WO2001023894A1 - Quantitative analyse und typisierung subzellulärer partikel - Google Patents

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WO2001023894A1
WO2001023894A1 PCT/EP2000/009468 EP0009468W WO0123894A1 WO 2001023894 A1 WO2001023894 A1 WO 2001023894A1 EP 0009468 W EP0009468 W EP 0009468W WO 0123894 A1 WO0123894 A1 WO 0123894A1
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probes
signal
particles
measurement
aggregates
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PCT/EP2000/009468
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English (en)
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Inventor
Jan Bieschke
Armin Giese
Original Assignee
Evotec Oai Ag
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • the present invention relates to a method for the determination and individual characterization of particles, in particular subcellular particles such as e.g. Molecules, molecular aggregates or viruses.
  • Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies represent a group of communicable neurodegenerative diseases in humans and animals, which include Creutzfeldt-Jakob disease in humans as well as scrapie in sheep and BSE in cattle.
  • Prior diseases are characterized by the deposition of an aggregated, pathological form of the prion protein (PrP) in the brain tissue of affected individuals, which is referred to as PrP 50 .
  • PrP prion protein
  • PrP Sc is believed to be the crucial, if not the only, component of the prion.
  • the disease and infectivity-associated PrP 50 differs from the physiologically occurring form of prion protein (PrP c ) in its organism due to its conformation, in particular its high proportion of ß-sheet structure, its relative resistance to protease K and its tendency to form large multimeric aggregates. It is assumed within the framework of the so-called prion hypothesis that the PrP Sc form can interact with the PrP c form and thereby convert the body's own PrP c into the PrP Sc form by changing the conformation. The newly formed PrP can then in turn interact with other PrP 50 molecules and also convert them into PrP ⁇ c , so that large amounts of PrP Sc form from the body's own PrP Sc in an avalanche-like chain reaction.
  • PrP c physiologically occurring form of prion protein
  • Pathogen strains also differ constantly when passing through hosts with identical prion protein, for example in mouse inbred strains in various properties such as incubation time, clinical symptoms, lesion patterns in the brain and transferability to other species.
  • the occurrence of different pathogen strains in animals with the same PrP amino acid sequence means that different stable forms of PrP Sc must exist, each of which can convert PrP c into the corresponding pathological form.
  • the problem on which the invention is based consists in providing a method which makes individual pathological protein aggregates detectable in an ultrasensitive manner in a homogeneous assay, and in characterizing and typing the detected aggregates.
  • this method should also be widely applicable in order to detect and characterize other preferably subcellular particles.
  • the particles in particular individual molecules or molecular aggregates, have at least one binding site, preferably a multiplicity of binding sites for at least one of the at least two different detectable probes,
  • the at least two different detectable probes are present in the sample
  • the ratio of the bound probes to one another is determined by determining particles • and where the determination is based on individual particles.
  • a method is also proposed for characterizing pathological prion proteins by subspecies by labeling them with probe molecules, the binding of at least two different probe molecules to the prion proteins being detected and the subspecies being determined from the ratio of the bound amounts of different probe molecules to one another.
  • FIG. 1 shows two-color intensity histograms of human PrP 5 type 1 and type 2.
  • FIG. 2 shows the relative distribution of the signal of the bound PrP-specific probes (12F10-Cy5) and (pri917-Alexa488) for human PrP Sc (129 M / M) type 1 and PrP Sc (129 M / M) type 2.
  • the signal of the MM 2 PrP is almost the same as the proportion of both probes while the signal of the MM 1 aggregates shows less than 20% red (12F10) signal.
  • Figure 3 Schematic structure of the confocal two-color fluorescence spectroscopy apparatus.
  • Figure 6 Quantitative intensity analysis of the fluorescence signal, a) fluorescence trace probe + PrP aggregates, C) intensity histogram of a), b) fluorescence trace of the free probe (rPrP-Cy2), d) intensity histogram of the fluorescence signal b), binocular width 250 ⁇ s.
  • FIG. 7 histogram of the fluorescence intensity with a bin width of 500 ⁇ s.
  • Figure 8 Influence of sample movement on the number of events detected. Intensity track and intensity histogram of fluorescent polystyrene beads in PBS + 0.1% (w / v) NP40 when excited with 488 nm. Top: measurement without movement, bottom: with movement of the measuring capillary at 1 mm / s. The number of events detected increases approximately 100 times. right: intensity histogram of both measurements. Moving the sample increases the number of channels with an intensity> 500 photons / channel four times.
  • Figure 9 Evaluation of different probe molecules.
  • Hamster rPrP (90-231), labeled with Oregon Green, (A, B) and monoclonal antibody 3F4, labeled with Alexa488, (C, D) were added to CSF from control patients to which prion rods were added.
  • the measurement is carried out 600 s with a sample movement of Imm / s and a bin width of 500 ⁇ s.
  • the high intensity signal was separated with a threshold (see arrow) of 500 photons / bin (B, D).
  • FIG. 10 peak signal of the prion rods from FIG. 9 C as a function of the concentration of the target molecules at a threshold of a) 350, b) 500, c) 750, d) 1000 photons / bin.
  • the detection limit is 2 pg.
  • Use peak signal of 110 pg PrP Sc depending on the threshold.
  • Figure 12 Specificity of the detection of Aß and PrP target molecules by two-channel SIFT. Specific and non-specific pairs of probes and target molecules were combined: a) pre-aggregated Aß (1-42) peptide (1 ⁇ M) + Aß antibody (6E10-Cy5, p42-Alexa), b) Aß (1-42) peptide (1 ⁇ M) + PrP antibody (3F4-Alexa, 12F 10-Cy5), c) prion rods 1: 1000 + PrP antibody (3F4-Alexa, 12F10-Cy5), d) c) prion rods 1: 1000 + irrelevant antibodies (Anti-IL8-Oregon Green, Anti-A / 3-Cy5.)
  • Figure 13 Western blot and two-channel SIFT measurement of a dilution of prion rods in spinalliquor.
  • the brain homogenate of a scrapie-infected 263K (af) hamster and prion rods in liquor were diluted as indicated.
  • B In parallel, aliquots of the prion rods were measured by two-channel SIFT and the signal was evaluated as described in FIG. 11.
  • Figure 14 Histogram representation of the two-channel SIFT measurement of a dilution of prion rods in spinal liquor.
  • Figure 15 a) Cross-correlation signal of a dilution of prion rods in spinalliquor. PrP S concentration: 160 pM (line), 56 pM (lines), 20 pM (points), 6 pM (line points), 2 pM (short lines), without rods (thin line), b) Plotting cross-correlation amplitude G, ( 0) against the amount of PrP Sc . c) Plotting the number of measurement channels of high fluorescence intensity of the two-channel SIFT analysis against the cross-correlation amplitude G, y (0).
  • Figure 16 Plotting the number of measurement channels of high fluorescence intensity of the two-channel SIFT analysis against the cross-correlation amplitude G / / 0) of aggregated A / 3 (1-42) peptide in different media.
  • the measurement was carried out in cerebrospinal fluid and buffer with and without detergent (buffer: PBS, PBS + 0.1% NP40, RIPA, PBS + 0.2% SDS, CSF, CSF + 0.1% NP40).
  • Buffer PBS, PBS + 0.1% NP40, RIPA, PBS + 0.2% SDS, CSF, CSF + 0.1% NP40.
  • PAB42-Alexa and 6E10-Cy5, c 6 nM served as specific antibody probes. Regardless of the medium used, both signals were proportional.
  • Figure 17 Two-channel SIFT measurement in CSF samples from CJD and control patients. The measurement was carried out for 600 s with a channel width of 0.5 ms as described in FIG. 11.
  • the monoclonal antibodies 3F4-Alexa488 and 12F10-Cy5 served as probes. In 5 of 24 CSF CSF samples, the signal was above a one-channel threshold, whereas none of the controls with other neurodegenerative diseases contained a positive signal.
  • Figure 18 Two-channel SIFT measurement in CSF samples from AD and control patients. The measurement was carried out for 600 s with a channel width of 0.5 ms as described in FIG. 11.
  • the antibodies pAB42-Alexa488 and 6E10-Cy5 served as probes. In 5 of 6 patients with clinical Alzheimer's diagnosis, but in none of the controls, the signal was above the set threshold.
  • Figure 19 Two-channel SIFT measurement in CSF samples from AD and control patients. The measurement was carried out for 600 s with a bin width of 0.5 ms as described in FIG. 11. The antibodies pAB42-Alexa488 and 6E10-Cy5 served as probes. The samples were preserved immediately after removal.
  • Figure 20 Determination of the binding ratio of the probes.
  • the antibodies Pri917-Alexa488 and 12F10-Cy5 served as probes.
  • the PrP ⁇ -specific signal> 8 I max was summed up in nine sectors with the same signal ratios.
  • FIG. 21 PrP S Type I and Type II in the SIFT signal from human PrP * (129 M / M).
  • the purified PrP Sc was diluted 1:10 in CSF from control patients with the addition of 0.1% NP40. Measurement and evaluation was carried out as described in FIG. 20, a) signal components of both probes in the measurement of (M / M) type I and (M / M) type II PrP Sc with adjustment by a normal distribution, b) signal components of both probes in the Summation of the individual measurements of PrP Type I and Type II (gray) and measurement of a mixture of both PrP 5 types.
  • the ratio of the bound probes to one another is preferably determined by determining particles in a measurement volume that represents a partial volume of the sample to be examined. The determination on the basis of individual particles which are in the measurement volume at different times is particularly preferred.
  • Different bound probes are preferably detected simultaneously on one particle.
  • the measurement volume is preferably ⁇ 10 "12 , in particular ⁇ 10 " 14 I.
  • the measurement is carried out in particular using a confocal microscopic set-up, a near-field set-up or a set-up for multi-photon excitation. Particles are determined and characterized in particular in a homogeneous assay method without washing steps.
  • target molecules pathological prion protein aggregates
  • suitable fluorescence-labeled probe molecules based on a device-related structure for two-color fluorescence spectroscopy, a measurement method is used, which is referred to below in a specific embodiment as SIFT (Scanning for Intensely Fluorescent Targets).
  • SIFT Sccanning for Intensely Fluorescent Targets.
  • the method according to the invention is based on a time-resolved intensity analysis of a fluorescence signal from an open volume element, which is defined by a confocal figure of one or more excitation LASERS bundled in one focus.
  • the particle-related signal component is preferably quantified by analyzing the intensity distribution of a measured detection signal, in particular a fluorescence signal , in successive time windows with detection times of constant or variable lengths in the range from microseconds to milliseconds, which frees the very intense signal of the multiple-labeled target molecules from the background signal Probe molecules are separated.
  • the intensity-based separation of the signal component caused by the target molecule could also be carried out using an algorithm for peak detection and analysis.
  • the sample is preferably scanned by generating an essentially constant relative movement between the sample and the measurement volume.
  • This goal is achieved in a preferred measurement setup by moving the sample filled into a measurement capillary in a meandering manner.
  • this aspect can also be realized by optics that allow the focus to move or by a flow capillary. Scanning has two advantages:
  • the mean stay in focus is no longer determined by the diffusion time T Diff , but by the scanning speed. This is advantageous because essentially all target molecules are mapped onto approximately the same number of measurement channels. This makes the number of very intensive channels a direct measure of the number and concentration of strongly labeled target molecules.
  • the use of antibodies as probe molecules is preferred. In comparison to monomeric aggregate building blocks, these have the advantage of low self-aggregation.
  • the method according to the invention can in principle be carried out with any preferably fluorescence-labeled probe that specifically binds to the target molecule.
  • the method according to the invention uses in particular a simultaneous analysis of two or more probes, in particular fluorescent probes, which can be measured separately in the same measurement volume and emit in different wavelength ranges or polarization planes.
  • the data determined according to the invention are preferably determined from multiple, in particular two-color or polarization measurements and are evaluated in one Arranged accordingly in a multidimensional, in particular two-dimensional, array and represented, for example, as an intensity histogram.
  • the number of channels with simultaneously high values for the multiple or two colors / polarizations is a measure of the number and concentration specific for target molecules labeled with multiple, in particular two, independent probes.
  • a multi-colored peak analysis is alternatively possible.
  • pathological protein aggregates can be detected as particles, in particular prion proteins by subspecies, by labeling them with probe molecules.
  • the binding of at least two different probe molecules to the particles forming the protein aggregates is preferably detected and the subspecies are determined from the ratio of the bound amounts of different probe molecules to one another.
  • the method according to the invention can also be used for pathogen strain typing or investigation of the relative binding of proteins of different species to pathological protein aggregates of a specific species in order to estimate a species barrier for disease transmission.
  • the method according to the invention can be used to examine degenerative diseases, in particular neurodegenerative diseases, with the formation of pathological aggregates, in particular aggregates, which, as components, prion protein, APP, tau, synuclein or proteins with a polyglutamine sequence such as huntingtin, or fragments or derivatives contain these proteins.
  • degenerative diseases in particular neurodegenerative diseases
  • pathological aggregates in particular aggregates, which, as components, prion protein, APP, tau, synuclein or proteins with a polyglutamine sequence such as huntingtin, or fragments or derivatives contain these proteins.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the investigation of subcellular particles, in particular also for the phenotypic analysis of viral particles or for the analysis of nucleic acids by means of antisense probes.
  • the method according to the invention has an additional potential: - 1 U -
  • the relative labeling intensity of the differently colored probes can be measured separately for essentially each detected target molecule.
  • this marking ratio with almost congruent volume elements for the various separately detected colors is largely independent of the route that the respective target molecule takes through the detection volume.
  • the simultaneous measurement of several different probes on a single particle can thus be understood as an internal standard at the single particle level by referencing the measured values to one another.
  • the labeling ratio is therefore similar for all detected particles; in a two-dimensional intensity histogram, the target molecule therefore scatters specific signals around a straight line, the slope of which is determined by the relative binding of the two analyzed probe molecules.
  • the method according to the invention is in principle not limited to the specific application described above in the area of typing different prion strains.
  • an analysis of a wide variety of preferably subcellular particles is possible, which can be labeled with fluorescence-labeled probes in particular.
  • the advantages listed above apply here analogously.
  • the following fields of application are particularly worth mentioning: a) In the field of prion diseases, in addition to the pathogen strain typing, the relative binding of PrP c of different species to prion protein aggregates of a specific species can be investigated, which enables an estimation of the respective species barriers for disease transmission. b) Other (neuro-) degenerative diseases with the formation of pathological aggregates such as, in particular, Alzheimer's disease can be examined analogously.
  • subtypes of pathological aggregates with potentially different diagnostic, prognostic and therapeutic significance can be identified.
  • Other subcellular particles can be examined analogously, up to the phenotypical analysis of viral particles.
  • CJD Creutzfeldt-Jakob disease
  • Alzheimer's disease The attachment of several probes to a pathological aggregate can be used for the detection of individual aggregates or general target molecules in solution.
  • CSF diagnostics Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and Alzheimer's disease are detailed below.
  • N mn is the number of aggregates which contain m monomers of the species / and n monomers of the species j, and N i ⁇ 0 and N j ⁇ 0 the number of free monomers / ' and j in the measurement volume at the start of the experiment. In the case of heterogeneous aggregates, this expression is too complex to allow a quantitative evaluation.
  • Equations 4 and 5 immediately show several features of the cross-correlation function that make them attractive for examining binding processes: 1.
  • the diffusion component of the double-labeled molecules is the denominator of G / . It can also be characterized in isolation in mixtures with monomers and homomultimers.
  • the amplitude G (0) is directly proportional to the concentration of the double-labeled molecules. The kinetics of a binding or cleavage process can thus be easily followed [24], [6],
  • the cross-correlation signal contains no triplet component [24]. This enables the measured values to be adapted with a smaller number of free parameters and thus a good adaptation even in the case of a poorer signal / noise ratio.
  • Another parameter that can be used in addition to the diffusion time to characterize a molecule is the specific brightness of the molecule.
  • An analysis of the fluorescence intensity based on higher modes of the correlation function was carried out by Qian in 1990 [18].
  • a good experimental measure of the specific brightness is the count rate of the fluorescence photons per molecule (cpms). With constant excitation, this size is proportional to the product Q of the fluorescence quantum yield and absorption cross section of the molecule [5]. It is therefore characteristic of the molecule.
  • the binding of many monomers with identical fluorophores creates the greater brightness of the aggregate.
  • the relative brightness would be proportional to the number of bound fluorophores. In practice, however, this consideration only allows a very rough estimate of the number of bound fluorophores.
  • the intensity distribution of the fluorescence photons could be known
  • the detection function of a molecule is the product of a general one
  • Detection function W (r) and a molecule-specific constant Q In the case of aggregate detection, the first assumption is only fulfilled for the case of stationary measurement. Otherwise, a longer bin width was chosen to maximize the relationship between the aggregate signal and the probe background. The second assumption is only partially fulfilled in the case of individual chromophores, since the transition to the radiationless triplet state reduces the quantum yield. This transition depends on the excitation intensity sity and thus the suggestion profile. However, this limitation can be neglected for multichromophoric molecules.
  • the distribution of the detected photons / bin n can be empirically adjusted by means of a "skewed" normal distribution.
  • a log normal distribution can serve as an adaptation model.
  • Buffer solutions were sterile filtered through a membrane filter (0.22 ⁇ m, Millipore) before use.
  • Prion protein rPrP A recombinant prion protein produced in E. coll, which was homologous to amino acids 90-231 of the prion protein of the Syrian hamster, was primarily used as a model system for investigating the aggregation of the prion protein. It thus corresponded to the protease-resistant core of the pathological PrPII, but was not glyco- unlike the natural protein. syled and had no membrane anchor. Otherwise, its structure corresponded to amino acids 90-231.
  • the protein was in an STII TIR vector in E. coli. Strain 27C7 expressed as described by Mehlhorn [13]. The protein was present as a stock solution with a concentration of 1 mg / ml in PBS + 0.2% SDS (w / v).
  • the antibody Pri917 is directed against the amino acids (214-230) of the human PrP.
