WO2018168816A1 - 齲蝕細菌検出用ｄｎａチップ - Google Patents

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WO2018168816A1
WO2018168816A1 PCT/JP2018/009620 JP2018009620W WO2018168816A1 WO 2018168816 A1 WO2018168816 A1 WO 2018168816A1 JP 2018009620 W JP2018009620 W JP 2018009620W WO 2018168816 A1 WO2018168816 A1 WO 2018168816A1
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bacteria
dna chip
dna
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和人 高山
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株式会社ジーシー
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Definitions

  • the present invention relates to a DNA chip for detecting carious bacteria, a probe mounted on the chip, and the like.
  • Periodontal disease and dental caries two major diseases in the oral cavity, are bacterial infections involving multiple bacteria.
  • Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, and lactobacilli are known as causative bacteria, and these causative bacteria metabolize saccharides to produce lactic acid.
  • the oral environment becomes acidic, and enamel It is known that demineralization occurs.
  • the ratio of Streptococcus mutans to the total number of streptococci present in the oral cavity has been reported as an index. That is, if the ratio of Streptococcus mutans to the total number of streptococci is high, caries is likely to occur (see, for example, Non-Patent Documents 1 to 3).
  • a kit for culturing and testing Streptococcus mutans and lactobacilli is commercially available, and is used as one material for diagnosis. From the cultured result, the approximate number of colonies is visually measured, and the test result is determined.
  • Streptococcus mutans and lactobacilli have different culture conditions, it is necessary to carry out them separately, and there has been no technique capable of simultaneously measuring with high work efficiency.
  • these culture methods have a problem that several days are required until measurement, and it takes a long time to obtain a determination result.
  • the present invention has been made in consideration of the above situation, and provides the following DNA chip and the like.
  • a probe comprising a nucleic acid that hybridizes to 16S rRNA specific for each of one or more oral bacteria to be detected, and the sequence according to any one of (i) to (iii) below:
  • a probe at least one sequence selected from the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7 (ii) a sequence complementary to the sequence (i) (iii) the sequence (i) or (ii) Substantially the same sequence (b) total quantity index probe (c) one or more types of absolute quantity index probes
  • a probe set for detecting carious bacteria comprising the following probe (a) and at least one of the following probes (b) and (c).
  • a probe comprising a nucleic acid that hybridizes to 16S rRNA specific for each of one or more oral bacteria to be detected, and the sequence according to any one of (i) to (iii) below:
  • a probe at least one sequence selected from the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7 (ii) a sequence complementary to the sequence (i) (iii) the sequence (i) or (ii) Substantially the same sequence (b) total quantity index probe (c) one or more types of absolute quantity index probes
  • the means and method which can perform the detection of the caries causative bacteria (multiple types of bacteria group) and the caries determination efficiently and rapidly can be provided as a bacterial test for caries.
  • the number of bacteria of each bacterium of Lactobacillus, Streptococcus sobrinus, and Streptococcus (Streptococci) is determined using a probe corresponding to a DNA sequence specific to each bacterium. By using the mounted DNA chip, it is possible to calculate simultaneously and in a short time.
  • the present invention relates to a DNA chip on which the following probe (a) and at least one of the following probes (b) and (c) are mounted.
  • a probe comprising a nucleic acid that hybridizes to 16S rRNA specific for each of one or more oral bacteria to be detected, and the sequence according to any one of (i) to (iii) below:
  • a probe at least one sequence selected from the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7 (ii) a sequence complementary to the sequence (i) (iii) the sequence (i) or (ii) Substantially the same sequence (b) total quantity index probe (c) one or more types of absolute quantity index probes
  • Probe probe set
  • the probe (a), probe (b) and / or probe (c) described above can be used as a probe set for detecting carious bacteria.
  • each of these probes will be described.
  • the oral bacteria to be detected are at least one of lactobacilli, Streptococcus sobrinus, and Streptococci, preferably two or more.
  • the probe (a) is capable of hybridizing with a base sequence in a specific region of a base sequence of a nucleic acid derived from oral bacteria.
  • the nucleic acid is preferably chromosomal DNA.
  • the probe that can be used in the present invention is preferably designed from a region that has a specific base sequence in the 16S rRNA gene in the chromosomal DNA of various oral bacteria to be detected.
  • Tm melting temperature
  • the specificity of the probe may be one that collectively detects bacteria of the same genus based on the specificity at the genus level, or may be the specificity that can be detected at the individual species level, Selection and judgment can be made as appropriate according to the purpose of bacteria detection.
  • the length of the probe for example, a sequence of 15 bases or more, preferably 17 bases or more, 100 bases or less, preferably 80 bases or less can be employed.
  • probes (a) are shown in Table 1 (SEQ ID NOs: 2 to 7).
  • the probe used in the present invention can be prepared by, for example, chemical synthesis using a normal oligonucleotide synthesis method.
  • a probe can be designed by, for example, Probe Quest (registered trademark: manufactured by Dynacom). In designing, it is necessary to set stringent conditions in consideration of hybridization conditions.
  • stringent conditions refers to conditions under which cross-hybridization due to a similar sequence is unlikely to occur or nucleic acid cross-hybridized with a similar sequence is dissociated.
  • the salt concentration of the buffer is preferably 48 to 780 mM, and the temperature is preferably 37 to 80 ° C.
  • the probe sequences shown in Table 1 are hybridized, Other conditions that prevent similar sequences from hybridizing are more preferably a salt concentration of 97.5 to 390 mM and a temperature of 45 to 60 ° C. Specifically, for example, conditions of 240 mM and 50 ° C. can be mentioned.
  • Preferred examples of the hybridizing DNA include, for example, a base sequence having 60% or more homology (identity) with respect to the base sequence of the DNA of the probe, more preferably 70% or more, 80% or more, Examples thereof include base sequences having homology (identity) of 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the base sequence of the nucleic acid possessed by the oral bacterium which is the detection object of the present invention may not be the base sequence itself, for example, a part of the base sequence is mutated by deletion, substitution, insertion, etc. It may be.
