测定可视化。观察到TR34临床样本呈阳性反应，为浅黄色，而观察到TR46和野生型样本呈阴性反应，为粉红色(图5a)。通过凝胶电泳进行的分析证实了，管中存在TR34-LAMP产物，该产物导致了颜色从粉红色变为黄色，表明TR34引物集对TR34突变具有特异性(图5b和5c)。

TR34 LAMP测定的特异性

通过限制性消化扩增的LAMP产物来确认扩增的特异性。正如预期的那样，在MluCI限制酶消化后，观察到两个条带(103bp和206bp)(图6)。这些结果表明，LAMP产物是从烟曲霉内的TR34区域特异性扩增的。

表2用临床分离株验证TR34-LAMP测定

a-LAMP-烟曲霉：使用已发表的用于烟曲霉检测的LAMP引物进行LAMP测定的结果(Tang等人，2016)。

b-TTP：报阳时间(在30分钟时间框内检测)

c-TR34-LAMP：使用临床样本进行TR34-LAMP测定的结果

d-估计浓度：通过线性回归公式(y＝-2.18x+23.08)估计初始浓度

+：阳性反应

-：阴性反应

SD：标准偏差。该值由三个重复样计算。

WT：野生型

实施例2-TR46-LAMP测定

实施例1中上述的关于TR34-LAMP测定的方法在加以必要的修改后适用于TR46-LAMP测定的设计。

在该研究中，引物设计面临的挑战是在长的高度重复的位置中选择六个不同区域。由于该区域的性质，引物自退火和非特异性扩增的可能性很高。为了克服这些困难，我们修改了F2的3'末端，并为F1c引物设计选择了最佳位置。在两个串联重复之间引入了错配，因为该接合处是保守度较低的区域，因此基于该区域设计的F2引物可能能够区分来自其他类似菌株的TR46突变体等位基因。

表3显示了用于检测TR46突变的LAMP引物的详细信息。

表3 TR46-LAMP引物序列。错配标有下划线

如表4所示，TR34-LAMP测定和TR46-LAMP测定均适用于临床样本和环境样本。

表4用临床样本和环境样本验证TR34-LAMP测定和TR46-LAMP测定

实施例3-从加标土壤样本中提取烟曲霉DNA和TR-LAMP测定

为了在TR-LAMP测定实验开始之前检查土壤和堆肥样本中是否存在野生型和抗烟曲霉，用10ml的0.05％Tween 20稀释2g的土壤和堆肥样本，然后在含或不含伏立康唑的皮氏培养皿中添加100ul的上清液。将皮氏培养皿培养两天，然后以鉴定出的烟曲霉菌落数对菌落形成单位(cfu)进行计数。

为了评估对提取自土壤中的烟曲霉DNA的TR-LAMP测定的性能，将两种不同土壤类型的样本(新森林土壤和Verve多功能堆肥)加标十倍系列稀释的分生孢子悬浮液(范围为1至10⁶个拷贝数/TR-LAMP反应)。分生孢子悬浮液基于三种不同的分离株-DUB-48(TR46)、DUB-41(TR34)和47-236(WT)，并在0.05％Tween中稀释。对于每种基质和分离株，进行了技术重复，并且未添加分生孢子的两种基质作为对照。

使用DNeasy PowerSoil DNA分离试剂盒(德国希尔登Qiagen)从加标土壤样本中提取基因组DNA，该方法遵循制造商的方案，但有两个改动。不使用建议的涡旋适配器进行匀浆和细胞裂解，而是使用TissueLyser II(德国希尔登Qiagen)以15次/秒的频率进行10分钟。另外，由于基质的粘稠性使得难以去除所需体积的上清液，堆肥样本需要多个离心循环。为了测试建议的增加DNA产量的步骤，提取了第一个10⁶个拷贝/反应集中的6个样本并在60℃下预孵育10分钟，然后添加溶液C1。用烟曲霉MAT型PCR测试所有12个样本以及阳性和阴性对照以及H₂O，然后进行PCR产物的凝胶电泳。此外，使用Qubit dsDNA高灵敏度测定试剂盒(美国马萨诸塞州Thermo Fisher Scientific)，用Qubit 3.0荧光计对该提取的DNA集进行定量。根据PCR和Qubit数据，在60℃的孵育条件和标准条件之间没有差异，因此，由于操作时间少，使用了标准条件。

对于TR34-和TR46-LAMP测定，改变实验条件以确保每个反应的DNA浓度更高，从而改进检测。因此，将10μl样本加载至孔中，并从配方中除去无核酸酶的水，以使每个反应的DNA量从每个反应1个拷贝/μl增加到1.75个拷贝/μl。基于之前进行的温度实验，TR34-LAMP在62℃下运行，TR46-LAMP在63℃下运行。分析的DNA样本浓度在10⁵至10³个拷贝/反应的范围内。10²个拷贝/反应集反复显示在大量测试中没有扩增，因此将其排除在进一步实验之外。分析所得数据以获得灵敏度、特异性的值以及阳性/阴性预测值。