  • the antibody 3F4 is directed against the AS (109-112) of the hamster PrP and has a somewhat weaker affinity for human PrP. It was produced according to [7].
  • Antibody 15B3 specifically recognizes the aggregated PrP sc isoform. It was manufactured by the company Prionics (Switzerland).
  • the antibody 12F10 is directed against AS (142-160) of human PrP (Krasemann [8]). It was obtained from the IBA company in Heiligenstadt.
  • the A / 3-specific antibody 6E10 is directed against the N-terminus of the Aß peptides (1-17).
  • Antibodies used are listed below:
  • FCS measurement setup A two-color cross-correlation FCS setup served as the basis for the aggregation measurements. The theoretical concept and practical structure are described in detail by Schwüle in [23]. On the basis of this setup, a prototype was developed on which the aggregation measurements were carried out. For the SIFT measurements, the setup was expanded to include a control system for scanning the sample and a measurement card for intensity analysis.
  • the measurement setup is shown schematically in FIG. 3.
  • the beam of an Ar-ion laser (488 nm) and a He-Ne laser (633 nm) are coupled into the beam path in parallel via a single-mode glass fiber, an expansion lens and a double dichroite and through a microscope objective (x40 or x63) focused in the measurement solution.
  • the focal points of both beams form the open measurement volume of the FCS.
  • the lens aperture is fully illuminated, resulting in a radius of 0.25 ⁇ m (x40) or 0.19 ⁇ m (x63) for the blue focus.
  • the figure of the foci is not completely ideal, the radius of the red focal point is approx. 20% larger than that of the green focus, the centers of both foci differ by approx. 50 nm. However, the green focus is still entirely within the red one.
  • the fluorescent light is collected via the microscope objective and confocally imaged on a pinhole.
  • the pinhole can be controlled in diameter and in x-y-z axes by stepper motors.
  • the parallelized fluorescent light is split into red and green emissions using a dichroic / filter combination and focused on two avalanche photodiodes (APD).
  • the APD have a detection efficiency of approx. 70% and generate a TTL pulse for each photon detected.
  • the TTL signal is sent via an amplifier crossover to a hardware correlator card (ALV-5000, ALV, Langen) for correlation analysis and to a multichannel scaler timer (MCS) card (MCD-2, FAST GmbH, Unterhaching or C. Zeiss, Jena) for intensity analysis of the signal.
  • AVS hardware correlator card
  • MCS multichannel scaler timer
  • the excitation laser output was 57 ⁇ W (488 nm) and 53 ⁇ W (633 nm).
  • the measurement solution was filled into a glass capillary 50 mm long, 0.18 mm thick and an internal cross section of 2.6 x 0.2 mm.
  • the sample volume was 20 ⁇ l.
  • the ends of the measuring capillary were attached to a glass slide using a rosin-based varnish and sealed at the same time.
  • the scanning of the measurement solution was realized by controlling the positioning table of the FCS measurement setup (März Reifen, Wetzlar) using a macro language (WinBatch, Wilson Window Ware, Seattle WA, USA).
  • a field of 2 x 20 points was defined, the distance of which along the capillary direction was 20 mm and 10 ⁇ m across the capillary.
  • the points of this field were controlled in such a way that the capillary was moved in a meandering manner relative to the microscope objective at a speed of 1 mm / s.
  • Microspin columns (Mobitec) with Sephadex G-75 (Pharmacia) were equilibrated with 3 * 350 ⁇ l PBSS (centrifugation 1 min, 750 g). After the reaction, the product was separated from excess dye via two microspin columns (centrifugation 3 min, 750 g).
  • the proportion of labeled molecules was 4% for PrP-Oregon Green and 14% for PrP-Cy5, assuming a fluorophore / protein molecule.
  • the labeled antibodies were purified on a microspin column with Sephadex G-75 (Pharmacia) (3 min, 750 g), which was equilibrated with PBSN. After elution again with 30 ⁇ l PBSN, a second fraction of labeled antibodies was obtained. The concentration of the antibody and the proportion of free dye ( ⁇ 5%) were determined by autocorrelation measurement in the FCS.
  • the ratio of c F / c P denotes the average number of fluorophores per protein molecule.
  • the final concentration of the fluorescence-labeled probes and the proportion of free dye was determined by autocorrelation measurements.
  • the structure parameter z 0 / ⁇ 0 , as well as the diffusion time of the free dye was determined on the basis of autocorrelation measurements of Alexa488 and Cy5 dye solutions.
  • prion rods or Aß aggregates in the specified concentration in liquor or buffer were placed in a silanized sample vessel (G. Kisker, Mühlhausen ) diluted to a volume of 18 ⁇ l.
  • 2 ul of a mixture of fluorescence-labeled probes in PBSN was added so that the final concentration of the probes was 6 nM (Antibody) or 10 nM (PrP).
  • 2 ⁇ l probe mix was added directly to 18 ⁇ l CSF. A measuring capillary was filled with the sample free of contamination and then sealed.
  • the measurement was carried out for 300 s or 600 s at 22 ° C. with a scanning speed of 1 mm / s. Contaminated material was decontaminated by autoclaving (2 h, 140 ° C) or treatment with 2 M NaOH (min. 2 h).
  • Antibody 12F10 was purified by protein G affinity chromatography (MAbTrap G II, Pharmacia) from serum-free cell culture supernatant.
  • the column was redistilled with 5 ml. H 2 0 rinsed and equilibrated with 3 ml of B buffer. 15 ml of culture supernatant were mixed with 15 ml of B buffer and applied to the column using a sterile plastic syringe through a membrane filter (0.45 ⁇ m, Millipore).
  • the column was rinsed with 3 ml of B buffer until the absorption (E 28 ⁇ nm ) of the run had decreased to the value of the buffer. It was eluted with 4 ml of E buffer.
  • the eluate was collected in 10 fractions, in each of which 20 ⁇ l of N buffer were placed.
  • the antibody was eluted in fraction 3 (400 ul).
  • the concentration was determined by absorption measurement 350 mg / ml determined.
  • 0.1% (v / v) NP-40 and 0.005% NaN 3 were added and the product was stored at -20 ° C.
  • prion rods were diluted in cerebrospinal fluid from patients with no signs of neurodegenerative diseases.
  • Scrapie-infected hamster brain (strain 263 K) was homogenized with 9 parts of lysis buffer and incubated for 30 min at 37 ° C. with proteinase K (100 ⁇ g / ml). The digestion was stopped by adding 5 mM PMSF and boiling in order buffer. 10 ul was separated on a 12.5% SDS polyacrylamide electrophoresis gel.
  • the PrP was detected by incubation with 3F4 as the primary antibody and goat anti-mouse secondary antibody coupled to alkaline phosphatase.
  • the phosphatase activity was visualized by the CDP-Star chemiluminescence system (Tropix Inc., Bedford MA) on Hyperfilm ECL (Amersham, IL) as indicated by the manufacturers.
  • RPrP was detected analogously, but without PK digestion. Where necessary, the PA gel was then stained with Coomassie Blue (30 min, RT).
  • the aggregation with transformation of the secondary structure into a more hydrophobic conformation is a fundamental characteristic of the prion protein.
  • the detection of aggregated protein can form the basis of a diagnostic test. For this purpose, it is desirable to detect individual pathological aggregates.
  • the addition process of the monomers can be visualized by adding monomeric fluorescence-labeled PrP to a solution of multimeric aggregates.
  • monomeric fluorescence-labeled PrP to a solution of multimeric aggregates.
  • fluorescence peaks increasingly appeared, the individual multimeric aggregates of the Prion protein with a large number of bound dyes could be assigned.
  • the passage of such aggregates through the focal volume creates a shower of fluorescence photons, hereinafter briefly called burst, through which the aggregates can be detected directly (see FIG. 4).
  • the labeling can be done with one or with two different probe molecules that are labeled with different fluorescent dyes.
  • the labeling strategy determines the analysis method with which the signal of the fluorescence-labeled aggregates can be detected and quantified.
  • the diffusion movement of individual molecules can be quantitatively evaluated by the classic correlation analysis of the fluctuation of the fluorescence signal.
  • the mean fluctuation time is determined from a large number of molecular penetrations. If only a few during a single measurement If penetrations of highly marked aggregates are detected, the measured passage time depends not only on the size of the aggregate, but also crucially on the path of the individual particles through the measuring volume. The aggregate size can therefore only be estimated from the passage time.
  • FIG. 5 shows the passage of a single aggregate of recombinant prion protein that was detected with one probe in the autocorrelation FCS or with two differently labeled probes in the cross-correlation FCS. The proportion of the aggregate was ⁇ 10% of the autocorrelation signal.
  • the signal of multimeric aggregates could be completely separated from the signal of mono- and oligomeric PrP molecules (see Fig. 5 left). Passage times of the aggregates of 3-50 ms were determined. The mean diffusion time corresponds to a molecular weight of several MDa.
  • the intensity of the labeled target molecules is on average 20 to 50 times higher than the intensity of the free probe molecules. This corresponds to the minimum number of probe molecules that are bound to an aggregate. Since the course of the fluorescence intensity of the aggregation suggests quenching of the monomers in the bound state, the actual number of bound probes is probably higher, at least when using monomers. Due to the large number of bound fluorophores, individual molecular penetrations can be detected immediately.
  • FIG. 4 shows a section of the trace of the fluorescence signal from a measurement of the CSF of a Creutzfeldt-Jakob patient in a single-channel FCS setup.
  • the fluorescence signal was recorded by the software of the FCS device and in parallel by a multi-channel counter (MCS) card.
  • MCS multi-channel counter
  • Several fluorescence peaks can be seen, which indicate the passage of a highly marked macromolecule through the measurement focus.
  • a successful application of this method has been described for the detection of dementia-specific aggregates of the A / 3 peptide in the spinal liquor of Alzheimer's patients [16].
  • the small number of events and probe-inherent aggregates did not allow reproducible differentiation of the CSF samples from CJD patients and control patients with other neurodegenerative diseases.
  • the direct counting of peaks in the fluorescence signal only allows a relatively unreliable identification of labeled target molecules without quantifying a threshold value of the intensity. Therefore, a simple form of intensity analysis was developed, which shows the proportion of high-intensity fluorescence signal in an intensity histogram, so as to determine the proportion of the peak signal quantitatively.
  • the signal from the photodetector is divided and the fluorescence photons are summed up in parallel in a counter-timer card at intervals of the same length (bins) in parallel with the correlation analysis.
  • the number of time intervals with a certain number of de- Detected fluorescence photons are displayed online in an intensity histogram during the measurement.
  • the intensity distribution of the free probe molecules (FIG. 6 d) is well defined by the homogeneous mean diffusion time of the probe molecules and the number of fluorophores. If, in addition to free probes, there were also target molecules in the solution that had bound a large number of fluorescent probes, the intensity histogram showed a proportion of measurement channels with a high number of detected fluorescence photons (FIG. 6 b).
  • the distribution of the fluorescence intensity arises from the convolution of the fluctuation in the number of molecules with the excitation and detection characteristics of the measurement setup, the so-called collection efficiency function (CEF) [19].
  • CEF collection efficiency function
  • the intensity distribution of the antibodies (3F4-Alexa488) could be adjusted experimentally by a log normal distribution (FIG. 7 a).
  • the component of the labeled aggregates was less well defined due to the heterogeneous aggregate size. As FIG. 7 b) shows, it could only be described incompletely by a single distribution term. It could be quantified by superimposing the distributions for different aggregate sizes and chromophore numbers. However, due to the small N of the detected aggregates, this appeared to be less practical.
  • the signal from the target molecules was therefore separated and quantified by setting a threshold value from the signal from the probes. With this method, part of the signal of the target molecules is lost because it overlaps with the distribution of the probe molecules. The higher the threshold, the higher the proportion of target molecules whose signal is below the threshold and which are therefore not detected. As a rule, a threshold of 3 ⁇ is selected to separate a noise background [1].
  • the separation of the signal from probe and target molecules in the intensity histogram depends on the temporal resolution, ie the bin width. For maximum separation from the probe background, the entire photons of the passage of a target molecule should fall into one bin. This is the minimum temporal resolution of the detection. If the bin width is greater than the average length of stay, the S / N ratio is reduced by averaging over the probe background.
  • the passage time is approximately four times the mean diffusion time ⁇ D - in the case of pure flow, it is determined by the ratio of focus diameter and flow speed.
  • the intensity analysis allows simple separation and quantification of the signal from the target molecules, it does not increase the number of molecule crossings and thus does not increase the sensitivity of the detection.
  • the cross-correlation analysis provides a parameter. for the direct differentiation of bound and unbound probe molecules, so that the size information, which provides the diffusion time, is no longer necessary for the recognition of the target molecules. These can also be recognized if the sample is moved relative to the measurement focus during the measurement.
  • the diffusion movement of the molecules was overlaid by a “flow movement”.
  • the detection sensitivity can be decisively increased by increasing the measurement volume, ie by "scanning" the sample.
  • the sample solution for the measurement was filled with a moving volume element in a drawn glass capillary, which enclosed a volume of 20 ⁇ l. The sealed measuring capillary was moved in a meandering manner at a speed of 1 mm / s during the measurement, thus measuring the sample volume.
  • the passage time of the aggregates through the measurement volume was reduced from 3 - 50 ms to ⁇ 0.5 ms by "scanning" the sample.
  • the passage time was therefore determined solely by the flow speed and by the geometry of the measuring volume. This also made the number of measurement channels with a high-intensity signal proportional to the number of marked particles that passed through the measurement volume.
  • the number of events detected increases with the speed at which the sample is moved. If the diffusion-related movement is neglected, the number of events detected is proportional to the volume.
  • increasing the scanning speed from 1 mm / s to 5 mm / s increased the number of events and thus the sensitivity by a factor of three.
  • the type of control of the positioning table limited the movement to 1 mm / s in routine use.
  • FIG. 10 shows the SIFT signal as a function of the prion-rod concentration at different threshold values. While the number of high-intensity channels changed depending on the threshold, the choice of the threshold had no influence on the proportionality of the SIFT signal to the concentration of prion rods.
  • Two-dimensional intensity analysis Two-dimensional intensity analysis
  • the detection system was expanded to include a second probe which is directed against another epitope of the prion protein. This was marked with a second fluorescent dye, which can be excited in the red spectral range at 633 nm. Binding of the probes results in target molecules that carry a high number of both dyes. As a result, two parameters can be used to isolate the signal of the target molecules:
  • the passage of a double-labeled aggregate can be identified by a peak in the fluorescence signal that occurs simultaneously in both measurement channels.
  • the fluorescence signal of both channels was plotted in a two-dimensional intensity histogram. Analogous to the intensity analysis of a measurement channel, the fluorescence photons were counted in parallel in two channels in bins of 500 ⁇ s and the intervals were summed up in a two-dimensional field according to the number of photons detected.
  • FIG. 11 shows the intensity histogram of a measurement of prion rods, superimposed with a schematic representation of the signal areas.
  • This evaluation separates the signal from particles which simultaneously show a high-intensity signal in both the green and red detection channels from the signal of the free sample.
  • the aggregate-specific signal lies in the fourth quadrant of the histogram, while the predominant number of bins represents the combined signal distribution of the two free probes and is therefore in the first quadrant (see FIG. 11, outlined in gray).
  • the high-intensity signal is separated using a threshold value.
  • a progressive threshold was chosen to take into account the crosstalk of the detection channels. If a high-intensity signal is detected in one of the channels in a bin, the threshold value for separating the specific signal in the other channel increases (see FIG. 11, green lines).
  • the specificity of the detection could be increased by the simultaneous labeling with two types of probe molecules. Both probes, which were directed against different epitopes of the target molecule, bound to the aggregate independently of one another. At the same time, non-specific binding of the probes to cellular components in the sample solution and binding by secondary proteins, e.g. Secondary antibodies that were present in the biological sample. These processes led to the formation of intensely fluorescent particles. In the measurement shown in FIG. 11, this was the case for the antibody probe marked in red. However, whether such non-specific aggregates occurred in one or both channels depended on the sample examined and on other factors that were difficult to control, such as the preparation of the antibodies. This signal, which only occurs in one of the measurement channels (see FIG. 11, red and green ellipses), can also be distinguished from the specific signal in the two-color intensity analysis.
  • the specificity of the recognition of the target molecule was determined using specific and non-specific probes as well as specific and non-specific target molecules. len examined (see Fig. 12). Two monoclonal antibodies were used as specific probes. Without the addition of prion-Tod, almost no simultaneous high-intensity signal was observed (see Fig. 14). After addition of aggregated Aß (1-42) peptide as a non-specific target molecule, no double-labeled aggregates were also observed, even if an antibody (3F4) showed an unspecific signal (FIG. 12 b).
  • the sensitivity of the detection system was compared to the detection of prion protein by Western blot after digestion with Proteinase K. Practically all current tests for pathogenic prion protein are based on this method. Aliquots of the prion-rod material diluted in CSF were analyzed in parallel by Western blot and measured in a confocal fluorescence-spectroscopic setup, the signal being evaluated by SIFT and cross-correlation analysis (see FIG. 13). Figure 14 shows the intensity histograms at different concentrations. The concentration of the prion rods could be measured by two-channel intensity analysis over four orders of magnitude, the detection threshold being a dilution of 1: 2 • 10 5 . In contrast, the detection threshold of the Western blot was 1:10 4 .
  • the signal from the Western blot was quantified using the band intensity in a money-sensitive manner.
  • the detection limit of the blot corresponded to approximately 1 ⁇ g of brain tissue.
  • This amount of tissue contains about 10 pg of monomeric PrP * [17], which corresponds to a concentration of 33 pM with the applied amount of 20 ⁇ l.
  • the detection limit of the SIFT measurement at which one or two aggregates were detected in the measurement time of 600 s, 0.5 pg or 2 pM PrP *.
  • the physical detection threshold of the measurement is the detection of a single particle in the diameter volume. With a scan volume of approx. 2 • 10 6 focal volumes of the confocal structure, this corresponds to a concentration of 1 fM, if one neglects distortions of the volume element.