  • probe used in the present invention preferably include those comprising the following base sequence DNA (i), (ii), or (iii). (I) at least one sequence selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7 (ii) a complementary sequence of the sequence (i) (iii) substantially the same as the sequence (i) or (ii) Array of
  • the “substantially identical sequence” in the sequence (iii) above hybridizes to the sequences described in SEQ ID NOs: 2 to 7 or a complementary sequence under stringent conditions as described above. More specifically, the nucleotide sequences are 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 96 with respect to the sequences described in SEQ ID NOs: 2 to 7 or complementary sequences. % Or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of a base sequence having homology (identity).
  • the total amount index probe is a target probe that captures all the bacteria in the specimen that can be amplified with a specific primer pair. In detecting bacteria, what percentage of the total number of bacteria, including non-detected bacteria, is, and how much bacteria are present in the sample in the first place It is also extremely important to detect the total amount of bacteria from the viewpoint.
  • Non-detection target bacteria can be understood as the sum (total) of bacteria whose existence and type are known but not required to be detected, and bacteria whose presence and type are unknown.
  • a probe serving as an indicator of the total amount of bacteria is mounted in the DNA chip. This makes it easier to operate and measure.
  • a base sequence common to many types of bacteria may be used from among the base sequences amplified by the primer pair. When such a sequence is not found, a plurality of relatively common sequences may be designed, and the total amount index probe may be determined by comprehensively judging them.
  • the total amount index probe is preferably a probe that hybridizes to a nucleic acid derived from a bacterium contained in a specimen, and more specifically, a plurality of types of bacteria to be detected among the base sequences amplified by the specific primer pair.
  • This probe contains a common base sequence.
  • the absolute quantity index probe is a probe that hybridizes only to the nucleic acid of the absolute quantity index.
  • the absolute quantity index is a nucleic acid added to a sample in a certain amount before an amplification reaction or a hybridization reaction.
  • the absolute quantity index is a nucleic acid that can be reliably amplified when a normal amplification reaction is performed, and serves as a so-called positive control.
  • the fluorescence intensity of the absolute quantity index obtained from a plurality of DNA chips should be constant, and when the amplification efficiency or hybridization efficiency slightly increases or decreases, A correction coefficient can be calculated by comparing the fluorescence intensities. In a plurality of DNA chips, corrected fluorescence intensities can be compared.
  • Table 1 SEQ ID NOs: 9 to 23
  • Table 2 SEQ ID NOs: 24 to 38
  • base sequences serving as absolute quantity indexes base sequences to be detected by an absolute quantity index probe
  • the absolute quantity index may be, for example, a nucleic acid standard for quantitative analysis developed by AIST or may be newly designed.
  • EXCEL software “manufactured by MICROSOFT”
  • an integer from 1 to 4 is randomly generated (X is an arbitrary number) and connected to generate 1
  • X is an arbitrary number
  • sequences only those sequences in which the sum of G and T is the same as the sum of A and T are extracted, and the extracted sequences are subjected to a Blast search against a database such as NCBI's GenBank to obtain nucleic acids derived from organisms.
  • a database such as NCBI's GenBank
  • sequence can be lengthened by connecting suitably, and it can also be partially removed and shortened.
  • the amplification product of the detection target bacteria is about 500 bp
  • the amplification product of the absolute quantity index is desirably about 300 bp to about 1000 bp.
  • the amplification product derived from the absolute index is designed to be an amplification product having a length different from that of the detection target bacteria. It is also possible to detect at a position different from that of the band and confirm the success or failure of the amplification reaction before hybridization.
  • an absolute quantity index is added before the amplification reaction, it is detected by hybridization that it is a nucleic acid amplified by a specific primer pair, that is, possesses a base sequence complementary to the primer pair. For this purpose, it is necessary to possess a base sequence that is not possessed by either the detection target bacteria or the non-detection target bacteria.
  • the specific primer means that the sequence to be amplified is limited, and the primer pair is not necessarily one pair. A multiplex method using two or more primer pairs can be applied as necessary. Examples of primer pairs are shown in Table 3. It is possible to use an absolute quantity indicator primer pair (SEQ ID NOs: 39 and 40) and a bacterial amplification primer pair (SEQ ID NOs: 41 and 42).
  • DNA chip of the present invention is one in which a plurality of probes described in the above item 1 are arranged (mounted) on a substrate serving as a support.
  • any form such as a flat plate (glass plate, resin plate, silicon plate, etc.), rod shape, or bead can be used.
  • a predetermined probe can be fixed on the flat plate with a predetermined interval for each type (spotting method, etc .; see Science 270, 467-470 (1995), etc.) . It is also possible to sequentially synthesize a predetermined probe for each type at a specific position on the flat plate (see, for example, photolithography method; Science 251, 767-773 (1991)).
  • Other preferred support forms include those using hollow fibers.
  • a DNA chip obtained by fixing a predetermined probe to each hollow fiber for each type, converging and fixing all the hollow fibers, and then repeatedly cutting in the longitudinal direction of the fiber (Hereinafter referred to as “fiber type DNA chip”) can be preferably exemplified.
  • This DNA chip can also be described as a type in which a nucleic acid is immobilized on a through-hole substrate, and is also referred to as a so-called “through-hole type DNA chip” (see Japanese Patent No. 3510882).
  • the method for fixing the probe to the support is not limited, and any bonding mode may be used. Moreover, it is not limited to fix
  • a support body can be previously coated with polymers, such as a polylysine, and a probe can also be fixed to the support body after a process.
  • a tubular body such as a hollow fiber is used as the support, the tubular body can hold a gel-like material, and the probe can be fixed to the gel-like material.
  • the fiber type DNA chip which is one form of the DNA chip will be described in detail.
  • the fiber-type DNA chip can be produced, for example, through the following steps (i) to (iv).
  • the material used for the hollow fiber is not limited, but for example, materials described in JP-A No. 2004-163211 are preferable.
  • the hollow fibers are arranged three-dimensionally so that the lengths in the longitudinal direction are the same (step (i)).
  • a plurality of hollow fibers are arranged in parallel at a predetermined interval on a sheet-like material such as a pressure-sensitive adhesive sheet to form a sheet, and then the sheet is spirally wound (Japanese Patent Laid-Open No. 11-1999). No.
  • the manufactured array is embedded so that the array is not disturbed (step (ii)).
  • the embedding method include a method in which a polyurethane resin, an epoxy resin, or the like is poured into a gap between fibers, and a method in which fibers are bonded together by heat fusion.
