JP7224297B2 - 歯周ポケット炎症面積の推定方法 - Google Patents
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Description
そこで、これまでに、簡便な歯周病の診断方法が提案されている。例えば、特許文献1では、歯肉溝滲出液に含まれるタンパク質を歯周病疾患マーカーとして利用した歯周病診断方法が開示されている。また、特許文献2では、唾液中の複数のタンパク質を分析することにより、歯周ポケットの深さ(PPD)や歯肉出血指数(BOP)を予測する手法が開示されている。しかしながら、通常、PPDやBOPについては、測定箇所が168箇所(28本の歯×6点法)も存在するため、実際にどの箇所について予測がされているのか不明である。
これまで、これら「歯周ポケット炎症面積」を簡便に評価するために、唾液中の歯周病細菌数との関係について検討されたことがあるが、P.g菌(Porphyromonas gingivalis(ポルフィロモナス・ジンジバリス))の菌数とCAPRS値との間、及び、レッドコンプレックス菌(P.g菌、T.d菌(Treponema denticola(トレポネーマ・デンティコラ))、T.f菌(Tannerella forsythensis(タネレラ・フォーサイセンシス)))の菌数とCAPRS値との間には相関が無く(非特許文献2、図3a,b)、唾液サンプルから簡便に「歯周ポケット炎症面積」予測する方法は知られていなかった。
また、このような状況下において、唾液中の細菌量の検出結果に基づいて、炎症面積(PISA値)等といった歯周組織の炎症度を簡便に予測する方法の提供が望まれていた。
該細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが負の相関関係を示す細菌とを含む、方法。
[2] 前記歯周ポケット炎症面積がPISA、又はCAPRSの値で表されるものである、[1]に記載の方法。
[3] 正の相関関係を示す細菌が、Treponema denticola、Tannerella forsythia、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Porphyromonas gingivalis、Campylobacter rectus、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Selenomonas noxia、Veillonella parvula、Streptococcus gordonii、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Streptococcus intermedius、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium periodonticum、SR1 sp. OT 345、Porphyromonas catoniae、Selenomonas sputigena、Neisseria flavescens、Streptococcus sobrinus、Parvimonas micra、Peptostreptococcus stomatis、Treponema socranskii、Eubacterium saphenum、Eubacterium nodatum、Treponema medium、Filifactor alocis、及びPorphyromonas endodontalisからなる群から選ばれる少なくとも1種である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 負の相関関係を示す細菌が、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Streptococcus mitis bv 2、Streptococcus mitis、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Prevotella pallens、Streptococcus salivarius、Eubacterium sulci、Rothia mucilaginosa、Prevotella denticola、Veillonella atypica、Prevotella histicola、Megasphaera micronuciformis、及びStreptococcus parasanguinisからなる群から選ばれる少なくとも1種である、[1]~[3]のいずれか1項に記載の方法。
[5] 以下の(1)~(4)工程を有する、[1]~[4]のいずれか1項に記載の方法。
(1)歯周ポケット炎症面積が既知の被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する工程
(2)当該各種細菌の細菌量について、菌ごとに固有の歯周ポケット炎症面積との相関係数を求め、各種細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積との関係式を構築して予測モデルを作成する工程
(3)歯周ポケット炎症面積が未知の被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する工程
(4)(3)で得られた各種細菌量を(2)で得られた関係式に入れて歯周ポケット炎症面積を推定する工程
[6] 前記予測モデルの作成方法が、線形回帰、回帰木、モデル木、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、バギング、ブースティング、ランダムフォレストの機械学習アルゴリズムから選ばれる1種を使用する方法である、[5]に記載の方法。 [7] 唾液中の1種以上の細菌の細菌量を検出し、得られた検出結果を指標として、歯周組織の炎症度を包括的に推定する方法。
[8] 歯周組織の炎症度が、PISA又はCAPRSの値である、[7]に記載の方法。
[9] 検出される細菌の細菌量が、唾液中の該細菌のコピー数である、[7] 又は[8]に記載の方法。
[10] 検出される細菌の細菌量が、唾液中の該細菌の16S rRNA配列情報に基づく細菌量である、[7]~[8]のいずれか1項に記載の方法。
[11] 検出される細菌が、Porphyromonas属、Tannerella属、Treponema属、Prevotella属、Campylobacter属、Fusobacterium属、Streptococcus属、Aggregatibacter属、Capnocytophaga属、Eikenella属、Actinomyces属、Veillonella属及びSelenomonas属から選ばれる少なくとも1種の属に属する細菌である、[7]~[10]のいずれか1項に記載の方法。
[12] 検出される細菌が、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Streptococcus mitis bv 2、Streptococcus mitis、Campylobacter concisus、Prevotella intermedia、Campylobacter showae、Prevotella nigrescens、Eikenella corrodens、Capnocytophaga gingivalis、Actinomyces naeslundii II、Streptococcus constellatus、Campylobacter gracilis、Fusobacterium periodonticum、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Capnocytophaga sputigena、Capnocytophaga ochracea、Streptococcus intermedius、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Streptococcus gordonii、Veillonella parvula、Selenomonas noxia、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Campylobacter rectus、Porphyromonas gingivalis、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Tannerella forsythia及びTreponema denticolaから選ばれる少なくとも1種である、[7]~[11]のいずれか1項に記載の方法。
[13] 検出される細菌は、該細菌の細菌量と歯周組織の炎症度とが正の相関関係となり得る細菌を含む、[7]~[12]のいずれか1項に記載の方法。
[14] 前記正の相関関係となり得る細菌が、Fusobacterium periodonticum、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Capnocytophaga sputigena、Capnocytophaga ochracea、Streptococcus intermedius、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Streptococcus gordonii、Veillonella parvula、Selenomonas noxia、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Campylobacter rectus、Porphyromonas gingivalis、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Tannerella forsythia及びTreponema denticolaから選ばれる少なくとも1種である、[13]に記載の方法。
[15] 検出される細菌は、該細菌の細菌量と歯周組織の炎症度とが負の相関関係となり得る細菌を含む、[7]~[12]のいずれか1項に記載の方法。
[16] 前記負の相関関係となり得る細菌が、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Streptococcus mitis bv 2、Streptococcus mitis、Campylobacter concisus、Prevotella intermedia、Campylobacter showae、Prevotella nigrescens、Eikenella corrodens、Capnocytophaga gingivalis、Actinomyces naeslundii II、Streptococcus constellatus及びCampylobacter gracilisから選ばれる少なくとも1種である、[15]に記載の方法。
また、本発明によれば、唾液中の細菌量の検出結果に基づいて、炎症面積(PISA値、CAPRS値)といった歯周組織の炎症度を簡便に予測することができる。すなわち、精密な歯周病検査(ポケット実測や撮像)をしなくとも、採取した唾液を用いて、簡便に口腔全体の炎症度(炎症指標数値)を推定することができる。
i)唾液中の2種以上の細菌の細菌量を検出する工程、及び、ii)得られた検出結果を指標として歯周ポケット炎症面積を推定する工程。
本発明の第二の態様である、歯周組織の炎症度を包括的に推定する方法(以下、「第二の発明群」ともいう。)の発明は、以下の工程を包含するものである。
i)唾液中(被験体、特にヒトの唾液中)の1種以上の細菌の細菌量を検出する工程、及び、ii)得られた検出結果を指標として歯周組織の炎症度を包括的に推定する工程。
本発明の方法においては、被験者から採取された唾液中から口腔内の細菌量を測定する際に、DNAチップを使用することができる。当該DNAチップには、例えば、以下のプローブ(a)(細菌特異的プローブ)を搭載することができ、さらに、プローブ(b)(総量指標プローブ)やプローブ(c)(絶対量指標プローブ)を搭載することもできる。
(b)総量指標プローブ:すべての細菌の遺伝子にハイブリダイズする核酸からなるプローブ
(c)絶対量指標プローブ:1種類又は複数種類の絶対量指標それぞれに特異的にハイブリダイズする核酸からなるプローブ
本発明の方法において、検出対象(細菌量の測定対象)となる唾液中の細菌としては、限定はされないが、例えば、以下に列挙する各属に属する細菌、すなわち、Porphyromonas属、Tannerella属、Treponema属、Prevotella属、Campylobacter属、Fusobacterium属、Streptococcus属、Aggregatibacter属、Capnocytophaga属、Eikenella属、Actinomyces属、Veillonella属、Selenomonas属、Eubacterium属、Parvimonas属、Filifactor属、Haemophilus属、Alloprevotella属、Solobacterium属、Rothia属、Peptostreptococcus属、Gemella属、Corynebacterium属、Neisseria属、Granulicatella属、Megasphaera属及びSR1門から選ばれる少なくとも1種の属に属する細菌であることが好ましい。
