KR20120074443A - 구강내의 충치균 진단 키트 및 이를 이용한 충치균 항체 검출 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구강내의 충치균 진단 키트에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 충치 원인균 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 항체를 포함하며 면역크로마토그래피 법을 이용하는 것을 특징으로 하는 충치균 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 충치 원인균 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 항체를 포함하고, 면역크로마토그래피 법을 이용한 충치균 진단 키트를 제조할 수 있으며, 상기 충치균 진단 키트는 충치균에 특이적인 항체 및 신속 면역크로마토그래피 법을 이용함으로써, 기존의 RT-PCR 방법 및 항체 검사 방법에 비해 간편성을 크게 향상시키고, 배지를 이용하는 증균 방식의 검사 방법에 비해 구강내 침을 바로 검체로 사용함으로써 시간을 크게 단축함은 물론 그 비용 또한 크게 절감할 수 있는 장점이 있다.

Description

구강내의 충치균 진단 키트 및 이를 이용한 충치균 항체 검출 진단 방법 {Detection kit for Streptococcus mutans in oral and detection method of Streptococcus mutans antibody using thereof}
본 발명은 구강내의 충치균 진단 키트에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 충치 원인균 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 항체를 포함하며 면역크로마토그래피 법을 이용하는 것을 특징으로 하는 충치균 진단 키트에 관한 것이다.
충치는 구강 내 충치를 유발하는 충치균(Streptococcus mutans)이 설탕, 밥알 등의 탄수화물을 분해하면서 생기는 산에 의해 치아가 녹는 과정이다. 또한 충치도 세균에 의한 질환이므로 세균전염에 의해 감염되며, 전염을 막기 위해서는 조기에 세균의 존재 유무를 파악하고 이를 치료하는 것이 매우 중요하다.
현재 충치균을 진단하는 방법은 구강 내 타액에서 배지를 이용하여 균을 분리ㆍ동정하고 있으나, 진단하는데 시간과 비용이 많이 들고 매우 번거롭다. 이러한 충치균 진단의 번거로움으로 인해 현재 병원에서는 대부분 일률적으로 아동을 대상으로 충치의 발생 가능성과 상관없이 불소처리(1.23% 불화물을 포함한 겔 형태로 치과에서 치아에 직접 도포)를 하고 있는 실정이다. 그러나 아동들은 이러한 처치를 통해 대략 30 mg 정도의 불소를 삼킬 수 있어 위장관손상의 위험이 있는 만큼 충치의 가능성이 클 경우에만 한해서 예방적 치료를 해야 할 필요가 있다. 또한 불소에 의한 환경오염 문제도 대두되고 있어, 불소의 오남용은 자제되어야 할 필요가 있다. 이에 따라 신속하고 간편하며 검사비용이 저렴한 충치균의 검사방법이 개발될 필요가 있다고 할 수 있다. 따라서 특이도와 민감도가 뛰어나며 5 ~ 10 분 이내에 충치균의 감염 여부 결과를 판정할 수 있는 간편하고 경제적인 진단 키트의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 충치 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 항체를 포함하고 면역크로마토그래피 법을 통해 구강내의 충치균을 검출할 수 있는 충치균 진단 키트를 제조하는 경우, 간편하고 신속하게 충치균을 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 충치 원인균 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체를 이용하여 상기 충치균의 신속한 검출을 위한 충치균 진단 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 충치균 진단 키트를 이용한 충치균 항체 신속 검출 진단방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 충치 원인균 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 항체를 포함하며 면역크로마토그래피 법을 이용하는 것을 특징으로 하는 충치균 진단 키트를 제공한다.
상기 충치 원인균 ‘스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)’는 글리코실트랜스퍼라제(glycosyltransferase)를 분비하고, 글리코실트랜스퍼라제는 구강 내에서 각종 당류를 이용하여 접착성이 강한 수불용성이 글루칸(glucan)을 균 전체 표면에 형성한다. 생성된 수불용성의 글루칸에 의해 스트렙토코커스 뮤탄스는 치아표면에 강력하게 부착되어 플라그(Plaque)를 형성하며, 플라그 내에서 유산균 등이 생산한 산이 치아를 용해시켜 충치가 발병하게 된다.