  • the embedded array is filled with a gel precursor polymerizable solution (gel forming solution) containing a probe in the hollow portion of each hollow fiber, and a polymerization reaction is performed in the hollow portion (step (iii)). Thereby, the gel-like thing with which the probe was fixed can be hold
  • the gel precursor polymerizable solution is a solution containing a reactive substance such as a gel-forming polymerizable monomer, and the solution can be converted into a gel by polymerizing and crosslinking the monomer.
  • a reactive substance such as a gel-forming polymerizable monomer
  • examples of such monomers include acrylamide, dimethylacrylamide, vinyl pyrrolidone, methylene bisacrylamide and the like.
  • the solution may contain a polymerization initiator and the like.
  • the block body is cut in a direction intersecting with the longitudinal direction of the hollow fiber (preferably in a direction perpendicular to the hollow fiber) to make a thin piece (step (iv)).
  • the flakes thus obtained can be used as a DNA chip.
  • the thickness of the DNA chip is preferably about 0.01 mm to 1 mm.
  • the block body can be cut by, for example, a microtome and a laser.
  • Preferred examples of the fiber-type DNA chip include a DNA chip (Genopal TM) manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
  • the probes are three-dimensionally arranged in the gel, and the three-dimensional structure can be maintained. Therefore, the detection efficiency is increased compared to a planar DNA chip in which a probe is bound to a slide glass whose surface is coated, and it becomes possible to perform a highly sensitive and highly reproducible test.
  • the number of types of probes arranged on the DNA chip is preferably 500 or less, preferably 250 or less, more preferably 100 or less, per DNA chip. By limiting the number (type) of probes arranged in this way to some extent, it becomes possible to detect target oral bacteria with higher sensitivity.
  • the type of probe is distinguished by the base sequence. Therefore, even if the probes are derived from the same gene, even if one base sequence is different, it is specified as a different type.
  • Method for measuring the number of bacteria in the oral cavity is, for example, a method including the following steps.
  • Step of extracting bacterial nucleic acid contained in the sample using the collected oral sample as a sample (II) Step of bringing the extracted nucleic acid into contact with the above-described DNA chip (or probe of the present invention)
  • III A step of calculating the number of bacteria based on the fluorescence intensity obtained from the DNA chip (or probe) after the contact
  • Step (I) the collected oral sample (bacteria in the oral cavity (bacteria group)) is used as a specimen, and the nucleic acid of the bacteria contained in the specimen is extracted.
  • the specimen can be collected, for example, from a desired subject or test organism.
  • the type of intraoral sample to be collected is not particularly limited, and for example, saliva, plaque (subgingival plaque, supragingival plaque), tongue coating, oral washing liquid, and the like can be used.
  • the method for collecting saliva is not particularly limited, and examples thereof include a method in which saliva is poured directly into a container, or a method in which saliva is soaked into a cotton swab or other paper-like material. .
  • gum may be taken prior to collection.
  • a method of transporting the collected sample by freezing it in an airtight container, or a method of collecting a sample with a cotton swab using a cotton swab with a case and storing it in a case is preferable.
  • the amount of saliva to be collected is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the method for detecting bacterial DNA present in the oral sample.
  • 0.1 mL or more is preferable and 0.5 mL or more is more preferable if it is the saliva of a subject.
  • the nucleic acid obtained from the specimen may be brought into contact with a DNA chip or the like as it is, or a desired base sequence region may be amplified by PCR or the like, and the amplified fragment may be brought into contact with a DNA chip or the like.
  • the desired site to be amplified is preferably a ribosomal RNA (16S rRNA) gene in the chromosomal DNA of the oral bacteria, for example.
  • Preferred examples of PCR primers that can be used for amplification of the region include SEQ ID NOs: 41 and 42 in Table 3. Amplification of nucleic acid by the PCR method can be performed according to a conventional method.
  • the nucleic acid extracted in this step and its amplified fragment can be appropriately labeled and used in the detection process after hybridization.
  • a method of labeling the end of a PCR primer with various reporter dyes a method of incorporating a reactive nucleotide analog during a reverse transcription reaction, a method of incorporating a biotin-labeled nucleotide, and the like can be considered.
  • it can be labeled with a fluorescent labeling reagent after preparation.
  • the fluorescent reagent for example, various reporter dyes (for example, Cy5, Cy3, VIC, FAM, HEX, TET, fluorescein, FITC, TAMRA, Texas red, Yakima Yellow, etc.) can be used.
  • Step (II) the nucleic acid obtained in step (I) or an amplified fragment thereof is brought into contact with the probe or DNA chip used in the present invention.
  • a hybridization solution is prepared, and a nucleic acid or the like in the solution is bound (hybridized) to a probe mounted on a DNA chip.
  • the hybridization solution can be appropriately prepared according to a conventional method using a buffer solution such as SDS or SSC.
  • the reaction conditions type of buffer, pH, temperature, etc.
  • nucleic acids in the hybridization solution can hybridize with the probe mounted on the DNA chip under stringent conditions. Can be done.
  • the detection intensity is measured for each spot using an apparatus capable of detecting a label such as a nucleic acid bound to the probe.
  • an apparatus capable of detecting a label such as a nucleic acid bound to the probe.
  • various fluorescence detection devices such as CRBIO (manufactured by Hitachi Software Engineering), arrayWoRx (manufactured by GE Healthcare), Affymetrix 428 Array Scanner (manufactured by Affymetrix, Inc.), GenePix (Axon Instruments), ScanArray (PerkinElmer), Geno Pearl Reader (Mitsubishi Rayon), etc. can be used to measure fluorescence intensity.
  • scanning can be performed by appropriately adjusting the laser output and the sensitivity of the detection unit, and in the case of a CCD camera type scanner, the exposure time can be adjusted appropriately.
  • a scan can be performed.
  • the quantification method based on the scan result is performed by quantification software.
  • the quantification software can be performed using the average value, median value, etc. of the fluorescence intensity of the spots. Further, in quantification, it is preferable to make adjustments such as using the fluorescence intensity of a spot not equipped with a probe as the background in consideration of the dimensional accuracy of the spot range of the DNA fragment.