より具体的には、以下に列挙する各種細菌から選ばれる少なくも1種、又は2種以上を検出対象とすることがより好ましい。
Tannerella forsythia
Treponema denticola
Campylobacter gracilis
Campylobacter rectus
Campylobacter showae
Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii
Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum
Fusobacterium nucleatum subsp. animalis
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum
Fusobacterium periodonticum
Prevotella intermedia
Prevotella nigrescens
Streptococcus constellatus
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Campylobacter concisus
Capnocytophaga gingivalis
Capnocytophaga ochracea
Capnocytophaga sputigena
Eikenella corrodens
Streptococcus gordonii
Streptococcus intermedius
Streptococcus mitis
Streptococcus mitis bv 2
Actinomyces odontolyticus
Veillonella parvula
Actinomyces naeslundii II
Selenomonas noxia
Streptococcus mutans
Eubacterium nodatum
Parvimonas micra
Filifactor alocis
Streptococcus sobrinus
Porphyromonas pasteri
Veillonella atypica
Haemophilus parainfluenzae
Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308)
Streptococcus parasanguinis
Actinomyces israelii
Prevotella pallens
Prevotella loescheii
Prevotella histicola
Solobacterium moorei
Prevotella melaninogenica
Selenomonas sputigena
Rothia dentocariosa
Rothia mucilaginosa
Veillonella rogosae
Peptostreptococcus stomatis
Prevotella denticola
Porphyromonas endodontalis
Streptococcus salivarius
Actinomyces graevenitzii
Treponema medium
Treponema socranskii
Gemella sanguinis
Porphyromonas catoniae
Corynebacterium matruchotii
Eubacterium saphenum
Neisseria flavescens
Granulicatella adiacens
Eubacterium sulci
Megasphaera micronuciformis
Prevotella shahii
SR1 sp. OT 345
歯周ポケット炎症面積とは、PISA(periodontal inflamed surface area:歯周炎症表面積)やCAPRS(conccaled area in periodontal pockt of tooth root surfase : 歯周ポケット内歯根表面積)を含む炎症を示す面積であり、同様の概念の指標があればその指標も含まれる。
DNAチップを用いて確認する場合、口腔内試料をDNAチップで測定し、その後歯周ポケット炎症面積と各細菌の細菌量またはSN比のような測定量との相関係数を算出し、相関係数が正の値となる細菌群と負の値となる細菌群として分類、特定することができる。これらの細菌は、測定回数が40回以上の場合に相関係数の絶対値が0.02以上であることが好ましく、0.1以上であることがより好ましく、0.2以上であることがさらに好ましく、0.4以上であることが特に好ましく、0.6以上であることが最も好ましい。
後述する、歯周ポケット炎症面積を推定するための予測モデルの作成に実験誤差補正後のデータを用いる際は、細菌群の分類にも実験誤差補正後のデータを用いる。
Treponema denticola
Tannerella forsythia
Fusobacterium nucleatum subsp. animalis
Porphyromonas gingivalis
Campylobacter rectus
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum
Selenomonas noxia
Veillonella parvula
Streptococcus gordonii
Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii
Streptococcus intermedius
Capnocytophaga ochracea
Capnocytophaga sputigena
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum
Fusobacterium periodonticum
SR1 sp. OT 345
Porphyromonas catoniae
Selenomonas sputigena
Neisseria flavescens
Streptococcus sobrinus
Parvimonas micra
Peptostreptococcus stomatis
Treponema socranskii
Eubacterium saphenum
Eubacterium nodatum
Treponema medium
Filifactor alocis
Porphyromonas endodontalis
Streptococcus mutans
Actinomyces odontolyticus
Streptococcus mitis bv 2
Streptococcus mitis
Campylobacter concisus
Capnocytophaga gingivalis
Prevotella pallens
Streptococcus salivarius
Eubacterium sulci
Rothia mucilaginosa
Prevotella denticola
Veillonella atypica
Prevotella histicola
Megasphaera micronuciformis
Streptococcus parasanguinis
上記正の相関関係を有する細菌としては、例えば、以下に列挙する細菌が好ましく挙げられ、これらのうちの少なくとも1種、好ましくは2種以上を検出対象とすることがより好ましい。
Tannerella forsythia
Fusobacterium nucleatum subsp. animalis
Porphyromonas gingivalis
Campylobacter rectus
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum
Selenomonas noxia
Veillonella parvula
Streptococcus gordonii
Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii
Streptococcus intermedius
Capnocytophaga ochracea
Capnocytophaga sputigena
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum
Fusobacterium periodonticum
Actinomyces odontolyticus
Streptococcus mitis bv 2
Streptococcus mitis
Campylobacter concisus
Capnocytophaga gingivalis
本発明において、細菌特異的プローブとして使用され得るオリゴDNAは、唾液中の細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの特定の領域中の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。ここで、当該核酸は、染色体DNAやプラスミドDNA等を含むDNA及びRNAのいずれでもよく限定はされないが、染色体DNAであることが好ましい。具体的には、本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、前記細菌の染色体DNA中の16S rRNA遺伝子の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。
本発明に用い得るプローブは、検出目的となる個々の細菌に特異的な塩基配列となるような領域を選択してその領域の塩基配列を設計することが好ましい。一般的に、プローブの設計の際には、特異的な領域を選択することに加え、融解温度(Tm)がそろっていて、二次構造を形成しにくいものである必要がある。
プローブの特異性は、属レベルの特異性を基に同じ属の細菌を一括に検出するものであってもよいし、個々の種レベルで検出可能な特異性であってもよく、検出目的に応じて適宜選択・設計が可能である。
本発明において用い得る細菌特異的なプローブの例を、下記の表Aに示す(配列番号1~29)。
総量指標プローブは、特定のプライマー対で増幅できた、検体中(唾液中)のすべての細菌を捕捉する目的のプローブである。細菌を検出する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそも検体中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から、細菌の総量を検出することも重要となる。
細菌の総量を検出するためには、例えば、DNAチップとは独立に細菌の総量を測定することも可能であるが、DNAチップ中に細菌の総量の指標となるプローブを搭載しておくことにより操作の簡便性が向上する。プローブについては、プライマー対によって増幅される塩基配列の中から、多種類の菌種に共通な塩基配列を使用してもよい。そのような配列が見つからない場合は、比較的共通な配列を複数設計し、それらを総合的に判断することで総量指標プローブとしてもよい。総量指標プローブは、好ましくは、検体中に含まれる細菌に由来する核酸にハイブリダイズするプローブ、詳しくは、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列を含むプローブである。総量指標プローブの例を、下記の表A(配列番号31)に示す。
そのような状況を防ぐためには、ハイブリダイゼーションに供する検体量を制限することが望ましい。又は、プローブを設計する際には、例えば当該プローブのTm値を低くする。具体的にはGC含量を少なくすることや、プローブの配列長自体を短くする方法が考えられる。
また、ハイブリダイゼーションに際して、増幅された核酸と総量指標プローブとのハイブリダイゼーションに対して競合的に作用するような核酸を添加することで、シグナル強度の低減化を図ることが可能である。このような核酸としては、例えば、総量指標プローブと全て又は部分的に同じ配列を有する核酸、又は総量指標プローブの相補配列を全て又は部分的に有する核酸などが挙げられる。
絶対量指標プローブは、絶対量指標の核酸にのみハイブリダイズするプローブである。
本明細書において、絶対量指標とは、増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、検体中に一定量添加する核酸である。絶対量指標は、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。