본 발명에서 이용하는 상기 ‘면역크로마토그래피(Immunochromatography) 법’은 일반적으로 항체ㆍ항원 반응을 이용하여 임신진단 또는 간염발병 등과 같은 각종 질병의 검사를 가능하게 하는 진단법으로서, 모세관 현상이 작용하는 다공성 박막을 고상(solid phase)으로 하고 금 콜로이드 또는 착색 폴리스티렌 나노 입자 등의 유색입자를 측정 라벨로 사용하는 신속 현장진단용 면역검사법의 일종이다.
본 발명의 충치균 진단 키트는 항 충치균 항체가 처리된 검사선(test line)과 항 면역글로불린이 처리된 대조선(control line)을 포함하는 니트로셀룰로오스 맴브레인이 구비되고, 상기 니트로셀룰로오스 맴브레인의 일측에는 콘쥬게이트 패드가 중첩되어 형성되며, 상기 콘쥬게이트 패드 위에 혈청 시료를 적하하는 샘플 패드가 중첩되어 구비되며, 상기 니트로셀룰로오스 맴브레인의 타측에는 반응이 종료된 혈청을 흡수하는 흡수 패드가 구비되는 면역크로마토그래피 법을 이용한 충치균 진단 키트인 것을 특징으로 한다.
상기 검사선, 대조선, 콘쥬게이트 패드, 샘플 패드 및 흡수 패드가 구비된 본 발명의 충치균 진단 키트 모식도는 도 1을 통해 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항 충치균 항체는 토끼 또는 기니피그 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 충치균 진단 키트 제조시, 보다 구체적으로 상기 검사선에의 항 충치균 항체 처리는 실시예 1에서 제조한 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항원에 특이적으로 결합하는 토끼 또는 기니피그 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체를 처리하였다. 또한 대조선에의 항 면역글로불린 처리는 골드 콘쥬게이트에 결합된 면역글로불린에 대해 특이적으로 결합하는 항 면역글로불린을 처리하였다.
본 발명에 있어서, 상기 콘쥬게이트 패트는 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체가 결합된 항체-골드 콘쥬게이트 용액이 처리된 것을 특징으로 한다.
상기 항체 콘쥬게이트 용액은 본 발명의 실시예에서 제조한 토끼 또는 기니피그 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체가 접합된 골드 콜로이드 용액이며, 보다 구체적으로는 약 40 nm인 골드 입자에 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체가 결합된 항체-골드 콘쥬게이트 용액이다 (실시예 2 참조).
본 발명의 충치균 진단 키트에 있어서, 상기 키트는 검체의 전처리와 희석을 위해 1% TritonX-100을 포함한 PBS 희석액을 포함하는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 검체의 전처리와 희석을 위한 희석액은 PBS에 1% TritonX-100을 첨가하여 제조하고, 상기 희석액을 검체에 처리하여 pH 8.6으로 보정한다. 상기와 같이 희석액으로 검체를 전처리함으로써 점도를 낮추고, TritonX-100에 의해 입안의 단백질 덩어리를 검체로 사용하기 좋은 상태로 만들 수 있게 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 충치균 항체 신속 검출 진단방법을 제공한다:
a) 항 충치균 항체 콘쥬게이트가 처리된 패드에 혈청 시료를 적하하는 단계;
b) 상기 혈청 시료가 모세관 현상에 의해 검사선 및 대조선을 이동하도록 하는 단계;
c) 검사선의 색 변화를 관찰하는 단계; 및
d) 검사선의 색 변화에 의해 혈청 시료에 충치균 존재 여부를 진단하는 단계.
상기 충치균 항체 신속 검출 진단방법에 있어서, 충치균 존재 여부는 대조군 및 검사선 모두에서 색 변화가 나타나면 양성으로, 대조군에만 색 변화가 나타나면 음성으로 진단한다 (도 5 참조).
