DE69535384T2 - Verfahen zum nachweis von nukleinsäure mit einer spezifischen sequenzzusammensetzung - Google Patents

Verfahen zum nachweis von nukleinsäure mit einer spezifischen sequenzzusammensetzung Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Bindung, dem Nachweis und der Amplifikation des Nachweises von spezifischen Zielnucleinsäuresequenzen in einer Probe mit hoher Zuverlässigkeit und Genauigkeit, selbst in Gegenwart von eng verwandten, aber verschiedenen Nucleinsäuren, bereit. Die Bindung kann das Begleiten und das Zusammenbauen von spezifischen Molekülen zu Zielbindungsanordnungen umfassen, die spezifisch Zielbindungsregionen binden, die durch Hybridisierung von Sondennucleinsäuren und Zielnucleinsäuresequenzen gebildet worden sind. Die Amplifikation kann das Begleiten und/oder den Zusammenbau von spezifischen Molekülen zu Booster-Bindungsanordnungen umfassen, die spezifisch Booster-Bindungsregionen binden, die durch Hybridisierung von Booster-Nnucleinsäuren mit Sondennucleinsäuren, Zielnucleinsäuren oder anderen Booster-Nucleinsäuren gebildet worden sind. Der Nachweis beinhaltet die Bereitstellung einer oder mehrerer nachweisbarer Markierungen, einschließlich radioaktiver, licht- oder fluoreszenzemittierender, enzymatischer oder anderer nachweisbarer oder signalerzeugender Moleküle, in Verbindung mit Sondennucleinsäuren, Zielbindungsanordnungen, Booster-Nucleinsäuren oder Booster-Bindungsanordnungen.
  • 2. Hintergrund und Beschreibung des Stands der Technik
  • Es gibt eine steigende Zahl von Fällen, bei denen es wichtig ist, über die Fähigkeit zu verfügen, Nucleinsäuren mit einem Gehalt an einer spezifischen Sequenz, nachstehend als Zielnucleinsäuren (TNAs) bezeichnet, in einer Probe nachzuweisen. Man ist bestrebt, die TNAs mit der kleinstmöglichen Anzahl an Verarbeitungsstufen, mit den einfachsten Komponenten und unter Ausschluss von anderen ähnlichen, aber unterschiedlichen Nucleinsäuren, nachstehend als Cousin-Nucleinsäuren (CNAs) bezeichnet, nachweisen zu können. Man ist bestrebt, spezifische TNAs unter Ausschluss von etwaigen und sämtlichen CNAs in der Nachweisprobe nachzuweisen, ohne dass eine Amplifikation oder andere dem Nachweis nachgeschaltete Verarbeitungen erforderlich sind.
  • Es gibt zahlreiche Verfahren, bei denen immobilisierte oder markierte Nucleinsäuren als Sonden für TNAs verwendet werden. Jedoch ist es unter Anwendung bekannter Verfahren schwierig, zwischen einer TNA, die an eine Sondennucleinsäure (PNA) gebunden ist, und einer an die PNA gebundene CNA zu unterscheiden. Beispielsweise können eine oder mehrere Basenfehlpaarungen zwischen der PNA und einer CNA immer noch zu einer CNA-PNA-Hybridisierung führen, die von einer TNA-PNA-Hybridisierung fast nicht unterscheidbar ist. Somit stellt eine Hybridisierung allein keinen optimalen Indikator dafür dar, dass eine PNA mit einer besonderen TNA eine Hybridisierung eingegangen ist.
  • Es gibt zahlreiche Situationen, bei denen eine PNA versuchsweise zu der Feststellung verwendet wird, ob eine TNA in einer Probe, die CNAs enthalten kann, vorhanden war. Eine Hybridisierung der PNA mit einer CNA würde in dieser Situation den diagnostischen Wert, den PNA zum Nachweis einer TNA haben könnte, bei Fehlen einer zusätzlichen Bestätigung einschränken. Ferner ist man bestrebt, TNAs mit einer geringen Kopienzahl in Proben, die zahlreiche Kopien von CNAs enthalten können, nachweisen und lokalisieren zu können, ohne dass es erforderlich ist, zusätzliche Kopien der TNA zu erzeugen. Außerdem ist man bestrebt, die Anwesenheit von CNAs – unabhängig von den TNAs – bestätigen zu können, ohne dass es erforderlich ist, die CNAs und die TNAs in der Probe zu trennen.
  • Ferner ist man bestrebt, das Signal einer Hybridisierung einer speziellen TNA-PNA selbst bei geringer Frequenz amplifizieren zu können. Zu diesem Zweck wäre ein Verfahren zum Polymerisieren von mehrfachen Kopien einer Markierung, nachstehend als Booster-Nucleinsäure (BNA) bezeichnet, mit der TNA-PNA wünschenswert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zum Erreichen der vorstehend geschilderten Ziele bereit. Wie sich aus dem nachstehenden Überblick ergibt, wurden die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren im Stand der Technik weder beschrieben noch nahegelegt. Ein allgemeiner und umfassender Überblick über den Stand der Technik des Nucleinsäurenachweises findet sich bei N. Keller und M. M. Manak, DNA Probes, Stockton Press (1989).
  • Berichtet wird über ein Verfahren zum Nachweisen von Basen-Fehlpaarungen durch chemische Maßnahmen, um festzustellen, ob die Hybridisierung einer PNA mit einer CNA anstelle einer TNA erfolgt ist. Im US-Patent 4 794 075 (Ford et al.) wird ein Verfahren zum Unterscheiden von DNA-Fragmenten, die Einzelbasen-Fehlpaarungen enthalten, von ihren perfekt gepaarten Homologen erörtert. Einzelsträngige Regionen innerhalb eines Duplexfragments werden mit Carbodiimid modifiziert, das mit ungepaarten Guanin (G)- und Thymin (T)-Resten in DNA-Moleküle reagiert. Lineare Duplex-DNA-Moleküle reagieren nicht, während DNA-Moleküle mit Einzelbasen-Fehlpaarungen quantitativ reagieren. Im Anschluss an die Reaktion mit Carbodiimid werden die DNA-Moleküle an hochprozentigen Polyacrylamidgelen fraktioniert, so dass modifizierte und unmodifizierte Fragmente unterschieden werden können. Ford et al. wandten diese Technik an, um DNA-Sequenzunterschiede zu lokalisieren und zu reinigen, die für eine Phänotypvariation und eine Erbkrankheit verantwortlich sind. Obgleich sich dieses Verfahren zum Verfolgen von Variationen in genetischem Material eignet, weist es eine große Anzahl an Stufen auf, erfordert kostspielige Komponenten und bietet keine direkte Möglichkeit zu der Feststellung, ob eine PNA mit der TNA unter Ausschluss von CNAs in der Probe eine Hybridisierung eingegangen ist.
  • Es gab zahlreiche Versuche, um sicherzustellen, dass mindestens ein Teil der Hybridisierung zwischen der PNA und einer anderen Nucleinsäure komplementär ist. Ein Verfahren beinhaltet das Überwachen der Transkriptionsprodukte, die erzeugt werden, wenn die PNA mit einer Nucleinsäure in ausreichendem Maße hybridisiert, um von einer Promotorstelle, die in der Sonde enthalten ist, transkribiert zu werden. Das US-Patent 5 215 899 (Dattagupta) führt aus, wie spezifische Nucleinsäuresequenzen durch Verwendung einer Haarnadelsonde amplifiziert werden, die bei Hybridisierung mit einer Zielsequenz und bei Verknüpfung mit dieser transkribiert werden kann. Die Sonde umfasst eine einzelsträngige, selbst-komplementäre Sequenz, die unter Hybridisierungsbedingungen eine Haarnadelstruktur mit einer funktionellen Promotorregion bildet, und ferner eine einzelsträngige Sondensequenz, die sich vom 3'-Ende der Haarnadelsequenz aus erstreckt. Bei Hybridisierung mit einer Zielsequenz, die zur Sondensequenz komplementär ist, und bei Verknüpfung des 3'-Endes der hybridisierten Zielsequenz mit dem 5'-Ende der Haarnadelsonde wird die Zielsequenz in Gegenwart einer geeigneten RNA-Polymerase und geeigneter Ribonucleosid-triphosphate (rNTPs) transkribierbar gemacht. Eine Amplifikation wird erreicht, indem man die erwünschte TNA-Sequenz mit der Sonde hybridisiert, die TNA mit der PNA verknüpft, die RNA-Polymerase und die rNTPs zu den abgetrennten Hybriden gibt und die Transkription so weit ablaufen lässt, bis sich eine erwünschte Menge eines RNA-Transkriptionsprodukts angereichert hat. Dieses Verfahren beinhaltet allgemein und spezifisch die Verwendung von Haarnadel-DNA, die mit einem einzelsträngigen, ungepaarten Ende gebildet ist, um eine Anlagerung an eine Zielsequenz herbeizuführen. Wenn die Zielsequenz gebunden ist, wird die Erzeugung von RNA-Transkriptionsprodukten ermöglicht. Somit beinhaltet das Verfahren den Nachweis von sekundären Transkriptionsprodukten anstelle der Verwendung einer Nucleinsäure-Bindungsanordnung zur direkten Immobilisierung und/oder Lokalisierung einer Zielsequenz. Eine CNA könnte leicht an die Sonde binden und der Mangel an Komplementarität würde nicht notwendigerweise die Bildung eines CNA-PNA-Hybrids stören, das dann die Erzeugung von unerwünschten Transkriptionsprodukten unterstützen könnte.