  • the aggregate concentration which results from the SIFT measurement by considering the detection threshold, can be related to the concentration of the monomeric PrP, which was determined in the Western blot. This leads to an average aggregate size of approx. 1000 PrP molecules.
  • Aß (1-42) peptide which had previously been aggregated under controlled conditions.
  • Two antibodies were used as fluorescent probes, one of which specifically recognized the C-terminal amino acids of A / 342, the other, however, recognized an epitope in the consensus sequence of the Aß peptides.
  • the Aß aggregates could be detected up to a concentration of 100 pM (9 pg) of monomeric Aß42. This suggests an aggregate size of approximately 10 5 units per aggregate.
  • FIG. 15 shows the cross-correlation curves of a dilution of prion rods in liquor. In the range from 0 to 50 pg PrP (160 pM) the cross correlation amplitude is proportional to the amount of prion rods used.
  • the effective detection quantum yield (cpms) the measure of which is the number of photons collected per molecule and second, was up to 200 kHz many times higher than the value of 1- 2 kHz, the double-labeled oligomers in the experiments for self-aggregation in the cross-correlation signal ranged.
  • the high molecular detection efficiency requires a high signal / noise ratio and thus a high cross-correlation amplitude.
  • the cross-correlation amplitude was to be differentiated from the signal of the control sample up to a PrP concentration of 5 pM. Due to the small number of events, the correlation amplitude was scattered strongly at low concentrations.
  • the invention particularly discloses a diagnostic system for the highly sensitive detection of pathological aggregates for the diagnosis of Creutzfeldt-Jakob and Alzheimer's disease.
  • the examination medium of the spinal cerebrospinal fluid can be used as an examination medium for three reasons: First, the cerebrospinal fluid washes around the human central nervous system. It is not like e.g. the blood is separated from the origin of the pathological aggregates by the blood-brain barrier. Second, liquor is a 'clean' medium. It contains hardly any cells or proteins that absorb or fluoresce in the range of the excitation wavelengths and is therefore well suited for fluorescence spectroscopic measurements. Third, it can be obtained comparatively easily and without risk from the patient through spinal cord puncture. To detect neurodegenerative secondary markers such as the 14-3-3 protein, this is done as part of routine clinical examinations.
  • a group of patients with other neurodegenerative diseases served as a control group to ensure that the test was specific for CJD and did not only recognize a secondary effect of neurodegenerative diseases.
  • a signal that was specific for PrP * was not obtained from any of the samples from the control patients (see FIG. 17). This corresponds formally to a sensitivity of 21% and a specificity of 100% for the detection of Creutzfeldt-Jakob disease. So far, this is the highest value of a pathogen-specific test in a patient's cerebrospinal fluid [2].
  • Alzheimer's disease is characterized by the increased formation of fragments of a transmembrane protein, the so-called amyloid precursor protein (APP), which aggregate in a subsequent process and form amyloid deposits.
  • APP amyloid precursor protein
  • the amyloid Aß peptides can be detected as normal metabolic products in small amounts even in healthy people.
  • a pathologically increased amount of aggregated peptides must therefore be defined by a threshold.
  • the examined CSF samples are samples that were used in routine clinical examinations, e.g. the detection of the neurodegenerative secondary marker 14-3-3. They are therefore very heterogeneous with regard to their clinical history.
  • a series of 5 AD samples and 4 control CSF samples were examined, which were specially preserved.
  • a significantly larger amount of amyloid aggregates could be detected in the AD-positive samples than in the samples from routine clinical diagnostics, which underlines the importance of sample preparation.
  • the two-channel intensity analysis alone evaluated whether an aggregate was labeled with a large number of both probe molecules.
  • the intensity analysis detects the signal of each detected particle separately. It therefore made it possible to determine the ratio of the signal in both measurement channels and thus the ratio of the bound probes for each target molecule.
  • the differential binding of a number of different monoclonal antibody probes to pathological prion protein was examined on purified human PrP *. It was possible to differentiate between different types of the pathogenic prion protein.
  • the measurement was carried out in the same measurement setup as the diagnostic application.
  • the intensity histogram of the two-channel intensity analysis was divided into sectors of the same signal ratio. In each sector, the number of measurement channels whose intensity was above a threshold was determined (Fig. 20).
  • the aggregate-specific signal was separated over a threshold of 8 • ⁇ . With this threshold, the high-intensity signal could be safely separated from the probe signal.
  • the separation of the prion types was optimized with different probe pairs and detergent additives.
  • Purified pathogenic prion proteins of type 1 and type 11 from two patients homozygous at codon 129 M / M could be characterized on the basis of the relative probe binding. Both conformations could be differentiated reproducibly on the basis of the binding ratio of the probes (FIG. 21 a).
  • the aggregate-specific signal of type 11 shows a normal distribution around a probe ratio of 45 ⁇ 15%.
  • the additional signal with a green portion> 90% is probably due to aggregation or crosslinking of the probe.
  • the labeling ratio in PrP * Type I is shifted in favor of the green-labeled probe (mAB 917Alexa). After deducting the signal component inherent in the probe, the distribution maximum is 85 ⁇ 20% of the probe marked green.
  • Alexa488 Alexa Fluor TM 488 (trade name of a rhodamine derivative)

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung und individuellen Charakterisierung von Partikeln mittels mindestens zweier unterschiedlicher detektierbarer Sonden in einer Probe, wobei die Partikel, insbesondere Moleküle oder Molekülaggregate, mindestens eine Bindungsstelle, vorzugsweise eine Vielzahl von Bindungsstellen für mindestens eine der mindestens zwei unterschiedlichen detektierbaren Sonden aufweisen; die mindestens zwei unterschiedlichen detektierbaren Sonden in der Probe anwesend sind; ein Mass für die Anzahl der gebundenen Sonden und das Verhältnis der gebundenen Sonden zueinander durch Bestimmung von Partikeln ermittelt wird; und wobei die Bestimmung auf Basis von einzelnen Partikeln erfolgt.

Description

Quantitative Analyse und Tvpisierunα subzellulärer Partikel
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung und individuellen Charakterisierung von Partikeln, insbesondere subzellulären Partikeln wie z.B. Molekülen, Molekülaggregaten oder Viren.
Ein möglicher und beispielhaft realisierter Einsatzbereich des vorliegenden Verfahrens ist die Diagnostik von Prionkrankheiten und Typisierung verschiedener Erregerstämme. Die Prionkrankheiten oder transmissiblen spongiformen Enzephalopathien stellen eine Gruppe übertragbarer neurodegenerativer Krankheiten bei Mensch und Tier dar, zu der die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit des Menschen sowie Scrapie beim Schaf und BSE beim Rind gehören. Prio- nerkrankungen sind charakterisiert durch die Ablagerung einer aggregierten, pathologischen Form des Prionproteins (PrP) im Gehirngewebe betroffener Individuen, die als PrP50 bezeichnet wird. Grundsätzlich sind Prionerkrankungen übertragbar, das übertragbare Agens wird als "Prion" bezeichnet. Es wird angenommen, dass PrPSc der entscheidende, wenn nicht sogar der einzige Bestandteil des Prions ist. Eine erregerassoziierte Nukleinsäure konnte nicht nachgewiesen werden. Das krankheits- und infektiositätsassoziierte PrP50 unterscheidet sich von der physiologisch im Organismus vorkommenden Form des Prionproteins (PrPc) durch seine Konformation, insbesondere seinen hohen Anteil an ß-Faltblattstruktur, seine relative Resistenz gegenüber Protease K und seine Neigung zur Bildung großer multimerer Aggregate. Es wird im Rahmen der sogenannten Prionhypothese angenommen, dass die PrPSc-Form mit der PrPc-Form in Wechselwirkung treten und dabei das körpereigene PrPc über eine Konformationsänderung in die PrPSc-Form umwandeln kann. Das so neu entstandene PrP kann dann seinerseits mit weiteren PrP50 Molekülen in Wechselwirkung treten und diese ebenfalls in PrP≤c umwandeln, so dass sich in einer lawinenartigen Kettenreaktion aus dem körpereigenen PrPSc große Mengen PrPSc bilden.
Ein wichtiges Phänomen bei den Prionkrankheiten ist das Auftreten verschiedener Erregerstämme. Erregerstämme unterscheiden sich auch bei Passage in Wirten mit identischem Prionprotein, z.B. in Maus-Inzuchtstämmen, konstant in verschiedenen Eigenschaften wie Inkubationszeit, klinischen Symptomen, Läsionsmuster im Gehirn und Übertragbarkeit auf andere Spezies. Im Rahmen der Prionhypothese bedeutet das Auftreten verschiedener Erregerstämme in Tieren mit gleicher PrP-Aminosäuresequenz, dass verschiedene stabile Formen von PrPSc existieren müssen, die jeweils PrPc in die entsprechende pathologische Form umwandeln können. Auch bei der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit des Menschen finden sich verschiedene distinkte Unterformen, die sich molekular anhand eines Polymorphismus am Codon 129 des Prionproteingens (PRNP) und der Größe des Proteinase K-resistenten Fragmentes des Prionproteins im Westernblot unterscheiden lassen, und mit unterschiedlichen phänotypischen Krankheitsausprägungen assoziiert sind.
Das der Erfindung zugrundeliegende Problem besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, das einzelne pathologische Proteinaggregate in einem homogenen Assay ultrasensitiv detektierbar macht und die detektierten Aggregate zu charakterisieren und zu typisieren.
Darüber hinaus sollte dieses Verfahren auch breit anwendbar sein, um andere bevorzugt subzelluläre Partikel zu detektieren und charakterisieren.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bestimmung und individuellen Charakterisierung von Partikeln mittels mindestens zweier unterschiedlicher detektier- barer Sonden in einer Probe vorgeschlagen, wobei
• die Partikel, insbesondere einzelne Moleküle oder Molekülaggregate, mindestens eine Bindungsstelle, vorzugsweise eine Vielzahl von Bindungsstellen für mindestens eine der mindestens zwei unterschiedlichen detektierbaren Sonden aufweisen,
• die mindestens zwei unterschiedlichen detektierbaren Sonden in der Probe anwesend sind,
• ein Maß für die Anzahl der gebundenen Sonden und
• das Verhältnis der gebundenen Sonden zueinander durch Bestimmung von Partikeln ermittelt wird • und wobei die Bestimmung auf Basis von einzelnen Partikeln erfolgt.
Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren vorgeschlagen zur Charakterisierung pathologischer Prionproteine nach Subspezies durch deren Markierung mit Sondenmolekülen, wobei die Bindung mindestens zweier unterschiedlicher Sondenmolekülen an die Prionproteine detektiert wird und aus dem Verhältnis der gebundenen Mengen an verschiedenen Sondenmolekülen zueinander die Subspezies bestimmt wird.
Figur 1 zeigt Zweifarben-Intensitätshistogramme von humanem PrP5 Typ 1 und Typ 2.
Figur 2 zeigt die relative Verteilung des Signals der gebundenen PrP- spezifischen Sonden (12F10-Cy5) und (pri917-Alexa488) für menschliches PrPSc (129 M/M) Typ 1 und PrPSc (129 M/M) Typ 2. Im Signal des MM 2 PrP ist der Anteil beider Sonden annähernd gleich während das Signal der MM 1 Aggregate weniger als 20% rotes (12F10) Signal zeigt.
Figur 3: Schematischer Aufbau der konfokalen Zweifarben-Fluoreszenz- Spektroskopie-Apparatur.
Figur 4: Anlagerung von fluoreszenten Sonden an PrP-Aggregate. Spur der Fluoreszenzintensität I a) ohne Anwesenheit b) mit Anwesenheit von pathoge- nen PrPsc-Aggregaten in Spinalliquor. Als Sonde diente rPrP-Cy2 (c = 10 nM), Anregung bei 488 nm, 180 μW, Messzeit 21 min. Unten: Zahl der detektierten Aggregate je Zeiteinheit im Verlauf der Messung.
Figur 5: Links: Bestimmung der Aggregatgröße durch ein heterologes Sondenpaar. Voraggregiertes rPrP(90-231), monomere Konzentration 0,1 μM, wurde durch ein Sondenpaar aus rPrP-Oregon Green (c = 2 nM) und dem Antikörper 15B3-Cy5 (c = 10 nM) detektiert. Gesamtmesszeit 20 * 1 min. Während der Einzelmessungen wurden nur einzelne markierte Aggregate detektiert, deren Durchtrittszeit anhand des Kreuzkorrelationsignals bestimmt wurde. Dargestellt ist Fluoreszenzspur und Kreuzkorrelationssignal einer Einzelmessung mit τ « 15 ms. Rechts: Homologe Detektion mit rPrP-Oregon Green. Figur 6: Quantitative Intensitätsanalyse des Fluoreszenzsignals, a) Fluoreszenzspur Sonde + PrP-Aggregate, C) Intensitätshistogramm von a), b) Fluoreszenzspur der freien Sonde (rPrP-Cy2), d) Intensitätshistogramm des Fluoreszenzsignals b), Binweite 250 μs.
Figur 7: Histogramm der Fluoreszenzintensität Binweite 500 μs. a) Antikörpersonde 3F4-Alexa488 c = 6 nM Anpassung durch Log-Normalverteilung (s. Gl. 9) mit υ = 32, σ = 16. b) prion-rods c = 0.35 nM, Anpassung durch einen Sondenterm mit υl = 30 und einen zweiten Term mit υ2= 200.
Figur 8: Einfluss der Probenbewegung auf die Anzahl der detektierten Ereignisse. Intensitätsspur und Intensitätshistogramm von fluoreszenten Polystyrol- beads in PBS + 0.1% (w/v) NP40 bei Anregung mit 488 nm. oben: Messung ohne Bewegung, unten: mit Bewegung der Messkapillare mit 1 mm/s. Die Zahl der detektierten Ereignisse steigt etwa 100-fach. rechts: Intensitäthistogramm beider Messungen. Durch Bewegung der Probe steigt die Zahl der Kanäle mit einer Intensität > 500 Photonen/Kanal vierfach.
Figur 9: Evaluierung unterschiedlicher Sondenmoleküle. Hamster rPrP(90- 231), markiert mit Oregon Green, (A,B) und monoklonaler Antikörper 3F4, markiert mit Alexa488, (C,D) wurden zu Liquor von Kontrollpatienten zugegeben, der mit prion-rods versetzt wurde. Die Messung erfolgt 600 s mit einer Probenbewegung von Imm/s und einer Binweite von 500 μs. Das Signal hoher Intensität wurde mit einer Schwelle (s. Pfeil) von 500 Photonen/Bin abgetrennt (B,D).
Figur 10: Peaksignal der prion-rods aus Fig. 9 C in Abhängigkeit von der Konzentration der Zielmoleküle bei einer Schwelle von a) 350, b) 500, c) 750, d) 1000 Photonen/Bin. Die Detektionsgrenze beträgt 2 pg. Einsatz: Peaksignal von 110 pg PrPSc in Abhängigkeit vom Schwellenwert.
Figur 11: Prinzip der Zweikanal-Intensitätsanalyse. Rot und grün markierte Antikörper (3F4-Alexa 488, c = 5 nM, 12F10-Cy5, c = 6nM) wurden zu Liquor von Kontrollpatienten zugegeben, der mit prion-rods versetzt wurde (1:500). Die Messung erfolgt 600 s mit einer Probenbewegung von 1 mm/s und einer Kanalweite von 500 μs. Das koinzidente Signal hoher Intensität wird mit einer progressiven Schwelle vom Signal der freien Sonden und Signal hoher Intensität der Einzelkanäle abgetrennt. Jeder Punkt entspricht einem Intensitätspaar. Die Zahl der Messkanäle ist logarithmisch auf einer Farbskala dargestellt.
Figur 12: Spezifität der Detektion von Aß und PrP Zielmolekülen durch Zweika- nal-SIFT. Es wurden spezifische und unspezifische Paare von Sonden und Zielmolekülen kombiniert: a) voraggregiertes Aß(l-42)-Peptid (1 μM) + Aß- Antikörper (6E10-Cy5, p42-Alexa), b)Aß(l-42)Peptid (1 μM) + PrP-Antikörper (3F4-Alexa, 12F 10-Cy5), c) prion rods 1: 1000 + PrP-Antikörper (3F4-Alexa, 12F10-Cy5), d) c) prion rods 1: 1000 + irrelevante Antikörper (Anti-IL8- Oregon Green, Anti-A/3-Cy5.)
Figur 13: Western Blot und Zweikanal-SIFT Messung einer Verdünnung von prion rods in Spinalliquor. Das Hirnhomogenat eines scrapie-infizierten Hamsters 263K (a-f) und prion rods in Liquor wurden wie angegeben verdünnt. A:PrPSc wurde mit Proteinase K (100 μg/ml) 30 min bei 37°C verdaut und anschließend durch Western Blot mit dem Antikörper 3F4 nachgewiesen. B: Parallel wurden Aliquots der prion rods durch Zweikanal-SIFT gemessen und das Signal wie in Fig. 11 beschrieben ausgewertet.
Figur 14: Histogrammdarstellung der Zweikanal-SIFT Messung einer Verdünnung von prion rods in Spinalliquor. A: Verdünnung 1:2000, B: 1:105, C: ohne PrPsc
Figur 15: a) Kreuzkorrelationssignal einer Verdünnung von prion rods in Spinalliquor. PrPS -Konzentration: 160 pM (Linie), 56 pM (Striche), 20 pM (Punkte), 6 pM (Strichpunkte), 2 pM (kurze Striche), ohne Rods (dünne Linie), b) Auftragung Kreuzkorrelationsamplitude G ,(0) gegen die eingesetzte Menge an PrPSc. c) Auftragung der Zahl der Messkanäle hoher Fluoreszenzintensität der Zweikanal-SIFT Analyse gegen die Kreuzkorrelationsamplitude G,y(0).