  • Step (III) the bacteria of the bacterial species of the detection target strain are obtained based on the fluorescence intensity obtained from the DNA chip (or probe) through the steps (I) and (II). Calculate the number. For example, there is a method of indicating the S / N ratio from the fluorescence intensity of the probe for detecting the detection target bacteria and the background fluorescence intensity. Alternatively, a conversion coefficient (calibration curve) for calculating the chromosomal DNA concentration for each bacterium based on the fluorescence intensity obtained by changing the concentration of the chromosomal DNA of each bacterium in advance and changing the concentration of the chromosomal DNA for each bacterium. A method of obtaining the concentration of chromosomal DNA from the fluorescence intensity obtained under each condition in advance is preferable.
  • a correction coefficient is calculated for each DNA chip so that the fluorescence intensity of the absolute quantity index probe obtained from the detection of a plurality of DNA chips is constant, and the correction coefficient is calculated for the fluorescence intensity of the detection target bacteria of each DNA chip. Considering the above, comparison between DNA chips may be performed.
  • V3 and V4 variable regions of 16S rRNA.
  • sequences specifically possessed by each bacterium were selected, and the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7 were designed and prepared.
  • PCR was carried out under the following reaction solution composition and reaction conditions.
  • the PCR kit used was Premix Ex Taq TM Hot Start Version (manufactured by Takara), and amplification reaction was carried out by ProFlex (manufactured by Applied Biosystems). Primers were used under the following primer conditions.
  • the forward primer used was labeled at the 5 ′ end with Cy5 to label the end of the amplified product.
  • ⁇ Reaction solution composition > 2 x Premix Ex Taq (registered trademark) Hot Start Version 10 ⁇ L 4 ⁇ M forward primer (for bacterial amplification) (SEQ ID NO: 41) 1 ⁇ L 4 ⁇ M reverse primer (for bacterial amplification) (SEQ ID NO: 42) 1 ⁇ L 4 ⁇ M forward primer (for absolute quantity index amplification) (SEQ ID NO: 39) 1 ⁇ L 4 ⁇ M reverse primer (for absolute quantity index amplification) (SEQ ID NO: 40) 1 ⁇ L 20pg sample-derived DNA 5 ⁇ L 1pg absolute quantity index 1 ⁇ L Total 20 ⁇ L
  • ⁇ DNA chip Manufacture of DNA chip for detection of oral bacteria> A through-hole type DNA chip was produced by the same method as that described in Example 1 of JP-A-2007-74950 (method for detecting methylated DNA and / or unmethylated DNA). However, probes having the sequence information shown in SEQ ID NOS: 1 to 7 and 23 in Table 1 were used as the mounted probes.
  • DNA amplification product obtained after PCR 20 ⁇ L 1M Tris-HCl 48 ⁇ L 1M NaCl 48 ⁇ L 0.5% Tween20 20 ⁇ L 64 ⁇ L of water Total 200 ⁇ L
  • the fluorescence intensity derived from the hybridization was calculated by subtracting the background value (the median value of the fluorescence intensity of the spot not equipped with the probe) from the fluorescence intensity of the spot loaded with the probe for detection target bacteria.
  • the fluorescence intensity of the probe of the total amount index which also serves as a positive control, was recognized in any bacterial genomic DNA, and the validity of the reaction could be confirmed.
  • the fluorescence intensity was obtained only for the target bacteria. From the above results, it was shown that all the probes of the present invention are highly specific probes.
  • ⁇ DNA preparation> Bacterial count in saliva samples ⁇ DNA preparation> A saliva evaluation test was conducted with the cooperation of five healthy adults. These five subjects were A, B, C, D, and E, and saliva was evaluated. Saliva collection was performed by collecting ⁇ -collect swab RI (Eiken Chemical) in the mouth for 1 minute. ⁇ collect swab RI was immersed in water in a tube and allowed to stand at room temperature for 5 minutes to elute bacterial components. Thereafter, the ⁇ collect swab RI was removed and the tube was centrifuged. DNA was extracted from the obtained pellet using DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN).
  • DNeasy Blood & Tissue Kit QIAGEN
  • PCR and detection conditions for DNA analysis were performed under the same conditions as in Example 2. However, probes having the sequence information shown in SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 7, 8, and 23 in Table 1 were used as probes mounted on the DNA chip.
  • the fluorescence intensity derived from the hybridization was calculated by subtracting the background value (the median value of the fluorescence intensity of the spot not equipped with the probe) from the fluorescence intensity of the spot equipped with the probe for detection target bacteria. Furthermore, as in Example 2, a plurality of bacterial DNAs with known concentrations were evaluated to create a calibration curve, and the fluorescence intensity was converted to the number of bacteria in 1 ml of saliva. As a result, as shown in Table 5, it was possible to calculate the ratio of Streptococcus mutans to the abundance of five types of target bacteria and the number of Streptococci.
  • the means and method which can perform the detection of the caries causative bacteria (multiple types of bacteria group) and the caries determination efficiently and rapidly can be provided as a bacterial test for caries.
  • the number of bacteria of each bacterium of Lactobacillus, Streptococcus sobrinus, and Streptococcus (Streptococci) is determined using a probe corresponding to a DNA sequence specific to each bacterium. By using the mounted DNA chip, it is possible to calculate simultaneously and in a short time.