  • Eine an die PNA gebundene CNA könnte nachgewiesen werden, wenn der Mangel an Komplementarität die Empfindlichkeit des hybriden CNA-PNA-Paars, durch eine Restriktionsendonuclease geschnitten zu werden, beeinträchtigt. Im US-Patent 5 118 605 (Urdea) und im US-Patent 4 775 619 (Urdea) werden neue Verfahren zum Testen eines Nucleinsäure-Analyten bereitgestellt, bei denen Polynucleotide mit Oligonucleotidsequenzen verwendet werden, die im wesentlichen homolog zu einer Sequenz von Interesse im Analyten sind, wobei das Vorliegen oder Fehlen einer Hybridisierung mit einer vorgegebenen Stringenz für die Freisetzung einer Markierung aus einem Träger sorgt. Es werden verschiedene Techniken zum Binden einer Markierung an einen Träger angewandt, wobei bei Spaltung eines Einzel- oder Doppelstrangs eine Markierung von einem Träger freigesetzt werden kann und die Freisetzung der Markierung als Anzeichen für das Vorliegen einer bestimmten Polynucleotidsequenz in einer Probe nachgewiesen werden kann. Jedoch hat diese Technik den Nachteil, dass ein CNA-PNA-Paar durch die Restriktionsendonuclease geschnitten werden kann, selbst wenn eine Fehlpaarung vorliegt, sofern sich die Fehlpaarung außerhalb der Endonuclease-Erkennungsstelle befindet. Dies würde dazu führen, dass der Test bei der Identifizierung eines CNA-PNA-Hybrids versagt.
  • Ein weiteres Verfahren bedient sich einer verzweigten DNA-Sonde zum Nachweis von Nucleinsäuren. Das US-Patent 5 124 246 (Urdea et al.) beschreibt lineare oder verzweigte Oligonucleotid-Multimere, die sich als Amplifikatoren bei biochemischen Tests eignen, wobei die Multimeren folgendes umfassen: (1) mindestens eine erste einzelsträngige Oligonucleotideinheit (PNA), die mit einer einzelsträngigen Oligonucleotidsequenz von Interesse (TNA) komplementär ist, und (2) eine Mehrzahl von zweiten einzelsträngigen Oligonucleotideinheiten, die mit einem einzelsträngigen, markierten Oligonucleotid komplementär sind. Obgleich amplifizierte Sandwich-Nucleinsäure-Hybridisierungen und Immunoassays unter Verwendung der Multimeren beschrieben werden, weist das Verfahren die Einschränkung auf, dass eine PNA-CNA-Hybridisierung auftreten kann und zur Bildung eines unerwünschten Signals führen kann.
  • Zusätzlich zu Verfahren zur Identifizierung von TNAs wurden Verfahren zur Amplifikation dieser DNA beschrieben. Im US-Patent 5 200 314 (Urdea) wird ein Analyt-Polynucleotidstrang mit einer Analytsequenz (TNA) innerhalb einer Probe mit einem Gehalt an Polynucleotiden nachgewiesen, indem man das Analyt-Polynucleotid mit einer Abfangsonde (PNA) unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt bringt, wobei die Abfangsonde einen ersten Bindungspartner, der spezifisch für die TNA ist, und eine zweite Bindungssequenz, die spezifisch für einen dritten Festphasen-Bindungspartner ist, aufweist. Der erhaltene Duplex wird sodann durch eine spezifische Bindung zwischen den Bindungspartnern immobilisiert und ungebundene Polynucleotide werden von der gebundenen Spezies abgetrennt. Das Analyt-Polynucleotid wird gegebenenfalls aus der festen Phase verdrängt und anschließend durch PCR amplifiziert. Die PCR-Primer weisen jeweils eine Polynucleotidregion auf, die zur Hybridisierung mit einer Region des Analyt-Polynucleotids befähigt ist, und mindestens einer der Primer weist ferner einen zusätzlichen Bindungspartner auf, der zur Bindung an einen Festphasen-Bindungspartner befähigt ist. Das amplifizierte Produkt wird sodann aus dem Reaktionsgemisch durch spezifische Bindung zwischen den Bindungspartnern abgetrennt und das amplifizierte Produkt wird nachgewiesen. Obgleich es möglich ist, (durch PCR) zu bestätigen, dass eine bestimmte Nucleinsäure mit der PNA eine Hybridisierung eingegangen ist, ist die Bestätigung aufwändig und beinhaltet zahlreiche Stufen.
  • In bezug auf Berichte, die sich mit der Wechselwirkung einer doppelsträngigen Nucleinsäure und eines DNA-Bindungsproteins befassen, wurde ein Verfahren beschrieben, bei dem eine Sequenz von immobilisierter DNA, die Bindungsstellen für ein einzelnes Protein enthält, zur Reinigung dieses Proteins verwendet wird. Das US-Patent 5 122 600 (Kawaguchi et al.) beschreibt ein Mikrokügelchen mit immobilisierter DNA, wobei das Produkt DNA-Ketten mit Basensequenzen, die spezifisch ein bestimmtes Protein binden, und einen Träger mit einer Teilchengröße von nicht mehr als 50 μm und nicht weniger als 0,01 μm, der keinerlei Protein adsorbiert, umfasst, wobei der Träger und die DNA-Ketten aneinander über eine chemische Bindung gebunden sind. Ferner wird ein Verfahren zur Reinigung eines Proteins unter Verwendung eines derartigen Mikrokügelchens beschrieben. Da es sich hier um ein Reinigungsverfahren für ein Protein handelt, wird weder ein Verfahren zum Nachweisen einer TNA noch ein Verfahren beschrieben, bei dem mehr als ein Protein an eine doppelsträngige Nucleinsäure gebunden ist, und zwar mit dem Ziel des Nachweises und der Lokalisierung von spezifischen TNA-Sequenzen.
  • EP-A-0 453 301 beschreibt ein Verfahren zum Nachweisen einer Polynucleotid-Zielsequenz in einer Probe, wobei die Sequenzen in einer TNA nachgewiesen werden, indem erste und zweite PNAs mit der TNA hybridisiert werden. Jede PNA enthält einen vorgeformten Duplex oder einen Duplex, der durch Kettenerweiterung gebildet ist, wobei der Duplex zur Bindung eines Nucleotidsequenz-spezifischen Bindungsproteins befähigt ist.
  • EP-A-0 147 665 beschreibt ferner die Verwendung von sequenzspezifischen Duplex-DNA-Bindungsproteinen als Nachweismittel in einem Hybridisierungstest.
  • Auch hier wird die Duplexsonde vorgeformt.
  • EP-A-0 450 594 beschreibt die Möglichkeit der Markierung sogenannter Entwicklermoleküle mit Duplexsequenz-spezifischen Verbindungen, z. B. bestimmten Interkalatoren. Diese Verbindungen werden vor der Hybridisierung an den Entwicklermolekülen angebracht.
  • US-A-4 556 643 beschreibt den nicht-radioaktiven Nachweis spezifischer Nucleotidsequenzen in einer Probe unter Hybridisierung einer Sonde, die spezifische DNA-Bindungsprotein-Sequenzen enthält.
  • WO-93/00446 beschreibt einzelsträngige Oligonucleotide, die einen Bereich umfassen, der dann, wenn er doppelsträngig gemacht wird, an das vom Herpes simplex-Virus abgeleitete UL9-Protein bindet, sowie einen weiteren Bereich, der dann, wenn er doppelsträngig gemacht wird, interkalierende Verbindungen bindet.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Die Erfindung ist in den beigefügten Ansprüchen definiert. Sie stellt Verfahren bereit, durch die spezifische Zielnucleinsäure (TNA)-Sequenzen durch die Verwendung von Sondennucleinsäuren (PNAs) nachgewiesen werden, die bei Hybridisierung mit TNAs zur Bindung von Zielbindungsanordnungen (TBAs) befähigt sind. Jede TBA bindet mindestens eine spezifische Region des PNA-TNA-Hybridpaars der Zielbindungsregion (TBR). Die TBA umfasst ein oder mehr Moleküle, von denen eines oder mehrere die TBR-Sequenzen in einer spezifischen und sequenz- oder konformationsabhängigen Weise binden können. Die TBA kann eine oder mehrere Pilotsequenzen, sogenannte "PILOTS" oder "Asymmetriesequenzen" umfassen, die ein zwanghaftes Zusammensetzen der nucleotidbindenden Komponenten der TBA zu spezifischen Geometrien bewirken. Die PILOTS bewirken ein Zusammensetzen spezifischer Nucleinsäure-Erkennungseinheiten oder anderer PILOTS, an denen spezifische Nucleinsäure-Erkennungseinheiten an den TBAs in einer vorgegebenen Art und Weise angebracht sind. Die TBA kann auch ein oder mehr Moleküle enthalten, die die TBA verankern oder lokalisieren.
  • Erfindungsgemäße PNAs sind in Anspruch 1 definiert. Anwendungsmöglichkeiten dieser Nucleinsäuren sind in anderen Ansprüchen definiert, z. B. Kits, die diese Nucleinsäuren enthalten.
