JPH09127111A - アッセイ及びアッセイ用試料の調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アッセイの感度及び／又は精度を実質的に高
め得る尿試料の調製方法を提供する。 【解決手段】 尿試料を遠心分離にかけて、ＬＰＳ抗原
の存在についてペレットを試験する前に、尿試料を単に
水性液体で、例えば水で１：１に希釈する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はアッセイ及び特にア
ッセイに使用する尿試料の調製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】臨床学
的に有意義な多数のアッセイでは、尿が適切な試料源で
ある。尿試料は、患者に不快感を与えることなく容易に
入手することができる。しかしながら、尿全体の組成は
大幅に変動し得るため、アッセイの感度及び／又は精度
が妨げられ得る。尿の組成は採尿の数時間前に患者が摂
取した液体や試料採取日時によって非常に大幅に異なり
得る。

【０００３】尿は、アッセイ試薬と非特異的に結合し
て、紛らわしい又は擬陽性結果を生じ得る成分を多量に
含み得る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明では、尿試料を単
に水性組成物、特に蒸留水又は脱イオン水で希釈すると
アッセイの感度及び／又は精度を実質的に高め得ること
が知見された。

【０００５】本発明では、考えられる細菌抗原等の存在
を、好ましくは尿試料を多孔質キャリヤーを通じて移動
させてアッセイ結果を前記キャリヤー上の検出区域内で
の標識試薬の特異結合によって示すことからなるアッセ
イ手段によって分析する前に、尿試料を水性液体で希釈
する尿試料の調製方法を提供する。好ましくは尿試料を
希釈した後に、例えば尿試料を濾過又は遠心分離するこ
とによって処理してアッセイの目的のための抗原物質を
溶解し回収して不溶性物質（例えば細菌細胞）のペレッ
トを得、これを抽出緩衝液で処理して適切な抗原物質を
放出させてアッセイ被分析物質を生成することができ
る。

【０００６】一般に、尿試料の約２分の１〜約２倍容量
の水性液体で適切に希釈することができる。試料の希釈
度は約１：１が理想的である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の特定の実施態様は、考え
られるＣｈｌａｍｙｄｉａ抗原の存在を分析する前に、
尿酸塩を実質的に溶解するのに十分な程度まで試料を水
性液体で希釈する男性尿試料の調製方法である。試料
は、純水、例えば脱イオン水で希釈することができる。
あるいは、希釈剤は、細胞溶解剤（例えば界面活性剤）
又はｐＨ調整剤のような試料を修正する成分を１種以上
含んでいてもよい。適切な抽出緩衝液については以下で
詳しく説明する。

【０００８】リポ多糖抗原はある種の病原性細菌（特に
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）の存在を示す重要な物質である。
男性がＣｈｌａｍｙｄｉａのキャリヤーとなり得ること
は公知である。特に感染接触の追跡を容易にするため
に、男性患者でのＣｈｌａｍｙｄｉａ生物の効果的なア
ッセイが必要である。

【０００９】抽出手順を使用して、存在し得る生物に由
来するリポ多糖抗原を放出させる。通常の抽出手順は洗
剤のような溶解剤を使用する。抽出手順は、１種以上の
溶解剤の存在下で試料を例えば８０〜１００℃の範囲の
温度まで加熱することからなり得る。数分後に、正確な
アッセイの基礎となるのに十分な量のリポ多糖抗原が、
存在する生物から放出される。

【００１０】本発明に従って試料を希釈すると何故アッ
セイ感度が増すのかについては完全には解明されていな
い。これは一部には、潜在的な妨害成分が溶解されるか
らであろう。幾つかの尿試料では、全塩濃度が非常に高
くなり得るので、尿酸塩のような塩が非溶解形態で存在
し得ることが観察された。これは、男性尿試料で最も頻
繁に観察されている。これらの塩は結晶質状態で強く着
色される傾向にある。例えば、尿酸塩は濃い赤煉瓦色で
ある。これらの塩が、尿試料中の被分析物質に対する特
異アッセイを実施するための試薬と非特異的に結合し得
ることも観察された。例えば、固相キャリヤー上に固定
化された抗リポ多糖抗体を捕捉剤として使用するＣｈｌ
ａｍｙｄｉａ生物用アッセイでは、尿酸塩が捕捉剤と結
合して、紛らわしい又は不正確な試験シグナルを発生し
得ることが観察された。従って、試料を希釈した後に例
えば遠心分離にかけて不溶性物質のペレットを回収し、
これを分離し、更に処理すれば、潜在的な妨害物質であ
る尿酸塩を簡単に除去してアッセイ試料を得ることがで
きる。しかしながら、話はそれだけではない。以下の実
験結果に示すように、尿試料を希釈すると、元の尿試料
が明らかに多量の非溶解塩を含んでいない場合でもアッ
セイ感度が高まる。一般に、アッセイ試料の希釈は通常
アッセイ感度の増加を促すのではなく、本発明の要旨で
は逆のことが当てはまるように思える。