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Abstract

齲蝕の原因細菌の検出及び齲蝕の判定を、効率的かつ迅速に行うことができる手段・手法を提供する。　本発明は、例えば、下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを搭載したＤＮＡチップ等に係るものである。 （ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ　（ｉ）配列番号２～７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列　（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列　（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列 （ｂ）総量指標プローブ （ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ

Description

齲蝕細菌検出用ＤＮＡチップ
　本発明は、齲蝕細菌を検出するためのＤＮＡチップ、及び当該チップに搭載するプローブ等に関する。
　口腔内の２大疾患である歯周病及び齲蝕は、複数の細菌が関与する細菌感染症である。
　齲蝕は、原因細菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｏｂｒｉｎｕｓ、及び、乳酸桿菌が知られており、これら原因細菌が糖類を代謝することにより乳酸を産生し、この結果、口内環境が酸性になり、エナメル質の脱灰が起こることが知られている。
　原因細菌の存在量に加え、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの比率が、指標となることが報告されている。すなわち、総連鎖球菌の菌数に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの比率が高いと、齲蝕になり易い（例えば、非特許文献１～３参照）。
　齲蝕の細菌検査としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓと乳酸桿菌を培養して検査するキットが市販されており、診断の一つの材料として利用されている。培養した結果から、目視で、およそのコロニー数が測定され、検査結果が判定されている。
　しかしながら、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓと乳酸桿菌とは培養条件が異なるため、別々に実施する必要があり、作業効率よく同時に測定できる手法はなかった。また、それらの培養法では、測定までに数日が必要であり、判定結果が得られるまでの時間が長いという問題があった。
Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ　Ｊａｎｕａｒｙ、２００７年、第１巻、Ｐ．３１－３９ Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｏｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９６年、第４１巻、ｐ．１６７－７３ 「日本細菌学会誌」２００１年、第５６巻、ｐ．３３４
　このような状況下において、齲蝕の細菌検査として、齲蝕の原因細菌（複数種の細菌群）の検出及び齲蝕の判定を、効率的かつ迅速に行うことができる手段・手法の開発が望まれていた。
　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示すＤＮＡチップ等を提供するものである。
［１］下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを搭載したＤＮＡチップ。
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ
　（ｉ）配列番号２～７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列
　（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
　（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
［２］ＤＮＡチップの形態が繊維型ＤＮＡチップである、上記［１］に記載のＤＮＡチップ。
［３］下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを含む、齲蝕細菌検出用プローブセット。
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ
　（ｉ）配列番号２～７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列
　（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
　（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
　本発明によれば、齲蝕の細菌検査として、齲蝕の原因細菌（複数種の細菌群）の検出及び齲蝕の判定を、効率的かつ迅速に行うことができる手段・方法を提供することができる。
　具体的には、本発明によれば、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）と、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｏｂｒｉｎｕｓと、総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の各細菌の細菌数を、当該各細菌に特異的なＤＮＡ配列に対応するプローブを搭載したＤＮＡチップを用いることにより、同時に且つ短時間で算出することができる。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１７－０４８６５４号明細書（２０１７年３月１４日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
　本発明は、前述のとおり、下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを搭載したＤＮＡチップに係るものである。
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ
　（ｉ）配列番号２～７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列
　（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
　（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ

１．プローブ（プローブセット）　
　前述したプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び／又はプローブ（ｃ）とは、齲蝕細菌検出用のプローブセットとして用いることができる。
　以下、これら各プローブについて説明する。
（１）プローブ（ａ）
　検出の対象となる口腔内細菌は、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）と、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｏｂｒｉｎｕｓと、総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の内の少なくとも１種、好ましくは２種以上である。
　プローブ（ａ）は、口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの特定の領域中の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。ここで、当該核酸は、染色体ＤＮＡであることが好ましい。
　本発明に用い得るプローブは、検出目的となる各種の前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子において、特異的な塩基配列となるような領域から設計することが好ましい。一般的に、プローブの設計の際には、特異的な領域を選択することに加え、融解温度（Ｔｍ）がそろっていて、二次構造を形成しにくいものである必要がある。
　一方で、プローブの特異性は、属レベルの特異性を基に同じ属の細菌を一括に検出するものであってもよいし、個々の種レベルで検出可能な特異性であってもよく、細菌検出の目的に応じて適宜選択・判断が可能である。プローブの長さとしては、例えば、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、１００塩基以下、好ましくは８０塩基以下の配列を採用できる。
　プローブ（ａ）の例を、表１に示す（配列番号２～７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明に用いるプローブは、例えば、通常のオリゴヌクレオチド合成法を使用して化学合成することにより作製することができる。そのようなプローブは、例えば、Ｐｒｏｂｅ　Ｑｕｅｓｔ（登録商標：ダイナコム社製）により設計することができる。設計の際には、ハイブリダイゼーション時の条件を考慮し、ストリンジェントな条件を設定する必要がある。
　なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい、又は類似配列によってクロスハイブリダイゼーションした核酸を解離させる条件のことをいい、具体的には、ハイブリダイゼーション反応時又はハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件として、バッファーの塩濃度が４８～７８０ｍＭ、温度が３７～８０℃が好ましく、さらにストリンジェントな条件として、表１に示したプローブ配列がハイブリダイズし、それ以外の類似配列がハイブリダイズしない条件として、塩濃度が９７．５～３９０ｍＭ、温度が４５～６０℃がより好ましい。具体的には、例えば２４０ｍＭで５０℃の条件を挙げることができる。
　ハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、プローブのＤＮＡの塩基配列に対して、６０％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列が好ましく挙げられ、より好ましくは、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列が挙げられる。
　本発明の検出目的となる前記口腔内細菌が有する核酸の塩基配列は、当該塩基配列そのものでなくてもよく、例えば、塩基配列の一部が欠失、置換、挿入等により変異が生じたものであってもよい。
　本発明に用いるプローブとしては、具体的には、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）の塩基配列ＤＮＡからなるものが好ましく挙げられる。
　（ｉ）配列番号２～７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも1つの配列
　（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
　（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
　ここで、上記（ｉｉｉ）の配列における「実質的に同一の配列」とは、配列番号２～７に記載の配列又は相補配列に対して、前述したようなストリンジェントな条件の下でハイブリダイズし得る塩基配列であり、より具体的には、配列番号２～７に記載の配列又は相補配列に対して、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列が挙げられる。
（２）プローブ（ｂ）について
　総量指標プローブは、特定のプライマー対で増幅できた検体の中のすべての細菌を捕捉する目的のプローブである。細菌を検出する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそも検体中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から細菌の総量を検出することもきわめて重要となる。
　非検出対象細菌は、存在や種類は分かっているが検出対象としなくてもよい細菌、及び存在や種類が不明である細菌の和（合計）として理解できる。
　細菌の総量を検出するためには、例えば、ＤＮＡチップによる測定とは別に、独立に細菌の総量を測定することも可能であるが、ＤＮＡチップ中に細菌の総量の指標となるプローブを搭載しておくことにより操作・測定の簡便性が向上する。プローブについては、プライマー対によって増幅される塩基配列の中から、多種類の菌種に共通な塩基配列を使用してもよい。そのような配列が見つからない場合は、比較的共通な配列を複数設計し、それらを総合的に判断することで総量指標プローブとしてもよい。総量指標プローブは、好ましくは、検体に含まれる細菌に由来する核酸にハイブリダイズするプローブ、詳しくは、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列を含むプローブである。
　総量指標プローブの例を、表１（配列番号１）に示す。
（３）プローブ（ｃ）について
　絶対量指標プローブは、絶対量指標の核酸にのみハイブリダイズするプローブである。
　本明細書において、絶対量指標とは、増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、検体中に一定量添加する核酸である。絶対量指標は、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。
　従って、絶対量指標に特異的なプローブを、ＤＮＡチップに搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを確認することができる。また、絶対量指標を１種類設定した場合、複数のＤＮＡチップから得られる絶対量指標の蛍光強度は一定になるはずであり、多少増幅効率やハイブリダイゼーション効率が増減した場合に、絶対量指標の蛍光強度を比較することにより補正係数を算出することができる。複数のＤＮＡチップにおいて、補正した蛍光強度は比較することができる。
　絶対量指標プローブの例を、表１（配列番号９～２３）に示す。また、絶対量指標となる塩基配列（絶対量指標プローブによる検出対象となる塩基配列）の例を、表２（配列番号２４～３８）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　絶対量指標は、例えば、産業技術総合研究所が開発した定量解析用核酸標準物質を利用しても良いし、新たに設計しても良い。設計する場合には、例えば、ソフトウェア「ＥＸＣＥＬ」（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ社製）のＲＮＤＢＥＴＷＥＥＮ関数を使用し、１から４までの整数をランダムにＸ個（Ｘは任意の数）発生させ、それをつなげて１から４までの数値のみから構成されるＸ桁の数値とし、１をＡ、２をＴ、３をＣ、４をＧと置き換えることにより、ＡＴＧＣのＸ塩基によるランダム配列を多数得ることができる。
　これらの配列につき、ＧとＴの和がＡとＴの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索し、生物由来の核酸に対し、類似配列の少ないものを選抜し、配列の両末端にプライマー配列を付加することで、設計可能である。また、設計された配列を適宜連結させて長くしたり、部分的に除去して短くしたりすることも可能である。
　増幅反応時における反応効率をなるべく一定にするために、検出対象細菌にて増幅される塩基長と絶対量指標の増幅塩基長は大きな差のないようにすることが望ましい。例えば、検出対象細菌の増幅産物が５００ｂｐ程度となるのであれば、絶対量指標の増幅産物は３００ｂｐから１０００ｂｐ程度とすることが望ましい。
　一方で、増幅後に電気泳動等で増幅鎖長を確認する場合においては、検出対象細菌とは異なる長さの増幅産物となるように設計した上で、絶対量指標由来の増幅産物を検出対象細菌のバンドとは異なる位置で検出し、ハイブリダイゼーションの前に増幅反応の成否を確認することも可能である。
　絶対量指標を増幅反応前に添加するのであれば、特定のプライマー対にて増幅される核酸であること、すなわちプライマー対と相補な塩基配列を所持していること、かつ、ハイブリダイゼーションで検出するためには、検出対象細菌、非検出対象細菌いずれにおいても所持していない塩基配列を所持している必要がある。
　特定のプライマーとは、増幅対象配列が限定されるという意味であり、プライマー対は必ずしも１対である必要はない。必要に応じて２対以上のプライマー対を用いるマルチプレックス手法も適用できる。プライマー対の例を、表３に示す。絶対量指標用プライマー対（配列番号３９、４０）や、細菌増幅用プライマー対（配列番号４１、４２）を利用することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
２．ＤＮＡチップ
　本発明のＤＮＡチップは、前記１.項で説明した各種プローブが支持体となる基盤に複数配置（搭載）されたものである。
　支持体となる基盤の形態としては、平板（ガラス板、樹脂板、シリコン板等）、棒状、ビーズ等のいずれの形態のものも使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔もって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０，　４６７－４７０　（１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１，　７６７－７７３　（１９９１）等参照）。他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、所定のプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるＤＮＡチップ（以下、「繊維型ＤＮＡチップ」と言う）が好ましく例示できる。このＤＮＡチップは、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのものと説明することもでき、いわゆる「貫通孔型ＤＮＡチップ」とも言われる（特許第３５１０８８２号公報等参照）。
　プローブの支持体への固定方法は限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定することもできる。
　以下、ＤＮＡチップの一形態である繊維型ＤＮＡチップに関して詳細に説明する。繊維型ＤＮＡチップは、例えば、下記（ｉ）～（ｉｖ）の工程を経て作製することができる。
　（ｉ）複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列して配列体を製造する工程
　（ｉｉ）前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
　（ｉｉｉ）プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
　（ｉｖ）中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程
　中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開２００４－１６３２１１号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
　中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように３次元に配列される（工程（ｉ））。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１－１０８９２８号公報参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開２００１－１３３４５３号公報参照）などが挙げられる。
　製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程（ｉｉ））。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂及びエポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法のほか、繊維どうしを熱融着により接着する方法等が好ましく挙げられる。
