DE60127460T2

DE60127460T2 - Unterscheidung von molekularen formen

Info

Publication number: DE60127460T2
Application number: DE60127460T
Authority: DE
Inventors: Stuart Mark Wilson; Christopher Ivotech Huntingdon STANLEY
Original assignee: Microsens Biophage Ltd
Current assignee: Microsens Biophage Ltd
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2021-07-12
Also published as: EP1368655B1; US20040038200A1; GB0016953D0; ATE357659T1; EP1368655A2; WO2002004948A3; JP2004512500A; DE60127460D1; CA2415639A1; AU2001270773B2; NZ524077A; AU7077301A; NO20030165D0; WO2002004948A2; NO20030165L

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Unterscheidung von aggregierten oder polymerisierten Formen eines gegebenen Moleküls von der nicht aggregierten oder nicht polymerisierten Form des gleichen Moleküls oder eines sehr ähnlichen Moleküls.
Hintergrund der Erfindung
Es existieren Verfahren, um die Wechselwirkung zwischen zwei verschiedenen Molekülen zu bestimmen. Ein duales Bakteriophagen Verfahren ist in der WO 99/63348 beschrieben, bei dem jedes Molekül, für das die Wechselwirkung bestimmt werden soll, durch ein Bakteriophage markiert wird, die für einen unterschiedliche selektierbaren Marker codiert. Wenn die Moleküle wechselwirken, wird das Phage in die Nähe gebracht und kann dabei die gleichen Wirt Bazillen infizieren verleihend dem Wirt den doppelt selektierbaren Marker Phänotyp. Ein Hefe Hybrid Verfahren wurde beschrieben, bei dem die interessierenden Proteine in dem Hefe Genom exprimiert werden. Wenn das Protein wechselwirkt, aktivieren diese einen Promoter, der ein messbares Signal erzeugt. Es gibt ein Verfahren, das als Fluoreszenz Anregungsübertragung (Fluores cence Excitation Transfer, FET) bezeichnet wird, bei dem ein Energietransfer zwischen zwei Liganden gemessen werden kann, wobei die Liganden verwendet werden, um jedes wechselwirkende Molekül zu markieren, und durch die Wechselwirkung dieser Moleküle in die direkte Nähe gebracht werden (für einen Review von möglichen Markern und Ähnlichem siehe Wood, P. und Barnard, G. 1997. Fluoroimmunoassay in Principles and Practice of Immunoassay. Price and Newman Eds. Macmillan Reference Ltd., UK).
Wie auch immer, in einigen Fällen ist es wünschenswert, einen Wechsel in einem gegebenen Molekül zu messen oder zu detektieren, der das Molekül dazu veranlasst, aneinander zu binden oder zu aggregieren oder zu polymerisieren. Zum Beispiel taucht bei einigen Krankheiten, solchen wie die übertragbare spongiforme Enzephalopathie (transmissible spongiform encephalopathies, TSEs), ein Wechsel in dem normalen zellulären Protein PrPc auf, welches aggregiert oder aneinander gebunden ist. Diese Aggregation und nachfolgende Deposition in vivo kann die Pathologie von dieses Krankheiten verursachen. Ein beachtliche Problem bei der Diagnose oder Detektion solcher Krankheiten ist die Ähnlichkeit der normalen und der pathogenen Proteine. Es müssen Verfahren entwickelt werden, um die normale von der pathogenen Form zu unterscheiden. Es ist schwierig, zum Beispiel Antikörper zu züchten, die spezifisch für die pathogene Form sind, denn die meisten Antikörper reagieren ebenfalls mit dem normalen zellulären Protein. Konsequenterweise müssen existierende Diagnose Methoden eine komplizierte Bereicherung des Verfahrens der Probenpräparation verwenden, mit sich bringend eine reinigende Extraktion, Protease Behandlung und/oder Lösungsmittel Extraktion, um vorzugsweise das pathogene Protein auszuwählen bevor der Assay durchgeführt wird.
WO 01/23894 A1 offenbart ein Verfahren zur Detektion von Aggregaten von Molekülen durch Markierung mit zwei fluoreszierenden Antikörper sonden, von denen jede eine unterschiedliche Stellen-Spezifität hat, und Detektion von Aggregaten, die intensiv mit beiden Sonden markiert sind.
Die vorliegende Erfindung versucht ein verbessertes Verfahren der Unterscheidung von aggregierten Molekülen von nicht aggregierten normalen Molekülen zur Verfügung zu stellen.
Offenbarung der Erfindung
Übereinstimmend mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird hier ein Verfahren zur Detektion einer Aggregation oder Polymerisation von Molekülen in einer Probe zur Verfügung gestellt, wobei dieses Verfahren die Schritte umfasst:

a) eine Probe, die die Moleküle enthält, wird mindestens zwei unterschiedlichen, markierenden Resten ausgesetzt, von denen jeder nur an einer einzigen Stelle eines jeden dieser Moleküle anbinden wird, so dass eine Bindung von einem dieser markierenden Reste zu einer dieser Stellen die Bindung an das gleiche Molekül eines anderen markierenden Restes ausschließen wird; und
b) es wird bestimmt, ob mindestens zwei verschiedene dieser markierenden Reste über Aggregate oder Polymere dieser Moleküle miteinander verknüpft vorhanden sind.