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 충치 원인균 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체를 포함하고, 면역크로마토그래피 법을 이용한 충치균 진단 키트를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 충치균 진단 키트는 충치균에 특이적인 항체 및 신속 면역크로마토그래피 법을 이용함으로써, 기존의 RT-PCR 방법 및 항체 검사 방법에 비해 간편성을 크게 향상시키고, 배지를 이용하는 증균 방식의 검사 방법에 비해 구강내 침을 바로 검체로 사용함으로써 시간을 크게 단축함은 물론 그 비용 또한 크게 절감할 수 있는 장점이 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 충치균 진단 키트의 구성물을 나타낸 것이며, 도 1b는 상기 충치균 진단 키트의 플라스틱 검사 키트의 윗면과 아랫면에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 충치균 진단 키트의 충치균 농도별 검출 감도 측정 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 동일한 충치 원인균 농도를 가지고 동일인이 3회 반복 실험한 재현성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 충치 원인균과 유사한 균주를 이용한 교차반응 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 충치균 항체 검출 진단예(양성 및 음성 결과)를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 항 스트렙토코커스 뮤탄스 ( Streptococcus mutans ) 항체 제조
1-1. 토끼 항 스트렙토코커스 뮤탄스 ( Streptococcus mutans ) 항체 제조
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) KCTC #3065를 면역원으로 사용하여 Freund's Adjuvant, complete 0.5 ml에 항원 100 μg을 혼합하여 에멀젼(emulsion)화 시킨 후, 준비된 상기 접종물(Freund's Adjuvant, complete 및 Streptococcus mutans 혼합물)을 토끼(나라바이오텍, New Zealand outbred, albino)의 피하에 접종하였다. 접종은 2 주 간격으로 2회 동일한 방법으로 접종하되 2회 접종부터는 incomplete adjuvant 0.5 ml을 사용하였다.
접종 후, 면역된 토끼에서 시험 채혈을 실시한 후, 혈청을 분리하여 ELISA 방법으로 역가를 측정하였다. ELISA에 의한 역가 측정은 다음에 자세히 나타내었다. 먼저, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항원을 ELISA용 플레이트(plate)에 1 μg/ml의 농도로 흡착시키고 항 혈청을 1% BSA 용액으로 1/1,000, 1/10,000, 1/100,000 및 1/1,000,000 배등으로 희석하여 반응시킨 후, goat anti-rabbit IgG-HRP를 이용하여 2차 반응을 시키고 TMB로 발색시켰다. 이후 정상 토끼혈청의 흡광도를 기준으로 약 3배 이상되는 흡광도를 기준치로 하여 100만배 이상의 역가(titer)를 나타내면 전 채혈하였다. 전 채혈 후, 원심분리하여 혈청을 분리하고 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 10%의 농도로 첨가하여 30 분간 혼합한 후, 15,000 rpm에서 30 분간 원심분리한 후 상층액을 취하였다. 얻어낸 상층액에 다시 황산 암모늄을 50%의 농도로 첨가한 후 4 ℃에서 30 분간 방치시킨 후, 다시 15,000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20 mM 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 20 mM 인산완충용액으로 18 시간 이상 투석(dialysis)한 후, 20 mM 인산완충용액(pH 7.0)으로 평형화된 단백질 G-결합 컬럼(Protein G-coupled column)에 투석액을 주입하고, 모두 주입되고 나면 인산완충용액을 이용하여 흡착되지 않은 물질들을 제거하였다. 컬럼에 결합된 항체는 100 mM 글리신 용액(glycine solution, pH 2.8)으로 용출(elution) 시켰다. 이때 1 M Tris(pH 9.0) 용액을 용출액의 1/10 부피를 첨가해 주어 pH를 보정해 주었다. 용출된 항체액을 농축시킨 후 150 mM 인산완충용액에서 투석시키고, 투석이 끝나면 브래드포드법(Bradford assay)을 이용하여 항체의 양을 확인하고, 이후의 사용을 위해 냉동 보관하였다.
1-2. 기니피그( Guinea Pig ) 항 스트렙토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ) 항체 제조
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) KCTC #3065를 면역원으로 사용하여 Freund's Adjuvant, cpmplete 0.5 ml에 항원 50 μg을 혼합하여 에멀젼(emulsion)화 시킨 후, 준비된 접종물을 기니피그(나라바이오텍, Female Heartley guinea pig)의 피하에 접종하였다. 접종은 2주 간격으로 5회 동일한 방법으로 접종하되, 2회 부터는 incomplete adjuvant 0.5 ml을 사용하였다.