Figur 16: Auftragung der Zahl der Messkanäle hoher Fluoreszenzintensität der Zweikanal-SIFT-Analyse gegen die Kreuzkorrelationsamplitude G//0) von ag- gregiertem A/3(l-42) Peptid in verschiedenen Medien. Die Messung erfolgte wie in Fig. 11 in Liquor und Puffer mit und ohne Detergenz (Puffer: PBS, PBS + 0.1% NP40, RIPA, PBS + 0.2% SDS, Liquor, Liquor + 0.1% NP40). Als spezifische Antikörpersonden dienten pAB42-Alexa und 6E10-Cy5, c = 6 nM. Unabhängig vom verwendeten Medium waren beide Signale proportional.
Figur 17: Zweikanal-SIFT Messung in Liquorproben von CJD und Kontrollpatienten. Die Messung erfolgte für 600s mit einer Kanalweite von 0.5 ms wie in Fig. 11 beschrieben. Als Sonden dienten die monoklonalen Antikörper 3F4- Alexa488 und 12F10-Cy5. In 5 von 24 CJD-Liquorproben lag das Signal über einer Schwelle von einem Kanal, dagegen enthielt keine der Kontrollen mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen positives Signal.
Figur 18: Zweikanal-SIFT Messung in Liquorproben von AD und Kontrollpatienten. Die Messung erfolgte für 600s mit einer Kanalweite von 0.5 ms wie in 11 beschrieben. Als Sonden dienten die Antikörper pAB42-Alexa488 und 6E10- Cy5. In 5 von 6 Patienten mit klinischer Alzheimerdiagnose, jedoch in keiner der Kontrollen lag das Signal über dem gesetzten Schwellenwert.
Figur 19: Zweikanal-SIFT Messung in Liquorproben von AD und Kontrollpatienten. Die Messung erfolgte für 600s mit einer Binweite von 0.5 ms wie in 11 beschrieben. Als Sonden dienten die Antikörper pAB42-Alexa488 und 6E10- Cy5. Die Proben wurden direkt nach der Entnahme asserviert.
Figur 20: Bestimmung des Bindungsverhältnisses der Sonden. Signal einer Zweikanal-SIFT Messung an humanem PrPSc (129M/M) Typ II. Die Messung erfolgte für 600s mit einer Kanalweite von 0.5 ms wie in 11 beschrieben. Als Sonden dienten die Antikörper Pri917-Alexa488 und 12F10-Cy5. Das PrP^- spezifische Signal > 8 Imax wurde in neun Sektoren gleicher Signalverhältnisse aufsummiert.
Figur 21: PrPS Typ I und Typ II im SIFT-Signal von humanem PrP* (129 M/M). Das gereinigte PrPSc wurde 1:10 in Liquor von Kontrollpatienten unter Zugabe von 0.1% NP40 verdünnt. Messung und Auswertung erfolgte wie in Fig. 20 beschrieben, a) Signalanteile beider Sonden in der Messung von (M/M) Typ I und (M/M) Typ II PrPSc mit Anpassung durch eine Normalverteilung, b) Signalanteile beider Sonden in der Summation der Einzelmessungen von PrP Typ I und Typ II (grau) sowie Messung einer Mischung beider PrP5 Typen. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise das Verhältnis der gebundenen Sonden zueinander durch Bestimmung von Partikeln in einem Messvolumen, das ein Teilvolumen der zu untersuchenden Probe darstellt, ermittelt. Besonders bevorzugt ist die Bestimmung auf Basis von einzelnen Partikeln, die sich zu verschiedenen Zeiten im Messvolumen befinden.
Die Detektion verschiedener gebundener Sonden erfolgt vorzugsweise gleichzeitig an einem Partikel.
Vorzugsweise beträgt das Messvolumen < 10"12, insbesondere < 10"14 I. Die Messung erfolgt insbesondere unter Verwendung eines konfokal mikroskopischen Aufbaus, eines Nahfeldaufbaus oder eines Aufbaus zur Mehrphotonenanregung. Die Bestimmung und Charakterisierung von Partikeln erfolgt insbesondere in einem homogenen Assayverfahren ohne Waschschritte.
Eine vorteilhafte Möglichkeit der Charakterisierung von Partikeln, wie z.B. pathologischer Prionproteinaggregaten (im folgenden "Zielmoleküle" genannt) ist deren Markierung mit geeigneten fluoreszenzmarkierten Sondenmolekülen und die anschließende Detektion und Analyse einzelner Aggregate. Hierfür dient aufbauend auf einem gerätetechnischen Aufbau zur Zweifarben-Fluoreszenz- Spektroskopie, ein Messverfahren, das im folgenden in einer spezifischen Ausführungsform als SIFT (Scanning for Intensely Fluorescent Targets) bezeichnet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf einer zeitaufgelösten Intensitätsanalyse eines Fluoreszenzsignals aus einem offenen Volumenelement, das durch eine konfokale Figur eines oder mehrerer in einem Fokus gebündelter Anregungs-LASER definiert wird. Dieses Verfahren unterscheidet sich vom Stand der Technik zur FCS-basierten Amyloid-Aggregat- Detektion (Pitschke et al. 1998) durch insbesondere folgende Modifikationen: a) Erfindungsgemäß erfolgt eine Quantifizierung des partikelbedingten Signalanteils vorzugsweise durch Analyse der Intensitätsverteilung eines gemessenen Detektionssignals, insbesondere eines Fluoreszenzsignals, in sukzessiven Zeitfenstern mit Detektionszeiten konstanter oder variabler Längen im Bereich von Mikro- bis Millisekunden, dadurch kann das sehr intensive Signal der mehrfach markierten Zielmoleküle vom Hintergrundsignal freier Sondenmoleküle abgetrennt werden. Alternativ könnte die intensitätsba- sierte Abtrennung des Zielmolekül bedingten Signalanteils auch über einen Algorithmus zur Peakdetektion und -analyse erfolgen. b) Erfindungsgemäß erfolgt vorzugsweise ein Scannen der Probe durch Erzeugen einer im wesentlichen konstanten Relativbewegung zwischen Probe und Messvolumen. Dieses Ziel ist in einem bevorzugten Messaufbau durch ein mäanderförmiges Bewegen der in eine Messkapillare eingefüllten Probe realisiert. In einer weiteren Ausführungsform kann dieser Aspekt auch durch eine Optik, die eine Bewegung des Fokus gestattet oder durch eine Flusskapillare realisiert werden. Das Scannen bewirkt zwei Vorteile:
1. Das untersuchte Volumen und damit die Messsensitivität wird deutlich erhöht.
2. Für große, sehr langsam diffundierende Zielmoleküle wird die mittlere Aufenthaltsdauer im Fokus nicht mehr durch die Diffusionszeit TDiff, sondern durch die Scangeschwindigkeit bestimmt. Dies ist vorteilhaft, weil im wesentlichen alle Zielmoleküle auf etwa die gleiche Zahl Messkanäle abgebildet werden. Dadurch wird die Anzahl der sehr intensiven Kanäle ein direktes Maß für die Zahl und Konzentration stark markierter Zielmoleküle. c) Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Verwendung von Antikörpern als Sondenmoleküle. Diese haben im Vergleich zu monomeren Aggregat- Bausteinen den Vorteil einer geringen Selbstaggregation. Dieser Punkt wird erfindungsgemäß zwar bevorzugt, das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich aber prinzipiell mit jeder spezifisch an das Zielmolekül bindenden bevorzugt fluoreszenzmarkierten Sonde durchführen. d) Das erfindungsgemäße Verfahren setzt insbesondere eine simultane Analyse zweier oder mehrerer getrennt im selben Messvolumen messbarer, in verschiedenen Wellenlängenbereichen oder Polarisationsebenen emittierender Sonden, insbesondere fluoreszierender Sonden ein. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäß ermittelten Daten aus Mehrfach-, insbesondere Zweifarb bzw. -polarisationsmessungen ermittelt und zur Auswertung in einem entsprechend mehrdimensionalen, insbesondere zweidimensionalen Array angeordnet und z.B. als Intensitätshistogramm dargestellt. Dabei ist die Zahl von Kanälen mit gleichzeitig hohen Werten für die mehreren oder beiden Farben/Polarisationen ein Maß für die Zahl und Konzentration spezifisch für mit mehreren, insbesondere zwei unabhängigen Sonden markierten Zielmolekülen. Wie schon unter Punkt a) erwähnt, ist hier alternativ eine mehrfarbige Peakanalyse möglich.
Erfindungsgemäß können pathologische Proteinaggregate als Partikel, insbesondere Prionproteine nach Subspezies, durch deren Markierung mit Sondenmolekülen, detektiert werden.
Vorzugsweise wird die Bindung mindestens zweier unterschiedlicher Sondenmoleküle an die Proteinaggregate bildenden Partikel detektiert und aus dem Verhältnis der gebundenen Mengen an verschiedenen Sondenmolekülen zueinander die Subspezies bestimmt.
Zur Erregerstammtypisierung oder Untersuchung der relativen Bindung von Proteinen verschiedener Spezies an pathologische Proteinaggregate einer bestimmten Spezies zwecks Abschätzung einer Speziesbarriere für eine Krankheitsübertragung kann das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann dieses zur Untersuchung degenerativer Erkrankungen, insbesondere neurode- generativer Krankheiten, mit Bildung pathologischer Aggregate, insbesondere Aggregate, die als Komponente Prionprotein, APP, Tau, Synuclein oder Proteine mit einer Polyglutaminsequenz wie Huntingtin, oder Fragmente oder Derivate dieser Proteine enthalten, dienen.
Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung subzellulärer Partikel, insbesondere auch zur phänotypischen Analyse viraler Partikel oder zur Analyse von Nukleinsäuren mittels Antisensesonden geeignet.
Neben der erhöhten Spezifität in der Detektion von Zielmolekülen hat das erfindungsgemäße Verfahren ein zusätzliches Potential: - 1 U -
Für im wesentlichen jedes detektierte Zielmolekül kann separat die relative Markierungsintensität der verschiedenfarbigen Sonden gemessen werden. Im Gegensatz zur absoluten Intensität der Einzelfarben ist dieses Markierungsverhältnis bei nahezu deckungsgleichen Volumenelementen für die verschiedenen separat detektierten Farben weitgehend unabhängig von der Route, die das jeweilige Zielmolekül durch das Detektionsvolumen nimmt. Die simultane Messung mehrerer unterschiedlicher Sonden an einem Einzelpartikel kann somit durch Bezug der Messwerte aufeinander als interner Standard auf Einzelpartikelebene aufgefasst werden. Bei einer homogenen Population an Zielmolekülen ist daher das Markierungsverhältnis für alle detektierten Partikel ähnlich, in einem zweidimensionalen Intensitätshistogramm streut daher das Zielmolekül spezifische Signale um eine Gerade, deren Steilheit von der relativen Bindung der zwei analysierten Sondenmoleküle bestimmt wird. Bei der Analyse eines anderen Typs von Zielmolekül mit abweichenden Bindungseigenschaften ergibt sich entsprechend ein anderes Markierungsverhältnis (Figur 1). Die relative Bindung zweier verschiedener Sonden kann somit leicht und schnell in einem homogenen Assay unter definierten Pufferbedingungen ermittelt werden und liefert unter geeigneten Bedingungen einen jeweils charakteristischen Wert für verschiedene Zielmolekültypen.
Im Fall der Prionkrankheiten ist aufgrund des Vorkommens verschiedener, in ihrem biologischen Verhalten unterscheidbarer Erregerstämme auch in Wirten mit identischer PrP- Primärstruktur davon auszugehen, dass verschiedene pathologische Formen von PrP* existieren, die sich offenbar nur in ihrer Konformation oder Aggregatstruktur unterscheiden. Durch konformationsabhängig unterschiedliche Antikörperbindung sollten diese verschiedenen Formen oder Prion-Stämme bei Verfügbarkeit geeigneter monoklonaler Antikörper grundsätzlich unterscheidbar sein. So findet sich bei der Untersuchung von gereinigten PrPSc-Aggregaten von Creutzfeldt-Jakob-Patienten in Abhängigkeit davon, ob es sich um pathologisches Prionprotein vom Typ 1 oder Typ 2 handelt, ein unterschiedliches Bindungsverhalten der monoklonalen Antikörper 12F10 und Pri917. Sowohl beim Menschen als auch im Tierreich ist die Erregerstamm-Typisierung von großer epidemiologischer Bedeutung. Hierbei ist von besonderer Relevanz die Identifizierung des BSE-Erregerstammes nach Übertragung auf andere Spezies. Insbesondere beim Menschen dürfte darüber hinaus eine Erregertypisierung auch prognostisch und eventuell therapeutisch bedeutsam sein.
Die Typisierung über relative Bindung verschiedener Sondenmoleküle mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hat dabei mehrere konzeptionelle Vorteile:
1) Da jedes Zielmolekül separat analysiert wird, können grundsätzlich auch Mischungen verschiedener Zielmoleküle untersucht und das Mengenverhältnis der Komponenten bestimmt werden. Dieses unterscheidet das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren grundsätzlich von allen Verfahren, in denen Messwerte, die sich aus der Integration oder Mittelwertbildung von Messwerten über Zielmolekül-Ensembles ergeben, gewonnen werden.
2) Zur Typisierung genügen Sonden mit einer mäßig unterschiedlichen Affinität zu den verschiedenen Zielmolekültypen, eine Alles-oder-Nichts-Bindung ist nicht erforderlich.
3) Aus der Zugänglichkeit verschiedener, von unterschiedlichen Sondenmolekülen erkannter Epitope bei unterschiedlichen Typen/Erregerstämmen können Rückschlüsse auf die räumliche Struktur gezogen werden.
4) Da die relative Bindung der verschiedenen Sondenmoleküle durch simultane Messung dieser Sondenmoleküle auf einzelnen Zielmolekülen (Partikeln) bestimmt wird, wird dieses Bindungsverhältnis auch durch die Interaktion dieser Sondenmoleküle (z.B. sterische Kompetition) beeinflusst. Die simultane Messung in Anwesenheit der verschiedenen separat detektierbaren Sonden liefert daher mehr Information als es die separate Bestimmung zu verschiedenen Zeitpunkten, in verschiedenen Messvolumina oder separaten Messansätzen täte.
5) Es genügen geringe Mengen wenig konzentrierten Zielmoleküls, eine vorhergehende Reinigung ist nicht nötig, wodurch das Zielmolekül auch unter nahezu nativen physiologischen Bedingungen analysiert werden kann. 6) Gegenüber etablierten Verfahren zur PrP* Typisierung (Western Blot) erlaubt das Verfahren einen schnellen Test in einem homogenen Assay, so dass ein große Probenzahl analysiert werden kann (diagnostisches oder Wirkstoff-Screening).
Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich nicht auf die oben beschriebene konkrete Anwendung im Bereich der Typisierung verschiedener Prion- Stämme beschränkt. Grundsätzlich ist eine Analyse verschiedenster bevorzugt subzellulärer Partikel möglich, die sich mit insbesondere fluoreszenzmarkierten Sonden markieren lassen. Die Vorteile, die oben aufgeführt wurden, gelten hier analog. Insbesondere sind folgende Einsatzfelder zu nennen: a) Im Bereich der Prionkrankheiten ist neben der Erregerstammtypisierung die relative Bindung von PrPc verschiedener Spezies an Prionproteinaggregate einer bestimmten Spezies untersuchbar, was eine Abschätzung der jeweiligen Speziesbariere für eine Krankheitsübertragung ermöglicht. b) Andere (neuro-)degenerative Krankheiten mit Bildung pathologischer Aggregate wie insbesondere der Morbus Alzheimer sind analog untersuchbar. Auch hier werden Subtypen pathologischer Aggregate mit potentiell unterschiedlicher diagnostischer, prognostischer und therapeutischer Bedeutung erkennbar. Es sei hier insbesondere die Analyse von Aggregaten genannt, die als mindestens eine Komponente Prionprotein, APP, Tau, Synuclein oder Proteine mit einer Polyglutaminsequenz wie z.B. Huntingtin, oder Fragmente oder Derivate (z.B. phosphorylierte oder glykosylierte Derivate) dieser Proteine enthalten. c) Andere subzelluläre Partikel werden analog untersuchbar, bis hin zur phä- notypischen Analyse viraler Partikel.
Die Anlagerung mehrerer Sonden an ein pathologisches Aggregat lässt sich zum Nachweis einzelner Aggregate, oder allgemeiner Zielmoleküle in Lösung nutzen. Die Entwicklung dieses Prinzips zu einem hochempfindlichen Detekti- onsverfahren und dessen beispielhafte Anwendung in der Liquordiagnostik der Creutzfeldt-Jakob Erkrankung (CJD) und von Morbus Alzheimer sind im Folgenden ausführlich dargestellt.
Theoretische Grundlagen
Korrelationsanalyse mehrerer Komponenten
Liegen in einer Lösung mehrere fluoreszente Komponenten / nebeneinander vor, so gehen diese anteilig in die Korrelationsfunktion ein [15]. Für den Fall, dass die Komponenten der Lösung eine unterschiedliche Quanteneffizienz der Fluoreszenz besitzen, also verschieden "hell" leuchten, sollte die unterschiedliche Detektionswahrscheinlichkeit der Moleküle berücksichtigt werden. Man definiert daher eine relative Quantenausbeute ctj ≡ Q Qi. Die Korrelationsfunktion lautet dann [27] :
G{r) = η^- ∑Xioidiffi (1)
J » i=l
mit
Figure imgf000015_0001
und C/ als Konzentration der Komponente /'. Es ist zu beachten, dass stark fluoreszierende Moleküle durch den quadratischen Einfluss von αi in der Korrelationsfunktion gegenüber ihrem Anteil an der Konzentration überrepräsentiert sind. Die effektive Leuchtkraft eines Moleküls, das viele Fluorophore trägt, ist sehr viel höher als die von Molekülen, die nur ein Fluorophor tragen. Im Falle der Aggregation kann daher der Durchtritt eines einzelnen hochmarkierten Aggregats durch den Fokus die Korrelationskurve völlig dominieren.