  • Die PNAs können neben TNA-spezifischen Sequenzen auch eine oder mehrere Sequenzen, 1/2-BBRs, enthalten, die zur Hybridisierung mit komplementären 1/2-BBRs in Booster-Nucleinsäuren (BNAs) befähigt sind. Über eine Hybridisierung von an die Starter-1/2-BBRs, die in den PNAs vorhanden sind, addierte BNAs werden Erweiterungen der PNAs in Form von PNA-BNA- und anschließend in Form von BNA-BNA-Hybriden hergestellt. Diese Erweiterungen enthalten eine oder mehrere Booster-Bindungsregionen (BBRs). Jede BBR ist zur Bindung einer Booster-Bindungsanordnung (BBA) befähigt. Die BBA besteht aus Molekülen, von denen eines oder mehrere eine BBR in einer spezifischen und sequenz- oder konformationsabhängigen Art und Weise binden kann. Die BBA kann eine oder mehrere Pilotsequenzen, sogenannte "PILOTS" oder "Asymmetriesequenzen", umfassen, die ein zwanghaftes Zusammensetzen der Nucleotid-Bindungskomponenten der TBA zu spezifischen Geometrien bewirken. Die PILOTS bewirken ein Zusammensetzen von spezifischen Nucleinsäure-Erkennungseinheiten oder anderen PILOTS, an denen spezifische Nucleinsäure-Erkennungseinheiten an den BBAs in einer vorgegebenen Art und Weise angebracht werden. Die BBA kann Moleküle enthalten, die die BBA verankern oder lokalisieren oder die einen Nachweis der gebundenen BBAs und dadurch der TBA-TNA-PNA-Komplexe, an die sie wiederum gebunden sein können, ermöglichen. Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung der 1/2-BBRs, BNAs, BBRs, BBAs und BBA-PILOTS, einschließlich deren Verwendung als Komponenten von diagnostischen und gerichtsmedizinischen Testkits, beschrieben.
  • Es werden Verfahren und Zusammensetzungen für Testverfahren und die Herstellung eines Testkits mit einem Gehalt an PNAs, TBAs, TBRs, BNAs, BBRs, BBAs und HNAs zum Nachweis, zur Lokalisierung und zur Differenzierung spezifischer Nucleinsäuresequenzen beschrieben, unter Einschluss von Nucleinsäuresequenzen, die in humanen Zellen, im humanen Immunschwächevirus (HIV), im humanen Papillomavirus (HPV) und in anderen nucleinsäurehaltigen Systemen, einschließlich Viren und Bakterien, auftreten.
  • Demzufolge besteht eine Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Bindung, dem Nachweis und der Amplifikation des Nachweises spezifischer Zielnucleinsäuresequenzen in einer Probe in zuverlässiger und genauer Weise, und zwar selbst in Gegenwart von eng verwandten, aber unterschiedlichen Nucleinsäuresequenzen.
  • Demgemäß besteht eine Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen zur Schaffung von Zielbindungsanordnungen, die spezifisch Zielbindungsregionen binden, die durch die Hybridisierung von Sondennucleinsäuren und Zielnucleinsäuresequenzen gebildet worden sind.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens und von Zusammensetzungen zur Schaffung von Booster-Bindungsanordnungen, die spezifisch Booster-Bindungsregionen binden, die durch die Hybridisierung von Booster-Nucleinsäuresequenzen mit Sondennucleinsäuren, Booster-Nucleinsäuren und Haarnadel-Nucleinsäuren gebildet werden.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens und von Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Amplifikation des Nachweises von Zielbindungsanordnungen, die an Zielbindungsregionen gebunden sind, unter Verwendung von Booster-Bindungsanordnungen und Booster-Nucleinsäuren.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens und von Zusammensetzungen, die die Anwendung von einer oder mehreren nachweisbaren Markierungen ermöglichen, unter Einschluss (jedoch ohne Beschränkung hierauf) von radioaktiven Markierungen, lichterzeugenden, fluoreszierenden, enzymatischen oder anderen signalerzeugenden Molekülen. Diese Markierungen werden in Verbindung mit Sondennucleinsäuren, Zielbindungsanordnungen, Booster-Bindungsanordnungen, Booster-Nucleinsäuren oder Haarnadelnucleinsäuren verwendet.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • In 1 sind die folgenden Darstellungen enthalten: 1-I ist eine PNA mit einem Gehalt an einer 1/2-TBR, bei der es sich um eine einzelsträngige Sequenz handelt, die komplementär zu einer TNA- und einer 1/2-BBR-Sequenz ist. 1-IIa ist eine TNA, an die die Komponenten von 1-I addiert sind und die unter Hybridisierungsbedingungen die PNA unter Bildung der Komponenten von 1-IIIa bindet, ein PNA-TNA-Hybrid mit einem Gehalt an mindestens einer TBR. 1-IVa ist eine BNA, an die die Komponenten von 1-IIIa addiert sind und die unter Hybridisierungsbedingungen die 1/2-BBR von 1-IIIa unter Bildung eines PNA-BNA-Hybrids mit einem Gehalt an einer BBR gemäß Darstellung in 1-IVa bindet.
  • 1-IIb ist eine BNA, die an die Komponenten von 1-I addiert ist und die unter Hybridisierungsbedingungen die PNA unter Bildung der Komponenten von 1-IIIb bindet, ein PNA-TNA-Hybrid mit einem Gehalt an einer BBR. 1-IVb ist eine TNA, an die die Komponenten von 1-IIIb addiert sind und die unter Hybridisierungsbedingungen die 1/2-TBR von 1-IIIb unter Bildung eines PNA- BNA-Hybrids mit einem Gehalt an einer TBR gemäß Darstellung in 1-IVb bindet.
  • 1-IIc ist eine HNA, an die die Komponenten von 1-I addiert sind und die unter Hybridisierungsbedingungen die PNA unter Bildung der Komponenten von 1-IIIc bindet, ein PNA-HNA-Hybrid mit einem Gehalt an einer BBR. 1-IVc ist eine TNA, an die die Komponenten von 1-IIIc addiert sind und die unter Hybridisierungsbedingungen die 1/2-TBR von 1-IIIc unter Bildung eines PNA-BNA-Hybrids mit einem Gehalt an einer BBR gemäß Darstellung in 1-IVc bindet.
  • Die Hybride, die die TBRs und BBRs bilden, sind erfindungsgemäß geeignet. Die PNAs und BNAs, die in 1 angegeben sind, können ohne befestigten Träger und/oder Indikator (OSA) vorliegen oder einen befestigten Träger oder andere Lokalisierungsmittel enthalten, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) eine Befestigung an Perlen, Polymere und Oberflächen, und/oder Indikatoren.
  • 2a ist eine Darstellung von Strategien für die Polymerisation von BNAs an PNAs und eine Maskierung durch HNAs.
  • 2b ist eine Darstellung zusätzlicher Strategien zur Amplifikation von PNA-TNA-Signalen über eine Polymerisation von BNAs und eine Maskierung durch HNAs.
  • 3 ist eine Darstellung der Verwendung von BNAs mit einem Gehalt an mehrfachen 1/2 BBRs pro BNA.
  • 4a ist eine Darstellung der Bindung von TBAs und BBAs an TBRs und BBRs und der Fähigkeit der TBA zur Unterscheidung zwischen TNAs und CNAs. Gemäß dieser Ausführungsform werden dann, wenn die TBA immobilisiert ist, und zwar entweder an einer Perle, einer Mikrotiterplatten-Oberfläche oder an einer beliebigen anderen derartigen Oberfläche, nur Komplexe, wie Komplex X, zurückgehalten und nachgewiesen, während dies bei Komplexen, wie Komplex XI, nicht der Fall ist.
  • 4b ist eine Darstellung von beispielhaften Ereignissen, ähnlich denen von 4a, jedoch in einer geringfügig unterschiedlichen Reihenfolge des Auftretens der Ereignisse.
  • 5 ist eine Darstellung von beispielhaften PNAs mit einem Gehalt von einer 1/2-TBR und keiner 1/2-BBR bis zu PNAs mit einem Gehalt an bis zu fünf 1/2-TBRs und einer 1/2-BBR. Die Bestandteile (a) und (b) der einzelnen Ziffern (I, II, III, IV und V) bilden einen Satz, der bei Hybridisierung an eine TNA TBRs ergibt, und zwar mit ((a)-Bestandteile) oder ohne ((b)-Bestandteile) einer verfügbaren 1/2-BBR für die Amplifikation über eine Hybridisierung an BNAs mit komplementären 1/2-BBRs.
  • 6a ist eine Darstellung von Beispielen einer bestimmten TNA mit zwei 1/2-TBRs, die bei Bindung an eine geeignete PNA zwei eng assoziierte TBRs bildet, die zur Bindung von zwei TBAs befähigt sind. Ferner wird eine 1/2-BBR für die Amplifikation bereitgestellt.
  • 6b ist eine Darstellung der gleichen Ereignisse wie in 6a, mit der Ausnahme, dass hier eine doppelte TBA verwendet wird, so dass eine Unterscheidung zwischen einzelnen TBRs, die in normalen Zellproben auftreten, von abnormalen, doppelten TBRs möglich ist.
  • 6c ist eine Darstellung des gleichen Szenariums wie in 6a, mit der Ausnahme, dass hier fünf TBRs in der TNA identifiziert sind. Jede TBR kann an eine gleiche oder unterschiedliche TBA gebunden sein und jede TBA kann unterschiedlich markiert sein, was eine Bestätigung ermöglicht, dass sämtliche fünf Stellen in der TNA vorhanden sind.
  • 6d ist eine Darstellung der gleichen Ereignisse wie in 6c, mit der Ausnahme, dass hier eine doppelte TBA dargestellt ist, wodurch der in 6b dargestellte Sachverhalt auf die Anwendung der doppelten TBA ausgedehnt ist. Ein Beispiel der in Abschnitt II der 6a, 6b, 6c und 6d dargestellten TNA ist einzelsträngige HIV-DNA oder -RNA.
  • 7 zeigt die HIV-LTR als eine TNA sowie zwei PNAs und eine Strategie zum Nachweis der TNA unter Verwendung der PNAs.
  • 8 zeigt schematisch eine Ausführungsform der Erfindung, wobei eine Zielbindungsanordnung zur Bindung eines hybriden TNA-PNA verwendet wird und Booster-Bindungsanordnungen zur Bindung von polymerisierten BNAs verwendet werden.