従って、絶対量指標に特異的なプローブを、DNAチップに搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを確認することができる。また、絶対量指標を1種類設定した場合、多少増幅効率やハイブリダイゼーション効率が増減した場合に、絶対量指標のシグナル強度を比較することにより補正係数を算出することができる。複数のDNAチップにおいて、補正したシグナル強度は比較することができる。
に示す。また絶対量指標の例を、下記の配列番号74に示す。
CTATTCGACCAGCGATATCACTACGTAGGC(配列番号30)
GTGAGAAGCCTACACAAACGTAACGTCAGGGCTAAGACAAACGCTAACGGTACACCCTAGATGGGAGCTTGTAGCTAGATCGCTAAGTCCTACCGACATGTAGGCATACTCACGAAGGCAATTCCCTGAAAGCCTCGTCTTATCCCGAACTTGGCATCTGCTGATACGTCAGGTTGAACGCGTACATTTACCTGTCATGCGTGGGCCTTCTCCGAATAGCCTACGTAGTGATATCGCTGGTCGAATAGGCGGATTGCTCATAAATGCACATTGGCTAAGGCCCACGGAACACGAATCACGTGAGATCACTTACTATTCGACGGAACTACTATACGCACCGGGACATGCAAGTAGCGTCCCACAAGCATAAGGAACTCTATACTCGCCATCTACGCAGCTACAGGGGATACACGTATGAGCGGTTACGAAGTAAAGCCGAGATAGAGCGGTCTTTAGAGAAAAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC(配列番号74)
特定のプライマーとは、増幅対象配列が限定されるという意味であり、プライマー対は必ずしも1対である必要はない。必要に応じて2対以上のプライマー対を用いるマルチプレックス手法も適用できる。プライマー対の例を、下記の表Bに示す。細菌増幅用プライマー対(配列番号32、33)や、絶対量指標用プライマー対(配列番号34、35)を利用することが可能である。
これらの配列につき、GとTの和がAとTの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、NCBIのGenBank等のデータベースに対してBlast検索し、生物由来の核酸に対し、類似配列の少ないものを選抜し、配列の両末端にプライマー配列を付加することで、設計可能である。また、設計された配列を適宜連結させて長くしたり、部分的に除去して短くしたりすることも可能である。
一方で、増幅後に電気泳動等で増幅鎖長を確認する場合においては、検出対象細菌とは異なる長さの増幅産物となるように設計した上で、絶対量指標由来の増幅産物を検出対象細菌のバンドとは異なる位置で検出し、ハイブリダイゼーションの前に増幅反応の成否を確認することも可能である。
最後に、検体中に含まれる絶対量指標はあまりにも濃度が高いと検出対象の細菌と増幅反応における競合が激しくなり、本来検出できるはずの検出対象細菌が検出できなくなる可能性もあるため、アプリケーションに応じて適宜濃度調整をする必要がある。
また、本発明に用いるプローブを構成するヌクレオチドは、DNA及びRNA、又はPNAのいずれであってもよく、DNA、RNA及びPNAの2種以上のハイブリッドであってもよい。
ここで、実質的に同一とは、配列番号1~31に記載の配列又は相補配列に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするものである。
(e) 上記(d)のDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ唾液中の細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列を検出し得る機能を有するDNA
また、上記(e)のDNAは、上記(d)の各種DNA若しくはそれと相補的な塩基配列からなるDNA、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、及びサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、cDNAライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のcDNAライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、前記と同様のものを参照することができる。上記(e)のDNAに関し、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション時の条件であって、バッファーの塩濃度が24~390mM、温度が40~65℃、好ましくは塩濃度が48.8~195mM、温度が45~60℃の条件を意味する。具体的には、例えば97.5mMで50℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間などの諸条件も考慮し、前記(e)のDNAを得るための条件を適宜設定することができる。ハイブリダイズするDNAとしては、前記(d)のDNAの塩基配列に対して少なくとも60%以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上である。
本発明の方法において、検出目的となる前述した唾液中の細菌が有する核酸の塩基配列は、当該塩基配列そのものである必要はなく、塩基配列の一部が欠失、置換、挿入等により変異が生じたものであってもよい。したがって、検出目的の核酸の塩基配列は、当該塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれの塩基配列に由来する機能や活性を有する変異型遺伝子も対象とすることができ、プローブは、このような変異型遺伝子の塩基配列を基礎として設計することもできる。ここで「ストリンジェントな条件」は、前記と同様の条件を適用することができる。
前記したように、本発明の方法においては、唾液中の細菌量の検出・測定に、DNAチップを用いることができる。当該DNAチップは、、歯周組織の炎症度を包括的に推定するという用途に用いられるものであり、前記1.項で説明した各種オリゴヌクレオチドプローブが支持体となる基盤に複数配置されたものである。
以下、DNAチップの一形態である繊維型DNAチップに関して詳細に説明する。このDNAチップは、例えば、下記(i)~(iv)の工程を経て作製することができる。
(ii) 前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
(iii) オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
(iv) 中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程
中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように3次元に配列される(工程(i))。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法(特開平11-108928号公報参照)や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板2枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後2枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、2枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法(特開2001-133453号公報参照)などが挙げられる。
包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液(ゲル形成溶液)を充填し、中空部内で重合反応を行う(工程(iii))。これにより、各中空繊維の中空部に、プローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。
ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合、溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。
前記した繊維型DNAチップとしては、例えば、三菱ケミカル社製DNAチップ(Genopal TM)等が好ましく挙げられる。
繊維型DNAチップでは、前記のように、プローブはゲル内で3次元的に配列され、3次元構造を維持することが可能となる。そのため、表面をコートしたスライドガラスにプローブを結合させた平面DNAチップに比べて、検出効率が上昇し、高感度で高再現性の検査をすることが可能となる。
また、DNAチップに配置されるプローブの種類の数は、1つのDNAチップに500種類以下、好ましくは250種類以下、さらに好ましくは100種類以下が好ましい。このように配置されたプローブ数(種類)をある程度制限することにより、目的の口腔内細菌をより高感度で検出することが可能となる。なお、プローブの種類は塩基配列によって区別される。従って、通常、同じ遺伝子に由来のプローブであっても塩基配列が1個でも異なれば別の種類として特定する。
本発明の方法において、唾液中の細菌量を測定するために当該細菌を検出する方法は、例えば、下記の工程を含む方法である。
(ii)抽出した核酸を、前記した本発明のオリゴヌクレオチドプローブ又は本発明のDNAチップに接触させる工程
(iii)DNAチップから得られたシグナル強度から細菌量を算出する工程
(1)工程(i)について
本工程では、被験者又は被生物から採取した口腔内試料としての唾液を検体とし、検体中(唾液中)に含まれる細菌の核酸を抽出する。唾液を採取する方法は特には限定されず、例えば、市販の唾液採取キットを利用する方法、綿棒を口に含み唾液を採取する方法、唾液を容器に直接採取する方法等が挙げられる。
唾液を採取する被験者は、特に限定はされないが、例えば、歯周病などの口内炎症を患っている患者に加え、歯周病などの口内炎症の自覚が無い者、又は心疾患など歯周病と関連が示唆される全身疾患患者や妊婦などでもよいし、あるいは、歯周病の罹患の疑いのない健常者であってもよい。
次いで、得られた唾液中に存在する細菌の核酸抽出を行う。抽出の方法は限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、機器による自動抽出法、市販の核酸抽出キットを利用する方法、プロテイナーゼK処理後にフェノール抽出する方法、クロロホルムを利用する方法又は簡易抽出方法として、試料を加熱、溶解する方法等が挙げられる。また、特に検体中から核酸を抽出せず、次の工程に進んでも良い。
本工程において抽出した核酸及びその増幅断片は、適宜標識化し、ハイブリダイズさせた後の検出過程において利用することも可能である。具体的には、PCRプライマーの末端を各種レポーター色素で標識しておく方法、反応性のヌクレオチドアナログを逆転写反応時に取り込ませる方法、ビオチン標識したヌクレオチドを取り込ませる方法などが考えられる。さらに、調製後に蛍光標識試薬と反応させて標識することも可能である。蛍光試薬としては、例えば、各種レポーター色素(例えば、Cy5、Cy3、VIC、FAM、HEX、TET、フルオレセイン、FITC、TAMRA、Texas red、Yakima Yellow等)を用いることができる。
本工程では、工程(i)で得た核酸又はその増幅断片を、本発明に用いるプローブ又はDNAチップに接触させるが、具体的には、当該核酸等を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、当該溶液中の核酸等を、DNAチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブに結合(ハイブリダイズ)させる。ハイブリダイゼーション溶液は、SDSやSSC等の緩衝液を用いて、定法に従い、適宜調製することができる。
ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸等が、DNAチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件(緩衝液の種類、pH、温度等)を適宜設定して行うことができる。なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい、又は類似配列によってクロスハイブリダイゼーションした核酸を解離させる条件のことをいい、具体的には、ハイブリダイゼーション反応時又はハイブリダイゼーション後のDNAチップの洗浄条件を意味する。
例えば、ハイブリダイゼーション反応時の条件としては、反応温度は、35~70℃が好ましく、より好ましくは40~65℃であり、ハイブリダイズさせる際の時間は、約1分~16時間が好ましい。