Zweifarben-Kreuzkorrelationsanalyse
Bei der Analyse eines Autokorrelationssignals stellt sich oft das Problem der Überlagerung vieler dynamischer Prozesse, z.B. durch verschiedene diffundierende Molekülspezies. Unterscheiden sich die Moleküle nicht wesentlich in ihrer Größe oder liegen mehr als zwei Komponenten in Lösung vor, können die Signalanteile der einzelnen Komponenten nicht mehr sicher bestimmt werden [25].
Eine Lösung dieses Problems bietet die in [3] entwickelte und von Petra Schwüle sowohl theoretisch als auch experimentell ausgearbeitete Technik der Zweifarben-Kreuzkorrelationsanalyse. Die Technik ist in [23] und [24] ausführlich beschrieben. In der Messung wird die Fluktuation im Signal zweier Fluorophore untersucht, deren Emissionsspektren möglichst wenig überlappen. Werden zwei Molekülspezies mit diesen Farbstoffen markiert, so kann die Interaktion der markierten Moleküle durch Kreuzkorrelation der Fluktuation beider Fluoreszenzsignale verfolgt werden. Ebenso können gleichartige Moleküle mit verschiedenen Markern versehen werden, um ihre Wechselwirkung miteinander oder mit einem dritten Partner zu charakterisieren. Wenn die Molekülspezies / und j aneinander oder an einen gemeinsamen Interaktionspartner binden, entsteht eine Molekülspezies ij, die beide Fluorophore trägt. Allein diese Komponente geht in das Kreuzkorrelationssignal ein. Sie wurde als Referenz bei der Detektion pathologischer Aggregate verwendet. Das Fluoreszenzsignal F(t) wird mit Fj (t + τ) im selben Messvolumen verglichen. Für das normierte Kreuzkorrelationssignal Gy (τ) gilt dann:
Figure imgf000016_0001
Für eine Farbe / ergibt sich analog Gl. 7 die Fluktuation des Fluoreszenzsignals aus der Summe der Fluktuationen aller Moleküle, die das Fluorophor / tragen. Besitzen die Molekülspezies nf unterschiedliche relative Helligkeiten, sollte wiederum die Emissionscharakteristik Wn(r) bezüglich der jeweiligen Anregungsfarbe berücksichtigt werden:
SFt{t) = £ / Wni(ηδCn(r, t)dτ (3) Im Fall eines Aggregationsprozesses enthält das System viele verschiedene Molekülspezies, die eine unterschiedliche Anzahl an Fluorophoren tragen und deren Quantenausbeute durch die unterschiedliche molekulare Umgebung wiederum in verschiedenem Maße verringert werden kann. Der Fluktuations- term kann durch die Vielzahl verschiedener Emissionscharakteristika W(r) sehr komplex werden. Nimmt man im Falle kleiner Aggregate an, dass der Aggregationsprozess die Emission der Farbstoffe nicht wesentlich ändert, so bleibt der Nenner von Gl. 2 konstant und man erhält:
Figure imgf000017_0001
wobei diff analog Gl. 1 definiert ist. Nmn ist die Anzahl der Aggregate, die m Monomere der Spezies / und n Monomere der Spezies j enthalten, sowie Niι0 und Njι0 die Anzahl freier Monomere /' und j im Messvolumen zu Beginn des Experiments. Auch dieser Ausdruck ist im Falle heterogener Aggregate noch zu komplex, um eine quantitative Auswertung zu erlauben.
Im Falle einer einfachen Dimerisierung, die bei niedrigen Konzentrationen der initiale Schritt jedes Aggregationsprozesses sein sollte, reduziert sich der Ausdruck für Gy auf eine einzelne Diffusionskomponente mit der Zeitkonstante τti:
Figure imgf000017_0002
Zwischen der inversen Korrelationsamplitude G(τ)"1 und τ erhält man damit einen linearen Zusammenhang:
GCr)"1 = — -r + N (6)
Anhand der Gleichungen 4 und 5 sind unmittelbar mehrere Merkmale der Kreuzkorrelationsfunktion ersichtlich, die sie zur Untersuchung von Bindungsprozessen attraktiv machen: 1. Allein die Diffusionskomponente der doppelt markierten Moleküle steht im Nenner von G/ . Auch in Mischungen mit Monomeren und Homo- Multimeren kann sie isoliert charakterisiert werden.
2. Unter der Voraussetzung, dass sich die Gesamtfluoreszenz im Laufe der Reaktion nicht ändert, ist die Amplitude G(0) unmittelbar proportional zur Konzentration der doppelt markierten Moleküle. Die Kinetik eines Bindungsprozesses oder Spaltungsprozesses kann damit auf einfache Weise verfolgt werden [24], [6],
3. Da der Übergang zweier Fluoreszenzphotonen in den Triplettzu stand auch dann voneinander unabhängig ist, wenn diese an das selbe Molekül gebunden sind, enthält das Kreuzkorrelationssignal keinen Triplettanteil [24]. Dies ermöglicht eine Anpassung der Messwerte mit einer geringeren Zahl freier Parameter und damit eine gute Anpassung auch im Falle eines schlechteren Signal/Rausch-Verhältnisses.
Intensitätsverteilung des Fluoreszenzsignals
Ein weiterer Parameter, der neben der Diffusionszeit zur Charakterisierung eines Moleküls genutzt werden kann, ist die spezifische Helligkeit des Moleküls. Eine Analyse der Fluoreszenzintensität auf der Basis höherer Moden der Korrelationsfunktion wurde 1990 von Qian vorgenommen [18]. Ein gutes experimentelles Maß der spezifischen Helligkeit ist die Zählrate der Fluoreszenzphotonen je Molekül (cpms). Bei konstanter Anregung ist diese Größe proportional zum Produkt Q von Fluoreszenzquantenausbeute und Absorptionsquerschnitt des Moleküls [5]. Sie ist damit charakteristisch für das Molekül. Im Falle eines Aggregationsprozesses oder auch der Detektion von Aggregaten, die bereits in der Lösung vorliegen, erzeugt die Bindung vieler Monomere mit identischen Fluorophoren die größere Helligkeit des Aggregates. Lässt man Quenching- und Verdeckungseffekte, die die Quantenausbeute der Fluorophore im Aggregat erniedrigen können, außer Acht, wäre die relative Helligkeit damit proportional zur Zahl der gebundenen Fluorophore. In der Praxis erlaubt diese Überlegung jedoch nur eine sehr grobe Abschätzung der Zahl der gebundenen Fluorophore. Die Intensitätsverteilung der Fluoreszenzphotonen ließe sich bei bekannter
Detektionsfunktion W(r) des Moleküls berechnen. Sie ist nach Gleichung 7 gegeben durch
W{r) = Ia{f) CEF{r) Q (7)
mit Ia(r) als Anregungsprofil und CEF(r) als Einsammelfunktion des optischen Aufbaus. Für die analytische Lösung der Korrelationsfunktion wurde W(r) durch ein dreidimensionales Gaußprofil angenähert [21]. Die Intensitätsverteilung der Fluoreszenzphotonen zeigt jedoch merkliche Abweichungen von dieser
Näherung [5]. Setzt man eine bekannte Detektionsfunktion W(r) voraus, lässt sich die Verteilung der Fluoreszenzphotonen in einem infinitesimalen Volumen dVi mit konstanter Detektionsfunktion W/ berechnen. Sie ist das Produkt zweier Poissonverteilungen, und zwar der Verteilung der Anzahl N der Moleküle im Volumen dV,- und der Verteilung der Zahl der Photonen n, die von einem Molekül im Volumen dV, detektiert werden [5].
Figure imgf000019_0001
mit (N) = / CdVi und <«} = QWiT
wobei C die Konzentration der Moleküle und T die Binweite, d.h. die Länge der Zeitintervalle ist, in denen die Photonen summiert werden. Dieser Ansatz macht zwei Annahmen:
1. Die Moleküle sind statisch, daher muss 7 « τD sein.
2. Die Detektionsfunktion eines Moleküls ist das Produkt einer allgemeinen
Detektionsfunktion W(r) und einer molekülspezifischen Konstante Q. Bei der Aggregatdetektion ist die erste Annahme nur für den Fall der stationären Messung erfüllt. Ansonsten wurde eine längere Binweite gewählt, um das Verhältnis zwischen Aggregatsignal und Sondenhintergrund zu maxi- mieren. Die zweite Annahme ist im Falle einzelner Chromophore nur bedingt erfüllt, da der Übergang in den strahlungslosen Triplettzustand die Quantenausbeute verringert. Dieser Übergang ist abhängig von der Anregungsinten- sität und damit vom Anregungsprofil. Diese Einschränkung kann jedoch bei multichromophoren Molekülen vernachlässigt werden.
Wenn keine genaue Charakterisierung der Intensitätsverteilung gefordert ist, sondern lediglich eine sehr intensiv fluoreszierende Komponente über einen Schwellenwert abgetrennt werden soll, lässt sich die Verteilung der detektierten Photonen / Bin n empirisch durch eine "schiefe" Normalverteilung anpassen. Als Anpassungsmodell kann dabei eine Log-Normalverteilung dienen.
Figure imgf000020_0001
Dabei gibt v den Erwartungswert und σ, die Standardabweichung der Verteilung an.
Materialien
Die Bezugsquellen der verwendeten Chemikalien, Chromatographiematerialien und Proteinen sind im Folgenden aufgeführt. Alle verwendeten Chemikalien besaßen die höchste erhältliche Reinheit.
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
Puffer und Stammlösungen
Die folgende Liste enthält alle verwendeten Puffer und Stammlösungen, die mit demineralisiertem Wasser angesetzt worden sind, sowie ihre Abkürzungen. Pufferlösungen wurden vor Verwendung durch einen Membranfliter (0.22 μm, Millipore) sterilflltriert.
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000022_0001
Prionprotein rPrP Als Modellsystem zur Untersuchung der Aggregation des Prionproteins wurde vornehmlich ein in E. coll erzeugtes rekombinantes Prionprotein verwendet, das homolog zu den Aminosäuren 90-231 des Prionproteins des syrischen Hamsters war. Es entsprach damit dem proteaseresistenten Kern des pathologischen PrPII, war anders als das natürliche Protein jedoch nicht glyko- syliert und besaß keinen Membrananker. Ansonsten entsprach seine Struktur den Aminosäuren 90-231. Das Protein wurde in einem STII TIR Vektor im E. coli. Stamm 27C7 exprimiert wie von Mehlhorn beschrieben [13]. Das Protein lag als Stammlösung einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS + 0.2% SDS (w/v) vor.
Prion Rods Die Präparation des aggregierten PrP (27-30) aus syrischen Hamstern, den sogenannten prion rods, ist in [17] beschrieben. Das Protein lag sonifiziert in einer Konzentration von 30 μg/ml in NaPi + 0.2% SDS (w/v) vor.
Humanes PrPsc Die unterschiedlichen Subtypen der Creutzfeldt Jakob Erkrankung sind anhand dieses Materials durch Parchi et al. (1997) durch konventionelle Methoden anhand der Straintypen (1/2) und des Polymorphismus am Codon 129 des humanen Prionproteins differenziert worden. Dasselbe Material wurde zur direkten Differenzierung der PrPsc Typen I und II durch SIFT Messung verwendet.
Antikörper
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene spezifische Antikörper gegen Epitope des Prionproteins und des Aß (l-42)-Peptids verwendet. Sie sind im Folgenden aufgeführt.
Der Antikörper Pri917 ist gegen die Aminosäuren (214-230) des menschlichen PrP gerichtet.
Der Antikörper 3F4 ist gegen die AS (109-112) des Hamster-PrP gerichtet und besitzt eine etwas schwächere Affinität zu humanem PrP Er wurde gemäß [7] hergestellt.
Der Antikörper 15B3 erkennt spezifisch die aggregierte PrPsc Isoform. Er wurde von der Firma Prionics (Schweiz) hergestellt.
Der Antikörper 12F10, ist gegen AS (142-160) des humanen PrP gerichtet (Krasemann [8]). Er wurde über die Firma IBA, Heiligenstadt bezogen. Der A/3-spezifische Antikörper 6E10 ist gegen den N-Terminus der Aß-Peptide (1-17) gerichtet.
Im Folgenden sind verwendete Antikörper aufgeführt:
Figure imgf000024_0001
Liquorproben
Für die diagnostsche Untersuchung wurde Spinalliquor von Patienten verwendet [30,31]. Die Entnahme im Rahmen der Studie erfolgte unter Zustimmung der Patienten.
Für die CJD Diagnostik wurde Spinalliquor von 37 Patienten verwendet, die an neurodegenerativen Erkrankungen litten. Darunter befanden sich 11 neuropa- thologisch gesicherte Fälle, sowie 13 Fälle, deren Diagnose nach epidemiologischen Kriterien [28] als wahrscheinlich galt.
Zur Alzheimer Diagnostik wurde Spinalliquor von 6 Patienten, deren Diagnose der Alzheimer Demenz anhand biochemischer (Konzentration Aß 42 / 40 / 38), neurologischer sowie psychologischer Kriterien gesichert war, sowie von 12 Kontrollpatienten verwendet. Die Liquorproben wurden im Rahmen der neurologischen Routinediagnostik gewonnen. Die Proben der klinischen Studien sind hinsichtlich ihrer Vorbehandlung nicht standardisiert. Sie wurden nach der Abnahme bei -70°C gelagert und für biochemische Untersuchungen mehrmals aufgetaut.
Spinalliquor von 5 AD Patienten sowie 4 Kontrollpatienten wurde eigens für die liquordiagnostische Anwendung gewonnen.
Messaufbau der FCS Als Basis für die Aggregationsmessungen diente ein Zweifarben- Kreuzkorrelations-FCS-Aufbau. Theoretisches Konzept und praktischer Aufbau sind von Schwüle in [23] ausführlich beschrieben. Auf Grundlage dieses Aufbaus wurde ein Prototyp entwickelt, an dem die Aggregationsmessungen durchgeführt wurden. Für die SIFT-Messungen wurde der Aufbau um eine Ansteuerung zum Scannen der Probe und um eine Messkarte zur Intensitätsanalyse erweitert.
Der Messaufbau ist in Figur 3 schematisch dargestellt. Der Strahl eines Ar- Ionen Lasers (488 nm) und eines He-Ne Lasers (633 nm) werden über eine single-mode Glasfaser, eine Aufweitungsoptik und einen doppelten Dichroiten parallel in den Strahlengang eingekoppelt und durch ein Mikroskopobjektiv (x40 bzw. x63) in der Messlösung fokussiert. Die Brennpunkte beider Strahlen bilden das offene Messvolumen der FCS. Die Apertur des Objektives wird vollständig ausgeleuchtet, so dass für den blauen Fokus ein Radius von 0.25 μm (x40) bzw. 0.19 μm (x63) resultiert. Die Figur der Foci ist nicht völlig ideal, der Radius des roten Brennpunktes ist um ca. 20% größer als der des grünen Fokus, die Mittelpunkte beider Foci weichen um ca. 50 nm voneinander ab. Der grüne Fokus liegt damit jedoch noch vollständig innerhalb des roten.
Das Fluoreszenzlicht wird über das Mikroskopobjektiv gesammelt und konfokal auf einem Pinhole abgebildet. Das Pinhole kann in Durchmesser, und in x-y-z- Achsen durch Schrittmotoren gesteuert werden. Das parallelisierte Fluoreszenzlicht wird über eine Dichroit/Filterkombination in rote und grüne Emmision gespalten und auf zwei AvalanchePhotodioden (APD) fokussiert. Die APD besitzen eine Detektionseffizienz von ca. 70% und erzeugen für jedes detektierte Photon einen TTL-Puls. Das TTL-Signal wird über eine Verstärkerweiche gleichzeitig an eine Hardwarekorrelatorkarte (ALV-5000, ALV, Langen) zur Korrelationsanalyse und an eine Multichannel-Scaler-Timer (MCS) Karte (MCD-2, FAST GmbH, Unterhaching bzw. C. Zeiss, Jena) zur Intensitätsanalyse des Signals weitergeleitet.
Bei den Messungen kamen zwei Objektiv/Pinhole Kombinationen zum Einsatz: • Objektiv x40 / 1.2 N.A. (Zeiss) und 50 μm Pinhole
• Objektiv x63 / 1.2 N.A. (Olympus) und 30 μm Pinhole.
Wo nicht anders angegeben betrug die Leistung der Anregungslaser 57 μW (488 nm) bzw. 53 μW (633 nm).
Scanning
Zum Scannen der Probe wurde die Messlösung in eine Glaskapillare von 50 mm Länge, 0.18 mm Wandstärke und einem Innenquerschnitt von 2.6 x 0.2 mm gefüllt. Das Probenvolumen betrug dabei 20 μl. Die Enden der Messkapillare wurde durch einen Lack auf Kollophoniumbasis auf einem Objektglasträger befestigt und dabei gleichzeitig versiegelt.
Das Scannen der Messlösung wurde durch Ansteuerung des Positioniertisches des FCS-Messaufbaus (Märzhäuser, Wetzlar) über eine Makrosprache (WinBatch, Wilson Window Ware, Seattle WA, USA) realisiert. Innerhalb des Confocor Steuerprograms (C. Zeiss, Jena) wurde ein Feld von 2 x 20 Punkten definiert, deren Abstand entlang der Kapillarrichtung 20 mm und 10 μm quer zur Kapillare betrug. Die Punkte diese Feldes wurden so angesteuert, dass die Kapillare relativ zum Mikroskopobjektiv mäanderförmig mit einer Geschwindigkeit von 1 mm/s bewegt wurde.
Intensitätsanalyse
Sowohl Aufnahme der Spur der Fluoreszenzintensität als auch die Intensitätsanalyse erfolgten auf einem separaten Messrechner durch eine MCS-Karte (C. Zeiss, Jena). Histogramme der Fluoreszenzintensität wurden mit der Software Origin 6 (Microcal, Northampton, MA, USA) erstellt. Ein Programm zur automatisierten Erstellung von Intensitätshistogrammen wurde erstellt und uns zusammen mit einer Messkarte freundlicherweise durch die Fa. Zeiss zur Verfügung gestellt. Die Auswertung sowie die grafische Darstellung der Intensitätshistogramme erfolgte über Perl-Routinen.