접종 후, 면역된 기니피그에서 시험 채혈을 실시한 후, 혈청을 분리하여 ELISA 방법으로 역가를 측정하였다. ELISA에 의한 역가 측정은 다음에 자세히 나타내었다. 먼저, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항원을 ELISA용 플레이트(plate)에 1 μg/ml의 농도로 흡착시키고 항 혈청을 1% BSA 용액으로 1/1,000, 1/10,000, 1/100,000 및 1/1,000,000 배등으로 희석하여 반응시킨 후, goat anti-Guinea pig IgG-HRP를 이용하여 2차 반응을 시키고 TMB로 발색시켰다. 이후 정상 기니피그 혈청의 흡광도를 기준으로 약 3배 이상되는 흡광도를 기준치로 하여 100만배 이상의 역가(titer)를 나타내면 전 채혈하였다. 전 채혈 후, 원심분리하여 혈청을 분리하고 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 10%의 농도로 첨가하여 30 분간 혼합한 후, 15,000 rpm에서 30 분간 원심분리한 후 상층액을 취하였다. 얻어낸 상층액에 다시 황산 암모늄을 50%의 농도로 첨가한 후 4 ℃에서 30 분간 방치시킨 후, 다시 15,000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20 mM 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 20 mM 인산완충용액으로 18 시간 이상 투석(dialysis)한 후, 20 mM 인산완충용액(pH 7.0)으로 평형화된 단백질 G-결합 컬럼(Protein G-coupled column)에 투석액을 주입하고, 모두 주입되고 나면 인산완충용액을 이용하여 흡착되지 않은 물질들을 제거하였다. 컬럼에 결합된 항체는 100 mM 글리신 용액(glycine solution, pH 2.8)으로 용출(elution) 시켰다. 이때 1 M Tris(pH 9.0) 용액을 용출액의 1/10 부피를 첨가해 주어 pH를 보정해 주었다. 용출된 항체액을 농축시킨 후 150 mM 인산완충용액에서 투석시키고, 투석이 끝나면 브래드포드법(Bradford assay)을 이용하여 항체의 양을 확인하고, 이후의 사용을 위해 냉동 보관하였다.
실시예 2 검사용 디바이스의 공정별 제조
토끼 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체-접합 골드 콜로이드의 제조를 위해, 먼저 염화금(gold chloride)을 0.01%로 증류수에 용해하며 가열하였다. 상기 용해액에 0.1% 시트르산나트륨(Sodium citrate) 용액을 첨가하고, 교반을 계속하면서 약 10 분간 더 가열한 후, 냉각하여 냉장보관하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 토끼 항 스트렙토코커스 뮤탄스 항체를 1 mg/ml 농도로 상기 골드용액에 첨가하면서 30 분간 서서히 교반시켜 반응시켰다. 상기 반응액에 1% PEG 용액과 1% BSA 용액을 첨가하여 골드입자를 안정화 시킨 후, 10,000×g에서 30 분간 원심분리하여 침전을 만들었다. 얻어진 침전을 PSB에 용해하고 0.45 μm 여과기로 여과한 후, 540 nm에서 흡광도가 10이 되도록 희석하였다.
이후, 기니피그 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체-접합 골드 콜로이드도 상기와 동일한 방법으로 제조하였다.
그리고, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체의 맴브레인 코팅을 위해, 나이트로 셀룰로스 맴브레인(Nupore, LFNC-C-SS04)의 검사선 부위에 스트렙토코커스 뮤탄스 항원에 특이적으로 결합하는 항 스트렙토코커스 뮤탄스 항체(실시예 1에서 제조한 토끼 또는 기니피그 항 스트렙토코커스 뮤탄스 항체)를 분주하고, 대조선 부위에는 골드 컨쥬게이트에 결합된 면역글로불린에 대해 특이적으로 결합하는 항 면역글로불린(Goat Anti-Rabbit Immunoglobin G, Arista biologicals inc., USA)을 자동 분주기를 이용하여 분주한 후, 25 ~ 30 ℃에서 5 ~ 10 시간 동안 건조시켰다.