  • 9 zeigt schematisch eine modulare TBA, wobei Anordnungssequenzen, Linkersequenzen und Asymmetriesequenzen dazu verwendet werden, erwünschte Nucleinsäure-Erkennungseinheiten miteinander unter Bildung einer TBA zu begleiten.
  • 10 zeigt modulare TBAs, die zum Nachweis von HIV-spezifischen Sequenzen geeignet sind.
  • 11 zeigt modulare TBAs, die zum Nachweis von humanen Papillomavirus-Sequenzen geeignet sind. Jede Einheit von E2 ist tatsächlich ein Dimeres des DNA-Bindungsbereiches von E2.
  • 12a zeigt schematisch eine TNA-Fraktionierung und -Mobilitätsverschiebung aufgrund der Bindung einer TBA.
  • 12b zeigt schematisch eine TNA-Fraktionierung und verstärkte Mobilitätsverschiebung aufgrund der Bindung von BBAs neben TBAs.
  • 13 zeigt eine Nachweisstrategie für Deletionssequenzen; ein Beispiel zur Anwendung dieser Strategie ist ein Integrationstest auf humanen Papillomavirus.
  • 14 zeigt eine Anordnung von TBAs höherer Ordnung durch Verwendung von Nucleinsäure-Erkennungseinheiten, Linker-, Anordnungs- und Asymmetriesequenzen, so dass verschiedene Zielbindungsanordnungen, die spezifisch für die Bindungsstellen in der HIV-LTR sind, gebildet werden.
  • 15 zeigt eine Anordnung von TBAs höherer Ordnung durch Verwendung von DNA-Erkennungseinheiten, Linker-, Anordnungs- und Asymmetriesequenzen, so dass verschiedene Zielbindungsanordnungen, die spezifisch für Bindungsstellen im HPV-Genom sind, gebildet werden.
  • 16 zeigt die unter Verwendung einer komplexen TBA erzielte Unterscheidung und die Fähigkeit von endogenen Konkurrenz-Zielbindungsmolekülen zur Beseitigung der Bindung der TBA an eine Cousin-Nucleinsäure, jedoch nicht von der TNA, die die geeignete Orientierung von mehr als einer Stelle, die durch die TBA erkannt wird, enthält.
  • 17 zeigt die Fähigkeit von TBA zur spezifischen Zielrichtung zur Bindung an Stellen von Sequenz-Fehlpaarungen und zur bevorzugten Bindung solcher Stellen gegenüber Cousin-Stellen, die nicht alle Ziel-Fehlpaarungen enthalten.
  • Kurze Beschreibung der Sequenzen
  • SEQ ID NO: 1 entspricht 5-Ia-1 und zeigt die Klasse I-MHC-NF-kB-Bindungsstelle.
  • SEQ ID NO: 2 entspricht 5 (Ia) und zeigt die B2-Mikroglobulin-NF-kB-Bindungsstelle.
  • SEQ ID NO: 3 entspricht 5 (Ia) und zeigt die kappa-Immunoglobulin-NF-kB-Bindungsstelle.
  • SEQ ID NO: 4 entspricht 5 (Ia) und zeigt eine der HIV-NF-kB-Bindungsstellen.
  • SEQ ID NO: 5 entspricht 5 (Ia) und zeigt eine der HIV-NF-kB-Bindungsstellen.
  • SEQ ID NO: 6 entspricht 5 (Ia) und zeigt die c-myc-NF-kB-Bindungsstelle.
  • SEQ ID NO: 7 entspricht 5 (IIa) und zeigt eine doppelte HIV-NF-kB-Bindungsstelle.
  • SEQ ID NO: 8 entspricht 5 (IIa) und zeigt eine doppelte HIV-NF-kB-Bindungsstelle.
  • SEQ ID NOs: 9–16 entsprechen 5 (IIa) und zeigen eine doppelte Bindungsstelle, wobei es sich bei der einen Stelle um eine HIV-NF-kB- Bindungsstelle und bei der anderen Stelle um eine HIV-SP-1-Bindungsstelle handelt.
  • SEQ ID NOs: 17–18 entsprechen 5 (IIa) und zeigen eine doppelte HIV-SP1-Bindungsstelle.
  • SEQ ID NOs: 19–31 entsprechen 5 (IIIa) und zeigen eine doppelte HIV-NF-kB-Bindungsstelle und eine HIV-SP1-Bindungsstelle.
  • SEQ ID NOs: 32–33 entsprechen 5 (IVa) und zeigen eine vierfache Bindungsstelle, wobei es sich bei zwei Stellen um HIV-NF-kB-Bindungsstellen und bei zwei Stellen um HIV-SP1-Bindungsstellen handelt.
  • SEQ ID NO: 34 entspricht 5 (VIa) und zeigt eine fünffache Bindungsstelle, wobei es sich bei zwei Stellen um HIV-NF-kB-Bindungsstellen und bei drei Stellen um HIV-SP1-Bindungsstellen handelt.
  • SEQ ID NO: 35 ist ein Beispiel für eine 1/2-BBR, in diesem Fall die OL1-, OL2- und OL3-Elemente des linken lambda-Bacteriophagen-Operators, einschließlich zwischenliegender Sequenzen.
  • SEQ ID NO: 36 ist ein Beispiel für eine 1/2-BBR, in diesem Fall die OR3-, OR2- und OR1-Elemente des rechten lambda-Bacteriophagen-Operators, einschließlich zwischenliegender Sequenzen.
  • SEQ ID NO: 37 zeigt die HIV-LTR
  • SEQ ID NO: 38 zeigt eine PNA, die komplementär zur PNA der HIV-LTR ist.
  • SEQ ID NO: 39 zeigt eine PNA, die komplementär zu einer im Vergleich zu SEQ ID NO: 38 unterschiedlichen PNA der HIV-LTR ist.
  • SEQ ID NO: 40 zeigt eine PNA, die komplementär zu einem Teil der HIV-LTR ist und ferner eine 1/2-BBR und eine Überhangsequenz zur Polymerisation von BNAs an die PNA enthält.
  • SEQ ID NO: 41 zeigt eine BNA, die komplementär zur SEQ ID NO: 40-1/2-BBR ist.
  • SEQ ID NO: 42 zeigt eine BNA, die eine Polymerisation an der SEQ ID NO: 41-BNA eingeht und zusammen mit SEQ ID NOs: 40 und 41 eine PstI-Erkennungsstelle schafft.
  • SEQ ID NO: 43 zeigt eine BNA, die komplementär zur SEQ ID NO: 42-BNA ist und die eine BamHI-Erkennungsstelle vervollständigt.
  • SEQ ID NO: 44 zeigt eine HNA, die eine BamHI-Erkennungsstelle aufweist, die mit der BamHI-Erkennungsstelle die durch SEQ ID NOs: 42 und 43 am wachsenden Polymeren erzeugt worden ist, hybridisiert.
  • SEQ ID NO: 45 zeigt eine zweite PNA, die ähnlich wie SEQ ID NO: 40 komplementär zu einem Teil der HIV-LTR ist, jedoch nicht mit der gleichen Sequenz wie SEQ ID NO: 40. SEQ ID NO: 45 kodiert ferner für eine 1/2-BBR und einen Überhang, der eine Polymerisation von BNAs, beginnend mit einer SphI-Erkennungsstelle, ermöglicht.
  • SEQ ID NOs: 46–62 zeigen humane Papillomavirus (HPV)-spezifische PNAs, die bei Hybridisierung mit HPV-Sequenzen TBRs bilden, die HPV-DNA-Bindungsproteine binden.
  • SEQ ID NOs: 63–71 zeigen NF-kB-DNA-Erkennungseinheiten zum Einbau in TBAs.
  • SEQ ID NO: 72 zeigt eine nukleare Lokalisierungssequenz.
  • SEQ ID NO: 73 zeigt eine SP1-Sequenzerkennungseinheit.
  • SEQ ID NO: 74 zeigt eine TATA-Bindungsprotein-Erkennungseinheit.
  • SEQ ID NOs: 75–84 zeigen Papillomavirus-E2-DNA-Erkennungseinheiten.
  • SEQ ID NOs: 85–92 zeigen Asymmetriesequenzen.
  • SEQ ID NO: 93 zeigt eine Arabidopsis-TATA-Bindungsprotein-Erkennungseinheit.
  • SEQ ID NO: 94 zeigt eine HPV-16-E2-1-DNA-Bindungsprotein-Erkennungseinheit.
  • SEQ ID NO: 95 zeigt eine HPV-16-E2-2-DNA-Bindungsprotein-Erkennungseinheit.
  • SEQ ID NO: 96 zeigt eine HPV-18-E2-DNA-Bindungsprotein-Erkennungseinheit.
  • SEQ ID NO: 97 zeigt eine HPV-33-E2-DNA-Bindungsprotein-Erkennungseinheit.
  • SEQ ID NO: 98 zeigt eine Rinder-Papillomavirus-E2-DNA-Bindungsprotein-Erkennungseinheit.
  • SEQ ID NOs: 99–102 zeigen beispielhafte Linkersequenzen.
  • SEQ ID NO: 103 zeigt ein Beispiel für eine nukleare Lokalisierungssignalsequenz (NLS).
  • SEQ ID NOs: 104–108 zeigen beispielhafte Begleitersequenzen.
  • SEQ ID NOs: 109–116 zeigen beispielhafte zusammengesetzte TBA-Sequenzen.
  • SEQ ID NO: 117 zeigt eine Konsensus-NF-kB-Bindungsstelle.