Markierung des Prionproteins Um den Einfluss des Fluorophors zu minimieren wurden bei allen Markierungsansätzen Bedingungen gewählt, die zu einer unvollständigen Markierung des Proteins führten, so dass maximal ein Farbstoffmolekül an ein Proteinmolekül gekoppelt wurde.
Zur Markierung des PrP mit den Fluoreszenzfarbstoffen Cyanin5 (Cy5), bzw. Oregon Green488 oder Alexa488 wurde ein aminoreaktiver Succinimidylester des Farbstoffes an eine primäre Aminogruppe eines Lysins des Proteins gekoppelt. Ein Aliquot des Farbstoffes (ca. 100 μg) wurden in 50 μl DMSO gelöst. Jeweils 3 μl des Farbstoffs wurden zu 100 μl rPrP (90-231) (100 μg/ml) in NaP2 zugegeben und in der Dunkelheit 1 h bei RT gerührt. Mikrospinsäulen (Mobitec) mit Sephadex G-75 (Pharmacia) wurden mit 3 * 350 μl PBSS äqui- libriert (Zentrifugation 1 min, 750 g). Nach der Reaktion wurde das Produkt von überschüssigem Farbstoff über zwei Mikrospinsäulen getrennt (Zentrifugation 3 min, 750 g).
Der Anteil markierter Moleküle betrug für PrP-Oregon Green 4% und für PrP- Cy5 14% unter Annahme eines Fluorophors/Proteinmolekül.
Markierung der Antikörper
Mikrospinsäulen (Mobitec) mit Sephadex G-15 (Pharmacia) wurden mit 3 * 350 Gel PBSN äquilibriert (Zentrifugieren 1 min, 750 g). 5-20 μl Antikörper (c = 0.1-1 mg/ml) wurden mit PBSN auf 30 μl aufgefüllt und über die Spinsäule in PBSN Puffer überführt (Zentrifugation 3 min, 750 g). Nach Zugabe von 3 μl NaC und 1.5 μl Cy5 bzw. 3 μl Oregon Green oder Alexa488 (2 μg/μl in DMSO) wurde ü.N. bei 4°C stehengelassen. Die markierten Antikörper wurden über eine Mikrospinsäule mit Sephadex G-75 (Pharmacia) gereinigt (3 min, 750 g), die mit PBSN äquilibriert war. Nach erneuter Elution mit 30 μl PBSN wurde eine zweite Fraktion markierter Antikörper erhalten. Konzentration des Antikörpers und Anteil an freiem Farbstoff (< 5%) wurden durch Autokorrelationsmessung in der FCS bestimmt.
Bestimmung des Markierungsverhältnisses Die Proteinkonzentration wurde durch Absorptionsmessung bei 280 nm und einer Schichtdicke von 1 cm in einem Spektralphotometer (Lambda 17, Perkin Eimer) bestimmt. Anhand des Absorptionsspektrums des freien Farbstoffes wurde zur Korrektur der Konzentration des markierten Proteins das Absorptionsverhältnis a = EF28o/EFF28o des Farbstoffs bestimmt (Alexa488, Oregon Green: £ nax = 495 nm, Cy5: ^max = 650 nm). Die Konzentration des markierten Proteins cp berechnet sich nach: cP = E28o(l - aEmax) ' /(gll) 1 1/m [M] (10) mit m als Molmasse des Proteins (g/mol). Die Konzentration des Fluorophors CF berechnet sich anhand des Extinktionskoeffizienten des Farbstoffs ε; cF = EF max • ε (εoregon = 7.0 . lO4/^ OT'J, εAlexa488 = 7.1 • 104ΛfJ cm'1, £cy5 = 2.5 105 1 cm'1). Das Verhältnis von cF/cP bezeichnet die mittlere Zahl der Fluorophore pro Proteinmolekül.
Konzentrationsbestimmung durch FCS-Messung
Die Endkonzentration der fluoreszenzmarkierten Sonden, sowie der Anteil an freiem Farbstoff wurde durch Autokorrelationsmessungen bestimmt. Der Strukturparameter z0/ω0, sowie die Diffusionszeit des freien Farbstoffs wurde anhand von Autokorrelationsmessungen von Alexa488- und Cy5- Farbstofflösungen bestimmt. Das effektive Detektionsvolumen V » 1.3 x 4/3πω2 0z0 wurde anhand der Messung einer Rhodamin Green Lösung (DRG = 2.8 • lQ'10m2s'1) über ω0 = (4DτD)~1/2 berechnet. Die Größe des Messvolumens betrug für das x40 Objektiv 0.4 fl (ω0 = 0.25 μm, τD = 55 μs) und für das x63 Objektiv 0.2 fl (ω0 = 0.19 μm, τD = 32 μs).
SIFT-Messungen
Für das "Scannen intensiv fluoreszierender Targetmoleküle" (SIFT), d.h. für die Messung am diagnostischen Modellsystem von CJD und AD wurden prion rods bzw. Aß-Aggregate in der angegebenen Konzentration in Liquor bzw. Puffer in einem silanisierten Probengefäß (G. Kisker, Mühlhausen) auf ein Volumen von 18 μl verdünnt. 2 μl einer Mischung fluoreszenzmarkierter Sonden in PBSN wurde zugegeben, so dass die Endkonzentration der Sonden 6 nM (Antikörper) bzw. 10 nM (PrP) betrug. Für die Messung der Liquorproben von AD und CJD Patienten wurde 2 μl Sondenmix direkt zu 18 μl Liquor zugegeben. Eine Messkapillare wurde kontaminationsfrei mit der Probe befüllt und anschließend versiegelt. Die Messung erfolgte für 300 s bzw. 600 s bei 22°C mit einer Scangeschwindigkeit von 1 mm/s. Kontaminiertes Material wurde durch Autoklavieren (2 h, 140°C) oder Behandlung mit 2 M NaOH (min. 2 h) dekontaminiert.
Aß-Aggregate
Aß Peptid (1-42) wurden in lyophylisierter Form von der Firma Bachern Feinchemikalien (Heidelberg) bezogen. Zur Erzeugung von voraggregiertem Aß (1- 42) wurde das Peptid in DMSO gelöst (c = 5 mg//ml), auf eine Konzentration von 10 μM in AS-Puffer verdünnt, und 2 H bei 22°C inkubiert. Aliquots des Aggregationszusatzes wurden in PBSN auf die angegebene Konzentration verdünnt.
Für die Adsorptionsmessung wurde aggregiertes Aß (1-42) zunächst auf 10 μM in PBS verdünnt. Aliquots wurden in den untersuchten Medien 1:10 verdünnt, mit Antikörpermix versetzt (6E10-Cy5, pAB42-Alexa488, c = 6 nM), in die Messkapillare gefüllt und versiegelt. Messung und Lagerung erfolgte bei 22°C im SIFT-Aufbau (Messzeit 300s, Binnweite 500 μs, Schwelle 8 .Imax).
Aufreinigung von Antikörpern
Antikörper 12F10 wurde über Protein G Affinitätschromatographie (MAbTrap G II, Pharmacia) aus serumfreiem Zellkulturüberstand aufgereinigt. Die Säule wurde mit 5ml bidest. H20 gespült und mit 3 ml B-Puffer equilibirert. 15 ml Kulturüberstand wurden mit 15 ml B-Puffer versetzt und mittels einer sterilen Kunststoffspritze durch einen Membranfilter (0.45 μm, Millipore) auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 3 ml B-Puffer gespült, bis die Absorption (E28θnm) des Durchlaufs auf den Wert des Puffers abgesunken war. Es wurde mit 4 ml E-Puffer eluiert. Das Eluat wurde in 10 Fraktionen aufgefangen, in denen jeweils 20 μl N-Puffer vorgelegt waren. Der Antikörper wurde in Fraktion 3 (400 μl) eluiert. Durch Absorptionsmessung wurde die Konzentration auf 350 mg/ml bestimmt. Es wurden 0.1% (v/v) NP-40 und 0.005% NaN3 zugegeben und das Produkt bei -20°C gelagert.
Western Blot
Zur Konzentrationsbestimmung durch Western blot wurden prion rods in Liquor von Patienten ohne Anzeichen neurodegenerativer Erkrankungen verdünnt. Scrapie-infiziertes Hamsterhirn (Stamm 263 K) wurde mit 9 Teilen Lyse-Puffer homogenisiert und 30 min bei 37°C mit Proteinase K (100 μg/ml) inkubiert. Der Verdau wurde durch Zugabe von 5 mM PMSF und Aufkochen in Auftragpuffer gestoppt. 10 μl wurden auf einem 12.5% SDS-Polyacrylamid- Elektrophoresegel getrennt. Nach Transfer auf eine Nitrocellulosemembran (0.45 μm, Bio-Rad, CA) wurde das PrP durch Inkubation mit 3F4 als Primär- Antikörper und an alkalische Phosphatase gekoppeltem Ziege-anti-Maus Se- kundär-Antikörper detektiert. Die Phosphataseaktivität wurde durch das CDP- Star ChemiluminiszenzSystem (Tropix Inc., Bedford MA) auf Hyperfilm ECL (Amersham, IL) sichtbar gemacht wie von den Herstellern angegeben. Der Nachweis von rPrP erfolgte analog, jedoch ohne PK-Verdau. Wo erforderlich, wurde das PA-Gel anschließend mit Coomassie Blau angefärbt (30 min, RT).
Entwicklung eines liquordiagnostischen Verfahrens für CJD und Mor- bus Alzheimer
Die Aggregation unter Umwandlung der Sekundärstruktur in eine stärker hydrophobe Konformation ist ein grundlegendes Charakteristikum des Prionproteins. Wie auch im Fail der Alzheimerschen Erkrankung, die zur Bildung pathologischer Aggregate der Aθ-Peptide führt, kann der Nachweis aggregierten Proteins die Basis eines diagnostischen Tests bilden. Zu diesem Zweck ist es wünschenswert einzelne pathologische Aggregate nachzuweisen.
Anlagerung an Aggregationskeime
Durch Zugabe von monomeren fluoreszenzmarkiertem PrP zu einer Lösung von multimeren Aggregaten kann der Anlagerungsprozess der Monomere sichtbar gemacht werden. Auch im Laufe der cfe-novo-Aggregation traten zunehmend Fluoreszenzpeaks auf, die einzelnen multimeren Aggregaten des Prionproteins mit einer großen Zahl von gebundenen Farbstoffen zuzuordnen waren. Der Durchtritt solcher Aggregate durch das Fokalvolumen erzeugt einen Schauer von Fluoreszenzphotonen, im Folgenden kurz Burst genannt, durch den die Aggregate unmittelbar nachgewiesen werden können (s. Fig. 4).
Während die Selbstaggregation des Prionproteins im Konzentrationsbereich, der für die FCS relevant ist, jedoch erst im Zeitraum > 30 min zu einer detektierbaren Menge an Multimeren führte, erfolgte die Anlagerung an präexistente Aggregate bereits innerhalb der Probenvorbereitungszeit, d.h. innerhalb von Minuten, quantitativ. Im weiteren Messverlauf blieb die Zahl der detektierten Aggregate pro Zeiteinheit konstant (Fig. 4 unten).
Auf der Basis dieser Ergebnisse boten sich folgende Strategien zur Markierung aggregierter Zielmoleküle an:
1. Koaggregation homologer fluoreszenter Monomere (PrP oder Aß)
2. Koaggregation heterologer fluoreszenzmarkierter Monomere
3. Bindung spezifischer, fluoreszenzmarkierter Antikörper
4. gemischter Ansatz aus Monomeren und Antikörper-Sonden
Die Markierung kann sowohl mit einer als auch mit zwei verschiedenen Sondenmolekülen erfolgen, die mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Die Markierungsstrategie bestimmt das Analyseverfahren, mit dem das Signal der fluoreszenzmarkierten Aggregate detektiert und quantifiziert werden kann. Die Entwicklung eines diagnostischen Systems für Prionkrankheiten und für Morbus Alzheimer kann dabei von der selben Grundidee, der Anlagerung von Sonden an einen Aggregationskeim, ausgehen. Seine Entwicklung ist im Folgenden dargestellt.
Abtrennung des Signals der Aggregate
Durch die klassische Korrelationsanalyse der Fluktuation des Fluoreszenzsignals kann die Diffusionsbewegung einzelner Moleküle quantitativ ausgewertet werden. Es wird dabei aus einer Vielzahl von Moleküldurchtritten die mittlere Fluktuationszeit bestimmt. Wenn während einer Einzelmessung nur wenige Durchtritte von hochmarkierten Aggregaten detektiert werden, hängt die gemessene Durchtrittszeit nicht nur von der Aggregatgröße, sondern auch entscheidend vom Weg der einzelnen Partikel durch das Messvolumen ab. Die Aggregatgröße kann daher anhand der Durchtrittszeit nur abgeschätzt werden.
Bei einer Sondenkonzentration von 10 nM liegen die freien Sonden gegenüber den Aggregaten 103 bis 106 fach im Überschuss vor. Figur 5 zeigt den Durchtritt eines einzelnen Aggregates von rekombinantem Prionprotein, das mit einer Sonde in der Autokorrelations-FCS beziehungsweise mit zwei unterschiedlich markierten Sonden in der Kreuzkorrelations-FCS detektiert wurde. Der Anteil des Aggregats betrug < 10% des Autokorrelationssignals. Durch heterologe Detektion mittels einer Kombination von grün markiertem rPrP als einer und einem aggregatspezifischem PrP Antikörper (15B3) als anderer Sonde konnte das Signal multimerer Aggregate vollständig von dem Signal mono- und oligomerer PrP-Moleküle getrennt werden (s. Fig. 5 links). Es wurden Durchtrittszeiten der Aggregate von 3-50 ms bestimmt. Die mittlere Diffusionszeit entspricht einem Molekulargewicht von mehreren MDa.
Die Intensität der markierten Zielmoleküle liegt im Mittel 20 bis 50-fach über der Intensität der freien Sondenmoleküle. Dies entspricht demnach der Mindestanzahl von Sondenmolekülen, die an ein Aggregat gebunden sind. Da der Verlauf der Fluoreszenzintensität der Aggregation auf ein Quenching der Monomere im gebundenen Zustand schließen lässt, liegt die tatsächliche Zahl der gebundenen Sonden zumindest bei der Verwendung von Monomeren vermutlich höher. Durch die große Zahl an gebundenen Fluorophoren lassen sich einzelne Moleküldurchtritte unmittelbar nachweisen.
Jedoch sind bei einer Konzentration der Aggregate im sub-picomolaren Bereich auf diese Weise nur wenige Zielmoleküle in einer Probe zu detektieren. Für ein 1000-mer in femtomolarer Konzentration ergibt sich bei einem Fokusdurchmesser von 0.4 μm eine Eintrittsfrequenz von 0.5 ■ 10'V1, was etwa zwei Teilchen je Stunde entspricht [3]. Zum limitierenden Faktor wird somit die Zahl der Durchtritte von Aggregaten durch den Messfokus, die wiederum durch die langsame Diffusion der Aggregate begrenzt wird. Mit der Fluoreszenzintensität und der Kreuzkorrelation stehen somit zwei Parameter zur Verfügung, mit der einzelne Zielmoleküle auch bei einem hohen Überschuss freier Sonden detektiert werden können.
Bei Experimenten zum Nachweis von pathologischen Aggregaten des Prionproteins im Liquor von Creutzfeldt-Jakob Patienten wurde die Zahl der markierten Aggregate zunächst direkt aus der Zahl der Signalspitzen in der Intensitätsspur des Fluoreszenzsignals bestimmt. Als Sonde wurde hier solubilisiertes Prionprotein verwendet, das aus dem Hirnmaterial von Scrapie- infizierten Hamstern stammte. Die PrP-Sonde war mit dem Fluorophor Cy2 markiert. Figur 4 zeigt einen Ausschnitt der Spur des Fluoreszenzsignals einer Messung des Liquors eines Creutzfeldt-Jakob Patienten im Einkanal-FCS- Aufbau.
Das Fluoreszenzsignal wurde durch die Software des FCS Geräts und parallel durch eine Mehrkanal-Zähler (MCS)-Karte aufgezeichnet. Zu erkennen sind mehrere Fluoreszenzspitzen, die den Durchtritt eines hochmarkierten Makromoleküls durch den Messfokus anzeigen. Zur Detektion demenzspezifischer Aggregate des A/3-Peptids im Spinalliquor von Alzheimerpatienten ist eine erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens beschrieben [16]. Im vorliegenden System ließ die geringe Zahl von Ereignissen und sondeninhärente Aggregate keine reproduzierbare Unterscheidung der Liquorproben von CJD Patienten und Kontrollpatienten mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen zu.
Quantitative Intensitätsanalyse
Die direkte Zählung von Peaks im Fluoreszenzsignal erlaubt ohne eine Quantifizierung eines Schwellwertes der Intensität nur eine relativ unzuverlässige Identifizierung markierter Zielmoleküle. Daher wurde eine einfache Form der Intensitätsanalyse entwickelt, die den Anteil an Fluoreszenzsignal hoher Intensität in einem Intensitäthistogramm darstellt, um so den Anteil des Peaksignals quantitativ zu bestimmen. Zu diesem Zweck wird das Signal des Photodetektors geteilt und die Fluoreszenzphotonen parallel zur Korrelationsanalyse in einer Zähler-Timer-Karte in Intervallen gleicher Länge (Bins) aufsummiert. Die Zahl der Zeitintervalle mit einer bestimmten Anzahl an de- tektierten Fluoreszenzphotonen wird im Laufe der Messung on-line in einem Intensitätshistogramm dargestellt.