本工程では、前記の手順で得られたシグナル強度より、検出対象菌種の細菌の細菌量を算出する。たとえば、検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度とバックグラウンドのシグナル強度からSN比として示す方法がある。または、あらかじめ細菌ごとに細菌の染色体DNAの濃度を変えて複数条件にて検出し、各濃度条件で得られるシグナル強度をもとに、細菌ごとに染色体DNA濃度を算出する換算係数(検量線)を取得しておき、それぞれの条件で得られたシグナル強度から染色体DNAの濃度を算出する方法などが好ましい。本発明においては、例えば、検出対象の細菌の16S rRNA配列情報に基づく、シグナル強度から、細菌量を算出することが好ましい。また、検出対象の細菌のゲノムコピー数を、細菌量とすることも好ましく採用できる。ゲノムコピー数は、DNAチップで検出されたシグナル強度に、事前に決定していた各細菌量算出係数を乗算し(且つ、必要に応じ、検出検体の希釈率を乗算し)、算出できる。各細菌量算出係数は、各細菌由来ゲノムDNAを検出したときのシグナル強度を測定し検量線を作成しておき、各細菌のシグナル強度から各細菌量を逆算する係数として求めておくことができる。
いずれの場合でも、各DNAチップの検出対象細菌のシグナル強度に補正係数を考慮することが好ましい。
本発明の方法は、唾液中の細菌の細菌量の検出結果を指標として、歯周ポケット炎症面積を推定する方法である。また、本発明の方法は、前記検出結果を指標として、歯周組織の炎症度を包括的に推定する方法である。
唾液中の細菌の細菌量の検出には、いかなるツールを用いてもよく、前記3.項で説明したようにDNAチップを用いる方法や、その他、酵素活性で菌の存在を確認する方法、電気的抵抗を測定し菌の総量を測定する方法、位相差顕微鏡と染色により細菌を数え上げる方法、培養して生菌数を測定する方法、リアルタイムPCRで個々の細菌数を定量する方法等が挙げられる。
(1)歯周ポケット炎症面積(PISA値、CAPRS値等)が既知の(実測されたPPD等から算出可能な)被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する。
(2)当該各種細菌の細菌量について、菌ごとに固有の歯周ポケット炎症面積との相関係数を求め、各種細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積との関係式を構築して予測モデルを作成する。
(3)歯周ポケット炎症面積が未知の被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する。
(4)(3)で得られた各種細菌量を(2)で得られた関係式に入れて歯周ポケット炎症面積を推定する。
Porphyromonas gingivalis,Tannerella forsythia,Treponema denticola,Campylobacter rectus,Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii,Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum,Fusobacterium nucleatum subsp. animalis,Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum,Fusobacterium periodonticum,Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Capnocytophaga ochracea,Capnocytophaga sputigena,Streptococcus gordonii,Streptococcus intermedius,Veillonella parvula,Selenomonas noxia,Solobacterium moorei,Prevotella loescheii,Veillonella rogosae,Actinomyces israelii,Corynebacterium matruchotii,SR1 sp. OT 345,Porphyromonas catoniae,Selenomonas sputigena,Neisseria flavescens,Streptococcus sobrinus,Parvimonas micra,Peptostreptococcus stomatis,Treponema socranskii,Eubacterium saphenum,Eubacterium nodatum ,Treponema medium,Filifactor alocis,Porphyromonas endodontalis
,Porphyromonas gingivalis,Tannerella forsythia,Treponema denticola,Campylobacter rectus,Fusobacterium nucleatum subsp. animalis,Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum,Veillonella parvula,Selenomonas noxia,Eubacterium saphenum,Eubacterium nodatum ,Treponema medium,Filifactor alocis,Porphyromonas endodontalis
正の相関を示す細菌としては、1種以上を用いることが好ましく、4種以上を用いることがより好ましく、8種以上を用いることがさらに好ましく、12種以上を用いることが特に好ましい。また、100種以下を用いることが好ましく、75種以下を用いることがより好ましく、50種以下を用いることがさらに好ましく、25種以下を用いることが特に好ましい。
負の相関祖示す細菌として、好ましくは以下の細菌が挙げられる。Streptococcus mitis,Streptococcus mitis bv 2,Actinomyces odontolyticus,Streptococcus mutans,Campylobacter concisus,Capnocytophaga gingivalis,Prevotella pallens,Streptococcus salivarius,Eubacterium sulci,Rothia mucilaginosa,Prevotella denticola,Veillonella atypica,Prevotella histicola,Megasphaera micronuciformis,Streptococcus parasanguinis,Gemella sanguinis,Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308),Prevotella melaninogenica,Actinomyces graevenitzii,Prevotella shahii,Rothia dentocariosa,Granulicatella adiacens,Porphyromonas pasteri,Haemophilus parainfluenzae
負の相関を示す細菌としては、1種以上を用いることが好ましく、2種以上を用いることがより好ましく、4種以上を用いることがさらに好ましく、8種以上を用いることが特に好ましい。また、100種以下を用いることが好ましく、75種以下を用いることがより好ましく、50種以下を用いることがさらに好ましく、25種以下を用いることが特に好ましい。
大阪大学歯学部附属病院にて、歯周病治療中の20代~70代の男女被験者計46人から、唾液1ml以上、46サンプルを採取した。採取した唾液は使用前まで-20℃で凍結して保管した。
<臨床情報の取得>
すべてのサンプルについて下記の臨床情報を記録した。下記2項目は歯科において広く活用されている指標である。
(i)歯周ポケットの深さ(PPD):歯周プローブをポケットに挿入した際の,歯肉辺縁からプローブ先端までの距離を示す。6点法で頬側近心、頬側中央、頬側遠心、舌側近心、舌側中央、舌側遠心を測定し、1mm単位で数値化した。
(ii)プロービング時の出血(BOP):歯周プローブをポケットに挿入した際に出血の有無を示す。上記の6点法と対応した位置に対して出血がない場合を0、出血がある場合を1とした。
(i)歯周ポケットの深さ(PPD)と(ii)プロービング時の出血(BOP)を、表1にまとめた。
続いて、記録した6点法による歯周病検査結果から、公知文献(Nesse, W., Abbas, F., van der Ploeg, I., Spijkervet, F.K.,Dijkstra ,P.U., Vissink, A.: Periodontal inflamed surface area: quantifying inflammatory burden. Journal of Clinical Periodontology, 35: 668-673, 2008.)を参照し、表2に示すようにPISA(Periodontal inflamed surface area)を算出した。PISAは口腔全体の歯周組織の炎症部位面積を平方ミリメートル(mm2)で示したものである。
表3に、46名のPISA値をまとめて示した。
<唾液からのDNAの抽出>
1-1 ビーズ破砕
2mlのチューブに前述の唾液のうち400μl、滅菌水400μlと0.1mmガラスビーズ0.4g(トミー精工社製#GB-01)を入れフタをしっかり締めた後、マイクロスマッシュ(トミー精工社製)にセットし、3200rpmで5分間ビーズ破砕した。その後、ビーズ等を落とすためにチューブを遠心機にセットし、1800gで5分間軽く遠心した。上清400μlを新しい1.5mlチューブに分注した。
1-1のサンプルに対してキアゲン社のBuffer ATL90μl、ProteinaseK 10μl、Buffer AL100μlを混合し、合計600μlとし、56℃で1時間インキュベートした。
インキュベート後、エタノール120μlを加えてボルテックスした。続いてQIAamp DNA Micro Kit(キアゲン社)を使用し、キットのカラムに720μl全量を入れて14000rpmで1分間遠心した後、溶出液を廃棄した。その後、キットのプロトコールに従い、Buffer AW1 500μl、Buffer AW2 500μlでカラムを洗浄した。続いて、空の状態で14000rpmで1分間遠心した後、滅菌水20μlでDNAを溶出した。46サンプルでそれぞれ約4~20ng/μlのDNA溶液を取得した。
前記のDNA溶液を希釈して20pg/μlとし、これをPCRテンプレートとした。サンプル中の口腔内細菌の16SrRNAの検出対象領域の配列を増幅するために、以下の反応液組成及び反応条件でPCRを実施した。PCR用キットは、Premix Ex Taq(TM) Hot Start Version(Takara社製)を用い、ProFlex(TM)PCR System(Thermo Fisher Scientific社製)により行った。プライマーは下記の配列を有するプライマーを用いた。なお、フォワードプライマーは5’末端がCy5で標識化されているものを用いた。
5’-Cy5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’ (配列番号32)
リバースプライマー(細菌増幅用):
5’-CAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACC-3’ (配列番号33)
5’-Cy5-GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTC-3’ (配列番号34)
リバースプライマー(絶対量指標増幅用):
5’-CTCTAAAGACCGCTCTATCTCGG-3’(配列番号35)
2×Premix Ex Taq(登録商標) Hot Start Version 10μL
4μMフォワードプライマー(細菌増幅用) 1μL
4μMリバースプライマー(細菌増幅用) 1μL
4μMフォワードプライマー(絶対量指標増幅用) 1μL
4μMリバースプライマー(絶対量指標増幅用) 1μL
テンプレートDNA 5μL
絶対量指標 1μL
合計 20μL
95℃で1分間加熱後、「解離:98℃(10sec)→アニーリング:55℃(30sec)→合成:72℃(20sec)」を1サイクルとして計40サイクル行い、4℃で冷却し、増幅産物を得た。
貫通孔型のDNAチップを、特開2007-74950号公報(メチル化DNA及び/又は非メチル化DNAの検出方法)の実施例1に記載の方法と同様の方法で製造を行った。
ただし、搭載させたオリゴヌクレオチドプローブは、表4に示す配列情報をもつプローブを用いた。
以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
1M Tris-HCl 48μL
1M NaCl 48μL
0.5% Tween20 20μL
水 65μL
合計 200μL
200μLのハイブリダイゼーション溶液を前記DNAチップに接触させ、50℃で16時間ハイブリダイゼーションした。