  • SEQ ID NO: 118 zeigt eine HIV-Tat-Aminosäuresequenz. Abkürzungen
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  • Definitionen
  • Aus der folgenden Beschreibung ist ersichtlich, dass dann, wenn Ausdrücke, wie Zielbindungsanordnungen (TBAs), Booster-Bindungsanordnungen (BBAs), DNA-Bindungsproteine, Nucleinsäurebindungsproteine oder RNA-Bindungsproteine, erwähnt werden, darunter Zusammensetzungen zu verstehen sind, die aus Molekülen bestehen, die DNA- oder RNA-Zielnucleinsäuresequenzen (TNAs) binden, unabhängig von der Spezifität der Kategorie von Bindungsmolekülen, aus denen sie abgeleitet sind. Somit kann beispielsweise eine TBA, die zur Bindung an humane Immunschwächevirus-Sequenzen geeignet ist, sehr ähnlich einem NF-KB-Transkriptionsfaktor sein, der typischerweise DNA-Sequenzen bindet. Jedoch ist der Gebrauch hier so zu verstehen, dass die TBA in optimaler Weise zur Bindung an RNA-Sequenzen einer bestimmten Sequenzzusammensetzung oder -konformation geeignet ist.
  • Die Zuverlässigkeit des hier beschriebenen Nachweisverfahrens hängt in hohem Maße von der selektiven Bindung von TBAs und BBAs an bestimmte Nucleinsäuremotive ab. Es ist darauf hinzuweisen, dass in der gesamten Beschreibung die Basis für eine TBA- und BBA-Unterscheidung der TNAs von verwandten Sequenzen (Cousin-Nucleinsäuren oder CNAs) in der Bildung von präzisen Sondennucleinsäure (PNA)-Zielnucleinsäure (TNA)-Hybridsegmenten (PNA-TNA-Hybride) liegen kann. Jedoch kann die Basis für die Unterscheidung ebenso in der Bildung einer bestimmten Konformation liegen und erfordert möglicherweise nicht das vollständige Fehlen einer fehlerhaften Basenpaarung im TNA-PNA-Hybrid. Demzufolge ist es ersichtlich, dass die Basis der TBA- oder BBA-Operation durchweg von einer Unterscheidung einer beliebigen Eigenschaft, die einzigartig für das TNA-PNA-Hybrid ist, abhängt, im Gegensatz zu beliebigen Eigenschaften, die bei beliebigen PNA-CNA-Hybriden auftreten, die in einer Testprobe, die mit einer vorgegebenen PNA in Kontakt gebracht wird, gebildet werden.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die beigefügten Ansprüche definiert. Sie stellt ein Verfahren zur spezifischen Identifikation einer Zielnucleinsäure (TNA) in einer Probe durch Verwendung von Zielbindungsanordnungen (TBAs), die spezifische Nucleinsäure-Bindungsproteine enthalten, bereit. Durch Verwendung von Sondennucleinsäuren (PNAs), die spezifisch für eine gegebene TNA-Sequenz sind, und einer TBA, die spezifisch für die Duplex-Zielbindungsregion (TBR), die bei Bildung von hybriden TNA-PNA-Sequenzen entsteht, ist, wird ein stabiler TBA-TNA-PNA-Komplex gebildet. Durch zusätzliches Bereitstellen spezifischer, amplifizierbarer Sequenzen in der PNA zusätzlich zu Sequenzen, die spezifisch zur Bildung der durch die TBA erkannten TBR beitragen, wird die Bindung der PNA an die TNA nachgewiesen und der Nachweis wird amplifiziert. Zu diesem Zweck können zahlreiche Nucleinsäure-Amplifikationssysteme, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion, oder eine verzweigte DNA, wobei jede Verzweigung eine nachweisbare Markierung enthält, verwendet werden. Insbesondere wird ein neuartiges Verfahren zur Amplifikation beschrieben, bei dem der amplifizierbare Bereich der PNA Sequenzen enthält, an die Booster-Nucleinsäuren (BNAs) polymerisiert werden können. Bei Bildung eines jeden BNA-PNA-Hybrids wird eine Booster-Bindungsregion (BBR) gebildet, an die spezifisch eine Booster-Bindungsanordnung (BBA) bindet. Bei nachweisbarer Markierung sorgen die BBAs oder BNAs für eine im wesentlichen unbegrenzte Amplifikation des ursprünglichen TNA-PNA-Bindungsereignisses.
  • Erfindungsgemäß ist der Begriff TNA so zu verstehen, dass er spezifische Nucleinsäuresequenzen umfasst. Der Begriff TBA ist als eine beliebige molekulare Anordnung zu verstehen, die eine spezifische und feste Bindung an ein gebildetes TNA-PNA-Hybrid eingehen kann. Die TBA enthält ein oder mehr Moleküle, deren Sequenzen zur Bindung an die TBR ausreichen. Nucleinsäure-Bindungsdomänen, die bekannt sind, können entweder direkt als Komponenten der TBA oder nach Modifikation gemäß der hier vermittelten Lehre verwendet werden. Bei den am leichtesten zugänglichen Molekülen mit derartigen Sequenzen handelt es sich um die DNA-Bindungsdomänen von DNA bindenden Proteinen. Speziell sind zahlreiche DNA- oder RNA-Bindungsproteine bekannt, die entweder direkt wie das bekannte, unmodifizierte Protein verwendet werden können, oder bei der TBA kann es sich um ein Nucleinsäure-Bindungsprotein handeln, das gemäß der hier speziell vermittelten Lehre modifiziert worden ist. Im letztgenannten Fall gehören zu erstrebenswerten Modifikationen eine Optimierung der Bindungsaffinitäten, eine Beseitigung von unerwünschten Aktivitäten (z. B. einer Nuclease-Aktivität und eine Reorganisation der TBA in Gegenwart von anderen Molekülen mit Affinität für Komponenten der TBA), eine Optimierung der Selektivität einer Zielsequenz gegenüber eng verwandten Sequenzen und eine Optimierung der Stabilität.
  • Zu Beispielen für DNA-Bindungsproteine, die erfindungsgemäß verwendet werden können, gehören die DNA-Bindungsbereiche des Transkriptionsfaktors NF-kB (p50 und p65), NF-IL6, NF-AT, rel, TBP, das Papillomavirus-E2-Protein, sp1, die Repressoren cro und CI aus dem lambda-Bacteriophagen. Es sind derartige Proteine bekannt, deren DNA-Bindungsbereich isoliert, kloniert, sequenziert und charakterisiert worden ist. Ferner gehören hierzu beliebige andere DNA-Bindungsproteine oder Teile eines Proteins, die zur Bindung eines TBR-Hybrids oder einer BBR notwendig und ausreichend sind. Hierzu gehören Proteine oder Teile von Wildtypproteinen mit veränderter DNA-Bindungsaktivität sowie erzeugte Proteine mit veränderter DNA-Bindungsspezifität, z. B. durch Austausch einer DNA-Bindungserkennungshelix aus einem Protein gegen ein anderes Produkt. Außerdem können Proteine, die Nucleinsäure-Bindungsfunktionen und andere Nucleinsäure-Funktionen ausüben, wie Restriktionsendonucleasen, als die Nucleinsäure-Bindungsfunktion verwendet werden. Proteine, die Zielregionen in DNA-RNA-Hybriden sowie in RNA-RNA-Hybriden binden, gehören dazu (vergl. beispielsweise Shi 1995, DeStefano 1993, Zhu 1995, Gonzales 1994, Salazar 1993, Jaishree 1993, Wang 1992, Roberts 1992, Kainz 1992, Salazar 1993(b)). Die Bindungsanordnungen können unter Verwendung eines Moleküls, das Teile der Bindungsanordnung begleitet, so konstruiert werden, dass spezifische Komponentenkombinationen und Geometrien erreicht werden können. Dieses Molekül wird hier als ein PILOT bezeichnet. Piloten können aus Proteinen oder beliebigen Kombinationen von organischen und anorganischen Materialien bestehen, die eine kombinatorische Auswahl ergeben und/oder spezifische Geometrien zwischen Mitgliedern der TBAs oder BBAs herbeiführen. Ein Begleiter ("chaperon") ist ein stabiles Gerüst, an dem eine TBA oder BBA so konstruiert werden kann, dass die richtige Konformation der TBA oder BBA erreicht wird, während gleichzeitig unerwünschte Eigenschaften eines natürlicherweise vorkommenden Nucleinsäure-Bindungsproteins beseitigt werden. Als spezielles Beispiel für diese Ausführungsform wird eine modifizierte Version des pleiotropen Transkriptionsfaktors NF-kB unter Verwendung eines modifizierten lambda-Bacteriophagen-cro-Proteins als Begleiter bereitgestellt. Jedes NF-kB-Bindungsdimere behält die picomolare Bindungsaffinität für die NF-kB-Bindungsstelle, während gleichzeitig die Bindungsanordnung mehrere vorteilhafte Eigenschaften in Bezug auf Herstellung, Stabilität und Spezifität aufweist.
  • Unter Berücksichtigung der vorstehenden Ausführungen werden die verschiedenen Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung nachstehend ausführlich beschrieben.
  • 1. Sondennucleinsäuren (PNAs) und ihre Herstellung.