Bevorzugt umfassen die markierenden Reste einen ersten Virus und einen zweiten Virus, die sich im allgemeinen voneinander unterscheiden. Beide Viren sind in der Lage, direkt oder indirekt an nur eine einzige Stelle von jedem dieser Moleküle zu binden. Zusätzlich binden die Viren direkt oder indirekt an die gleiche Stelle dieses Moleküls, so dass die Bindung von einem Virus die Bindung eines anderen Virus ausschließt. Die Viren binden entweder an die gleiche identische Stelle oder an eine ähnliche überlappende Stelle in der Art, dass ein Virus von der Bindung ausge schlossen ist, wenn ein andere Virus gebunden ist. Das zuletzt genannte kann erreicht werden durch eine sterische Hinderung durch den zuerst gebundenen Virus, welches den zweiten Virus von der Bindung abhält, oder durch einen konformativen Wechsel in dem Targetmolekül, welches die Bindung des zweiten Virus verhindert.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens bindet der Virus indirekt an eine identische oder überlappende Stelle über monoklonale Antikörper, die spezifisch für eine identische oder überlappende Stellen sind. In Zukunft wird diese Eigenschaft der Bindung von einer markierenden Rest an das Targetmolekül ausschließlich der Bindung von dem zweiten oder anderen markierenden Resten als „sich gegenseitig ausschließende Bindung" bezeichnet, und der Ausdruck „sich gegenseitig ausschließende Stelle" bezieht sich auf eine Stelle an einem Molekül, an der eine sich gegenseitig ausschließende Bindung auftaucht. Durch die Bindung von zwei oder mehr markierenden Resten an das Targetmaterial entsteht ein Material, dass eine unterscheidende Eigenschaft hat, wenn es beide, den ersten und den zweiten Virus enthält, die miteinander über aggregierte und polymerisierte Moleküle verknüpft sind.
Der Ausdruck „Virus" wird hier benutzt, um echte Viren und Organismen zu bezeichnen, die Bakterien auf eine Art infizieren, die derjenigen von echten Viren vergleichbar ist. Daher schließt der Ausdruck Virus ein:

a. Komponenten von einem Virus, die die Charakteristika des Virus haben, von dem sie stammen;
b. verpackte Phagemide, die eine Kreuzung zwischen Plasmiden und Viren sind und die wie Plasmide in bakteriellen Wirten wachsen können, die aber gepackt und abgesondert werden können als ob sie virale Partikel wären in der Gegenwart von einem Hilfsvirus, obwohl sie nicht unabhängig virale Vermehrung durchführen können;
c. Viren, die lysogen für Bakterien sind und die in den Bakterien wachsen, sich replizieren und Vermehrung durchführen können ohne Lysis der Bakterien, die weiter wachsen und sich replizieren können.