在堆肥样本中，确认了41个cfu中的34个cfu为烟曲霉WT，而土壤样本中2个cfu中的1个cfu被确认为烟曲霉WT。没有检测到耐唑性烟曲霉。使用凝胶电泳分析来检测TR34、TR46和WT样本的扩增(图9)，从而确认提取的样本中存在烟曲霉DNA。

对于土壤样本，观察到的TR34-LAMP检出限(LOD)为10³个拷贝/反应，对于堆肥样本，观察到的TR34-LAMP检出限为10⁴个拷贝/反应，对于土壤和堆肥样本，均观察到TR46-LAMP检出限为10⁴个拷贝/反应。针对两种样本类型，TR34-LAMP的平均报阳时间(TTP)在10⁵个拷贝/反应时为20.57分钟，在10⁴个拷贝/反应时为26.63分钟。针对两种样本类型，TR46-LAMP的平均TTP在10⁵个拷贝/反应和10⁴个拷贝/反应时分别为26.47分钟和36.24分钟。除了最初存在的烟曲霉WT菌株在堆肥中更多外，没有发现底物之间的差异。

表5用从浓度范围已知的分生孢子播种的土壤或堆肥样本中提取的DNA进行TR34和TR46 LAMP测定验证。

SD：由五个重复样计算出的标准偏差。

表6列出了两种测定的TR34、TR46和WT反应的结果，TR-LAMP结果与接种的分离株一致。70％的TR34测定反应导致可检测到的TR34突变株的扩增，63.3％的TR46测定反应导致TR46突变株的扩增。基于表7中的值，TR34-LAMP测定所得的灵敏度值为70％，而特异性为100％。TR34-LAMP测定的阳性预测值为100.00％，阴性预测值为86.96％。TR46-LAMP测定的灵敏度值为63.00％，特异性为93.00％，阳性预测值为90.48％，阴性预测值为84.06％。两种测定均未检测到与WT的交叉反应。TR46-LAMP检测到TR34分离株土壤(35.49分钟)和堆肥(34.98分钟)样本在10⁵个拷贝/反应浓度时为假阳性。

表6提取的土壤和堆肥DNA小组的总体TR34和TR46 LAMP测定结果，包括重复数、基于总重复数的百分比。数据包括WT阴性和两次测定之间的交叉反应阴性，涵盖的浓度范围为10⁵至10³个拷贝/反应。

实施例4-基于CMOS的芯片实验室对临床和环境样本中TR34和TR46突变的检测

可以使用具有4368个离子敏感场效应晶体管(ISFET)的芯片上阵列实时检测PCR扩增过程中释放的氢离子(H⁺)。ISFET是一种固态电位计传感器，其结构类似于金属氧化物半导体场效应晶体管(MOSFET)，使用参比电极(通常为Ag/AgCl)和顶部氮化硅(Si₄N₃)钝化层作为感测材料进行偏置(Georgiou和Toumazou,2009,Sensors and Actuators B:Chemical 143(1):211-217；Moser等人,2016,IEEE Sensors Journal 16(17):6496-6514)。

使用这样的系统来证明使用TR-LAMP测定的芯片上检测。图10示出了未修改的CMOS技术中的ISFET的横截面。检测原理依赖于质子与顶部Si₃N₄层的结合，从而使器件的阈值电压相对于溶液中的pH变化成比例地改变。图10所示的器件微模型由等效MOSFET栅极处的电容组成。化学贡献V_chem随溶液的pH值而变化，反映了扩增反应过程中双链DNA的产生。该公式可以表示为：

DNA_n+d_NTP→DNA_n+1+焦磷酸盐+质子(H⁺)

V_chem＝γ-αS_N log[H⁺]

其中γ是非化学依赖项，S_N是环境温度下59mV/pH的能斯特灵敏度，而α是与该理想灵敏度的偏差。

与液体接触的微芯片表面层的水化导致测量过程中的时间漂移缓慢(Georgiou和Toumazou,2009,Sensors and Actuators B:Chemical 143(1):211-217；Moser等人,2016,IEEE Sensors Journal 16(17):6496-6514)，这对提取与pH变化相关的信号提出了挑战。在这项工作中，我们通过假设漂移遵循通过拟合曲线获得的指数关系来进行处理后补偿。补偿后，传感器的输出将转换回线性域，以产生传统的扩增曲线，从而反映出扩增过程中DNA拷贝的时间增长。芯片上TR-LAMP测定的实验设置如图11所示。