ハイブリダイゼーション後、下記の条件でDNAチップを洗浄した。0.24M Tris・HCl/0.24M NaCl/0.05% Tween-20溶液1000μLで220秒の洗浄を12回繰り返し、続いて、0.24M Tris・HCl/0.24M NaCl1000μLで220秒の洗浄を4回繰り返した。
洗浄終了後に、各チップを室温の0.24M Tris・HCl/0.24M NaCl混合溶液に移した。
前記洗浄後、ジェノパールリーダー(型式:GR-S1、三菱ケミカル社製)を用い、下記条件でDNAチップの各スポットの蛍光強度を測定した。
中心励起波長 :633nm
露光時間 :0.1、1、4、40秒
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度を、バックグラウンド値(プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値)で除算し、ハイブリダイゼーションに由来する蛍光強度(以後、シグナル強度と呼ぶ)のSN比を算出した。
<PISA値と細菌量の相関解析>
まず、サンプルごとに、PISA値および各細菌量を示すSN比のデータを対応させた。その結果を、表5に示した。
m <- train(PISA~.,data=bacteria ,method="M5")
PISAを目的変数とし、説明変数を表5の細菌全種類としてモデル木を生成させるコマンドである。46サンプルデータすべてを使用した。
(using smoothed linear models)
Actinomyces.odontolyticus <= 20.1 :
| Campylobacter.concisus <= 2.2 :
| | Capnocytophaga.sputigena <= 2.15 :
| | | Tannerella.forsythia <= 6.9 :
| | | | Streptococcus.mutans <= 5.3 : LM1 (2/12.282%)
| | | | Streptococcus.mutans > 5.3 : LM2 (2/32.179%)
| | | Tannerella.forsythia > 6.9 :
| | | | Streptococcus.mutans <= 2.95 : LM3 (3/16.447%)
| | | | Streptococcus.mutans > 2.95 : LM4 (3/2.075%)
| | Capnocytophaga.sputigena > 2.15 :
| | | Streptococcus.gordonii <= 35.45 : LM5 (2/1.965%)
| | | Streptococcus.gordonii > 35.45 : LM6 (3/26.323%)
| Campylobacter.concisus > 2.2 :
| | Treponema.denticola <= 15.35 :
| | | Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum <= 38.35 : LM7 (3/2.882%)
| | | Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum > 38.35 :
| | | | Actinomyces.odontolyticus <= 10.9 : LM8 (3/4.64%)
| | | | Actinomyces.odontolyticus > 10.9 : LM9 (2/2.948%)
| | Treponema.denticola > 15.35 : LM10 (3/39.648%)
Actinomyces.odontolyticus > 20.1 :
| Tannerella.forsythia <= 2.85 :
| | Streptococcus.gordonii <= 19.6 :
| | | Actinomyces.naeslundii.II <= 4.05 : LM11 (5/2.414%)
| | | Actinomyces.naeslundii.II > 4.05 : LM12 (3/3.304%)
| | Streptococcus.gordonii > 19.6 :
| | | Control.DNA <= 837.15 : LM13 (3/4.132%)
| | | Control.DNA > 837.15 : LM14 (2/0.098%)
| Tannerella.forsythia > 2.85 :
| | Streptococcus.constellatus <= 1.75 : LM15 (3/14.832%)
| | Streptococcus.constellatus > 1.75 :
| | | Porphyromonas.gingivalis <= 1.35 : LM16 (2/9.58%)
| | | Porphyromonas.gingivalis > 1.35 : LM17 (2/2.751%)
LM num: 1
.outcome =
5.9609 * Treponema.denticola
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus
- 43.3698 * Streptococcus.mutans
+ 161.5714 * Capnocytophaga.sputigena
- 0.4833 * Control.DNA
+ 3.734 * Tannerella.forsythia
+ 1510.5973
LM num: 2
.outcome =
5.9609 * Treponema.denticola
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus
- 43.3698 * Streptococcus.mutans
+ 161.5714 * Capnocytophaga.sputigena
- 0.4833 * Control.DNA
+ 3.734 * Tannerella.forsythia
+ 1507.5864
LM num: 3
.outcome =
5.9609 * Treponema.denticola
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus
- 26.3717 * Streptococcus.mutans
+ 161.5714 * Capnocytophaga.sputigena
- 0.4833 * Control.DNA
+ 3.9077 * Tannerella.forsythia
+ 1392.5945
LM num: 4
.outcome =
5.9609 * Treponema.denticola
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus
- 26.3717 * Streptococcus.mutans
+ 161.5714 * Capnocytophaga.sputigena
- 0.4833 * Control.DNA
+ 3.9077 * Tannerella.forsythia
+ 1394.1708
LM num: 5
.outcome =
5.9609 * Treponema.denticola
+ 1.2546 * Streptococcus.gordonii
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus
- 26.3717 * Streptococcus.mutans
+ 201.9643 * Capnocytophaga.sputigena
- 0.4833 * Control.DNA
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia
+ 1565.177
LM num: 6
.outcome =
5.9609 * Treponema.denticola
+ 1.336 * Streptococcus.gordonii
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus
- 26.3717 * Streptococcus.mutans
+ 201.9643 * Capnocytophaga.sputigena
- 0.4833 * Control.DNA
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia
+ 1555.611
LM num: 7
.outcome =
13.3672 * Treponema.denticola
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus
- 30.4289 * Streptococcus.mutans
- 0.4833 * Control.DNA
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia
- 0.3524 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum
+ 1314.4003
LM num: 8
.outcome =
13.3672 * Treponema.denticola
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii
- 1.3817 * Actinomyces.odontolyticus
- 30.4289 * Streptococcus.mutans
- 0.4833 * Control.DNA
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia
- 0.3171 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum
+ 1293.9573
LM num: 9
.outcome =
13.3672 * Treponema.denticola
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii
- 1.3181 * Actinomyces.odontolyticus
- 30.4289 * Streptococcus.mutans
- 0.4833 * Control.DNA
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia
- 0.3171 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum
+ 1294.0756
LM num: 10
.outcome =
15.293 * Treponema.denticola
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus
- 30.4289 * Streptococcus.mutans
- 0.4833 * Control.DNA
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia
+ 1320.5275
LM num: 11
.outcome =
3.3786 * Treponema.denticola
+ 5.1956 * Streptococcus.gordonii
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus
- 0.5662 * Control.DNA
+ 29.9183 * Tannerella.forsythia
- 2.6289 * Actinomyces.naeslundii.II
+ 826.1665
LM num: 12
.outcome =
3.3786 * Treponema.denticola
+ 5.1956 * Streptococcus.gordonii
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus
- 0.5662 * Control.DNA
+ 29.9183 * Tannerella.forsythia
- 2.9643 * Actinomyces.naeslundii.II
+ 825.1613
LM num: 13
.outcome =
3.3786 * Treponema.denticola
+ 5.4972 * Streptococcus.gordonii
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus
- 0.6637 * Control.DNA
+ 29.9183 * Tannerella.forsythia
+ 0.4481 * Actinomyces.naeslundii.II
+ 906.7614
LM num: 14
.outcome =
3.3786 * Treponema.denticola
+ 5.4972 * Streptococcus.gordonii
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus
- 0.6694 * Control.DNA