골드 콘쥬게이트용 패드는 0.5% PVA(Polyvinylalcohol)가 함유된 Tris 완충용액(10 mM, pH 8.5)으로 충분히 적셔 건조기에서 완전히 건조시킨 후 사용하였다. Tris 완충용액으로 전처리된 콘쥬게이트 패드에 크기가 약 40 nm인 골드 입자에 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체가 결합된 항체-골드 콘쥬게이트 용액(항체-접합 골드 콜로이드)을 분주하고, 완전히 건조시킨 후, 5 ± 0.1 mm 크기로 절단하여 사용하였다. 검체 패드(샘플 패드)는 검액이 잘 흡수될 수 있는 용액으로 충분히 적셔, 건조기에서 완전히 건조시켜 사용하고, 흡수 패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조기에서 수분을 완전히 건조시킨 상태로 아무런 처리없이 그대로 사용하였다.
라미네이터를 이용하여 상기에서 준비한 코팅된 맴브레인, 콘쥬게이트 패드, 검체 패드, 흡수 패드를 정해진 위치에 올려놓고 라미네이션을 진행하였다. 이때 플라스틱 검사킷의 중앙부위의 맴브레인을 중심으로 맴브레인의 하단에는 골드 컨쥬게이트 패드와 검체 패드(샘플 패드)를 중첩되도록 부착하고, 검사 시험지의 상단에는 흡수 패드를 중첩되도록 부착하였다. 이와 같이 조립된 검사킷이 빈틈이 없는지 확인하고 조립 완료된 검사킷은 제습된 데시케이터(습도 10% 이하)에 보관하였다. 라미네이션이 되어진 검사킷을 절삭기로 절단하고, 절단된 스트립은 반응판에 조립시키기 전까지 제습된 데시케이터(습도 10% 이하)에 보관하였다. 제조한 스트립을 반응판의 바닥면에 밀봉된 쪽으로 검체 패드가 가도록 정확하게 놓고 검체 패드 위쪽으로 시료 홀이 가도록 디바이스를 조립하였다. 조립된 디바이스는 알루미늄 팩에 건조된 실리카겔과 함께 넣고 밀봉한다. 그리고 검체의 전처리와 희석을 위한 희석액은 PBS에 1% TritonX-100을 첨가하고 pH 8.6으로 보정한 후 튜브 당 500 μL씩 분주하였다.
본 발명에 따라 제조된 충치균 진단 키트 디바이스는 도 1b에 나타낸 바와 같다.
실시예 3. 충치균 검출 감도실험
KCTC로부터 분양받은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)(KCTC 3065; ATCC 25175)를 Brain Heart Infusion(Broth Media) 배지에서 증균 배양하여, 약 1×109 CFU/ml이 되도록 균주 원액을 만든 후, 이 균주 원액을 PBS 버퍼로 단계적으로 희석하여 3개의 양성 표준물질을 제조하였다. 그리고 양성 표준물질의 CFU 값을 측정하기 위해, 각 양성 표준물질을 PBS 버퍼로 10-1 ~ 10-9 범위로 10배씩 단계적으로 희석하여 각 희석배수(10-1 ~ 10-9)에서 1 ml씩 채취하여 평판배지에 넣어 도말하였다. 평판배지에 도말할 때는 동일에 동일인이 각 희석배수(10-1 ~ 10-9)마다 1 ml씩 3번 채취하여 각기 다른 3 개의 평판배지에 도말하였다. 이후 37 ℃ 인큐베이터에서 콜로니가 보일 때까지 배양하고, 배양완료 후 고농도 원액을 만들어 희석하여 양성 표준검체로 사용하였다. 음성 표준물질로는 희석버퍼를 그대로 사용하였다.
이후 표준물질의 검출을 위해, 미리 제조한 양성 표준물질 4종(고농도, 중농도, 저농도 및 Cut-off)과 희석버퍼를 시험검체로 사용하였다. 면봉을 이용하여 검체를 상기 각각의 시험검체로 충분히 적신 후, 검체를 희석액이 담긴 튜브에 넣고 강하게 10회 정도 회전시켰다. 이후 드롭퍼(dropper)를 이용하여 검사 키트의 검체적하구에 3 방울 적하하였다. 적하 후, 10 분간 실온에 방치한 후 검사 결과를 판독하였다. 양성 표준물질의 검체 농도 및 검출 결과를 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다.