选择了三种TR34突变体(C287、C288、Hyde42)，两种TR46突变体(C87和C93)和两种WT(C245和C249)样本进行芯片上验证实验。还分析了非模板对照和交叉反应性反应(包含与串联重复靶标错配的引物的反应)。

为了说明对芯片数据执行的处理，我们考虑了来自TR34突变体靶标的Hyde42样本，并显示了图12中每个处理步骤的结果。对来自所有暴露的传感器的输出取平均值，得出原始输出曲线，该曲线反映了DNA扩增过程中的传感器漂移和pH值变化。为了提取信号，算法在时间T2找到拐点，该时间对应于扩增中，即pH的贡献超越初始漂移而占主导的时间。然后使用阈值法在输出曲线中识别出三个反应区域：

1)0-T1：无扩增；输出仅为漂移。

2)T1-T3：扩增正在发生；输出是漂移和pH信号之和。

3)T3-结束：扩增产物已饱和；输出仅为漂移。

使用指数近似，可以消除区域1和3中的漂移。在区域2中，我们假设漂移率从T1到T3线性变化，并从输出中减去结果曲线。基于未修改的CMOS的标准pH灵敏度，将mV转换为pH(Moser等人,2018IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems 12(2):390-401)，我们得到了pH读数曲线。然后通过求幂将pH读数曲线映射到线性标尺，从而得到经典的扩增曲线，该曲线跟踪反应过程中的DNA拷贝数。

我们将算法应用于上述样本并获得图12的扩增曲线。对于TR34-LAMP特异性测定，C287(TR34突变体)的TTP为15.44分钟，Hyde42(TR34突变体)的TTP为13.24分钟和C288(TR34突变体)的TTP为15.02分钟，而WT、TR46突变株和非模板对照在30分钟内仍保持阴性；对于TR46-LAMP特异性测定，C87(TR46突变体)的TTP为13.66分钟，C93(TR46突变体)的TTP为16.06分钟，而WT、TR34突变株和非模板对照在30分钟内仍保持阴性(图13)。总体而言，通过电压变化测量的由芯片上系统检测到的扩增曲线与常规实时PCR仪接收到的荧光信号的可比性高(平均TTP差异<2分钟)。

为了确保化学信号可以用作可靠的扩增读数，我们使用Sentron pH计测试了反应前和反应后混合物的pH(平均pH变化≈0.7)。此外，每个pH敏感的芯片上LAMP测定的后dsDNA浓度都显著增加，这提示通过特异性TR-LAMP引物进行了成功扩增(dsDNA产量＝680至1025ng/ul)。

序列表

<110> 帝国科学、技术与医学学院

<120> 检测串联重复的方法

<130> P117256WO

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 1

taattaggca actttcattc cggatgtgtg ctgagccgaa taaat 45

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 2

actaaggtgt agttccagca taccgtaagt agatctacct accgtagt 48

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 3

caccacttca gagttgtct 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 4

gtattttata ttcacctacc tacca 25

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 5

cggaccgcgt gattcat 17

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 6

taattaggca actttcattc cggatgtgtg ctgagaaaaa ggaaagttgt ctag 54

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 7

actaaggtgt agttccagca taccgtaagt agatctacct accgtagt 48

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 8

caccacttca gagttgtct 19

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 9

gtattttata ttcacctacc tacca 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 10

accatacacc ctaactcata ctacgg 26

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 11

caccacttca gagttgtct 19

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 12

gtattttata ttcacctacc tacca 25

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 13

taattaggca actttcattc cggatgtgtg ctgagccgaa taaat 45

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 14

actaaggtgt agttccagca taccgtaagt agatctacct accgtagt 48

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> Artificial sequence

<400> 15

cggaccgcgt gattcat 17

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 16

caccacttca gagttgtct 19

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

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<220>

<223> Artificial sequence

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gtattttata ttcacctacc tacca 25

<210> 18

<211> 54

<212> DNA

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<220>

<223> Artificial sequence

<400> 18

taattaggca actttcattc cggatgtgtg ctgagaaaaa ggaaagttgt ctag 54

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

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<210> 20

<211> 26

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<220>

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accatacacc ctaactcata ctacgg 26

<210> 21

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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caacagat 8