  • Die erfindungsgemäßen PNAs umfassen mindestens drei miteinander verbundene Hauptteile. Gemäß 1 (I) der Zeichnungen handelt es sich beim ersten Teil der PNA um eine oder mehrere Sequenzen von Basen mit der Bezeichnung "1/2-TBR". Gemäß 1 (I und IIa) der Zeichnungen ist die 1/2-TBR in der PNA komplementär zu einer Sequenz von Interesse in einer Probe, wobei die TNA eine 1/2-TBR enthält. Gemäß 1 (IIIa) der Zeichnungen bildet die TNA bei Addition an die PNA unter Hybridisierungsbedingungen ein PNA-TNA-Hybrid mit einem Gehalt an einer TBR. Gemäß 1 (I) der Zeichnungen handelt es sich beim zweiten Teil der PNA um eine Sequenz von Basen mit der Bezeichnung "1/2-BBR". Gemäß 1 (I, IIb, IIc und IVa) der Zeichnungen ist die 1/2-BBR in der PNA komplementär zu einer 1/2-BBR, die in einer BNA oder HNA enthalten ist. Gemäß 1 (IIIb, IIc oder Va) der Zeichnungen bildet die BNA oder HNA bei Zugabe zur PNA unter Hybridisierungsbedingungen ein PNA- oder HNA-Hybrid. Gemäß 1 (I) der Zeichnungen handelt es sich beim dritten Teil der PNA um eine OSA, die als Kreis in einem Kästchen angedeutet ist. Bei der OSA kann es sich um einen Nicht-Träger und/oder Indikator oder festen Träger oder um andere Lokalisierungsmittel handeln, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) um eine Befestigung an Perlen, Polymeren und Oberflächen und/oder Indikatoren, die an die PNA kovalent gebunden oder in nicht-kovalenter, jedoch spezifischer Weise mit der PNA assoziiert sind. Bei der OSA kann es sich um ein Atom oder ein Molekül handeln, das die Trennung und/oder die Lokalisierung unterstützt, z. B. um eine Festträger-Bindungsgruppe oder Markierung, die durch verschiedene physikalische Maßnahmen nachgewiesen werden kann, einschließlich durch (ohne Beschränkung hierauf) Adsorption oder Abbildung von emittierten Teilchen oder Licht. Verfahren zum Anbringen von Indikatoren an Oligonucleotiden oder zur Immobilisierung von Oligonucleotiden an festen Trägern sind aus dem Stand der Technik bekannt (vergl. Keller und Manak, a.a.O.).
  • Die erfindungsgemäße PNA kann durch beliebige geeignete Verfahren hergestellt werden. Zu derartigen Verfahren gehören allgemein die Oligonucleotidsynthese und die Klonierung in einem replizierbaren Vektor. Verfahren zur Nucleinsäuresynthese sind aus dem Stand der Technik bekannt. Bei der Klonierung oder Synthese kann eine Reinigung und Abtrennung von Strängen zur Verwendung des Produkts als reine PNA erforderlich sein. Verfahren zur Herstellung von RNA-Sonden sind bekannt (vergl. beispielsweise Blais 1993, Blais 1994, der sich der in vitro-Transkription nach einer PCR-Reaktion unter Einsatz eines T7-RNA-Polymerase-Promotors bedient).
  • Die Länge und die spezifische Sequenz der PNA sind, wie es für den Fachmann ersichtlich ist, von der Länge und der Sequenz, die in einer TNA nachzuweisen sind, und den Einschränkungen zur Erzielung einer engen und spezifischen Bindung der zu verwendenden speziellen TBA abhängig (vergl. die nachstehende Erörterung über TBAs). Im allgemeinen sind PNAs mit Sequenzlängen von etwa 10 bis etwa 300 Nucleotiden geeignet, wobei Längen von etwa 15–100 Nucleotiden für zahlreiche der hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen erstrebenswert sind.
  • Ferner ist darauf hinzuweisen, dass die PNA so konstruiert sein kann, dass sie mehr als eine 1/2-TBR enthält und mehr als eine TBR für eine oder mehrere TBAs erzeugt, die gleich oder verschieden sind, sowie komplexe TBRs, die durch neue Duplex- und Multiplex-TBAs (vergl. die nachstehenden Ausführungen bezüglich dieser neuartigen TBAs) bei Hybridisierung der PNAs und TNAs erkennt. 5 zeigt die spezifischen PNAs, die eine oder mehrere 1/2-TBRs enthalten. Spezifische Sequenzen, die den 1/2-TBR-Sequenzen gemäß Darstellung in 5 (Ia, IIa, IIIa, IVa und Va) entsprechen, sind die Sequenzen SEQ ID NOs: 1–34 (vergl. die vorstehende Beschreibung der Sequenzen).
  • Wie in den 2a und 2b gezeigt, kann die PNA mit einem Gehalt an einer 1/2-TBR mit einer oder mehreren BNAs (vergl. die nachstehenden Ausführungen) hybridisiert werden und die Kette von BNAs kann zu einer beliebigen potentiellen Länge für die Amplifikation des TNA-PNA- Hybridisierungsereignisses polymerisiert werden. Vorzugsweise sind 1 bis 10 1/2-BBRs in der PNA vorhanden.
  • Wie in den 6a und 6b gezeigt, kann die PNA mehrere 1/2-TBRs, die gleich oder verschieden sind, enthalten, die mit mehreren 1/2-TBRs in einer TNA hybridisieren können. Jedes Mal, wenn eine 1/2-TBR in der PNA zu einer 1/2-TBR in einer TNA passt, wird eine Zielbindungsregion, TBR, gebildet, die eine TBA binden kann. Ferner ist es nicht wesentlich, dass es sich bei sämtlichen TBRs um eine einzelne, zusammenhängende PNA handelt. Somit werden in einer Ausführungsform der Erfindung zwei verschiedene PNAs zum Nachweis von Sequenzen an einer bestimmten TNA verwendet. Als eine Erläuterung dieses Aspekts der Erfindung zeigt 7 eine Darstellung der langen terminalen Wiederholungssequenz (LTR) des humanen Immunschwächevirus (HIV). Wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, umfasst die HIV-LTR zwei NF-kB-Bindungsstellen und drei SP1-Bindungsstellen in enger Nachbarschaft, wobei NF-kB und SP1 bekannte DNA-Bindungsproteine darstellen. 7 zeigt zwei PNAs, PNA1 (SEQ ID NO: 38) und PNA2 (SEQ ID NO: 39), die jeweils komplementär zum gegenüberliegenden Strang sind, der als eine TNA (SEQ ID NO: 37) dargestellt ist, die die beiden NF-kB-Bindungsstellen und die drei SP1-Bindungsstellen der HIV-LTR zeigt. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung hybridisiert PNA1 spezifisch mit dem Anschnitt der in 7 gezeigten TNA, bei dem die Basen mit einem "+"-Symbol unterstrichen sind, während PNA2 spezifisch mit dem in 7 dargestellten Abschnitt der TNA hybridisiert, bei dem die Basen mit einem "="-Symbol unterstrichen sind. Jede PNA1 oder PNA2 kann ferner Sequenzen (mit den Symbolen "#" oder "*" bezeichnet) enthalten, die mit 1/2-BBR-Sequenzen einer BNA hybridisieren (vergl. die nachstehenden Ausführungen). Ferner kann jede PNA1 und PNA2 unterschiedlich mit einer OSA markiert sein, z. B. einem Fluorophor, wie einer Fluorescein- oder einer Rhodamin-Markierung, was eine Bestätigung ermöglicht, dass beide Sonden an die TNA gebunden worden sind. Wenn nur eine oder gar keine Markierung nachgewiesen wird, lässt dies den Schluss zu, dass die TNA in der getesteten Probe nicht vorhanden ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der in 7 dargestellten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Veränderung der Spezifität des vorliegenden Testverfahrens dargelegt. Durch Veränderung der Länge der Lücke zwischen PNA1 und PNA2 in der Weise, dass die unhybridisiert verbleibende TNA-Region verändert wird, ist man bei der Ausführung der Erfindung dazu befähigt, das Unterscheidungsvermögen des Tests zu verändern.
  • Um diesen Aspekt der Erfindung klarer durch ein Beispiel zu belegen, muss betont werden, dass die TBR eine helikale Struktur aufweisen kann. Während somit PNA1 auf einer "Seite" der Helix TBRs erzeugt, erzeugt PNA2 entweder auf der gleichen oder auf einer unterschiedlichen Seite der Helix je nach dem Abstand zwischen den Zentren der einzelnen TBRs (in 7 unterstrichen) eine TBR. Wenn die Mitte jeder Bindungsstelle um ein ganzzahliges Produkt von 10,5 Basen entfernt ist, befinden sich die TBRs auf der gleichen Seite der Helix, während bei einem Abstand mit einem Wert eines nicht-ganzzahligen Produkts von 10,5 Basen die TBRs sich auf gegenüberliegenden Seiten der Helix befinden. Auf diese Weise kann eine Kooperativität der Bindung durch die TBA, die die PNA1-TBR erkennt, und der TBA, die die PNA2-TBR erkennt, manipuliert werden (vergl. A. Hochschild, M. Ptashne, Cell, Bd. 44 (1986), S. 681–687, wo dieser Effekt für die Bindung des lambda-Bacteriophagen-Repressors an zwei verschiedene Operatorstellen, die sich in unterschiedlichen Abständen voneinander an einer DNA-Helix befinden, dargelegt wird). Wie von Perkins et al., EMBO J., Bd. 12 (1993), S. 3551–3558, ausgeführt wird, ist eine Kooperativität zwischen den NF-kB- und SP1-Stellen erforderlich, um eine Aktivierung der HIV-LTR zu erreichen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann das Zweifach-NF-kB-Dreifach-SP1-Bindungsstellenmotiv in der HIV-LTR in vorteilhafter Weise ausgenützt werden, indem man ein einziges, neuartiges Bindungsprotein bereitstellt, das zur gleichzeitigen Bindung an beide Stellen befähigt ist, jedoch nur, wenn der Abstand zwischen den Stellen geometrisch geeignet ist. Dies wird sowohl durch die Struktur der gewählten TBA als auch durch die verwendeten PNAs gesteuert. Somit können in der in 7 dargestellten Ausführungsform die beiden Sonden mit einem ausreichend großen Intersondenbereich aus verbleibender einzelsträngiger DNA verwendet werden, so dass selbst dann, wenn sich die NF-kB- und SP1-Bindungsstellen auf gegenüberliegenden Seiten der Helix befinden, die einzelsträngige Region zwischen den Sonden ein ausreichend flexibles "Gelenk" ergibt, so dass die DNA sich sowohl biegen als auch verdrillen kann, um sich der Geometrie der TBA anzupassen. Alternativ kann ein stringenterer Test konzipiert werden, indem man den Intersondenabstand so verengt, dass die DNA nur gebogen, jedoch nicht verdrillt werden kann. Schließlich können die Sonden in so engem Abstand angeordnet werden oder es kann eine einzelne PNA verwendet werden, so dass die DNA sich nur biegen, jedoch nicht verdrillen kann. Somit wird anhand dieser Figur die Herstellung von Nachweissystemen beispielhaft erläutert und ermöglicht, bei denen ein beliebiger vorgegebener Grad der Unterscheidung zwischen Zielnucleinsäuren mit ähnlichen Sequenzen, jedoch mit unterschiedlichen Nebeneinanderstellungen dieser Sequenzen vorliegt.