측정 결과, 본 발명에 따른 충치균 검출 진단 키트는 매우 낮은 농도(4.5×105 CFU/ml)의 충치 원인균의 검출이 가능할 뿐만 아니라, 반 정량적인 검출(Semi-Quantitative detection)이 가능함을 알 수 있다.
[표 1. 양성 표준물질의 검체 농도 및 검출 결과]
Figure pat00001

실시예 4. 표준물질 검출의 재현성 확인
본 발명에 따른 충치균 검출 진단 키트의 재현성을 확인하기 위해, 상기 실시예 3에서 사용한 동일 검체(고농도 및 저농도)에 대하여 동일인이 3회 반복 실험하였다.
그 결과, 하기 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이 동일 농도의 검체에 대하여 동일한 감도 결과가 나타남을 확인하였다.
[표 2. 양성 표준물질 검출 재현성 결과]
Figure pat00002

실시예 5. 유사균종에 대한 교차반응 실험
본 발명에서 사용한 충치 유발균의 유사 균종에 대한 교차반응을 수행하기 위해, 충치 유발균과 유사한 균종인 Streptococci sobrinus, Streptococci sanguis, Streptococci salivarius 및 Streptococci mitis를 양성 표준검체로 하여 검출 실험을 수행하였다. 검출 실험은 상기 실시예 3에서 수행한 것과 동일하게 수행하였다. 측정 결과는 하기 표 3 및 도 4에 나타내었다.
측정 결과, 본 발명에 따른 충치균 검출 진단 키트는 유사 균주들에 대해서 교차반응을 하지 않는 것을 확인하였다.
[표 3. 유사균종에 대한 교차반응 결과]
Figure pat00003

실시예 6. 상위 검사방법과의 비교
일반적으로 충치균 진단에 사용되는 상위 검사방법인 Real Time PCR 방법과 본 발명의 충치균 검출 진단 키트의 충치균 진단에 대한 검출 감도와 특이도를 비교분석하였다. 총 30 개의 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 검체에 대해서 비교 실험을 진행하였다. 구체적인 실험 과정은 하기에 자세히 나타내었다.
6-1. 세균 염색체 추출
세균 염색체의 추출을 위해 Shiroza [Shiroza T, Ueda S, Kuramitsu HK : Sequence analysis of the gtfB gene from Streptococcus mutans. J Bacteriol 169:4263-4270, 1987]등의 방법을 변형으로 하기와 같은 방법으로 추출하였다. 분리세균 2×108 CFU를 BHI broth에 접종하고 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 균체를 회수하였다.
상기 균체에 Lysozyme(3.3 mg/ml) 및 RNase A(166 μg/ml)가 함유된 PEG(16%) 혼합 용액을 가하여 37 ℃에서 1 시간 반응시킨 뒤, 다시 원심분리하여 상청액을 제거하고, 침천물만을 얻었다. 상기 침전물을 2.5 ml의 TE 완충액에 현탁시킨 후, 여기에 50 μL의 Proteinase K와 250 μL의 10% SDS를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 반응시킨 뒤, 에탄올을 첨가하여 13,000 rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후 상청액을 제거한 후, 침전물을 2.5 mL의 1% SDS를 첨가하여 65 ℃에서 30 분간 반응시키고, 그후 50 μL의 Proteinase K를 첨가하여 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 상기 반응 혼합액을 동량의 페놀(phenol)과 페놀/클로로포롬(25:24)으로 차례로 추출하여 상청액을 튜브(tube)에 옮기고, 100% 에탄올을 가하여 DNA를 침전시켰다. 이후 다시 70% 에탄올을 가하여 침전물을 한번 세척하고, 500 μl의 TE 완충액에 현탁시킨 후 4 ℃에서 보관하였다.
6-2. 올리고뉴클레오티드 프라이머(Oligonucleotide primer) 준비
클루캔 합성에 관여하는 글리코실트랜스퍼라제(glycosyltransferase)를 지정하는 gtf 유전자를 증폭시키기 위해, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) GS-5의 gtfB와 gtfC 유전자를 포함하는 염기서열에 상보적인 프라이머 1쌍, 즉 gtfB-F961(5'-TCTAAGCAAGAAGCTGCTAGTACT-3')과 gtfC-R5574(5'-TGGTGAGATGTTGCTGAAGTTGC-3')를 바이오니아 사에 의뢰하여 사용하였다.