　包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、プローブを含むゲル前駆体重合性溶液（ゲル形成溶液）を充填し、中空部内で重合反応を行う（工程（ｉｉｉ））。これにより、各中空繊維の中空部に、プローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。
　ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合、溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。
　中空繊維内にプローブを固定した後、中空繊維の長手方向と交差する方向（好ましくは直交する方向）で、ブロック体を切断して薄片化する（工程（ｉｖ））。このようにして得られた薄片は、ＤＮＡチップとして使用できる。当該ＤＮＡチップの厚みは、０．０１ｍｍ～１ｍｍ程度であることが好ましい。ブロック体の切断は、例えば、ミクロトーム及びレーザー等により行うことができる。
　前記した繊維型ＤＮＡチップとしては、例えば、三菱レイヨン社製ＤＮＡチップ（Ｇｅｎｏｐａｌ　ＴＭ）等が好ましく挙げられる。
　繊維型ＤＮＡチップでは、前記のように、プローブはゲル内で３次元的に配列され、３次元構造を維持することが可能となる。そのため、表面をコートしたスライドガラスにプローブを結合させた平面ＤＮＡチップに比べて、検出効率が上昇し、高感度で高再現性の検査をすることが可能となる。
　ＤＮＡチップに配置されるプローブの種類の数は、１つのＤＮＡチップに５００種類以下、好ましくは２５０種類以下、さらに好ましくは１００種類以下が好ましい。このように配置されたプローブ数（種類）をある程度制限することにより、目的の口腔内細菌をより高感度で検出することが可能となる。なお、プローブの種類は塩基配列によって区別される。従って、通常、同じ遺伝子に由来のプローブであっても塩基配列が１個でも異なれば別の種類として特定する。
３．口腔内細菌数を測定する方法
　口腔内細菌数を測定する方法は、例えば、下記の工程を含む方法である。
（I）採取した口腔内試料を検体とし、検体中に含まれる細菌の核酸を抽出する工程
（II）抽出した核酸を、前述した本発明のＤＮＡチップ（又は本発明のプローブ）に接触させる工程
（III）上記接触後のＤＮＡチップ（又はプローブ）から得られた蛍光強度に基づいて細菌数を算出する工程
　以下に、当該測定方法の詳細を工程ごとに説明する。
（１）工程（I）について
　本工程では、採取した口腔内試料（口腔内の細菌（細菌群））を検体とし、検体中に含まれる細菌の核酸を抽出する。検体の採取は、例えば、所望の被験者又は被験生物から行うことができる。採取する口腔内試料の種類は、特には限定されないが、例えば、唾液、プラーク（歯肉縁下プラーク、歯肉縁上プラーク）、舌苔、口腔洗浄液等を使用することができる。
　口腔内試料として唾液を使用する場合、唾液を採取する方法は特には限定されず、例えば、容器に直接唾液を流し込む方法、あるいは綿棒やその他紙状のものに唾液をしみこませる方法等が挙げられる。唾液採取を容易にするために、採取前にガムをかんでも良い。
　採取した試料を輸送する場合は、採取した試料を密閉容器に入れて凍結させ輸送する方法や、ケース付き綿棒を用いて綿棒で試料を採取しケースに収納して輸送する方法が好ましい。
　採取する唾液の量は特には限定されず、口腔内試料に存在する細菌のＤＮＡを検出する方法に応じて適宜選択することができる。例えば、ＤＮＡチップを用いて試料中の遺伝子ＤＮＡを検出する場合は、被験者の唾液であれば０．１ｍＬ以上が好ましく、０．５ｍＬ以上がより好ましい。
　検体から得られた核酸は、そのままＤＮＡチップ等に接触させてもよいし、ＰＣＲ等により所望の塩基配列領域を増幅し、その増幅断片をＤＮＡチップ等に接触させてもよく、限定はされない。増幅する所望の部位としては、具体的には、例えば、前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中のリボソームＲＮＡ　（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）遺伝子であることが好ましい。当該領域の増幅に用い得るＰＣＲプライマーとしては、例えば、表３の配列番号４１、４２が好ましく挙げられる。なお、ＰＣＲ法による核酸の増幅は、定法に従って行うことができる。
　本工程において抽出した核酸及びその増幅断片は、適宜標識化し、ハイブリダイズさせた後の検出過程において利用することも可能である。具体的には、ＰＣＲプライマーの末端を各種レポーター色素で標識しておく方法、反応性のヌクレオチドアナログを逆転写反応時に取り込ませる方法、ビオチン標識したヌクレオチドを取り込ませる方法などが考えられる。さらに、調製後に蛍光標識試薬と反応させて標識することも可能である。蛍光試薬としては、例えば、各種レポーター色素（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＶＩＣ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ　Ｙｅｌｌｏｗ等）を用いることができる。
（２）工程（II）について
　本工程では、工程（I）で得た核酸又はその増幅断片を、本発明に用いるプローブ又はＤＮＡチップに接触させるが、具体的には、当該核酸等を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、当該溶液中の核酸等を、ＤＮＡチップに搭載されたプローブに結合（ハイブリダイズ）させる。ハイブリダイゼーション溶液は、ＳＤＳやＳＳＣ等の緩衝液を用いて、定法に従い、適宜調製することができる。
　ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸等が、ＤＮＡチップに搭載されたプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、ｐＨ、温度等）を適宜設定して行うことができる。
　洗浄後は、プローブに結合した核酸等の標識を検出できる装置により、スポットごとに検出強度を測定する。例えば、前記核酸等を蛍光標識化していた場合は、各種蛍光検出装置、例えば、ＣＲＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）、ａｒｒａｙＷｏＲｘ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ　４２８　Ａｒｒａｙ　Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，社製）、ＧｅｎｅＰｉｘ（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）、ジェノパールリーダー（三菱レイヨン社製）などを用いて、蛍光強度を測定することができる。これらの装置については、蛍光スキャナーの場合は、例えば、レーザーの出力、検出部の感度を適宜調整してスキャンを行うことができ、ＣＣＤカメラ型のスキャナーの場合は、露光時間を適宜調節してスキャンを行うことができる。スキャンの結果に基づく定量方法は、定量ソフトウェアにより行う。定量ソフトウェアに特に限定はなく、スポットの蛍光強度の平均値、中央値等を用いて定量することができる。また、定量にあたっては、ＤＮＡフラグメントのスポット範囲の寸法精度などを考慮し、プローブを搭載していないスポットの蛍光強度をバックグラウンドとして用いるなど、調整を行うことが好ましい。
（３）工程（III）について
　本工程では、前記工程（I）及び（II）の手順を経て、ＤＮＡチップ（又はプローブ）から得られた蛍光強度に基づいて、検出対象菌種の細菌の細菌数を算出する。例えば、検出対象細菌を検出するためのプローブの蛍光強度とバックグラウンドの蛍光強度からＳＮ比として示す方法がある。または、あらかじめ細菌ごとに細菌の染色体ＤＮＡの濃度を変えて複数条件にて検出し、各濃度条件で得られる蛍光強度を元に、細菌ごとに染色体ＤＮＡ濃度を算出する換算係数（検量線）を取得しておき、それぞれの条件で得られた蛍光強度から染色体ＤＮＡの濃度を算出する方法などが好ましい。
　いずれの場合でも、複数のＤＮＡチップの検出から得られる絶対量指標プローブの蛍光強度が一定となるようにＤＮＡチップごとに補正係数を算出し、各ＤＮＡチップの検出対象細菌の蛍光強度に補正係数を考慮することで、ＤＮＡチップ間の比較をしてもよい。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
細菌検出用ＤＮＡプローブの設計
　細菌検出用ＤＮＡプローブを設計するために、１６ＳｒＲＮＡの可変領域として、Ｖ３及びＶ４に着目した。Ｖ３及びＶ４領域のうち、各細菌が特異的に有する配列を選抜し配列番号２～７に示される塩基配列を設計・作製した。
細菌検出用ＤＮＡプローブの評価
＜測定対象＞
　ＡＴＣＣより購入した、各種細菌由来ゲノムＤＮＡ１００ｐｇを測定する検体とし、実施例１で設計・作製した細菌特異的プローブの性能を評価した。
＜ＰＣＲ＞
　細菌由来ゲノムＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡの検出対象領域の配列を増幅するために、以下の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ用キットは、Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑTM　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ＰｒｏＦｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、増幅反応を実施した。プライマーは、以下に示すプライマー条件とした。なお、フォワードプライマーは５’末端がＣｙ５で標識化されているものを用いて、増幅産物の末端を標識した。
＜プライマー配列＞
フォワードプライマー
　５’Ｃｙ５－ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’（配列番号４１）
リバースプライマー