【００１１】臨床試料がしばしば、リポ多糖抗原アッセ
イの感度を妨げ得る不適切な成分を含んでいることは既
によく知られている。カチオンが特に厄介である。ヨー
ロッパ特許出願公開第３９２８６５号はこの問題を議論
し、例えばＥＤＴＡのような物質でキレート化して、二
価カチオンを系から除去すべきであると推奨している。
ヨーロッパ特許出願公開第３９２８６５号は特に、望ま
しくない亜鉛やマグネシウムのような二価カチオンの存
在に関する。臨床試料には他のカチオン帯電物質も存在
し得る。これらのカチオン物質のいずれも、リポ多糖抗
原アッセイの感度を妨げ得る。カチオンがリポ多糖分子
の負帯電区域に結合して、上記アッセイに有用な抗体が
産生される重要な結合部位を阻害するために上記のよう
な妨害が生ずると考えられる。

【００１２】本発明の重要な実施態様は、カチオンによ
って生ずる妨害を低減するのに十分な量のアニオン多糖
の存在下で実施され、アッセイ試料が上述したような希
薄尿試料であるリポ多糖抗原用アッセイである。

【００１３】アニオン多糖がヘパリンのようなグリコサ
ミノグリカンであることが好ましい。代替例にはヘパリ
ン硫酸及びデルマタン硫酸が含まれる。

【００１４】本発明は更に、細菌中の抗原物質等を溶解
させるための、アッセイ感度を高めるのに十分な量のア
ニオン多糖を含む水性抽出緩衝液を尿試料の希釈剤とし
て提供する。

【００１５】本発明の重要な実施態様は、尿試料希釈剤
として使用するときにアッセイ感度を高めるのに十分な
量のグリコサミノグリカン、特にヘパリンを含んでい
る、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ内のリポ多糖抗原の溶解に使用
される水性抽出緩衝液である。緩衝液が少なくとも約
０．１ｍｇ／ｍｌのヘパリンを含んでいることが好まし
い。緩衝液は通常、約１０ｍｇ／ｍｌ以上のヘパリンを
含む必要はない。

【００１６】本発明の方法が、細胞物質を界面活性剤水
溶液で処理して細胞生物学的物質（例えば細菌）から溶
解した抗原物質を抽出する手順を包含している場合もア
ニオン多糖の存在下で実施する。界面活性剤が双性イオ
ンであることが好ましい。界面活性剤が（ＣＨＡＰＳと
称される）３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルア
ンモニオ−１−プロパンスルホネート、又は（ＣＨＡＰ
ＳＯと称される）３−（３−クロラミドプロピル）ジメ
チルアンモニオ−２−ヒドロキシル−１−プロパンスル
ホネート、又はこれらの混合物であることが更に好まし
い。

【００１７】ヘパリンと双性イオン界面活性剤（特にＣ
ＨＡＰＳ及び／又はＣＨＡＰＳＯ）との水溶液を用いて
抽出を実施すれば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種（例えばＣｈ
ｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ、Ｃ．ｐｓｉ
ｔｔａｃｉ及びＣ．ｔｗａｒ）由来のリポ多糖抗原が特
に効果的に抽出される。

【００１８】重要ではないが、例えば約５０℃を超える
高温で抗原物質を溶解するのに十分な時間抽出すること
が好ましい。抽出温度が少なくとも約６０℃であること
が更に好ましい。一般には、抽出温度は約１００℃を超
えてはならず、約９０℃以下が好ましい。抽出温度は約
８０℃が理想である。このような高温で実施される抽出
段階は一般に少なくとも約５分間継続すべきである。

【００１９】水性抽出媒質中の界面活性剤の量は少なく
とも約０．１重量％が好ましい。界面活性剤の量は、好
ましくは約２重量％以下、更に好ましくは約１重量％以
下である。