+ 29.9183 * Tannerella.forsythia
+ 0.4481 * Actinomyces.naeslundii.II
+ 910.6162
LM num: 15
.outcome =
-215.5803 * Porphyromonas.gingivalis
+ 3.3786 * Treponema.denticola
+ 3.1851 * Streptococcus.gordonii
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus
- 56.1926 * Streptococcus.constellatus
- 0.5662 * Control.DNA
+ 36.302 * Tannerella.forsythia
+ 1327.7476
LM num: 16
.outcome =
-221.29 * Porphyromonas.gingivalis
+ 3.3786 * Treponema.denticola
+ 3.1851 * Streptococcus.gordonii
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus
- 53.2351 * Streptococcus.constellatus
- 0.5662 * Control.DNA
+ 36.302 * Tannerella.forsythia
+ 1307.8776
LM num: 17
.outcome =
-221.29 * Porphyromonas.gingivalis
+ 3.3786 * Treponema.denticola
+ 3.1851 * Streptococcus.gordonii
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus
- 53.2351 * Streptococcus.constellatus
- 0.5662 * Control.DNA
+ 36.302 * Tannerella.forsythia
+ 1307.1008
引き続き、cor(p,bacteria$PISA)をコマンドを入力し、予測PISA値「p」と実測のPISA値の相関係数を計算させたところ、相関係数0.8759666となった。
予測PISA値「p」と実測のPISA値の散布図を図2に示す。
このモデルに示すようにDNAチップのSN比からPISA値を予測可能であることが示された。
特に表6に示した各細菌量を示すSN比と口腔内全体のPISA値との比較において、負の相関係数をもつ、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Campylobacter concisus、Actinomyces.naeslundii.II、Streptococcus.constellatusと、正の相関係数をもつCapnocytophaga sputigena、Tannerella forsythia、Streptococcus gordonii、Treponema denticola、Fusobacterium nucleatum subsp..nucleatum、Porphyromonas gingivalisの細菌群のSN比からPISA値を予測可能であることが示された。
<PISA値と細菌量の相関解析>
まず、サンプルごとに、PISA値および各細菌量を示すSN比のデータを対応させた。その後、すべてのサンプルの絶対量指標プローブのSN比の中央値を算出し、個々のサンプルの絶対量指標プローブのSN比をこの中央値で除算した。これをチップ間補正値とする。続いて、個々のサンプルのすべての細菌のSN比データを、個々のサンプルのチップ間補正値で除算することにより、チップ間のSN比データを標準化した。その結果を、表7に示した。
m <- train(PISA~.,data=bacteria ,method="M5")
PISAを目的変数とし、説明変数を表7の細菌全種類としてモデル木を生成させるコマンドである。46サンプルデータすべてを使用した。
(using smoothed linear models)
Treponema.denticola <= 6.1 :
| Campylobacter.concisus <= 1.45 :
| | Actinomyces.odontolyticus <= 53.95 :
| | | Streptococcus.mutans <= 15 :
| | | | Tannerella.forsythia <= 4.9 :
| | | | | Porphyromonas.gingivalis <= 1.45 : LM1 (2/25.547%)
| | | | | Porphyromonas.gingivalis > 1.45 : LM2 (2/24.859%)
| | | | Tannerella.forsythia > 4.9 : LM3 (3/3.438%)
| | | Streptococcus.mutans > 15 : LM4 (2/7.664%)
| | Actinomyces.odontolyticus > 53.95 :
| | | Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis <= 2.2 : LM5 (2/3.144%)
| | | Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis > 2.2 : LM6 (2/2.358%)
| Campylobacter.concisus > 1.45 :
| | Capnocytophaga.ochracea <= 1.15 :
| | | Fusobacterium.periodonticum <= 2.35 : LM7 (2/4.372%)
| | | Fusobacterium.periodonticum > 2.35 : LM8 (2/1.326%)
| | Capnocytophaga.ochracea > 1.15 :
| | | Total.bacteria <= 2252.6 : LM9 (4/4.488%)
| | | Total.bacteria > 2252.6 :
| | | | Capnocytophaga.ochracea <= 1.55 : LM10 (4/2.777%)
| | | | Capnocytophaga.ochracea > 1.55 :
| | | | | Tannerella.forsythia <= 2.9 :
| | | | | | Tannerella.forsythia <= 2.35 : LM11 (2/11.398%)
| | | | | | Tannerella.forsythia > 2.35 : LM12 (2/1.572%)
| | | | | Tannerella.forsythia > 2.9 : LM13 (3/17.057%)
Treponema.denticola > 6.1 :
| Campylobacter.rectus <= 6.4 :
| | Veillonella.parvula <= 1.25 :
| | | Streptococcus.gordonii <= 36.15 : LM14 (3/12.485%)
| | | Streptococcus.gordonii > 36.15 :
| | | | Tannerella.forsythia <= 11.5 : LM15 (2/8.205%)
| | | | Tannerella.forsythia > 11.5 : LM16 (2/1.572%)
| | Veillonella.parvula > 1.25 : LM17 (3/55.578%)
| Campylobacter.rectus > 6.4 :
| | Total.bacteria <= 1916.55 : LM18 (2/4.176%)
| | Total.bacteria > 1916.55 : LM19 (2/1.965%)
LM num: 1
.outcome =
0.1154 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 2.8479 * Actinomyces.odontolyticus
- 4.1907 * Streptococcus.mutans
+ 353.0028
LM num: 2
.outcome =
0.1154 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 2.8479 * Actinomyces.odontolyticus
- 4.1907 * Streptococcus.mutans
+ 354.0939
LM num: 3
.outcome =
0.1154 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 2.8479 * Actinomyces.odontolyticus
- 4.1907 * Streptococcus.mutans
+ 353.0353
LM num: 4
.outcome =
0.1154 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 2.8479 * Actinomyces.odontolyticus
- 5.4232 * Streptococcus.mutans
+ 347.5507
LM num: 5
.outcome =
0.1154 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 3.3806 * Actinomyces.odontolyticus
+ 263.7849
LM num: 6
.outcome =
0.1154 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 3.3806 * Actinomyces.odontolyticus
+ 262.54
LM num: 7
.outcome =
0.1154 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 27.5903 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus
+ 33.5894
LM num: 8
.outcome =
0.1154 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 27.5903 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus
+ 32.468
LM num: 9
.outcome =
0.0649 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 43.8294 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus
+ 146.6484
LM num: 10
.outcome =
0.0785 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 44.0191 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus
+ 93.2371
LM num: 11
.outcome =
0.0785 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 45.0694 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus
+ 91.1073
LM num: 12
.outcome =
0.0785 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 45.0694 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus
+ 91.0077
LM num: 13
.outcome =
0.0785 * Total.bacteria
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis
+ 45.1623 * Tannerella.forsythia
+ 3.4246 * Treponema.denticola
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus
+ 93.4098
LM num: 14
.outcome =
-0.0279 * Total.bacteria
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia
+ 5.5503 * Treponema.denticola
+ 24.5588 * Campylobacter.rectus