　５’－ＣＲＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＹＧＴＴ－３’ （配列番号４２）
＜反応液組成＞　　
２×Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）
　　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　　　　　　　　　　　１０μＬ　　
４μＭフォワードプライマー（細菌増幅用）（配列番号４１）　　　１μＬ　　
４μＭリバースプライマー（細菌増幅用）（配列番号４２）　　　　１μＬ　　
４μＭフォワードプライマー（絶対量指標増幅用）（配列番号３９）１μＬ　　
４μＭリバースプライマー（絶対量指標増幅用）（配列番号４０）　１μＬ　　
２０ｐｇ検体由来ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５μＬ　　
１ｐｇ絶対量指標　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μＬ
　合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μＬ　　
＜反応条件＞　　
　９５℃で１分間加熱後、「解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：５０℃（３０ｓｅｃ）→合成：７２℃（２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計４０サイクル行い、４℃で冷却し、増幅産物を得た。
＜ＤＮＡチップ：口腔内細菌検出用ＤＮＡチップの製造＞
　貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７－７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例１に記載の方法と同様の方法で製造した。
　ただし、搭載させたプローブは、表１の配列番号１～７、２３に示す配列情報をもつプローブを用いた。
＜ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション＞
　以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
ＰＣＲ後に得たＤＮＡ増幅産物　２０μＬ
１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　　　　４８μＬ
１Ｍ　ＮａＣｌ　　　　　　　　４８μＬ
０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０　　　２０μＬ
水　　　　　　　　　　　　　　６４μＬ　　
　合計　　　　　　　　　　　２００μＬ
　自動ハイブリ洗浄装置（型式：AHF-200、三菱レイヨン社製）を用い、２００μＬのハイブリダイゼーション溶液を前記ＤＮＡチップに接触させ、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションした。
　ハイブリダイゼーション後、下記の条件でＤＮＡチップを洗浄した。０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０溶液１０００μＬで２２０秒の洗浄を１２回繰り返し、続いて、０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ１０００μＬで２２０秒の洗浄を４回繰り返した。
　洗浄終了後に、各チップを室温の０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ混合溶液に移した。
＜検出＞
　前記洗浄後、ジェノパールリーダー（型式：GR-S1、三菱レイヨン社製）を用い、下記条件でＤＮＡチップの各スポットの蛍光強度を測定した。
＜検出条件＞
中心励起波長　：６３３ｎｍ　　
露光時間　：０．１、１、４、４０秒
＜結果＞
　検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度から、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）を減算し、ハイブリダイゼーションに由来する蛍光強度を算出した。その結果、表４に示すとおり、いずれの細菌由来ゲノムＤＮＡにおいても陽性コントロールの役割でもある総量指標のプローブの蛍光強度が認められ、反応の妥当性が確認できた。さらに、本発明の各細菌プローブにおいて、目的の細菌のみ蛍光強度が得られた。以上の結果より、本発明のプローブはいずれも特異性の高いプローブであることが示された。
[規則26に基づく補充 30.03.2018]　
Figure WO-DOC-TABLE-4
唾液検体中の細菌数測定
＜ＤＮＡの調製＞
　成人健常者５名の協力により、唾液評価試験を実施した。この５名の被験者をＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅとし、唾液を評価した。
　唾液採取は、γコレクトスワブＲＩ（栄研化学）を１分間口に含み唾液を採取する方法とした。γコレクトスワブＲＩをチューブ中の水に浸漬し室温で５分静置し、細菌成分を溶出させた。その後、γコレクトスワブＲＩを取り出し、チューブを遠心分離機にかけた。得られたペレットに対し、ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを抽出した。
＜ＤＮＡの解析＞
　ＤＮＡ解析のためのＰＣＲ、検出条件は実施例２と同様の条件にて実施した。ただし、ＤＮＡチップに搭載させたプローブは、表１の配列番号１、４、６、７、８、２３に示す配列情報をもつプローブを用いた。
＜結果＞

　検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度から、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）を減算し、ハイブリダイゼーションに由来す蛍光強度を算出した。
　さらに、実施例２のように、濃度既知の細菌ＤＮＡを複数評価することにより、検量線を作成し、蛍光強度を唾液１ｍｌ中の細菌数へ換算した。その結果、表５に示すとおり、目的の細菌５種類の存在量及び総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の菌数に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの比率を算出することが出来た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上の結果より、口腔内における、齲蝕関連細菌のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｏｂｒｉｎｕｓ、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及び総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の存在量、及び総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の菌数に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの比率という多項目を同時に短時間で算出することができた。
　本発明によれば、齲蝕の細菌検査として、齲蝕の原因細菌（複数種の細菌群）の検出及び齲蝕の判定を、効率的かつ迅速に行うことができる手段・方法を提供することができる。
　具体的には、本発明によれば、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）と、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｏｂｒｉｎｕｓと、総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の各細菌の細菌数を、当該各細菌に特異的なＤＮＡ配列に対応するプローブを搭載したＤＮＡチップを用いることにより、同時に且つ短時間で算出することができる。
　配列番号１～４２：合成ＤＮＡ

Claims (3)

  1. 　下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを搭載したＤＮＡチップ。
    （ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ
    　（ｉ）配列番号２～７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列
    　（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
    　（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
    （ｂ）総量指標プローブ
    （ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
  2. 　ＤＮＡチップの形態が繊維型ＤＮＡチップである、請求項１に記載のＤＮＡチップ。
  3. 　下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを含む、齲蝕細菌検出用プローブセット。
    （ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ
    　（ｉ）配列番号２～７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列
    　（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
    　（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
    （ｂ）総量指標プローブ
    （ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
     
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