  • In Bezug auf ein diagnostisches oder forensisches Kit für HIV ist es für den Fachmann ersichtlich, dass die vorerwähnten Aspekte der Erfindung es ermöglichen, die Komponenten des diagnostischen oder forensischen Kits so maßzuschneidern, dass sie dem entsprechen, was zu einem gegebenen Zeitpunkt über die vorherrschenden Stämme von HIV und andere Pathogene oder Krankheitszustände bekannt ist. Ferner ist es für den Fachmann ersichtlich, dass der Nachweis von HIV-Infektionen zwar nicht die einzige Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung darstellt, dass dieser Nachweis aber aufgrund der Mutationsfähigkeit des HIV-Genoms vermutlich eine der kompliziertesten Testumgebungen für ein derartiges Diagnostikum darstellt. Aber gerade in einer derartigen veränderlichen Umgebung ist die Flexibilität des vorliegenden Verfahrens in Verbindung mit seiner Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen sehr eng verwandten Sequenzen besonders wertvoll. In weniger veränderlichen Umgebungen brauchen einige der besonders ausgeklügelten Maßnahmen der Erfindung nicht eingesetzt werden. Somit stehen bei einem diagnostischen Kit für eine Papillomavirus-Infektion alle Unterscheidungscharakteristika der TBA-TBR-Wechselwirkung zur Verfügung, zusammen mit der Fähigkeit zur Amplifikation des Signals unter Verwendung der BNAs und BBAs, wobei aber eine einzige, einfache PNA, z. B. eine beliebige der Sequenzen SEQ ID NOs: 46–62, verwendet werden kann, die einzigartige Papillomavirus-Sequenzen identifiziert, von denen auch bekannt ist, dass sie eine TBA binden, z. B. das Papillomavirus-E2-Protein oder geschnittene DNA-Bindungsbereiche davon (vergl. Hegde et al., Nature, Bd. 359 (1992), S. 505–512; Monini et al., J. Virol., Bd. 65 (1991), S. 2124–2130).
  • Bei Anwendung des vorliegenden Verfahrens auf den Nachweis einer bestimmten TNA zur Feststellung der Tatsache, ob bestimmte Nucleinsäuren vorhanden sind, die mit dem Fortschreiten von Melanomen, Hepatomen, Brust-, Zervix-, Lungen-, Kolon-, Prostata-, Pankreas- oder Ovarialkrebs im Zusammenhang stehen, kann die TNA aus Biopsiematerialien, das Organen und Flüssigkeiten mit einem Verdacht auf einen Gehalt an krebsartigen Zellen entnommen worden ist, erhalten werden. Zum Nachweis von genetischen Defekten kann die TNA aus Patientenproben mit einem Gehalt an den betroffenen Zellen erhalten werden. Zum Nachweis von Fermentationsverunreinigungen und -produkten bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, chemischen oder biotechnologischen Produkten oder bei der biologischen Aufarbeitung von Abfällen, kann die TNA aus Proben, die in verschiedenen Stadien des Fermentations- oder Behandlungsverfahrens entnommen worden sind, erhalten werden. Zum Nachweis von Nahrungsmittel- oder Arzneistoff-Pathogenen oder -Verunreinigungen kann die TNA-Probe aus folgenden Produkten erhalten werden: aus den Nahrungsmitteln oder Arzneistoffen, aus Abwischprodukten von Nahrungsmitteln oder von mit Nahrungsmitteln in Kontakt stehenden Oberflächen, aus Flüssigkeiten, die mit Nahrungsmitteln in Kontakt stehen, aus Verarbeitungsmaterialien, Flüssigkeiten und dergl., die bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, Arzneistoffen oder biologischen Proben anfallen oder in Kontakt damit stehen, wobei die biologischen Proben Produkten entnommen worden sind, die in Kontakt mit den Nahrungsmitteln oder Arzneistoffen oder dergl. gestanden haben.
  • 2. Booster-Nucleinsäuren (BNAs), Booster-Bindungsregionen (BBRs) und deren Herstellung.
  • Die erfindungsgemäßen BNAs bestehen aus mindestens einem oder mehreren 1/2-BBRs unter Kupplung an eine OSA. Die 1/2-BBRs können mit komplementären 1/2-BBRs, die in der PNA enthalten sind, mit anderen BNAs oder mit einer HNA hybridisieren.
  • Gemäß 1 (I, IIb und IIIb) der Zeichnungen besteht die einfachste BNA aus zwei Teilen. Gemäß 1 (IIb) der Zeichnungen handelt es sich beim ersten Teil der einfachsten BNA um eine Sequenz von Basen, die komplementär mit der Sequenz in der PNA mit der Bezeichnung "1/2-BBR" ist, die mit einem von einem Kästchen umgebenen Kreis bezeichnet ist. Bei der OSA handelt es sich um einen Nichtträger und/oder Indikator oder festen Träger oder andere Lokalisierungsmittel, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) einer Befestigung an Perlen, Polymeren und Oberflächen und/oder Indikatoren, die kovalent an die BNA gebunden oder in einer nicht-kovalenten, jedoch spezifisch zugeordneten Verbindung zur BNA stehen.
  • Gemäß 2a (II und III) der Zeichnungen kann die BNA mehr als eine 1/2-BBR-Sequenz enthalten. Die in 3 (II) dargestellte PNA enthält eine Sequenz, die komplementär zu der in 3 (I) dargestellten PNA ist, und zwei weitere 1/2-BBR-Sequenzen. Die in 3 (III) dargestellte BNA enthält zwei 1/2-BBR-Sequenzen, die komplementär zu zwei der 1/2-BBR-Sequenzen in der in 3 (II) dargestellten BNA ist, zusätzlich bis zu "n" weitere 1/2-BBRs für die Polymerisation von zusätzlichen BNAs.
  • Unter Hybridisierungsbedingungen erzeugt die in 3 (II) dargestellte BNA bei Kombination mit der in 3 (I) dargestellten PNA das in 3 (IVa) PNA-BNA-Hybrid mit einem Gehalt an einer BBR und einer unhybridisierten Verlängerung mit zwei zusätzlichen 1/2-BBR-Sequenzen oder "Booster"-Sequenzen. Die durch diese Hybridisierung geschaffenen BBRs können identische, ähnliche oder unähnliche Sequenzen aufweisen. Die durch diese Hybridisierung geschaffenen BBRs können identische, ähnliche oder unähnliche BBAs binden (vergl. die nachstehenden Ausführungen). Die BNAs können in analoger Weise wie die PNAs hergestellt werden.
  • Unter Hybridisierungsbedingungen erzeugt das in 3 (IVb) dargestellte BNA-BNA-Hybrid bei Kombination mit der in 3 (Vb) dargestellten PNA das in 3 (VI) dargestellte PNA-BNA-Hybrid mit einem Gehalt an einer BBR, zwei zusätzlichen BNA-BNA-Hybriden mit einem Gehalt an BBRs und eine unhybridisierte Verlängerung mit einer zusätzlichen 1/2-BBR-Sequenz, einer "Booster"-Sequenz. Die durch die Hybridisierung geschaffenen BBRs können identische, ähnliche oder unähnliche Sequenzen aufweisen. Die durch diese Hybridisierung geschaffenen BBRs können identische, ähnliche oder unähnliche BBAs binden (vergl. die nachstehenden Ausführungen). Die BNAs können in analoger Weise wie die PNAs hergestellt werden.
  • 3. Zielnucleinsäuren (TNAs) und ihre Herstellung.
  • Die erste Stufe beim Nachweis und bei der Amplifikation von Signalen, die durch den Nachweis einer bestimmten TNA gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt werden, besteht in der Hybridisierung eines derartigen Ziels mit der PNA in einem geeigneten Gemisch. Eine derartige Hybridisierung wird unter geeigneten Bedingungen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, erreicht.
  • Die Probe, von der man annimmt oder von der bekannt ist, dass sie die betreffende TNA enthält, kann aus verschiedenen Quellen erhalten werden. Es kann sich um eine biologische Probe, eine Nahrungsmittelprobe oder landwirtschaftliche Probe, eine Probe aus der Umwelt und dergl. handeln. Bei der Anwendung des vorliegenden Verfahrens auf den Nachweis einer bestimmten TNA für die Zwecke der medizinischen Diagnostik oder der Forensik kann die TNA aus einer Biopsieprobe, einer Körperflüssigkeit oder einem Exsudat, wie Urin, Blut, Milch, zerebrospinaler Flüssigkeit, Sputum, Speichel, Stuhl, Lungenaspiraten, Rachen- oder Genitalabstrichen und dergl., erhalten werden. Ferner kann der Nachweis in situ erfolgen (vergl. beispielsweise Embretson, 1993; Patterson 1993; Adams 1994).