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 10.5169 * Streptococcus.gordonii
+ 793.003 * Veillonella.parvula
- 497.9287
LM num: 15
.outcome =
-0.0279 * Total.bacteria
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia
+ 5.5503 * Treponema.denticola
+ 24.5588 * Campylobacter.rectus
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 10.4819 * Streptococcus.gordonii
+ 793.003 * Veillonella.parvula
- 489.1573
LM num: 16
.outcome =
-0.0279 * Total.bacteria
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia
+ 5.5503 * Treponema.denticola
+ 24.5588 * Campylobacter.rectus
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 10.4819 * Streptococcus.gordonii
+ 793.003 * Veillonella.parvula
- 489.4669
LM num: 17
.outcome =
-0.0279 * Total.bacteria
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia
+ 5.5503 * Treponema.denticola
+ 24.5588 * Campylobacter.rectus
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 10.4024 * Streptococcus.gordonii
+ 853.2173 * Veillonella.parvula
- 506.1734
LM num: 18
.outcome =
-0.0958 * Total.bacteria
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia
+ 5.5503 * Treponema.denticola
+ 32.3143 * Campylobacter.rectus
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 7.3721 * Streptococcus.gordonii
+ 686.8925 * Veillonella.parvula
+ 139.0553
LM num: 19
.outcome =
-0.0958 * Total.bacteria
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia
+ 5.5503 * Treponema.denticola
+ 32.3143 * Campylobacter.rectus
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis
+ 7.3721 * Streptococcus.gordonii
+ 686.8925 * Veillonella.parvula
+ 143.569
Number of Rules : 19
実際のPISA値と予測PISA値の相関係数を算出するためcor(p,bacteria$PISA)をコマンドを実行し、予測PISA値「p」と実測のPISA値の相関係数を計算させたところ、相関係数0.9291664を得た。予測PISA値「p」と実測のPISA値の散布図を、図3に示す。このモデルに示すようにDNAチップのSN比からPISA値を予測可能であることが示された。
予測モデルの構築では46サンプルのうち、ランダムに34サンプルを抽出してクロスバリデーション法に用いた。クロスバリデーション法におけるモデル構築訓練データと検証データの比率は75:25とし学習回数は10回とした。
モデル構築後、モデル構築には全く使用していない残りの12サンプルのデータを将来の未知データとして用い、検証に使用した。
より具体的には、表7の表をデータフレーム名「bacteria」とした後、以下のコマンドにより実行した。
train.index <- sample(nrow(bacteria),nrow(bacteria)*0.75)
#モデル作成用データのセット
data.train <- bacteria[train.index,]
#テスト用データのセット
data.test <- bacteria[-train.index,]
data.m5 <- train(data.train[,-1],data.train$PISA,method="M5",trControl=fitControl)
(クロスバリデーション法におけるモデル構築訓練データと検証データの比率は75:25とし学習回数は10回とした。)
data.m5$results #構築モデルの表示
#未知データでの検証結果
PISA.pred <- predict(data.m5,newdata=data.test[,-1])
#相関係数の計算
cor(PISA.pred,data.test$PISA)
#散布図の出力
plot(PISA.pred,data.test$PISA)
#トレーニングデータでの結果
PISA.predtr <- predict(data.m5,newdata=data.train[,-1])
#相関係数の計算
cor(PISA.predtr,data.train$PISA)
#散布図の出力
plot(PISA.predtr,data.train$PISA)
M5 unpruned model tree:
(using smoothed linear models)
Tannerella.forsythia <= 3.589 :
| Capnocytophaga.ochracea <= 1.085 : LM1 (3/3.579%)
| Capnocytophaga.ochracea > 1.085 :
| | Prevotella.intermedia <= 1.135 :
| | | Total.bacteria <= 2072.974 : LM2 (2/2.188%)
| | | Total.bacteria > 2072.974 : LM3 (3/2.889%)
| | Prevotella.intermedia > 1.135 :
| | | Treponema.denticola <= 2.289 : LM4 (3/0.856%)
| | | Treponema.denticola > 2.289 : LM5 (2/4.57%)
Tannerella.forsythia > 3.589 :
| Capnocytophaga.sputigena <= 1.786 :
| | Eikenella.corrodens <= 1.067 :
| | | Fusobacterium.periodonticum <= 1.502 : LM6 (3/2.054%)
| | | Fusobacterium.periodonticum > 1.502 :
| | | | Streptococcus.mitis <= 3.972 : LM7 (2/7.05%)
| | | | Streptococcus.mitis > 3.972 :
| | | | | Aggregatibacter.actinomycetemcomitans <= 1.334 : LM8 (3/5.601%)
| | | | | Aggregatibacter.actinomycetemcomitans > 1.334 : LM9 (2/21.879%)
| | Eikenella.corrodens > 1.067 : LM10 (3/7.804%)
| Capnocytophaga.sputigena > 1.786 :
| | Tannerella.forsythia <= 12.803 :
| | | Total.bacteria <= 2244.721 : LM11 (2/6.126%)
| | | Total.bacteria > 2244.721 : LM12 (2/103.221%)
| | Tannerella.forsythia > 12.803 :
| | | Total.bacteria <= 1907.395 : LM13 (2/25.331%)
| | | Total.bacteria > 1907.395 : LM14 (2/1.945%)
LM num: 1
.outcome =
0.1964 * Total.bacteria
+ 8.473 * Treponema.denticola
- 3.7524 * Streptococcus.mitis
+ 136.0844
LM num: 2
.outcome =
0.1872 * Total.bacteria
+ 8.473 * Treponema.denticola
- 102.9193 * Prevotella.intermedia
- 3.7524 * Streptococcus.mitis
+ 297.6459
LM num: 3
.outcome =
0.1877 * Total.bacteria
+ 8.473 * Treponema.denticola
- 102.9193 * Prevotella.intermedia
- 3.7524 * Streptococcus.mitis
+ 295.2116
LM num: 4
.outcome =
0.1964 * Total.bacteria
+ 10.9568 * Treponema.denticola
- 102.9193 * Prevotella.intermedia
- 3.7524 * Streptococcus.mitis
+ 261.0986
LM num: 5
.outcome =
0.1964 * Total.bacteria
+ 11.1029 * Treponema.denticola
- 102.9193 * Prevotella.intermedia
- 3.7524 * Streptococcus.mitis
+ 261.4416
LM num: 6
.outcome =
0.1528 * Total.bacteria
+ 6.7947 * Tannerella.forsythia
+ 6.5901 * Treponema.denticola
+ 29.1856 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans
+ 74.536 * Capnocytophaga.sputigena
- 197.1112 * Eikenella.corrodens
- 5.6233 * Streptococcus.mitis
+ 637.0725
LM num: 7
.outcome =
0.1528 * Total.bacteria
+ 6.7947 * Tannerella.forsythia
+ 6.5901 * Treponema.denticola
+ 32.1268 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans
+ 74.536 * Capnocytophaga.sputigena
- 197.1112 * Eikenella.corrodens
- 5.6233 * Streptococcus.mitis
+ 625.658
LM num: 8
.outcome =
0.1528 * Total.bacteria
+ 6.7947 * Tannerella.forsythia
+ 6.5901 * Treponema.denticola
+ 32.301 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans
+ 74.536 * Capnocytophaga.sputigena
- 197.1112 * Eikenella.corrodens
- 5.6233 * Streptococcus.mitis
+ 627.695
LM num: 9
.outcome =
0.1528 * Total.bacteria
+ 6.7947 * Tannerella.forsythia
+ 6.5901 * Treponema.denticola
+ 32.3574 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans
+ 74.536 * Capnocytophaga.sputigena
- 197.1112 * Eikenella.corrodens
- 5.6233 * Streptococcus.mitis
+ 627.9978
LM num: 10
.outcome =
0.1528 * Total.bacteria