Wenn die virale Infektion der bakteriellen Zellen durchgeführt wird unter Verwendung von einem Überschuss von Bakterien über dem erforderlichen, um Gleichheit zwischen den infizierenden Viren und den infizierbaren bakteriellen Zellen zu erreichen, ist es unwahrscheinlich, dass eine gegebene Bakteriumzelle von mehr als einem Viruspartikel infiziert wird. Die Menge, bei der eine solche duale Infektion so ausreichend unwahrscheinlich wird, dass es nicht die Ergebnisse des Assay Verfahrens der Erfindung stören wird, kann statistisch berechnet werden und wird hier als die statistische Menge bezeichnet. Solch eine statistische Kalkulation kann durch einfaches Ausprobieren („trial and error" Versuche) durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind zwei virale Partikel physikalisch über das Targetmaterial miteinander verknüpft und daher kann jedes von ihnen die selbe Bakterienzelle infizieren, so dass diese Zelle mit beiden charakteristischen Eigenschaften der infizierenden Viren ausgestattet ist. Eine bakterielle Zelle, die mit beiden Viren infiziert ist und die die Summe der zwei charakteristischen Eigenschaften aufweist, kann einfach von Zellen unterschieden werden, die nur eine von diesen Eigenschaften aufweisen. Zum Beispiel können die infizierten Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, unter denen Zellen nicht überleben können, die nur eine der Eigenschaften aufweisen, zum Beispiel in der Gegenwart von spezifischen Antibiotika oder spezifischer Temperatur oder spezifischen pH Bedingungen. Die infizierten Zellen, die beide charakteristischen Eigenschaften haben, überleben und werden repliziert. Daher indiziert eine Kaskade von bakteriellem Wachstum in der Gegenwart von markiertem Targetmaterial das das Targetmaterial in der ursprünglichen Probe vorhanden war. Wenn in dieser Kultivierungsstufe kein markiertes Material vorhanden ist, wird es nur wenig oder kein bakterielles Wachstum geben. Wenn lysogene Viren als Tags verwendet werden, die an das Targetmaterial angebracht werden, werden zusätzlich die Viren innerhalb der infizierten bakteriellen Zellen repliziert und stellen vermehrte Viruspartikel her, die freigelassen werden, um weitere Zyklen der Infektion und Replikation zu starten.
In einem besonders bevorzugten Verfahren der Erfindung wird ein Ligand, solch einer wie ein monoklonaler Antikörper (mAbs), verwendet, welcher an eine Seite des interessierenden Moleküls recognises und bindet. In dem nicht aggregierten oder nicht pathogenen Stadium wird nur ein Ligand an ein Molekül unter Isolierung von allen anderen Liganden gebunden. Wie auch immer, wenn das Molekül in der pathogenen Form und aggregiert ist, binden eine Vielzahl von Liganden an das Aggregat durch Erkennen der Bindungsstellen an jedem individuellen Molekül, die von dem Aggregat umfasst werden. In diesem Fall enthält das Aggregat viele Kopien des Liganden. Ein einzelner Ligand kann von mehrfach gebundenen Liganden unter Verwendung verschiedener Detektionstechniken unterschieden werden. Ein Anteil des Liganden kann mit einem ersten Rest markiert werden und ein Anteil des Liganden, die mit einem zweiten Rest so markiert ist, dass in dem Aggregat mit mehrfachen Ligandenbindungen der Energietransfer zwischen den zwei Resten, die in große Nähe zueinander gebracht wurden, gemessen werden kann (für einen Übersichtsartikel von möglichen Markern und Ansätzen siehe Wood, P und Barnard, G, 1997, Fluoroimunoassay in Principles and Practice of Imunoassay, Price and Newman Eds. Macmillan Reference LTD, UK). In einem anderen Beispiel konnten die. Liganden mit den nicht aktiven Komponenten oder Untereinheiten eines funktionellen Restes in der Art markiert werden, dass der Rest mit einer messbaren Funktion ausgestattet ist, wenn die Komponenten oder Untereinheiten zusammen gebracht werden. In diesem Beispiel wurden die Untereinheiten von einem Enzym als Marker in der Art verwendet, dass sie, wenn sie zusammen in die Nähe gebracht wurden, die Aktivität des Enzyms zum Teil wieder herstellen oder voll wieder herstellen oder verändern. Es ist bevorzugt, das doppelte Bakteriophagen Verfahren zu verwenden, das in der WO 99/63348 beschrieben ist, bei dem die zwei Bakteriophagen mit dem gleichen Liganden markiert worden sind. In diesem Beispiel wird, wenn die zwei Bakteriophagen, die mit Ligand markiert sind, zu dem Assay zugegeben werden, das normale Molekül nur einen Liganden und eine Phage binden, so dass da kein Signal auftreten wird. Wie dem auch sei wird ein Aggregat aus den pathogenen Molekülen viele Moleküle des Liganden binden, die mit jeder Sorte des Phagen markiert sind. Es ist wahrscheinlich, dass eine Mischung der zwei Phagentypen durch den Liganden an das Aggregat gebunden wird. Die Bindung der beiden Phagentypen durch den Liganden und das aggregierte pathogene Molekül erzeugt ein Signal, wie dies in der WO 99/63348 beschrieben ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine Nukleinsäuremarkierung verwendet werden. In diesem Fall ist ein Ligand, wie zum Beispiel ein monoklonaler Antikörper an ein einzel- oder doppelsträngiges Molekül Nukleinsäure gekoppelt, welches