6-3. gtf 유전자 증폭
상기에서 분리한 지노믹 DNA(genomic DNA) 5 μl를 주형으로하여 4.6 kb의 gtf 유전자를 증폭하였다. 먼저, 지노믹 DNA에 10× polymerase buffer, dNTP(각각 200 μM), 프라이머(각각 10 pM) 및 0.625 U의 Taq DNA polymerase(Takara Syuzo Co., Kyoto, Japan)를 가하여 총 50 μl의 반응액을 제조하고, GeneAmp PCR system 2400(Perkin-Elmer Co., Norwalk, CT, USA)을 이용하여 DNA를 증폭시켰다. PCR 조건은 94 ℃에서 3 분간 DNA를 변형시키고, 다음의 3 단계를 30 cycle 반복하였다: ① DNA 변성 단계; 94 ℃에서 2 분간, ② 프라이머 annealing 단계; 55 ℃에서 2 분간, ③ extension 단계; 72 ℃에서 15 분간 반응, 마지막 cycle에서는 72 ℃에서 10 분간 반응. PCR 반응이 완료된 후, 각각의 반응액에서 10 μl를 취하여 2 μl의 6× gel loading buffer(0.25% bromophenol blue/0.25% xylene cyanol/50% glycerol)와 혼합하여 0.7% 아가로스 겔(agarose gel)에 로딩(loading) 하였다. 이때 1 μl의 1 kb ladder(Promega, Madison, Wi, USA)를 동시에 로딩하고, 50 V로 1 시간 동안 전기영동을 시행한 후, 0.5 μg/ml의 EtBr(ethidium bromide) 용액으로 염색하고, 자외선 투사기를 이용하여 DNA 밴드(band)를 관찰하였다.
측정 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 충치균 검출 진단 키트는 RT-PCR 양성 검체 16개 가운데 15개를 검출하여 93.8%의 민감도를 나타내었으며, 음성 검체는 14개 가운데 13를 검출하여 92.9%의 특이도를 나타내었다. 상기의 결과는 RT-PCR 검출에 소요되는 비용과 시간을 고려할 때, 충치균 진단에 있어서 이를 대체할 수 있는 효과적인 방법으로 본 발명의 충치균 검출 진단 키트가 사용될 수 있음을 시사한다.
[표 4. 상기 검사법과의 검출능력 비교]
Figure pat00004

Claims (6)

  1. 충치 원인균 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 항체를 포함하며 면역크로마토그래피 법을 이용하는 것을 특징으로 하는 충치균 진단 키트.
  2. 제 1항에 있어서, 항 충치균 항체가 처리된 검사선(test line)과 항 면역글로불린이 처리된 대조선(control line)을 포함하는 니트로셀룰로오스 맴브레인이 구비되고, 상기 니트로셀룰로오스 맴브레인의 일측에는 콘쥬게이트 패드가 중첩되어 형성되며, 상기 콘쥬게이트 패드 위에 혈청 시료를 적하하는 샘플 패드가 중첩되어 구비되며, 상기 니트로셀룰로오스 맴브레인의 타측에는 반응이 종료된 혈청을 흡수하는 흡수 패드가 구비되는 면역크로마토그래피 법을 이용한 충치균 진단 키트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 항 충치균 항체는 토끼 또는 기니피그 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 법을 이용한 충치균 진단 키트.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 콘쥬게이트 패드는 항 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 항체가 결합된 항체-골드 콘쥬게이트 용액이 처리된 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 법을 이용한 충치균 진단 키트.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 키트는 검체의 전처리와 희석을 위해 1% TritonX-100을 포함한 PBS 희석액을 포함하는 것을 특징으로 하는 충치균 진단 키트.
  6. 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 충치균 항체 신속 검출 진단방법:
    a) 항 충치균 항체 콘쥬게이트가 처리된 패드에 혈청 시료를 적하하는 단계;
    b) 상기 혈청 시료가 모세관 현상에 의해 검사선 및 대조선을 이동하도록 하는 단계;
    c) 검사선의 색 변화를 관찰하는 단계; 및
    d) 검사선의 색 변화에 의해 혈청 시료에 충치균 존재 여부를 진단하는 단계.
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