【００２０】抽出媒質のｐＨは一般に約７．５〜約９の
範囲内にあるべきである。

【００２１】ヘパリン又は他のアニオン多糖は所望によ
り可溶性形態で使用してもよいし、不溶性形態で使用し
てもよい。ヘパリンは両方の形態で市販されている。一
変形例は、アニオン多糖を抽出緩衝液及び／もしくは尿
希釈剤中に可溶性成分として含ませるか又は実際のアッ
セイ手順開始前の最後の段階で可溶性成分として添加す
ることである。使用者の観点からは恐らく、抽出緩衝液
／希釈剤中の成分として存在させることが最も好都合で
ある。あるいは、水性試料／抽出物を不溶化形態のアニ
オン多糖（例えば樹脂ビーズのような固体表面に結合し
たヘパリン）と接触させることができる。不溶化アニオ
ン多糖は、実際のアッセイを実施する前に水性組成物か
らを除去することができる。例えば、ビーズは遠心分離
にかけられるか又は濾去され得る。より嵩高な固相、例
えば表面積の大きくヘパリンの結合したディップスティ
ックは、液体の手動抽出又はデカンテーションによって
水性組成物から分離され得る。当業者には多様な代替方
式が提案されよう。主な目的は、アニオン多糖を、任意
に存在してリポ多糖抗原アッセイの精度を妨げ得るカチ
オン成分の少なくとも一部分と結合させて、実際に系か
ら除去することができる状況下で、分析すべきリポ多糖
抗原を含んでいる水性組成物をアニオン多糖に暴露する
ことである。所定のアッセイ手順及び方式では、アニオ
ン多糖の最適量及び提供は単なる実験により決定され得
る。

【００２２】本発明の通常の抽出手順では、Ｃｈｌａｍ
ｙｄｉａに感染していると思われる患者から採取した尿
試料に由来する濃縮固体形態の生物学的試料を例えば抽
出媒質と接触させる。適切な試料は例えば、生殖器、直
腸もしくは眼球スワブ、又は早朝尿のような液体に由来
する遠心分離ペレットの形態をとり得る。例えば８０℃
で１０分間抽出し、次いで短期間、例えば５分間抽出
し、この間に抽出媒質を冷却する。その後、例えばスワ
ブを取り出して溶液を濾過することによって抽出媒質を
固形分から分離して、適切なアッセイ手順で使用できる
抽出抗原を含んだ試料液体を提供することができる。被
分析物質用アッセイはラジオイムノアッセイ又は酵素結
合免疫アッセイのような慣用的なアッセイ技術を包含し
得る。尿試料は、特にニトロセルロース固相と、直接粒
状標識（例えば着色ラテックス粒子）で標識した抗体試
薬とを用いて、上述し、ヨーロッパ特許出願公開第２９
１１９４号にも開示されているような免疫クロマトグラ
フィーアッセイ手順で使用するのに理想的である。ヘパ
リンをＣＨＡＰＳ及び／又はＣＨＡＰＳＯと共に希釈し
て使用すれば、抗リポ多糖抗原抗体を特異結合試薬とし
て含むＣｈｌａｍｙｄｉａアッセイの感度が高まる。

【００２３】

【実施例】以下の実験で、Ｃｈｌａｍｙｄｉａリポ多糖
抗原アッセイの感度及び／又は精度を高める上での尿試
料希釈の利点を実証する。

【００２４】材料 脱イオン水で希釈し、次いで３０００ｇで１０分間遠心
分離にかける。

【００２５】抽出緩衝液の組成：０．８５％の塩化ナト
リウム、０．２５％のＣＨＡＰＳＯ、５ｍＭのＥＤＴ
Ａ、１％のウシ血清アルブミン、１ｍｇ／ｍｌのヘパリ
ン（ＳＩＧＭＡ）を含む０．２５Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ
８．５。

【００２６】アッセイ手順：フィルター／ドロッパーキ
ャップを備えたプラスチック抽出管内で、尿試料を８０
℃±２℃で１０分間加熱する。５分間室温に冷却する。
フィルターキャップを抽出管上に置き、ヨーロッパ特許
出願公開第２９１１９４号に概説されているように、市
販の「ＣＬＥＡＲＶＩＥＷ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ」（Ｕ
ｎｉｐａｔｈ Ｌｔｄ， ＵＫ）アッセイ装置上の管か
ら５滴を圧搾する。アッセイ結果は試験窓の目に見える
線として示した。線の強さは標準化された対照試料に対
する抗原検出の尺度として任意の単位で光学的に評価し
た。

【００２７】実験１ 試料１〜４（表１） アッセイ性能を高めるための尿希釈前処理の能力を実証
する。

【００２８】Ｃｈｌａｍｙｄｉａ陰性男性尿を４ｍｌず
つのアリコートａ）、ｂ）に分けた： ａ）４ｍｌの尿 ｂ）水で１：１に希釈した４ｍｌの尿 各アリコートを３０００ｇで１０分間遠心分離にかけ、
上清を除去し、ペレットを分析した。６００μｌの抽出
緩衝液を加えて、ペレットを再度懸濁させ、次いでペレ
ットを抽出管に移した。上記の「アッセイ手順」に記載
したように、試料を既知量のＣｈｌａｍｙｄｉａ抗原
（１５μｌ）の存在下で試験した。