als Markierung fungiert. Die Kopplung kann mittels standardisierter Techniken durchgeführt werden, wie zum Beispiel mittels der Bindung eines 5'- oder eines 3'-Amino-DNA Oligonukleotids an einen Antikörper unter Verwendung von Bis(succinimid) oder Bis(maleinimid) als Kreuzverknüpfer, oder mittels Glutaraldehyd. Kurze Oligonukleotide mit 15 bis 25 Basen sind bevorzugt; längere DNA Moleküle von mehreren hundert Basen können ebenfalls eingesetzt werden. Unter passenden Bedingungen ist das Oligonukleotid, das mit dem 5'-Ende an einen Antikörper gebunden ist, in der Lage, mit einem Oligonukleotid zu hybridisieren, das mit dem 3'-Ende an ein anderes Molekül Antikörper gebunden ist; dies wird vorzugsweise erreicht durch die Anwendung einer vorhergehenden Spaltung mittels einer Restriktions-Endonuklease, die an beiden Enden der Oligonukleotide kurze, komplementäre Sequenzen erzeugt („klebrige Enden"), bevor diese an die Antikörper gekoppelt werden.
Wenn der monoklonale Antikörper, der mit einer der Formen der Nukleinsäure-Markierung markiet ist, an die aggregierte Form eines Moleküls bindet, werden die Oligonukleotid-Markierungen nebeneinander angeordnet, und eine Hybridisierung wird unterstützt. Dies wird eine vorteilhaftere Reaktion sein als diejenige, die in einer freien Lösung (das Hintergrund Signal) oder bei Anbindung an nicht aggregierte Moleküle stattfindet. Nach Hybridisierung der Oligonukleotide kann eine Ligationsreaktion stattfinden, die entweder chemisch oder mit DNA-Ligase katalysiert wird; für einzelsträngige DNA Moleküle ist ein vorhergehender Hybridisierungsschritt mit einem komplementären, „verbrückenden" Oligonukleotid bevorzugt, welches eine doppelsträngige DNA-Region als Substrat für die Ligase erzeugt. Ligation mit glattem Ende (blunt end) zwischen zwei nichtüberlappenden DNA Oligonukleotid-Markierungen kann ebenfalls stattfinden.
Nach der Ligation sind Moleküle des von Cantor beschriebenen Typs ( US 5,849,878 ) erzeugt worden, das heißt zwei Antikörper, die mit einem ligierten DNA Molekül miteinander verbunden sind. Das Produkt der Ligation kann dann auf verschiedene Arten und Weisen detektiert werden, wie zum Beispiel durch Hybridisierung der markierten Sonden in der ligierten Region, oder durch DNA Amplifikationstechniken wie zum Beispiel PCR unter Verwendung von Primern, die sich an beiden Seiten der ligierten Region befinden. Andere passende DNA Amplifikationstechniken beinhalten RCA (rolling circle amplification) und LCR (ligase chain reaction).
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Zur Veranschaulichung wird die Erfindung in der Folge durch bevorzugte Ausführungsformen ihrer selbst beschrieben. In diesen Beispielen wird die Duale Phagen Detektionsmethode angewandt, um die Gegenwart von polymerisiertem bovinem Serumalbumin (BSA) im ersten Beispiel, und von polymerisiertem Tubulin im zweiten Beispiel aufzuzeigen. Im dritten Beispiel wird gezeigt, dass die Methode zwischen den aggregierten PrP Molekülen, die mit der transmissiblen spongiformen Enzephopathie (TSE) -Krankheit Scrapie verbunden sind, und normalen, nichtaggregierten PrP Molekülen, die in normalem und nicht krankem Gehirn vorkommen, unterscheiden kann. Die Duale Phagen Methode verwendet zwei Phagemide, die zwei verschiedene Gene für die Resistenz gegen Antibiotika kodieren: Resistenz gegen Ampicillin in Phage A und Resistenz gegen Chloramphenicol in Phage C. Die Phagemide werden mit Hilfe eines von M13 abgeleiteten Helferphagen zu infektiösen Partikeln verpackt.
Methode 1
In dieser Methode wurde ein Modellsystem verwendet, um zu zeigen, dass künstlich miteinander kreuzverknüpfte Moleküle von identischen Molekülen unterscheidbar sind, die nicht kreuzverknüpft wurden.
Herstellung der Assay Reagentien
Der Anti-BSA monoklonale Antikörper (Klon Nr. BSA-33, Sigma-Aldrich Company Ltd, UK) und die Phagen A und C wurden mittels Biotinamidocapronsäure-3-sulfo-N-hydroxysuccinimidester (Biotinester) (Sigma Aldrich Company Ltd., UK) biotinyliert. Der Antikörper wurde gegen PBS dialysiert und es wurden 2,5 μl eines Biotinester Vorratslösung mit 0,1 mg/ml PBS zugegeben (dies ergibt einen Durchschnitt von ungefähr 1 Biotin Markierung pro Molekül Antikörper) und es wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Überschüssiger Ester wurde durch Dialyse entfernt. Die Phagen A und C wurden nach Standardprozeduren hergestellt (Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. 1996. Kay, Winter and McCafferty, Eds. Academic Press, UK) und durch Cäsiumchlorid Dichtegradienten Zentrifugation gereinigt. Nach der Dialyse gegen PBS zur Entfernung des Cäsiumchlorids wurden 10¹¹ Plaque bildende Einheiten von jedem Phagen in einem Volumen von 100 μl mit 10 μl von Biotinester (10 μg/ml in PBS) für zwei Stunden bei Raumtemperatur markiert. Überschüssiger Ester wurde durch Polyethylenglykol Ausfällung der Phagen, gefolgt von Standard – Prozeduren (Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. 1996. Kay, Winter and McCafferty, Eds. Academic Press, UK), entfernt, und das Phagenpellet wurde in 100 μl PBS wieder suspendiert.
Detektion von kreuzverknüpftem BSA