Die Intensitätsverteilung der freien Sondenmoleküle (Fig. 6 d) ist durch die homogene mittlere Diffusionszeit der Sondenmoleküle und die Zahl an Fluo- rophoren wohl definiert. Lagen in der Lösung neben freien Sonden auch Zielmoleküle vor, die eine große Zahl fluoreszenter Sonden gebunden hatten, so zeigte das Intensitätshistogramm einen Anteil von Messkanälen mit einer hohen Zahl detektierter Fluoreszenzphotonen (Fig. 6 b).
Die Verteilung der Fluoreszenzintensität entsteht durch die Konvolution der Fluktuation der Molekülzahl mit der Anregungs- und Detektionscharakteristik des Messaufbaus, der sogenannten collection efficiency function (CEF) [19]. Experimentell ließ sich die Intensitätsverteilung der Antikörper (3F4-Alexa488) gut durch eine Log-Normalverteilung anpassen (Fig. 7 a).
Die Komponente der markierten Aggregate war aufgrund der heterogenen Aggregatgröße weniger gut definiert. Wie Figur 7 b) zeigt, ließ sie sich durch einen einzelnen Verteilungsterm nur unvollkommen beschreiben. Sie könnte durch eine Überlagerung der Verteilungen für unterschiedliche Aggregatgrößen und Chromophorzahlen quantifiziert werden. Aufgrund des kleinen N der detektierten Aggregate erschien dies jedoch wenig praktikabel. Das Signal der Zielmoleküle wurde daher durch Setzen eines Schwellenwertes vo.m Signal der Sonden abgetrennt und quantifiziert. Durch dieses Verfahren geht ein Teil des Signals der Zielmoleküle verloren, da es mit der Verteilung der Sondenmoleküle überlappt. Je höher der Schwellenwert, desto höher ist naturgemäß der Anteil an Zielmolekülen, deren Signal unterhalb der Schwelle liegt und die daher nicht detektiert werden. In der Regel wird zur Abtrennung eines Rauschhintergrundes eine Schwelle von 3 σ gewählt [1]. Da im vorliegenden Fall die Sondenmoleküle gegenüber dem Target in einem Überschuss von bis zu 106 vorlagen und dennoch eine falsch positive Zuordnung des Signals vermieden werden sollte, wurde ein wesentlich konservativerer Schwellenwert gewählt, der typischerweise bei 12 σ für die Detektion und bei 8 σ für die Charakterisierung von Aggregaten lag. Die Trennung des Signals von Sonden- und Zielmolekülen im Intensitätshistogramm hängt von der zeitlichen Auflösung, d.h. der Binweite, ab. Für eine maximale Trennung vom Sondenhintergrund sollten die gesamten Photonen des Durchtritts eines Zielmoleküls in ein Bin fallen. Dies ist somit die minimale zeitliche Auflösung der Detektion. Ist die Binweite größer als die mittlere Aufenthaltsdauer, so verringert sich das S/N-Verhältnis durch Mittelung über den Sondenhintergrund. Verteilt sich der Moleküldurchtritt auf zu viele Bins, nimmt die relative Fluktuation des Sondensignals zu und verringert so das Signal- Rausch-Verhältnis. Im Falle diffusionskontrollierter Bewegung beträgt die Durchtrittszeit etwa das Vierfache der mittleren Diffusionszeit τD - Im Falle reinen Flusses ist sie durch das Verhältnis von Fokusdurchmesser und Flussgeschwindigkeit bestimmt. Für die Messung mit bewegter Probe wurde daher für eine Bewegungsgeschwindigkeit V = 1 mm/s und für einen Fokalradius ω0 = 0.5 μm eine Binweite von 0.5 ms gewählt, so dass sich das Signal eines Zielmoleküls auf 1-2 Bins verteilt.
Sensitivitätssteigerung durch Bewegung des Messvolumens
Während die Intensitätsanalyse eine einfache Separierung und Quantifizierung des Signals der Zielmoleküle erlaubt, steigert sie nicht die Zahl der Moleküldurchtritte und damit auch nicht die Sensitivität der Detektion. Sie liefert jedoch, ebenso wie die Kreuzkorrelationsanalyse, einen Parameter. zur direkten Unterscheidung von gebundenen und ungebundenen Sondenmolekülen, so dass die Größeninformation, die die Diffusionszeit liefert, nicht länger zur Erkennung der Zielmoleküle erforderlich ist. Diese können auch dann erkannt werden, wenn die Probe während der Messung relativ zum Messfokus bewegt wird.
Durch "Scannen" der Probe wurde die Diffusionsbewegung der Moleküle von einer "Flussbewegung" überlagert. Für Moleküle, deren diffusionsbedingte Eintrittsfrequenz in das Volumenelement klein gegenüber ihrer Aufenthaltsdauer im Messvolumen ist, kann die Detektionsempfindlichkeit durch Vergrößerung des Messvolumens, d.h. durch "Scannen" der Probe, entscheidend erhöht werden. Im Gegensatz zur stationären Messung, bei der die Messlösung in der Regel als Tropfen auf einem Deckglas ruhte, wurde die Probenlösung für die Messung mit bewegtem Volumenelement in eine gezogene Glaskapillare gefüllt, die ein Volumen von 20 μl umschloss. Die versiegelte Messkapillare wurde während der Messung mäanderförmig mit einer Geschwindigkeit von 1 mm/s bewegt und damit das Probenvolumen durchmessen. Die Durchtrittszeit der Aggregate durch das Messvolumen verringerte sich durch das "Scannen" der Probe von 3 - 50 ms auf ~ 0.5 ms. Die Durchtrittszeit wurde daher allein durch die Flussgeschwindigkeit und durch die Geometrie des Messvolumens bestimmt. Damit wurde auch die Zahl der Messkanäle mit einem Signal hoher Intensität proportional zur Zahl der markierten Partikel, die durch das Messvolumen traten.
Durch die geringe Zahl an Ereignissen in der stationären Messung ließ sich der Gewinn an Sensitivität durch die Probenbewegung nicht direkt am diagnostischen System messen, da in der Regel in der stationären Probe wenige oder keine Aggregate detektiert wurden. Um die Steigerung der Durchtrittsfrequenz durch das "Scannen" der Probe zu bestimmen, dienten fluoreszente Polystyrolperlen, sogenannte Beads, mit einem Durchmesser von 0.1 μm als Modell für die Aggregate. Die mittlere Diffusionszeit der Beads entsprach mit ca. 3 ms der unteren Grenze der Diffusionszeiten, die für die PrP-Aggregate bestimmt worden waren. In der bewegten Messung (Figur 8) wurden etwa 100-fach mehr Ereignisse detektiert als in der stationären Messung.
Die Zahl der detektierten Ereignisse steigt mit der Geschwindigkeit, mit der die Probe bewegt wird. Wenn die diffusionsbedingte Bewegung vernachlässigt wird, ist die Zahl der detektierten Ereignisse proportional zum durchmessenen Volumen. Bei der Detektion von pathogenen PrPSc-Aggregaten erhöhte eine Steigerung der Scangeschwindigkeit von 1 mm/s auf 5 mm/s die Zahl der Ereignisse und damit die Sensitivität um den Faktor drei. Die Art der Ansteue- rung des Positioniertisches begrenzte im Routineeinsatz jedoch die Bewegung auf 1 mm/s.
Evaluation des SIFT-Verfahrens mit PrP und Antikörpersonden Die Kombination der Intensitätsanalyse mit einer Probenbewegung, d.h. die "Suche nach intensiv fluoreszierenden Targetmolekülen" (Scanning for Inten- sely Fluorescent Targets, SIFT), wurde hinsichtlich ihrer Detektionssensitivität an einem Modellsystem untersucht. Aufgereinigte Aggregate des pathogenen Prionproteins, die aus dem Hirngewebe des syrischen Hamsters gewonnen wurden, sogenannte prion-rods, wurden in Spinalliquor verdünnt. Zur Detektion wurde einerseits fluoreszenzmarkiertes rekombinantes HamsterPrP und andererseits ein markierter PrP-spezifischer monoklonaler Antikörper verwendet. Das Fluoreszenzsignal wurde in einem Intensitätshistogramm ausgewertet (s. Fig. 9 A,C) und die Anzahl der Kanäle mit einer Intensität oberhalb einer Schwelle von 500 Photonen/Kanal addiert (s. Fig. 9 B,D). Abhängig von der Konzentration der prion-rods wurde ein Signal hoher Intensität erhalten. Die PrP-Sonde zeigte jedoch bereits ohne Zugabe von Zielmolekülen einen Anteil an Signal hoher Intensität, vor dessen Hintergrund die prion-rods nur bis zu einer Verdünnung von etwa 1:500 nachzuweisen waren. Das sondeninherente Signal, das in den stationären Messungen durch deren geringere Sensitivität nicht zu beobachten war, ist durch Aggregate der PrP-Sondenmoleküle bedingt. Diese können durch zwei Prozesse entstehen: einerseits durch die Selbstaggregation des PrP und andererseits durch die Entstehung hochmolekularer Aggregate beim Markieren des PrP mit dem Fluoreszenzfarbstoff. Die Aggregatbildung bei der Markierung ließ sich trotz sorgfältiger Wähl der Reaktionsbedingungen nicht vollständig unterdrücken. Multimere PrP-Aggregate sind in der bewegten Probe erheblich empfindlicher nachzuweisen, als dies in den Messungen zur Selbstaggregation der Fall war. Dagegen war die Antikörpersonde weitgehend frei von inhärentem Signal, so dass durch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers die Detektionsschwelle um zwei Größenordnungen gesenkt werden konnte.
Figur 10 zeigt das SIFT-Signal in Abhängigkeit von der prion-rod Konzentration bei verschiedenen Schwellenwerten. Während sich die Zahl der Kanäle hoher Intensität in Abhängigkeit vom Schwellenwert änderte, hatte die Wahl des Schwellenwertes keinen Einfluss auf die Proportionalität des SIFT-Signals zur Konzentration an prion-rods. Zweidimensionale Intensitätsanalyse
Um die Spezifität der Detektion zu erhöhen, wurde das Detektionssystem um eine zweite Sonde erweitert, die gegen ein anderes Epitop des Prionproteins gerichtet ist. Diese wurde mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert, der im roten Spektralbereich bei 633 nm angeregt werden kann. Bei Bindung der Sonden resultieren Zielmoleküle, die eine hohe Zahl beider Farbstoffe tragen. Dadurch können zwei Parameter zur Isolierung des Signals der Zielmoleküle genutzt werden:
1. die Amplitude der Zweifarben-Kreuzkorrelation und
2. die simultane Fluoreszenzintensität.
Wird das Fluoreszenzsignal mit hoher zeitlicher Auflösung betrachtet, so kann der Durchtritt eines doppelt markierten Aggregats durch eine Spitze im Fluoreszenzsignal identifiziert werden, die gleichzeitig in beiden Messkanälen auftritt. Für eine Intensitätsanalyse beider Detektionskanäle wurde das Fluoreszenzsignal beider Kanäle in einem zweidimensionalen Intensitätshistogramm aufgetragen. Analog zur Intensitätsanalyse eines Messkanals wurden die Fluoreszenzphotonen parallel in zwei Kanälen in Bins von 500 μs gezählt und die Intervalle entsprechend der Zahl der detektierten Photonen in einem zweidimensionalen Feld aufsummiert. Im Intensitätshistogramm, das während der Messung on-line dargestellt werden kann, ist die Fluoreszenzintensität der beiden Farben auf den Achsen aufgetragen, die Zahl der Bins eines Intensitätspaares ist durch die Farbe des jeweiligen Punktes logarithmisch dargestellt. Figur 11 zeigt das Intensitätshistogramm einer Messung von prion-rods, überlagert mit einer schematischen Darstellung der Signalbereiche.
Durch diese Auswertung wird das Signal von Partikeln, die gleichzeitig ein Signal hoher Intensität sowohl im grünen als auch im roten Detektionskanal zeigen, vom Signal der freien Probe separiert. Das aggregatspezifische Signal liegt im vierten Quadranten des Histogramms, während die überwiegende Zahl der Bins die kombinierte Signalverteilung der beiden freien Sonden wiedergibt und somit im ersten Quadranten liegt (s. Fig. 11, grau umrandet). Wiederum wird das hochintensive Signal im einfachsten Fall über einen Schwellenwert separiert. Um dem Übersprechen der Detektionskanäle Rechnung zu tragen, wurde ein progressiver Schwellenwert gewählt. Wird in einem Bin ein Signal hoher Intensität in einem der Kanäle detektiert, steigt der Schwellenwert zur Abtrennung des spezifischen Signals im anderen Kanal (s. Fig. 11, grüne Linien). Dies ist streng genommen nur zur Abgrenzung des spezifischen Signals von grünem unspezifischen Signal hoher Intensität erforderlich. Das Emissionsspektrum des grünen Farbstoffs überlappt zu einem kleinen Teil mit dem Emissionsspektrum des roten Fluorophors. Etwa 0.5% der Photonen, die ein Molekül, das nur grüne Fluorophore trägt, beim Durchtritt durch den Fokus emittiert, werden daher vom roten Detektor aufgefangen.
Durch die gleichzeitige Markierung mit zwei Typen von Sondenmolekülen konnte die Spezifität der Detektion erhöht werden. Beide Sonden, die gegen unterschiedliche Epitope des Zielmoleküls gerichtet waren, banden unabhängig voneinander an das Aggregat. Gleichzeitig erfolgte zum Teil eine unspezifische Bindung der Sonden an zelluläre Bestandteile in der Probenlösung sowie eine Bindung durch sekundäre Proteine, z.B. Sekundärantikörper, die in der biologischen Probe vorlagen. Diese Prozesse führten zur Bildung intensiv fluoreszierender Partikel. In der Messung, die in Figur 11 dargestellt ist, war dies für die rot markierte Antikörpersonde der Fall. Ob derartige unspezifische Aggregate in einem oder beiden Kanälen auftraten, hing jedoch von der untersuchten Probe sowie von anderen schwer zu kontrollierenden Faktoren wie der Präparation der Antikörper ab. Dieses Signal, das nur in einem der Messkanäle auftritt (s. Fig. 11, rote und grüne Elipse), kann in der Zweifarben- Intensitätsanalyse ebenfalls vom spezifischen Signal unterschieden werden.
Evaluierung von Spezifität und Sensitivität
Das erweiterte Detektionssytem wurde wiederum hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität der Detektion am diagnostischen Modellsystem evaluiert. Dazu diente Liquor von Kontrollpatienten, der mit prion-rods versetzt wurde.
Die Spezifität der Erkennung des Zielmoleküls wurde anhand von spezifischen und unspezifischen Sonden sowie spezifischen und unspezifischen Zielmolekü- len untersucht (s. Fig. 12). Als spezifische Sonden wurden jeweils zwei mo- noklonale Antikörper verwendet. Ohne die Zugabe von prion-Tods wurde fast kein gleichzeitiges Signal hoher Intensität beobachtet (s. Fig. 14). Nach Zugabe von aggregiertem Aß(l-42) Peptid als unspezifϊsches Zielmolekül wurden ebenfalls keine doppelt markierten Aggregate beobachtet, wenn auch ein Antikörper (3F4) unspezifisches Signal zeigte (Fig. 12 b). Dagegen trat bei Zugabe von spezifischen Sonden -3F4 und 12F10 zu PrP-Zielmolekülen sowie 6E10 und pAB42 zu Aß(l-42) Peptid - ein starkes Signal doppelt markierter Zielmoleküle (Fig. 12 a,c) auf. Um zu prüfen, ob zwei unspezifische Sonden gleichzeitig an ein einzelnes Zielmolekül binden, wurden zwei Sonden gegen die Zielmoleküle 1L8 und A 3(l-40), die nicht mit der Creutzfeldt-Jakob Erkrankung assoziiert sind, zu Kontrolliquor zugegeben, der prion-rods enthielt. Obwohl ein Signalanteil hoher Intensität in beiden Kanälen auftrat, der durch Bindung oder Aggregation der Sonden entstanden sein kann, wurde kein hochintensives Signal beobachtet, das simultan in beiden Kanälen auftrat (Fig. 12 d).
Die Sensitivität des Detektionssystems wurde mit dem Nachweis von Prionprotein durch Western Blot nach Verdau mit Proteinase K verglichen. Auf diesem Verfahren beruhen praktisch alle derzeitigen Test auf pathogenes Prionprotein. Aliquots des in Liquor verdünnten prion-rod Materials wurden parallel durch Western Blot analysiert und in einem konfokalen fluoreszens- Spektroskopische Aufbau vermessen, wobei das Signal durch SIFT und Kreuzkorrelationsanalyse ausgewertet wurde (s. Fig. 13). Figur 14 zeigt die Intensitätshistogramme bei unterschiedlicher Konzentration. Die Konzentration der prion-rods konnte durch Zweikanallntensitätsanalyse über vier Größenordnungen gemessen werde, wobei die Detektionsschwelle bei einer Verdünnung von 1:2 • 105 lag. Die Detektionsschwelle des Western Blots lag dagegen bei 1:104. Das Signal des Western Blot wurde anhand der Bandenintensität geldensito- metrisch quantifiziert. Durch Vergleich mit dem parallel aufgetragenen Hirngewebe eines Scrapie-infizierten Hamsters wurde ermittelt, dass die Nachweisgrenze des Blots etwa 1 μg Hirngewebe entsprach. Diese Menge Gewebe enthält etwa 10 pg monomeres PrP* [17], was bei der aufgetragenen Menge von 20 μl einer Konzentration von 33 pM entspricht. Dementsprechend war das Detektionslimit der SIFT-Messung, bei dem in der Messzeit von 600 s noch ein bis zwei Aggregate detektiert wurden, 0.5 pg bzw. 2 pM PrP*.
Die physikalische Detektionsschwelle der Messung ist die Detektion eines einzelnen Partikels im durchmessenen Volumen. Bei einem Scanvolumen von ca. 2 • 106 Fokalvolumina des konfokalen Aufbaus entspricht dies einer Konzentration von 1 fM, wenn man Verzerrungen des Volumenelementes vernachlässigt. Die Aggregatkonzentration, die sich aus der SIFT Messung durch Überlegungen zur Detektionsschwelle ergibt, lässt sich ins Verhältnis zur Konzentration des monomeren PrP setzen, die im Western Blot bestimmt wurde. Dies führt zu einer mittleren Aggregatgröße von ca. 1000 PrP Molekülen.