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 22

cttagtgcgc caggcctaca cacgactcgg cttactttca acgga 45

<210> 23

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 23

caacagatct tagtgcgcca ggcctacaca cgactcggct tacttagtgc gccaggccta 60

cacacgactc ggcttacttt caacgga 87

<210> 24

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 24

caacagatct tagtgcgcca ggcctacaca cgactcggct tactttcaac agatcttagt 60

gcgccaggcc tacacacgac tcggcttact ttcaacgga 99

Claims

1.一种检测核酸序列中的串联重复的方法，其中所述串联重复包含两个或更多个重复单元，所述重复单元中的每个重复单元包括至少两个碱基对，其中，所述方法包括：

(i)核酸序列，

(ii)核酸聚合酶，

(iii)核苷三磷酸混合物，

(iv)正向内部引物(FIP)，和

(v)反向内部引物(BIP)，

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，FIP包括F1c区和F2区，其中所述FIP的F2区退火至所述靶区域。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述FIP的F2区包含相对于所述靶区域的一个或多个错配核苷酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述一个或多个错配核苷酸位于所述FIP的F2区的3’端附近。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述FIP的F2区包含18至30个核苷酸。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，BIP包括B1c区和B2区，其中所述BIP的B2区退火至靶区域，可选地其中所述BIP的B2区包含相对于靶区域的一个或多个错配核苷酸，可选地其中所述一个或多个错配核苷酸位于所述BIP的B2区的3’端附近，并且可选地其中所述BIP的B2区包含18至30个核苷酸。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，

(a)所述串联重复是直接串联重复，

(b)所述串联重复的长度小于或等于300个碱基对，和/或

(c)所述串联重复包含两个或三个重复单元。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述重复单元中的每个重复单元包括20至70个碱基对，可选地30至50个碱基对。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶区域包含：来自第一重复单元的10个或更多个核苷酸；来自第二重复单元的1至10个核苷酸；总共18至30个核苷酸。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应混合物进一步包含正向外部引物(F3)和/或反向外部引物(B3)。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应混合物进一步包含正向环引物(LF)和/或反向环引物(LB)。

12.一种检测生物体的耐药性的方法，所述方法包括根据前述权利要求中任一项所述的方法检测核酸序列中的串联重复。

13.一种诊断传染病或耐药性感染的方法，所述方法包括根据权利要求1至11中任一项所述的方法检测核酸序列中的串联重复。

14.一种治疗有需要的对象的传染病或耐药性感染的方法，所述方法包括根据权利要求13所述的方法诊断传染病或耐药性感染，并进一步包括向所述有需要的对象施用药物。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是临时地执行的。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，

(a)核酸序列是DNA，核酸聚合酶是DNA聚合酶，并且核苷三磷酸混合物包含dNTP，或

(b)含有所述串联重复的核酸序列是RNA，该方法进一步包括RNA反转录以产生cDNA，扩增核酸序列是扩增所述cDNA，所述核酸聚合酶是DNA聚合酶，并且所述核苷三磷酸混合物包含dNTP。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述样本是环境样本或临床样本。

18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸是来自病原体的核酸或来自宿主的核酸。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述串联重复选自由以下组成的组：烟曲霉的cyp51A基因中的TR34；烟曲霉的cyp51A基因中的TR46；和烟曲霉的cyp51A基因中的TR53。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，

(a)所述串联重复是烟曲霉的cyp51A基因中的TR34，并且

(i)FIP包含TAATTAGGCAACTTTCATTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAATAAAT(SEQ ID NO:1)，

(ii)BIP包含ACTAAGGTGTAGTTCCAGCATACCGTAAGTAGATCTACCTACCGTAGT(SEQ ID NO:2)，

(iii)F3包含CACCACTTCAGAGTTGTCT(SEQ ID NO:3)，

(iv)B3包含GTATTTTATATTCACCTACCTACCA(SEQ ID NO:4)，和/或

(v)LF包含CGGACCGCGTGATTCAT(SEQ ID NO:5)；或

(b)所述串联重复是烟曲霉的cyp51A基因中的TR46，并且

(i)FIP包含TAATTAGGCAACTTTCATTCCGGATGTGTGCTGAGAAAAAGGAAAGTTGTCTAG(SEQ IDNO:6)，

(ii)BIP包含ACTAAGGTGTAGTTCCAGCATACCGTAAGTAGATCTACCTACCGTAGT(SEQ ID NO:7)，

(iii)F3包含CACCACTTCAGAGTTGTCT(SEQ ID NO:8)，

(iv)B3可以包含GTATTTTATATTCACCTACCTACCA(SEQ ID NO:9)，和/或

(v)LB可包含ACCATACACCCTAACTCATACTACGG(SEQ ID NO:10)。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测是比色检测、基于pH的检测和/或由一个或多个离子传感器进行的检测。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述一个或多个离子传感器是一个或多个基于半导体的离子传感器，可选地是离子敏感场效应晶体管(ISFET)。

23.一种试剂盒，包含：

(i)正向内部引物(FIP)，和

(ii)反向内部引物(BIP)，

24.根据权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包含：

(iii)正向外部引物(F3)，

(iv)反向外部引物(B3)，和

(v)正向环引物(LF)。

25.一种反应混合物，其包含在液体介质中的根据权利要求23或24所述的试剂盒的组分。