1. BSA, Fraktion V (Sigma Aldrich Company Ltd, UK) wurde unter Verwendung von seriellen Verdünnungen von Glutaraldehyd (Grad 1, 25% Vorratslösung) (Sigma Aldrich Company Ltd, UK) kreuzverknüpft. Das BSA wurde mit 10 mg/ml in PBS präpariert und in 100 μl Anteilen bei Raumtemperatur mit seriell 5-fachen Verdünnungen von Glutaraldehyd mit Endkonzentrationen von 2–0,0032% (v/v) für 2 Stunden kreuzverknüpft. Eine Glutaraldehyd-freie und eine BSA- und Glutaraldehyd-freie Kontrolle wurden in das Experiment mit aufgenommen.
2. Nach der Inkubation wurde das Volumen jeder Reaktionslösung mittels TBS und 5 mM Ethanolamin (Sigma Aldrich Company Ltd, UK) auf 1 ml erhöht und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um den Glutaraldehyd zu quenchen.
3. 1 μl von jeder Reaktion wurde zu 10 μl einer Lösung von 4% (w/v) Natriumdodecylsulfat (Sigma Aldrich Company Ltd, UK) und 2,5% (v/v) B-Mercaptoethanol (Sigma Aldrich Company Ltd, UK) gegeben und für 5 Minuten auf 95°C erhitzt, um das Protein zu denaturieren und die Epitope für die Bindung des Antikörpers freizulegen.
4. Nach der Denaturierung wurde jede Reaktion mit einer 50 mM Natriumcarbonat – Lösung von pH 9,6 auf 1 ml aufgefüllt.
5. Jede Reaktion wurde tausendfach mit Carbonatpuffer verdünnt, und 100 μl von jedem Ansatz wurden verwendet, um bei 4°C über Nacht eine Maxisorb (Nunc, Dänemark) Mikrotiter Platten Vertiefung zu beschichten.
6. Nach der Beschichtung wurden die Vertiefungen 3 × mit TBS mit 0,2% (v/v) Tween 20 gewaschen. Die letzte Waschflüssigkeit wurde für 60 min bei Raumtemperatur in der Vertiefung belassen.
7. Der biotinylierte anti-BSA monoklonale Antikörper wurde auf 10^–4 verdünnt mit TBS Tween 20, und 100 μl zu jeder Vertiefung zugesetzt.
8. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Vertiefung 3 × mit TBS Tween 20 gewaschen, und 100 μl Streptavidin (Sigma Aldrich Company Ltd, UK) (eine Vorratslösung von 1 mg/ml, verdünnt auf 10^–4 mit TBS Tween 20) zugegeben.
9. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Vertiefung 3 × mit TBS Tween 20 gewaschen, und 100 μl TBS Tween 20 beinhaltend 10⁸ Plaque bildende Einheiten von jedem der biotinylierten Phagen C und Phagen A wurde zugesetzt.
10. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurden die Vertiefung 3 × mit TBS Tween 20 und dann 2 × mit TBS gewaschen.
11. 1 ml log phase growth XL-1 Blue (Stratagene) E. coli Zellen werden dann zu jeder Vertiefung zugesetzt, und die Mikrotiter Platten bei 37°C für 60 Minuten inkubiert.
12. Die Zellensuspension aus jeder Vertiefung wurde danach auf eine 2 × YT (Sigma Aldrich Chemical Company Ltd) 1,5% (w/v) Agarplatte aufgebracht, die 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Chloramphenicol enthielt.
13. Nach der Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Zahl der Kolonien auf jeder Platte durch Zählen ermittelt.