【００２９】結果を表１に詳しく示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】実験２ 試料５及び６（表２）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ 陽性尿試料でのアッセイ性能を高め
るための尿希釈前処理の能力を実証する。

【００３２】赤煉瓦色の沈殿物を有するＣｈｌａｍｙｄ
ｉａ陽性男性尿を４ｍｌずつのアリコートａ）、ｂ）に
分けた。

【００３３】ａ）４ｍｌの尿 ｂ）水で１：１に希釈した４ｍｌの尿 これらを実験１と同様に処理して分析した。

【００３４】結果を表２に詳しく示す。

【００３５】実験３ 試料７及び８（表２）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ 陽性尿試料中に存在する妨害物質
（必ずしも尿酸塩によるものではない）を阻害するため
の尿希釈前処理の能力を実証する。

【００３６】明白な沈殿物のないＣｈｌａｍｙｄｉａ陽
性男性尿を４ｍｌずつのアリコートａ）、ｂ）に分け
た。

【００３７】ａ）４ｍｌの尿 ｂ）水で１：１に希釈した４ｍｌの尿 これらを実験１と同様に処理して分析した。

【００３８】結果を表２に詳しく示す。

【００３９】

【表２】

【００４０】実験４ 試料９〜１４（表３） 試験前に男性尿試料を希釈しない場合に不溶性塩の存在
がアッセイ精度に及ぼす影響を実証する。

【００４１】尿を事前に希釈せずに、３個のＣｈｌａｍ
ｙｄｉａ陽性試料及び３個のＣｈｌａｍｙｄｉａ陰性試
料を試験した。全ての試料は肉眼で見える尿酸塩沈殿物
を含んでいた。アッセイは、市販の「ＣＬＥＡＲＶＩＥ
Ｗ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ」アッセイ装置を用いて実施し
た。この製品は黒色ラテックスを粒状直接標識として使
用しており、これは陽性結果を装置内の白色ニトロセル
ロースストリップ上の際だった黒線として示すはずであ
る。試料中に沈殿した塩が常に試験線に妨害シグナルを
生じて、使用者を混乱させることがあることは表３のデ
ータから明白である。この作用は、試料を本発明に従っ
て希釈すれば排除された。

【００４２】

【表３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポール・レイモンド・シアード イギリス国、エヌ・エヌ・８・２・ユー・ ビイ、ノーサンプトン、ウイルビイ、メイ ン・ロード・131、デナム・ハウス

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 考えられる被分析物質の存在を、好まし
   くは尿試料を多孔質キャリヤーを通じて移動させてアッ
   セイ結果を前記キャリヤー上の検出区域内での標識試薬
   の特異結合によって示すことからなるアッセイ手段によ
   って分析する前に、該試料を水性液体で希釈する尿試料
   の調製方法。
2. 【請求項２】 アッセイ中に検出区域で非特異的に結合
   し得る塩を実質的に溶解させるのに十分な程度まで希釈
   する請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 考えられるＣｈｌａｍｙｄｉａ抗原の存
   在を分析する前に男性尿試料を水性液体で希釈する男性
   尿試料の調製方法。
4. 【請求項４】 試料を純水で希釈することからなる請求
   項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 【請求項５】 尿試料の約２分の１から約２倍容量の水
   性液体で希釈する請求項１から４のいずれか一項に記載
   の方法。
6. 【請求項６】 試料を約１：１に希釈することからなる
   請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 【請求項７】 希釈後に遠心分離等を実施して不溶性物
   質を回収し、これを液体から分離し、更に処理してアッ
   セイ用試料を得る請求項１から６のいずれか一項に記載
   の方法。
8. 【請求項８】 アッセイがリポ多糖抗原用であり、尿試
   料又はそれから分離した物質をアッセイの前にアニオン
   多糖（特にヘパリン）と接触させる請求項１から７のい
   ずれか一項に記載の方法。
9. 【請求項９】 水性希釈剤が、尿試料中に存在し得る標
   的生物に由来する抗原物質の放出を促進するための抽出
   緩衝液である請求項１から８のいずれか一項に記載の方
   法。
10. 【請求項１０】 尿酸塩を実質的に溶解するのに十分な
    程度まで患者尿試料を水性組成物（好ましくは水）で希
    釈し、陽性試験結果が多孔質キャリヤー（好ましくは試
    験ストリップ）の区域内での標識試薬の特異結合によっ
    て示され、標識が粒状直接標識（好ましくは着色ラテッ
    クス粒子）であるアッセイによって、上記希釈試料でＣ
    ｈｌａｍｙｄｉａリポ多糖の存在を試験する男性患者で
    のＣｈｌａｍｙｄｉａの存在のｉｎ ｖｉｖｏ検出方
    法。