CN111607637A - 一种基于声表面波和rpa扩增的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于声表面波和RPA扩增的检测方法，涉及病原菌检测技术领域，包括配制RPA核酸扩增反应液，将RPA核酸扩增反应液放置于声表面波的传播途径上，将RPA核酸扩增反应液滴在压电材料表面或者将声表面波器件与RPA核酸扩增反应液接触，叉指换能器添加正弦电压，通过变压器调整输入电压的数值，靶核酸序列即可进行扩增，通过在反应过程中加入染料。本发明操作简单，效率高，特异性高，应用广泛。
Description
技术领域
本发明属于病原菌检测技术领域，具体涉及一种基于声表面波和RPA扩增的检测方法。
背景技术
根据世界卫生组织对全球的流行病趋势调查研究表明，以往常规的病原菌检测方法(例如细菌培养、外部形态结构和生理生化鉴定以及血清学鉴定等)由于其耗时费力、步骤繁琐和对仪器设备的依赖等不足，已经无法有效的满足人类对致病微生物进行快速和特异检测的要求。分子生物学技术的快速发展，使得人们可以从分子水平来对目前常规检测手段难以检测的病原微生物进行快速/正确地鉴定，极大的提高病原菌的检测水平，并对传染病传播的起到了良好的控制效果。目前，高度敏感、高度特异的核酸扩增技术可以直接在不需要对病原微生物进行分离培养的基础上直接用于临床标本的检测，并能在较短时间内(2-3小时)得出结果，在感染性疾病的诊断中应用越来越广泛。这些分子检测技术与其他分子生物学技术以及生物信息学手段结合，正向快速朝着准确、快速、灵敏以及自动化的方向发展。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)被称为可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶，单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最近反应温度在37℃左右。PRA的扩增步骤一般可分为：1.重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应并启动DNA的延伸和合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，以防止进一步替换。在该体系中，由两队相对的引物起始一个DNA合成事件。整个过程非常迅速，一般可以在十分钟之内获得可检测的水平的扩增产物。
但是由于RPA的反应溶液中存在比较大量的PEG，这使得反应溶液的粘度非常高，不利于的RPA的进行，从而达到有效快速扩增靶向核酸序列的目的。因此，在目前的RPA使用过程中，一般采用两种策略来解决由于RPA反应溶液粘度高所带来的一系列问题：分别采用震荡涡旋的方式和在反应溶液中加入磁性颗粒进行搅拌的方式。前者需要对反应进行适时中止，这不仅会延长检测的时间而且还容易造成扩增产物的污染；后者则需要比较要磁力搅拌器，这不利于仪器的集成和自动化。
因此急需提供一种操作简单，效率高，特异性高，应用广泛的基于声表面波和RPA扩增的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于声表面波和RPA扩增的检测方法。
本发明提供了如下的技术方案：
一种基于声表面波和RPA扩增的检测方法，包括如下步骤：
S1.配制RPA核酸扩增反应液；
S2.将RPA核酸扩增反应液放置于声表面波的传播途径上，将RPA核酸扩增反应液滴在压电材料表面或者将声表面波器件与RPA核酸扩增反应液接触；
S3.叉指换能器添加正弦电压，通过变压器调整输入电压的数值，靶核酸序列即可进行扩增；
S4.通过在反应过程中加入染料，当反应中的靶向基因浓度不断升高时，相应的染料信号逐渐发生变化。
优选的，叉指换能器中的叉指数量为10-30个，工作频率为5-30MHz。
优选的，步骤S2中的压电材料为石英晶体、镓酸锂、锗酸锂、锗酸钛、铁晶体管铌酸锂和钽酸锂中的一种。
基于上述结构，本发明还提供一种基于声表面波和RPA扩增的检测方法制备的试剂盒，包括靶核酸和荧光染料。
优选的，所述靶核酸为DNA和RNA中的一种或两种。
优选的，所述荧光染料为EVA GREEN、SYBR GREEN 1、钙黄绿素DNA和羟基萘酚蓝中的一种或者多种。
本发明的有益效果是：在声表面波和重组酶聚合酶核酸扩增技术作用下反应15-30分钟，即可完成对靶核酸序列的扩增，整个扩增只需一个简单叉指换能器即可完成所有的扩增过程，这极大降低了其对仪器的要求。如果在反应中加入相应的荧光染料，即可通过荧光计数仪得到相应的扩增曲线或者通过肉眼直接判断扩增反应结果。这些优点使得针对靶核酸序列扩增检测的整个变得快速简便，而且对其结果的检测也不需要涉及打开反应管和繁琐的电泳检测过程。特异性、操作简单和对对仪器设备的要求低等特点可以获得很广泛的应用前景，而且特别适合现场检测以及在基层医疗单位的推广使用，如：与直接相关的人类遗传性疾病的分子诊断；病原体微生物的检测；对肿瘤癌症的诊断及预后的评估；某些微生物的分型，试剂盒可应用在检测病原微生物、环境微生物、微生物分型、人类遗传病或者健康风险基因及其评估中，操作简单，效率高，特异性高，应用广泛。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的结构示意图。