Ergebnisse
Schlußfolgerung
Dieses Experiment zeigt, dass kreuzverknüpftes BSA von monomerem (nicht kreuzverknüpftem) BSA unterschieden werden kann. Der monoklonale Antikörper kann nur an eine Stelle jedes BSA Moleküls binden. Konsequenterweise resultiert dies in der Bindung nur eines Phagen A oder C an jedes Molekül BSA. Dies bringt die Phagen A und C nicht in die große Nähe zueinander, die eine anschließende duale Infektion von E. Coli erlauben würde. Entsprechend bleibt E. Coli nicht infiziert oder einfach infiziert, und wächst nicht auf Agarplatten, die beide Antibiotika enthalten. Wenn jedoch BSA kreuzverknüpft ist sind viele Moleküle in großer Nähe zueinander gebunden, von denen jedes einen Phagen A oder C binden kann. Dadurch werden Phagen A und Phagen C in große Nachbarschaft zueinander gebracht, was eine duale Infektion von E. Coli erlaubt, welches wiederum dann auf Agarplatten wachsen kann, die beide Antibiotika enthalten.
Aus den Resultaten ist ersichtlich, dass unter diesen Bedingungen und in diesem Modellsystem 0,016% (v/v) Glutaraldehyd das höchste Signal ergab. Geringere Konzentrationen von Glutaraldehyd ergaben wahrscheinlich weniger kreuzverknüpfte Moleküle, während bei einer höheren Konzentration von Glutaraldehyd das Epitop, das vom Antikörper er kannt wird, vom Agens modifiziert und zerstört worden sein könnte, womit eine Erkennung durch den Antikörper verhindert worden wäre.
Methode 2
Mit dieser Methode wurde die aggregierte Form eines selbstaggregierenden Moleküls von der nicht aggregierten Form unterschieden.