+ 6.7947 * Tannerella.forsythia
+ 6.5901 * Treponema.denticola
+ 22.9812 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans
+ 74.536 * Capnocytophaga.sputigena
- 273.7656 * Eikenella.corrodens
- 5.6233 * Streptococcus.mitis
+ 673.9955
LM num: 11
.outcome =
0.1989 * Total.bacteria
+ 14.1331 * Tannerella.forsythia
+ 6.5901 * Treponema.denticola
+ 90.7394 * Capnocytophaga.sputigena
- 6.2112 * Streptococcus.mitis
+ 410.322
LM num: 12
.outcome =
0.1989 * Total.bacteria
+ 14.1331 * Tannerella.forsythia
+ 6.5901 * Treponema.denticola
+ 90.7394 * Capnocytophaga.sputigena
- 6.2112 * Streptococcus.mitis
+ 409.7214
LM num: 13
.outcome =
0.1989 * Total.bacteria
+ 14.1331 * Tannerella.forsythia
+ 6.5901 * Treponema.denticola
+ 90.7394 * Capnocytophaga.sputigena
- 6.2112 * Streptococcus.mitis
+ 497.6085
LM num: 14
.outcome =
0.1989 * Total.bacteria
+ 14.1331 * Tannerella.forsythia
+ 6.5901 * Treponema.denticola
+ 90.7394 * Capnocytophaga.sputigena
- 6.2112 * Streptococcus.mitis
+ 501.0283
Number of Rules : 14
この結果より、未知のデータに対してもPISAの値を予測できることが示された。
特に、表8に示した各細菌量を示すSN比と口腔内全体のPISA値との比較において、負の相関係数をもつ、Streptococcus mitisと、正の相関係数をもつTannerella forsythia、 Treponema denticola、Capnocytophaga ochracea、 Capnocytophaga sputigena、Eikenella corrodens 、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Prevotella intermedia、Fusobacterium periodonticumの細菌群のSN比からPISA値を予測可能であることが示された。
唾液を検体とした歯周病の状態の判定については、歯周疾患者における抗菌療法の診療ガイドライン(日本歯周病学会編集)によると、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythensis及びTreponema denticolaの3種類の細菌数の合計が、総菌数に対して0.05%未満の場合を「軽度」、総菌数に対して0.05%以上0.5%未満の場合を「中程度」、総菌数に対して0.5%以上の場合を「重度」であると判定することができる。
そこで、表7に示したSN比の内、レッドコンプレックスであるPorphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticolaの3菌種のSN比の合計値と、総菌量を示すTotal bacteriaのSN比の比率を算出して既存の指標とした。この指標により、前述の「軽度」、「中程度」、「重度」を判定した。
判定した結果とPISA実測値、実施例3の結果に基づくPISA予測値、3菌のSN比、Total bacteriaのSN比を、表9にまとめた。
算出した値(X軸)とPISA値(Y軸)との散布図を、図8に示した。その結果、XとY関係について、決定係数0.41程度の関係性があることが分かった。すなわち、バランス指標を用いた場合においてもPISAを推定できることが分かった。
PCRに使用したプライマーを以下のように変更して実施した。
R、Yは混合塩基を示しており、RはAとG、YはCとTを示す。
5’-Cy5-TACGGGAGGCAGCAG-3’(配列番号72)
リバースプライマー(細菌増幅用):
5’-CRGGGTATCTAATCCYGTT-3’(配列番号73)
フォワードプライマー(絶対量指標増幅用):
5’-Cy5-GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTC-3’(配列番号34)
リバースプライマー(絶対量指標増幅用):
5’-CTCTAAAGACCGCTCTATCTCGG-3’(配列番号35)
ひきつづき得られた蛍光強度を以下のように処理した。
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度を、バックグラウンド値(プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値)で減算し、ハイブリダイゼーションに由来するシグナル強度を算出した。このとき、シグナル強度がある閾値を下回るものについては、ノイズと判断し「0」とする。ここでは閾値として、プローブを搭載していないスポット30個の傾向強度のうち上下位5つを除いた20個の値の標準偏差の3倍の値を用いた。
の13菌種とした。
res1 <- lm(PISA~.,data=data01)
(PISAを目的変数として、22種類の細菌を説明変数として、56サンプルのデータで重回帰分析を実施するコマンド)
Claims (11)
- 唾液中の2種以上の細菌の細菌量を検出し、得られた検出結果を指標として歯周ポケット炎症面積を推定する方法であって、検出される細菌は、
該細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが正の相関関係を示す細菌と、
該細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが負の相関関係を示す細菌とを含む、方法。 - 前記歯周ポケット炎症面積がPISA、又はCAPRSの値で表されるものである、請求項1に記載の方法。
- 正の相関関係を示す細菌が、Treponema denticola、Tannerella forsythia、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Porphyromonas gingivalis、Campylobacter rectus、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Selenomonas noxia、Veillonella parvula、Streptococcus gordonii、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Streptococcus intermedius、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、及びFusobacterium periodonticumからなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 正の相関関係を示す細菌が、SR1 sp. OT 345、Porphyromonas catoniae、Selenomonas sputigena、Neisseria flavescens、Streptococcus sobrinus、Parvimonas micra、Peptostreptococcus stomatis、Treponema socranskii、Eubacterium saphenum、Eubacterium nodatum、Treponema medium、Filifactor alocis、及びPorphyromonas endodontalisからなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 負の相関関係を示す細菌が、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Streptococcus mitis bv 2、Streptococcus mitis、Campylobacter concisus、及びCapnocytophaga gingivalisからなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 負の相関関係を示す細菌が、Prevotella pallens、Streptococcus salivarius、Eubacterium sulci、Rothia mucilaginosa、Prevotella denticola、Veillonella atypica、Prevotella histicola、Megasphaera micronuciformis、及びStreptococcus parasanguinisからなる少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 負の相関係数を示す細菌が、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Campylobacter concisus、Actinomyces.naeslundii.II、及びStreptococcus.constellatusを含み、
正の相関係数を示す細菌が、Capnocytophaga sputigena、Tannerella forsythia、Streptococcus gordonii、Treponema denticola、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、及びPorphyromonas gingivalisを含む、
請求項1に記載の方法。 - 負の相関係数を示す細菌が、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Campylobacter concisusを含み、
正の相関係数を示す細菌が、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Porphyromonas gingivalis、Fusobacterium nucleatum subsp.animalis、Streptococcus gordonii、Veillonella parvula、Campylobacter rectus、Capnocytophaga ochracea、及びFusobacterium periodonticumを含む、
請求項1に記載の方法。 - 負の相関係数を示す細菌が、Streptococcus mitisを含み、
正の相関係数をもつTannerella forsythia、Treponema denticola、Capnocytophaga ochracea、 Capnocytophaga sputigena、Eikenella corrodens 、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Prevotella intermedia、及びFusobacterium periodonticumを含む、
請求項1に記載の方法。 - 以下の(1)~(4)工程を有する、請求項1に記載の方法。
(1)歯周ポケット炎症面積が既知の被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する工程
(2)当該各種細菌の細菌量について、菌ごとに固有の歯周ポケット炎症面積との相関係数を求め、各種細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積との関係式を構築して予測モデルを作成する工程
(3)歯周ポケット炎症面積が未知の被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する工程
(4)(3)で得られた各種細菌量を(2)で得られた関係式に入れて歯周ポケット炎症面積を推定する工程 - 前記予測モデルの作成方法が、線形回帰、回帰木、モデル木、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、バギング、ブースティング、ランダムフォレストの機械学習アルゴリズムから選ばれる1種を使用する方法である、請求項10に記載の方法。
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