Die Sensitivität im Nachweis von pathologischen amyloiden Aggregaten der Alzheimer Demenz, deren Hauptkomponente Aß-Peptide mit einer Länge von 40-43 Aminosäuren sind, wurde in analoger Weise an Aß(l-42) Peptid untersucht, das zuvor unter kontrollierten Bedingungen aggregiert worden war. Als fluoreszente Sonden dienten zwei Antikörper, von denen einer spezifisch die C- terminalen Aminosäuren des A/342, der andere dagegen ein Epitop in der Konsensussequenz der Aß Peptide erkannte. Die Aß-Aggregate konnten bis zu einer Konzentration von 100 pM (9 pg) an monomerem Aß42 detektiert werden. Dies lässt auf eine Aggregatgröße von etwa 105 Einheiten je Aggregat schließen.
Vergleich mit Kreuzkorrelationsanalyse
Parallel zu der Auswertung mittels SIFT wurde das Fluoreszenzsignal der Messungen durch Kreuzkorrelation der Detektionskanäle nach Gleichung 2 ausgewertet. Die Figur 15 zeigt die Kreuzkorrelationskurven einer Verdünnung von prion rods in Liquor. Im Bereich von 0 bis 50 pg PrP (160 pM) ist die Kreuzkorrelationsamplitude proportional zur Menge der eingesetzten prion rods. Bedingt durch die hohe Zahl der Fluorophore, die an ein Zielmolekül gebunden sind, lag die effektive Detektionsquantenausbeute (cpms), deren Maß die Zahl der eingesammelten Photonen je Molekül und Sekunde ist, mit bis zu 200 kHz um ein Vielfaches über dem Wert von 1-2 kHz, den doppelt markierte Oligo- mere in den Versuchen zur Selbstaggregation im Kreuzkorrelationssignal er- reichten. Die hohe Moleküldetektionseffizienz bedingt ein hohes Signal/Rausch Verhältnis und damit eine hohe Kreuzkorrelationsamplitude. Die Kreuzkorrelationsamplitude war bis zu einer PrP Konzentration von 5 pM vom Signal der Kontrollprobe zu differenzieren. Durch die geringe Zahl der Ereignisse streute die Korrelationsamplitude bei niedrigen Konzentrationen stark.
Innerhalb einer Messreihe waren beide Parameter, G,y(0) und SIFT-Signal, zueinander proportional (s. Fig. 15 c). Damit beide Methoden als allgemeines Maß der Konzentration dienen können, ist es zudem erforderlich, dass beide Signale unabhängig von den Messbedingungen, wie Puffer und Detergenzien- konzentration, korrelieren. Figur 16 vergleicht am Modellsystem des aggre- gierten Aß-Peptids das Verhältnis beider Signale unter einer Vielzahl von Pufferbedingungen. Es blieb für ein Sondenpaar bei konstanter Anregung gleich.
Liquordiagnostische Anwendung
Die Erfindung offenbart insbesondere ein diagnostisches System zum hochempfindlichen Nachweis pathologischer Aggregate zur Diagnose der Creutzfeldt-Jakob und der Alzheimerschen Erkrankung. Als Untersuchungsmedium bietet sich aus drei Gründen die Untersuchung des Spinalliquors an: Erstens umspült der Liquor das Zentralnervensystem des Menschen. Er ist damit nicht wie z.B. das Blut durch die Blut-Hirn Schranke vom Entstehungsort der pathologischen Aggregate separiert. Zweitens handelt es sich bei Liquor um ein ' sauberes' Medium. Er enthält kaum Zellen oder Proteine, die im Bereich der Anregungswellenlängen absorbieren oder selbst fluoreszieren und eignet sich damit gut für fluoreszenzspektroskopische Messungen. Drittens kann er durch Rückenmarkspunktion vergleichsweise einfach und risikolos vom Patienten gewonnen werden. Zum Nachweis neurodegenerativer Sekundärmarker wie dem 14-3-3 Protein geschieht dies im Rahmen klinischer Routineuntersuchungen.
Detektion von pathogenem PrP im Liquor von CJD Patienten Der Detektionsansatz, der am Modellsystem der prion-rods entwickelt und evaluiert wurde, diente auch zum Nachweis von pathologischen Aggregaten des Prionproteins im Spinalliquor von Creutzfeldt-Jakob Patienten. Die Liquorproben wurden direkt mit dem Sondenmix versetzt und 600 s im Zweika- nal-SIFT-Messaufbau vermessen. In fünf von 24 Liquorproben der Patienten, deren CJD-Diagnose anhand von klinischen oder neuropathologischen Kriterien gesichert war, konnte so ein spezifisches Signal detektiert werden, das der gleichzeitigen Bindung beider Sonden an ein PrP*- Aggregat entsprach. Als Kontrollgruppe diente ein Patientenkollektiv mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen, um sicherzustellen, dass der Test spezifisch für CJD war und nicht nur einen Sekundäreffekt neurodegenerativer Erkrankungen erkannte. Aus keiner der Proben der Kontrollpatienten wurde ein Signal erhalten, das für PrP* spezifisch war (s. Fig. 17). Dies entspricht formal einer Sensitivität von 21% und einer Spezifität von 100% für den Nachweis der Creutzfeldt- Jakob Erkrankung. Dies ist bislang der höchste Wert eines erregerspezifischen Tests im Liquor eines Patienten [2].
Liquordiagnose von Morbus Alzheimer
Die Alzheimersche Erkrankung ist durch die erhöhte Entstehung von Fragmenten eines Transmembran-Proteins, dem sogenannten Amyloid-Precursor- Protein (APP), gekennzeichnet, die in einem Folgeprozess aggregieren und amyloide Ablagerungen bilden. Anders als das pathologische PrP* sind die amyloiden Aß-Peptide als normale Stoffwechselprodukte auch im gesunden Menschen in geringer Menge nachzuweisen. Eine pathologisch erhöhte Menge an aggregierten Peptiden ist daher durch einen Schwellenwert zu definieren.
Mittels der Zweikanal-Intensitätsanalyse wurden unbehandelte Liquorproben von sechs Alzheimer Patienten sowie 16 Proben von Patienten, die an anderen neurodegenerativen Erkrankungen litten, sowie von gesunden Patienten untersucht. Dabei wurde das Antikörper-Sondensystem verwendet, das anhand von künstlichen Aß42 Aggregaten etabliert und evaluiert worden war. In 83% (5 / 6 Fällen) der untersuchten SpinalliquorProben von Alzheimer-Patienten lag die Menge an aggregatspezifischem Signal über dem gesetzten Schwellenwert. Dagegen lag das Signal aller Kontrollpatienten darunter (s. Fig. 18).
Bei den untersuchten Liquorproben handelt es sich sowohl im Falle der Alzheimer- als auch der Creutzfeldt-Jakob-Patienten um solche, die im Rahmen von klinischen Routineuntersuchungen, wie z.B. dem Nachweis des neurodegenerativen Sekundärmarkers 14-3-3, gewonnen wurden. Sie sind hinsichtlich ihrer klinischen Vorgeschichte daher sehr heterogen. Es wurde eine Serie von 5 AD Proben und 4 Kontroll-Liquorproben untersucht, die eigens asserviert wurden. Hier konnte in den AD-positiven Probe eine deutlich größere Menge amyloider Aggregate nachgewiesen werden als in den Proben aus der klinischen Routinediagnostik, was die Bedeutung der Probenvorbereitung unterstreicht.
Differenzierung von Prionstämmen
Für die Detektion pathologischer Aggregate im Rahmen der diagnostischen Systeme wurde in der Zweikanal-Intensitätsanalyse allein ausgewertet, ob ein Aggregat mit einer großen Zahl beider Sondenmoleküle markiert war. Im Gegensatz zur Korrelationsanalyse, die Aussagen über die mittlere Konzentration und den Markierungsgrad der detektierten Moleküle liefert, erfasst die Intensitätsanalyse das Signal jedes detektierten Partikels separat. Daher erlaubte sie, das Verhältnis des Signals in beiden Messkanälen und damit das Verhältnis der gebundenen Sonden für jedes Zielmolekül zu bestimmen. Damit war neben der Detektion von Aggregaten auch ihre Charakterisierung anhand der relativen Affinität mehrerer Sonden möglich.
Die differentielle Bindung einer Anzahl unterschiedlicher monokionaler Antikörpersonden an pathologisches Prionprotein wurde an aufgereinigtem menschlichem PrP* untersucht. Dabei war es möglich verschiedene Typen des patho- genen Prionproteins zu differenzieren. Die Messung erfolgte im gleichen Messaufbau wie die diagnostische Anwendung. Zur Bestimmung des Verhältnisses des Signals der beiden fiuoreszenzmarkierten Sonden in einer Messung wurde das Intensitätshistogramm der Zweikanal-Intensitätsanalyse in Sektoren gleichen Signalverhältnisses unterteilt. In jedem Sektor wurde die Zahl der Messkanäle, deren Intensität über einem Schwellenwert lag, bestimmt (Fig. 20). Das aggregatspezifische Signal wurde über eine Schwelle von 8 • σ abgetrennt. Das Signal hoher Intensität konnte mit dieser Schwelle sicher vom Sondensignal separiert werden. Ein Störsignal der unspezifischen Sonde- naggregation wurde hingegen nicht vom restlichen Signal hoher Intensität getrennt. Aus diesem Grund enthält der Sektor, in dem das Signal mit einem Anteil der roten Sonde von 0-10% zusammengefasst ist, in allen Messungen einen Anteil unspezifischen Signals. Dieser Anteil wurde in Referenzmessungen bestimmt und vom aggregatspezifischen Signal abgezogen.
Die Trennung der Priontypen wurde mit verschiedenen Sondenpaaren und Detergenzienzusätzen optimiert. Aufgereinigtes pathogenes Prionprotein von Typ 1 und Typ 11 zweier an Codon 129 M/M homozygoter Patienten konnte anhand der relativen Sondenbindung charakterisiert werden. Dabei ließen sich beide Konformation reproduzierbar anhand des Bindungsverhältnisses der Sonden differenzieren (Fig. 21 a). Das aggregatspezifische Signal des Typs 11 (129 M/M) zeigt eine Normalverteilung um ein Sondenverhältnis von 45 ± 15%. Das zusätzliche Signal mit einem grünen Anteil > 90% ist vermutlich auf Aggregation bzw. Vernetzung der Sonde zurückzuführen. Dagegen ist das Markierungsverhältnis im PrP* Typ I zugunsten der grün markierten Sonde verschoben (mAB 917Alexa). Nach Abzug des sondeninhärenten Signalanteils liegt das Verteilungsmaximum hier bei einem Anteil der grün markierten Sonde von 85 ± 20%.
Um sicherzustellen, dass die Differenzierung aufgrund der Konformation des Zielmoleküls und nicht aufgrund von Sekundäreffekten, wie z.B. Kontaminationen aus der Aufarbeitung der Proben, erfolgte, wurde eine Mischung von Typ I und Typ II des PrP* analysiert. Zwar überlagern sich die Verteilungen beider Typen, doch ist die Gesamtverteilung der Mischung weitgehend deckungsgleich mit der Summe der Intensitätsverteilungen, die aus Einzelmessungen gewonnen wurden (Fig. 21 b). Die unterschiedliche Affinität der Sonden ist also auf die Konformation des Zielmoleküls und nicht auf Kontaminationseffekte zurückzuführen. Ist das Verteilungsmaximum der Priontypen durch Eichmessungen bestimmt worden, lassen sich auch ohne vollständige Trennung der Verteilungen die Anteile von Typ I und Typ II PrP* in den Proben bestimmen. Zur Differenzierung des Signals der PrP*-Typen ist es nicht erforderlich, jeden Partikel mit der selben Effizienz zu detektieren. Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Charakterisierung einzelner Partikel durch die relative Bindungsaffinität mehrerer Sonden, wie z.B. der FACS-Analyse auf Zellebene, liefert die quantitative Detektion des Fluoreszenzsignals auf Basis einzelner Moleküldurchtritte einen internen Standard zur Bestimmung des Markierungsverhältnisses.
Abkürzungsverzeichnis
Ac Acetat
AD Alzheimersche Demenz bzw. Erkrankung
Alexa488 Alexa Fluor™ 488 (Handelsname eines Rhodaminderivats)
APP Amyloid-Precursor-Protein
AS Aminosäure
BSA bovines Serumalbumin
BSE bovine spongiforme Enzephalopathie
CD Circulardichroismus
CJD Creutzfeldt-Jakob Demenz bzw. Erkrankung
Cy2 / Cy5 FluoroLink™ Cyanin2 / Cyanin5
Da Dalton
DNA Desoxyribonukleinsäure
DMSO Dimethylsulfoxid ε Extinktionskoeffizient
FCS Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie
FITC Fluorescein-Isothiocyanat
9 Erdbeschleunigung
Gl. Gleichung
GPI Glycolsyl-Phosphadityl-Inositol h Stunde(n)
IgG Immunoglobulin
M molar min Minute(n) NMR Kernspinresonanz NP-40 nichtionisches Alkylphenyl-polyoxyethylen-Detergenz
(Handelsname) nvCJD neue Variante der Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PK Proteinase K
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PrP Prionprotein
PrPc zelluläres Prionprotein
PrP* pathologische Scrapie-Isoform des Prionproteins
RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen / Minute rPrP rekombinantes Prionprotein
RT Zimmertemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat
Tab. Tabelle
TSE transmissible spongiforme Enzephalopathie
Tris Tris-methylaminomethan
IN. über Nacht
UV Ultraviolett w/v Anteile Gewicht von Volumen
ZNS Zentrales Nervensystem
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung und individuellen Charakterisierung von Partikeln mittels mindestens zweier unterschiedlicher detektierbarer Sonden in einer Probe, wobei
• die Partikel, insbesondere Moleküle oder Molekülaggregate, mindestens eine Bindungsstelle, vorzugsweise eine Vielzahl von Bindungsstellen für mindestens eine der mindestens zwei unterschiedlichen detektierbaren Sonden aufweisen,
• die mindestens zwei unterschiedlichen detektierbaren Sonden in der Probe anwesend sind,
• ein Maß für die Anzahl der gebundenen Sonden und
• das Verhältnis der gebundenen Sonden zueinander durch Bestimmung von Partikeln ermittelt wird,
• und wobei die Bestimmung auf Basis von einzelnen Partikeln erfolgt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der gebundenen Sonden zueinander durch Bestimmung von Partikeln in einem Messvolumen, das ein Teilvolumen der zu untersuchenden Probe darstellt, ermittelt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung auf Basis von einzelnen Partikeln erfolgt, die sich zu verschiedenen Zeiten im Messvolumen befinden.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion verschiedener gebundener Sonden gleichzeitig an einem Partikel erfolgt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Messvolumen < 10"12, insbesondere < 10"14 I beträgt.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung unter Verwendung eines konfokal mikroskopischen Auf- baus, eines Nahfeldaufbaus oder eines Aufbaus zur Mehrphotonenanregung erfolgt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung und Charakterisierung von Partikeln in einem homogenen Assayverfahren ohne Waschschritte erfolgt.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Quantifizierung des partikelbedingten Signalanteils durch Analyse der Intensitätsverteilung eines gemessenen Detektionssignals, insbesondere eines Fluoreszenzsignals, in sukzessiven Zeitfenstern mit Detektions- zeiten konstanter oder variabler Längen im Bereich von Mikro- bis Millisekunden erfolgt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine intensitätsbedingte Abtrennung des partikelbedingten Signalanteils über einen Algorithmus zur Peakdetektion und -analyse erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Scannen der Probe durch Erzeugen einer im wesentlichen konstanten Relativbewegung zwischen Probe und Messvolumen erfolgt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Relativbewegung durch eine Optik, die eine Bewegung des Messvolumens ermöglicht, durch eine Bewegung eines die Probe aufweisenden Probenträgers oder durch eine Flusskapillare realisiert wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass Antikörper als Sondenmoleküle verwendet werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine simultane Analyse zweier oder mehrerer getrennt im selben Messvolumen messbarer, in verschiedenen Wellenlängenbereichen oder Polarisationsebenen emittierender Sonden, insbesondere fluoreszierender Sonden, erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Daten aus Mehrfachfarbmessungen, insbesondere Zweifarbmessungen oder Mehr- fachpolarisationsmessungen/polarisationsmessungen ermittelt werden und zur Auswertung gegebenenfalls in einem mehrdimensionalen, insbesondere zweidimensionalen Array angeordnet als Intensitätshistogramm dargestellt werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass pathologische Proteinaggregate als Partikel, insbesondere Prionproteine nach Subspezies, durch deren Markierung mit Sondenmolekülen detektiert werden.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung mindestens zweiter unterschiedlicher Sondenmoleküle an die Proteinaggregate bildenden Partikel detektiert wird und aus dem Verhältnis der gebundenen Mengen an verschiedenen Sondenmolekülen zueinander die Subspezies bestimmt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Erregerstammtypisierung oder Untersuchung der relativen Bindung von Proteinen verschiedener Spezies an pathologische Proteinaggregate einer bestimmten Spezies zwecks Abschätzung einer Speziesbarriere für eine Krankheitsübertragung.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Untersuchung degenerativer Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativer Krankheiten, mit Bildung pathologischer Aggregate, insbesondere Aggregate, die als Komponente Prionprotein, APP, Tau, Synuclein oder Proteine mit einer Polyglutaminsequenz wie Huntingtin, oder Fragmente oder Derivate dieser Proteine enthalten.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Untersuchung subzellulärer Partikel, insbesondere zur phänotypischen Analyse viraler Partikel o- der zur Analyse von Nukleinsäuren mittels Antisensesonden.
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