1. Anti-Tubulin monoklonarer Antikörper TUB 2.1 (Sigma Aldrich Company Ltd) wurde mit jedem der beiden Bakteriophagen Phage A und Phage C kreuzverknüpft, wobei Standardprotokolle für die chemische Verknüpfung verwendet wurden (Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences. 1998. Aslam and Dent, Eds. Macmillan Reference Ltd., UK).
2. Zwei Reagenzgläser, beinhaltend jeweils 100 μl einer 2 mg/ml Lösung von Tubulin (T238, Cytoskeleton, Inc, Denver USA), wurden hergestellt. In ein Reagenzglas wurde 10 μl destilliertes Wasser gegeben; dies ist die nicht polymerisierte Kontrollröhre. Zum anderen Reagenzglas wurde 10 μl Glycerin gegeben, um den Prozess der Polymerisation zu initiieren.
4. Die Reagenzgläser wurden bei 37°C für 30 min inkubiert.
5. Jede Reaktion wurde auf 10^–6 verdünnt, und zu 10 μl jeder Verdünnung wurde 10 μl des Phagen Puffers (50 mM Na₃PO₄, 0,15 M NaCl, 1 mM MgCl₂, pH 7,2), beinhaltend 10⁵ Plaque bildende Einheiten des Anti-Tubulin Antikörper-konjugierten Phagen A und Phagen C, gegeben und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
6. 1 ml log phase growth XL-1 Blue (Stratagene) E. coli Zellen wurden dann zu jedem Reagenzglas zugesetzt und bei 37°C für 60 Minuten inkubiert.
7. Die Reagenzgläser wurden für 5 Minuten bei 4000 × g zentrifugiert, und die Pellets in 50 μl des Phagen Puffers resuspendiert.
8. Die resuspendierten Pellets wurden danach auf eine 2 × YT (Sigma Aldrich Chemical Company Ltd) 1,5% (w/v) Agarplatte aufgebracht, die 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Chloramphenicol enthielt.
9. Die Platten wurde bei 37°C über Nacht inkubiert und die resultierende Zahl der Kolonien von E. Coli wurde gezählt.

Ergebnis
Die Platte, die von dem Reagenzglas erhalten wurde, das nicht polymerisiertes Tubulin enthielt, enthielt keine Kolonien vom E. Coli Wachstum. Die Platte, die von dem Reagenzglas erhalten wurde, das polymerisiertes Tubulin enthielt, zeigte viele Kolonien vom E. Coli Wachstum (mehr als 1000 Kolonien). Das polymerisierte Tubulin war in der Lage, die beiden Typen von Phagen miteinander zu verbinden, so dass sie den selben bakteriellen Wirt infizieren konnten, und so Resistenzen gegenüber den beiden Antibiotika verliehen, die im Folgenden für die Selektion auf der Agar Platte verwendet wurden.
Dieses Experiment zeigt, dass nicht aggregierte oder nicht polymerisierte Moleküle, in diesem Beispiel von Tubulin, klar unterschieden werden können von der aggregierten oder polymerisierten Form. Die letztere Form ergibt ein klar positives Signal, wenn ein monoklonaler Antikörper im dualen Phagendetektions Assay verwendet wird.
Methode 3
In diesem Beispiel wurde das Material für den Assay aus Scrapie infiziertem und aus nicht infiziertem bovinem Hirnhomogenisat durch Detergenz-unterstützte Solubilisierung und Niedergeschwindigkeits-Zentrifugation zur Klärung von Bruchstücken hergestellt, wie es in Saborio, G. P., Permanne, B., and Soto, C. 2001. Nature, 411: 810–813 beschrieben wurde. Ein Proteinase K – Schritt wurde nicht durchgeführt.
Um die Phagen Konjugate herzustellen wurde der gleiche Anti-PrP monoklonale Antikörper an jeden der beiden Bakteriophagen, Phage A und Phage C kreuzverknüpft, wobei Standardprotokolle für die chemische Verknüpfung verwendet wurden (Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences. 1998. Aslam and Dent, Eds. Macmillan Reference Ltd., UK).

1. Die Vertiefungen von einer Reacti-Bind Maleinsäureanhydrid Microtiter Platte (Pierce, UK) wurden bei 4°C über Nacht mit 100 ng von einem anti-PrP monoklonalen Antikörper in einem Carbonatpuffer beschichtet.
2. Die Vertiefungen wurden mit 0,2 M Ethanolamin bei pH 7,5 gefüllt und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
3. 100 μl des Materials, das von dem nicht infizierten und von dem infizierten Hirn extrahiert wurde, wurde zu einzelnen Vertiefungen gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Die Vertiefungen wurden dann 3 × mit PBS gewaschen und danach mit 0,016% (v/v) Glutaraldehyd in PBS gefüllt.
5. Nach einer Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen mit PBS gewaschen und danach mit 6 M Harnstoff gefüllt.
6. Nach 30 Minuten wurden die Vertiefungen geleert und mit 0,2 M Ethanolamin bei pH 7,5 gefüllt.
7. Nach 30 Minuten wurden die Vertiefungen 3 × mit TBS Tween 20 gewaschen.
8. 100 μl von TBS Tween 20, beinhaltend 10⁸ Plaque bildende Einheiten von jedem der anti-PrP konjugierten Phagen A und Phagen C wurde zugegeben.
9. Nach Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen 3 × mit TBS Tween 20 und danach 2 × mit TBS gewaschen.
10. 1 ml log phase growth XL-1 Blue (Stratagene) E. coli Zellen wurden dann zu jeder Vertiefung zugesetzt und die Mikrotiter Platte bei 37°C für 60 Minuten inkubiert.
11. Die Zellsuspension einer jeden Vertiefung wurde danach auf eine 2 × YT (Sigma Aldrich Chemical Company Ltd) 1,5% (w/v) Agarplatte aufgebracht, die 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Chloramphenicol enthielt.
12. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wurde die Zahl der Kolonien von E. Coli durch Auszählen ermittelt.