图中标记为：1、RPA核酸扩增反应液；2、压电材料；3、声表面波器件；4、叉指换能器。
具体实施方式
实施例
如图所示，一种基于声表面波和RPA扩增的检测方法，包括如下步骤：
S1.配制RPA核酸扩增反应液1；
S2.将RPA核酸扩增反应液1放置于声表面波的传播途径上，将RPA核酸扩增反应液1滴在压电材料2表面或者将声表面波器件3与RPA核酸扩增反应液1接触；
S3.叉指换能器4添加正弦电压，通过变压器调整输入电压的数值，靶核酸序列即可进行扩增；
S4.通过在反应过程中加入染料，当反应中的靶向基因浓度不断升高时，相应的染料信号逐渐发生变化。
叉指换能器4中的叉指数量为10-30个，工作频率为5-30MHz。步骤S2中的压电材料2为石英晶体、镓酸锂、锗酸锂、锗酸钛、铁晶体管铌酸锂和钽酸锂中的一种。
一种基于声表面波和RPA扩增的检测方法制备的试剂盒，包括靶核酸和荧光染料。
靶核酸为DNA和RNA中的一种或两种。荧光染料为EVA GREEN、SYBR GREEN 1、钙黄绿素DNA和羟基萘酚蓝中的一种或者多种。
通过叉指换能器4在压电材料2表面产生声表面波，并将RPA核酸扩增反应液1放置在声表面波行进的传播途径上，当声表面波遇到RPA核酸扩增反应液1时，其所携带的能量会部分被RPA核酸扩增反应液1所吸收，所吸收的能量不仅可以为RPA技术提供一个稳定的温度，而且还可以推动反应液的旋转和搅拌，从实现RPA技术在恒温条件下进行快速、方便、高效和特异扩增检测靶向基因的目的。
压电材料2是指受到压力作用时会在两端面间出现电压的晶体材料，压电材料2的晶体对称性较低，当受到外力作用发生形变时，晶胞中正负离子的相对位移使正负电荷中心不再重合，导致晶体发生宏观极化，而晶体表面电荷面密度等于极化强度在表面法向上的投影，所以压电材料2受压力作用形变时两端面会出现异号电荷；反之，压电材料2在电场中发生极化时，会因电荷中心的位移导致材料变形，当在叉指换能器4上添加正弦电压时，换能器上的叉指将作为声表面波的振源而产生相应的声表面波，所有的声表面波可以叠加在一起并沿着压电材料2向前传递，当其遇到RPA核酸扩增反应液1时，声表面波所携带的机械能就会被RPA核酸扩增反应液1所吸收，所吸收的机械能部分可以转换成热能从而达到加热RPA核酸扩增反应液1的效果，部分机械能可保持机械能起到对溶液达到搅拌混匀的目的，就可以有效的达到解决由于RPA核酸扩增反应液1粘度太高所导致的对核酸扩增反应效率的影响。
在声表面波和RPA技术作用下反应15-30分钟，即可完成对靶核酸序列的扩增，整个扩增只需一个简单叉指换能器4即可完成所有的扩增过程，这极大降低了其对仪器的要求。如果在反应中加入相应的荧光染料，即可通过荧光计数仪得到相应的扩增曲线或者通过肉眼直接判断扩增反应结果。这些优点使得针对靶核酸序列扩增检测的整个变得快速简便，而且对其结果的检测也不需要涉及打开反应管和繁琐的电泳检测过程。
本发明以其特异性、操作简单和对对仪器设备的要求低等特点可以获得很广泛的应用前景，而且特别适合现场检测以及在基层医疗单位的推广使用，如：与直接相关的人类遗传性疾病的分子诊断；病原体微生物的检测；对肿瘤癌症的诊断及预后的评估；某些微生物的分型。
本发明的试剂盒可应用在检测病原微生物、环境微生物、微生物分型、人类遗传病或者健康风险基因及其评估中。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于声表面波和RPA扩增的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.配制RPA核酸扩增反应液；
S2.将RPA核酸扩增反应液放置于声表面波的传播途径上，将RPA核酸扩增反应液滴在压电材料表面或者将声表面波器件与RPA核酸扩增反应液接触；
S3.叉指换能器添加正弦电压，通过变压器调整输入电压的数值，靶核酸序列即可进行扩增；
S4.通过在反应过程中加入染料。
2.根据权利要求1所述的基于声表面波和RPA扩增的检测方法，其特征在于，步骤S2中的压电材料为石英晶体、镓酸锂、锗酸锂、锗酸钛、铁晶体管铌酸锂和钽酸锂中的一种。
3.根据权利要求1所述的基于声表面波和RPA扩增的检测方法，其特征在于，步骤S3中，叉指换能器中的叉指数量为10-30个，工作频率为5-30MHz。
4.一种使用如权利要求1-3所述的基于声表面波和RPA扩增的检测方法制备的试剂盒，其特征在于，包括靶核酸和荧光染料。
5.根据权利要求4所述的基于声表面波和RPA扩增的检测方法制备的试剂盒，其特征在于，所述靶核酸为DNA和RNA中的一种或两种。
6.根据权利要求4所述的基于声表面波和RPA扩增的检测方法制备的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为EVA GREEN、SYBR GREEN 1、钙黄绿素DNA和羟基萘酚蓝中的一种或者多种。
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