Ergebnisse
Die Platte, die von der Vertiefung erhalten wurde, die nicht infizierten Hirnextrakt enthielt, enthielt keine Kolonien vom E. Coli Wachstum. Die Platte, die von der Vertiefung erhalten wurde, die infizierten Hirnextrakt enthielt, zeigte viele Kolonien vom E. Coli Wachstum (mehr als 1000 Kolonien). Das aggregierte PrP war in der Lage, die beiden Typen von Phagen miteinander zu verbinden, so dass sie den selben bakteriellen Wirt infizieren konnten, und so Resistenzen gegenüber den beiden Antibiotika verliehen, die im Folgenden für die Selektion auf der Agar Platte verwendet wurden. Dies zeigt, dass die Methode verwendet werden kann, um zwischen der aggregierten Krankheitsform eines Moleküls und der nicht aggregierten normalen Form zu unterscheiden.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf deren bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist die Erfindung nicht beschränkt auf diese Ausführungsformen, und viele Modifikationen können innerhalb des Schutzbereichs der Ansprüche gemacht werden.

Claims

Verfahren zur Detektion einer Aggregation oder Polymerisation von Molekülen in einer Probe, welches Verfahren folgende Schritte umfasst: a) eine die Moleküle enthaltende Probe wird mindestens zwei unterschiedlichen, markierenden Resten ausgesetzt, von denen jeder nur an einer Stelle eines jeden der Moleküle anbinden wird, so dass eine Bindung von einem der markierenden Reste an einer derartigen Stelle die Bindung mit dem gleichen Molekül eines anderen markierenden Restes ausschließt; und b) es wird bestimmt, ob mindestens zwei verschiedene der markiereneden Reste über Aggregate oder Polymere der Moleküle miteinander verknüpft vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zwei verschiedenen markierenden Reste einen ersten Virus und einen zweiten Virus umfassen, wobei sich die Viren genetisch unterscheiden, jeder Virus direkt oder indirekt sich nur an einer einzigen Stelle an jedem der Moleküle zur Bindung eines gebundenen Moleküls anbinden kann, sodass eine Bindung des ersten oder des zweiten Virus mit dem Ort die Bindung des anderen von dem ersten und dem zweiten Virus mit dem gebundnen Molekül ausschließt, um ein viral gebundenes Targetmaterial zu bilden, das eine unterscheidende Eigenschaft hat, wenn es sowohl den ersten als auch den zweiten Virus umfasst, die über aggregierte oder polymerisierte Moleküle miteinander verknüpft sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Schritt a) umfasst, dass die Probe gleichzeitig oder nacheinander dem ersten und dem zweiten Virus ausgesetzt wird, wobei jeder Virus an einen monoklonalen Antikörper gebunden ist, und zwar unter Bedingungen, um eine Verknüpfung der monoklonalen Antikörper mit den Stellen an den Molekülen zu bewirken, so dass ein viral gebundenes Targetmaterial gebildet wird, das eine unterscheidende Eigenschaft hat, wenn es sowohl das erste als auch das zweite Virus umfasst, die über aggegierte oder polymerisierte Moleküle verknüpft sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wo der Bestimmungsschritt b) folgende Schritte umfasst: c) in der Gegenwart des Produkts aus a) wird ein Indikatormaterials kultiviert, an das sich die von dem viral gebundenen Targetmaterial getragenen Viren anlagern, damit das Indikatormaterial die unterscheidende Eigenschaft des viral gebundenen Targetmaterials annimmt, wenn das Targetmaterial sowohl das erste als auch das zweite Virus umfasst, die über aggegierte oder polymerisierte Moleküle miteinander verbunden sind; und d) ein Vorliegen oder sonstiges von Indikatormaterial wird überwacht, an das sich beide Viren angelagert haben.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Kultivierungsschritt c) unter Bedingungen durchgeführt wird, unter denen das Indikatormaterial, an das sich beide Viren angelagert haben, überlebt, das Indikatormaterial, an welches sich keines oder nur eines der Viren angelagert hat, aber nicht überlebt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Viren über einen Zwischenliganden mit den Molekühlen verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Zwischenligand ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das erste und das zweite Virus unterschiedliche Gene kodieren.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das erste Virus mindestens ein Gen zur Resistenz gegenüber einem ersten Antibiotikum kodiert und das zweite Virus mindestens ein Gen zu Resistenz gegenüber einem zweiten, unterschiedlichen Antibiotikum kodiert, wobei die Viren das Indikatormaterial mit Resistenz gegenüber beiden Antibiotika ausstatten, wenn das Targetmaterial sowohl das erste als auch das zweite Virus enthält, die über aggregierte oder polymerisierte Moleküle miteinander verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Indikatormaterial eine Bakterienkultur ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Kultivierung in Schritt c) in Gegenwart mindestens der statistischen Menge an Bakterienzellen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die unterschiedlichen markierenden Reste jeweils einen ersten Nukleinsäurerest und einen zweiten Nukleinsäurerest umfassen, wobei jeder Nukleinsäurerest sich direkt oder indirekt an nur einer einzigen Stelle an jedem der Moleküle anbinden kann, um ein gebundenes Molekül zu bilden, so dass ein Binden entweder des ersten oder des zweiten Nukleinsäurerests an diese Stelle das Binden des anderen des ersten und des zweiten Nukleinsäurerests an das gebundene Molekül ausschließt, um ein nukleinsäuregebundenes Targetmaterial zu bilden, das eine unterscheidende Eigenschaft hat, wenn es sowohl den ersten als auch den zweiten Nukleinsäurerest umfasst, die über aggregierte oder polymerisierte Moleküle miteinander verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Nukleinsäurereste über einen Zwischenliganden mit den Molekülen verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Zwischenligand ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die Nukleinsäurerest Oligonukleotide umfassen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Oligonukleotide 15 bis 25 Basen haben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, des Weiteren umfassend den Schritt eines Spaltens der Nukleinsäurereste mit einer Restriktionsendonuklease, die vor dem Koppeln an die Liganden kurze komplementäre Sequenzen an jedem Ende der Nukleinsäurereste erzeugt.
Verfahren nach einem Ansprüche 12 bis 17, wobei der Bestimmungsschritt b) die Durchführung einer Ligationsreaktion der hybridisierten Nukleinsäurereste und ein anschließendes Detektieren der Ligationsprodukte umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Moleküle Proteinmoleküle sind.
Verfahren zum Differenzieren von pathogenen, aggregierten Proteinmolekülen gegenüber nicht pathogenen, nicht aggregierten Proteinmolekülen, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) eine die Proteinmoleküle enthaltende Probe wird mindestens zwei unterschiedlichen, markierenden Resten ausgesetzt, von denen jeder an nur einer einzigen Stelle an jedem der Proteinmoleküle anbindet, so dass eine Bindung einer der kennzeichnenden Reste mit einer Stelle die Bindung des gleichen Moleküls mit einem anderen der kennzeichnenden Reste ausschließt; und b) es wird bestimmt, ob mindestens zwei unterschiedliche der markierenden Reste vorliegen, die über Aggregationen der Proteinmoleküle miteinander verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die unterschiedlichen markierenden Reste einen ersten Virus und einen zweiten Virus umfassen, wobei jeder Virus direkt oder indirekt an nur einer einzigen Stelle an jedem der Moleküle zur Bildung eines gebundenen Moleküls anbinden kann, so dass eine Bindung entweder des ersten oder des zweiten Virus an die Stelle die Bindung des anderen des ersten und zweiten Virus an das gebundene Molekül ausschließt, um ein viral gebundenes Targetmaterial zu bilden, das eine unterscheidende Eigenschaft hat, wenn es sowohl das erste als auch das zweite Virus umfasst, die über aggregierte oder polymerisierte Moleküle miteinander verbunden sind; wobei der Bestimmungsschritt b) folgende Schritte umfasst: a) in der Gegenwart des Produkts aus Schritt a) wird ein Indikatormaterial kultiviert, an das sich das durch das viral gebundene Targetmaterial getragenen Viren anlagern, damit das Indikatormaterial die unterscheidende Eigenschaft des viral gebundenen Targetmaterials annimmt, wenn das Targetmaterial sowohl das erste als auch das zweite Virus umfasst, die über aggregierte oder polymerisierte Moleküle miteinander verknüpft sind; und b) ein Vorliegen oder sonstiges von Indikatormaterial wird überwacht, an das sich beide Viren angelagert haben.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die unterschiedlichen, markierenden Reste einen ersten Nukleinsäurerest und einen zweiten Nukleinsäurerest umfassen, wobei sich jeder Nukleinsäurerest direkt oder indirekt an nur einer Stelle eines jeden der Molekühle zur Bildung eines gebundenen Moleküls anlagern kann, so dass eine Bindung des ersten oder des zweiten Nukleinsäurerests an dieser Stelle die Bindung des anderen des ersten und zweiten Nukleinsäurerests mit dem gebundenen Molekül ausschließt, um ein nukleinsäuregebundenes Tagetmaterial zu bilden, das eine unterscheidende Eigenschaft hat, wenn es sowohl den ersten und den zweiten Nukleinsäurerest umfasst, die über aggregierte oder polymerisierte Moleküle miteinander verbunden sind; wobei der Bestimmungsschritt b) folgende Schritte umfasst: c) Auslösen einer Ligationsreaktion von hybridisierten Nukleinsäureresten; und d) Detektieren der Ligationsprodukte.