  • Demzufolge kommen PNAs, die spezifisch für Wirbeltiere (unter Einschluss von Säugetieren und unter Einschluss des Menschen) oder für beliebige oder sämtliche der nachstehenden Mikroorganismen von Interesse sind, in Betracht und können beim vorliegenden Verfahren verwendet werden:
  • Corynebacteria
    • Corynebacterium diphtheriae
  • Bacillus
    • Bacillus thuringiensis
  • Pneumococci
    • Diplococcus pneumoniae
  • Streptococci
    • Streptococcus pyogenes
    • Streptococcus salivarius
  • Staphylococcus
    • Staphylococcus aureus
    • Staphylococcus albus
  • Pseudomonas
    • Pseudomonas stutzen
  • Meisseria
    • Neisseria meningitidis
    • Neisseria gonorrhea
  • Enterobactericeae
    • Escherichia coli
    • Aerobacteria aerogenes
    • Klebsiella pneumoniae – koliforme Bakterien
    • Salmonella typhosa
    • Salmonella choleraesuis – Salmonellen
    • Salmonella typhimurium
    • Shigellae dysenteriae
    • Shigellae schmitzii
    • Shigellae arabinotarda
    • Shigellae flexneri – Shigellae
    • Shigellae boydii
    • Shigellae sonnei
  • Weitere enterische Bazillen
    • Proteus vulgaris
    • Proteus mirabilis – Proteus-Spezies
    • Proteus morgani
    • Pseudomonas aeruginosa
    • Alcaligenes faecalis
    • Vibrio cholerae
  • Haemophilus-Bordetella-Gruppe
    • Haemophilus influenzea, H. ducryi
    • Haemophilus hemophilus
    • Haemophilus aegypticus
    • Haemophilus parainfluenzae
    • Bordetella pertussis
  • Pasteurellae
    • Pasteurella pestis
    • Pasteurella tulareusis
  • Brucellae
    • Brucella melitensis
    • Brucella abortus
    • Brucella suis
  • Aerobe, sporenbildende Bazillen
    • Bacillus anthracis
    • Bacillus subtilis
    • Bacillus megaterium
    • Bacillus cereus
  • Anaerobe, sporenbildende Bazillen
    • Clostridium botulinum
    • Clostridium tetani
    • Clostridium perfiringens
    • Clostridium novyi
    • Clostridium septicum
    • Clostridium histolyticum
    • Clostridium terfium
    • Clostridium bifermentans
    • Clostridium sporogenes
  • Mycobacteria
    • Mycobacterium tuberculosis hominis
    • Mycobacterium bovis
    • Mycobacterium avium
    • Mycobacterium leprae
    • Mycobacterium paratuberculosis
  • Actinomycetes (pilzartige Bakterien)
    • Actinomyces israeli
    • Actinomyces bovis
    • Actinomyces naeslundii
    • Nocardia asteroides
    • Nocardia brasiliensis
  • Spirochäten
    • Treponema pallidum
    • Treponema perfenue
    • Treponema carateum
    • Spirillum minus
    • Streptobacillus moniliformis
    • Borrelia recurrens
    • Leptospira icterohemorrhagiae
    • Leptospira canicola
  • Trypanasomen
  • Mycoplasmen
    • Mycoplasma pneumoniae
  • Weitere Pathogene
    • Listeria monocytogenes
    • Erysipelothrix rhusiopathiae
    • Streptobacillus moniliformis
    • Donvania granulomatis
    • Bartonella bacilliformis
  • Rickettsiae (bakterienartige Parasiten)
    • Rickettsia prowazekii
    • Rickettsia mooseri
    • Rickettsia rickettsii
    • Rickettsia conori
    • Rickettsia australis
    • Rickettsia sibiricus
    • Rickettsia akari
    • Rickettsia tsutsugamushi
    • Rickettsia burnetti
    • Rickettsia quintana
  • Chlamydia (unklassifizierbare bakterielle/virale Parasitern)
    • Chlamydia Agentien (Bezeichnung unsicher)
  • Pilze
    • Cryptococcus neoformans
    • Blastomyces dermatidis
    • Histoplasma capsulatum
    • Coccidioides immitis
    • Paracoccidioides brasiliensis
    • Candida albicans
    • Aspergillus fumigatus
    • Mucor corymbifera (Absidia corymbifera)
    • Rhizopus oryzae
    • Rhizopus arrhizus – Phycomyceten
    • Rhizopus nigricans
    • Sporotrichum schenkii
    • Fonsecaea pedrosoi
    • Fonsecaea compact
    • Fonsecaea dermatidis
    • Cladosporium carrioni
    • Phialophora verrucosa
    • Aspergillus nidulans
    • Madurella mycetomi
    • Madurella grisea
    • Allescheria boydii
    • Phialophora jeanselmei
    • Microsporum gypsum
    • Trichophyton mentagrophytes
    • Keratinomyces ajelloi
    • Microsporum canis
    • Trichophyton rubrum
    • Microsporum adouini
  • Viren
    • Adenoviren
  • Herpes-Viren
    • Herpes Simplex
    • Varicella (Windpocken)
    • Herpes zoster (Gürtelrose)
    • Virus B
    • Cytomegalovirus
  • Pockenviren
    • Variola (Pocken)
    • Kuhpocken
    • "Poxvirus bovis"
    • Paravakzine
    • Molluscum contagiosum
  • Picornaviren
    • Poliovirus
    • Coxsackievirus
    • Echoviren
    • Rhinoviren
  • Myxoviren
    • Influenza (A, B und C)
    • Parainfluenza (1–4)
    • Mumpsvirus
    • Newcastle-Krankheit-Virus
    • Masernvirus
    • Rinderpestvirus
    • Hundestaupevirus
    • Respiratorisches Syncytialvirus
    • Rötelnvirus
  • Arboviren
    • Eastern-Pferde-Encephalitisvirus
    • Western-Pferde-Encephalitisvirus
    • Sindbisvirus
    • Chikugunyavirus
    • Semliki-Forstvirus
    • Mayoravirus
    • St. Louis-Encephalitisvirus
    • Kalifornien-Encephalitisvirus
    • Colorado-Zeckenfiebervirus
    • Gelbfiebervirus
    • Dengue-Virus
  • Reoviren
    • Reovirus Typen 1–3
  • Retroviren
    • Humanes Immunschwächevirus (HIV)
    • Humanes lymphotrophes T-Zellenvirus I & II (HTLV)
  • Hepatitis
    • Hepatitis A-Virus
    • Hepatitis B-Virus
    • Hepatitis-Nicht A- Nicht B-Virus
    • Hepatitis C, D, E
  • Tumorviren
    • Rauscher-Leukämievirus
    • Gross-Virus
    • Maloney-Leukämievirus
    • Humane Papillomaviren
  • Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass es im allgemeinen erforderlich ist, Proben, bei denen ein Verdacht an einem Gehalt an einer bestimmten TNA besteht, in der Weise zu behandeln, dass Fragmente entstehen, die leicht mit der PNA hybridisieren können. Es kann erforderlich sein, eine Testprobe so zu behandeln, dass eine Freisetzung oder Extraktion der TNA für die Hybridisierung erfolgt, z. B. durch Einwirkung einer hypotonischen Umgebung auf Blutzellen oder andere Zellen oder durch anderweitiges Aufschließen der Probe unter Anwendung drastischerer Maßnahmen. Wenn angenommen wird, dass die TNA in doppelsträngiger Form vorliegt, ist es natürlicherweise erstrebenswert, die Stränge zu trennen, um die TNA in eine hybridisierbare, einzelsträngige Form zu bringen, wobei man sich bekannter Verfahren bedient, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) einer Erwärmung oder einer begrenzten Einwirkung von alkalischen Bedingungen, die bei Zugabe der einzelsträngigen PNA neutralisiert werden können, um eine Hybridisierung zu ermöglichen. Verfahren zur Vorbereitung von RNA-Zielen sind bekannt (vergl. Waterhouse, 1993; Mitchel, 1992).
  • Für eine Fragmentierung von Nucleinsäureproben mit einem Gehalt an TNAs ist es üblicherweise erforderlich, die Probenviskosität zu verringern und die Zugänglichkeit der TNAs zu den PNAs zu erhöhen. Eine derartige Fragmentierung wird durch willkürliche oder spezifische Maßnahmen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, erreicht. Somit können beispielsweise spezifische Nucleasen, von denen bekannt ist, dass sie mit einer bestimmten Frequenz einen Schneidevorgang im speziellen, zu analysierenden Genom vornehmen, verwendet werden, um Fragmente mit einer bekannten durchschnittlichen Molekülgröße zu erzeugen. Ferner können weitere Nucleasen, Phosphodiesterasen, Exonucleasen und Endonucleasen, eine physikalische Scherbehandlung und eine Ultraschallbehandlung zu diesem Zweck herangezogen werden. Diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Verwendung von Restriktionsenzymen zum Zweck der DNA-Fragmentierung wird im allgemeinen bevorzugt. Jedoch kann DNA auch durch eine Vielzahl von chemischen Maßnahmen fragmentiert werden, z. B. unter Verwendung von Reagenzien der folgenden Typen: EDTA-Fe(II) (gemäß Stroebel et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 110 (1988), S. 7927; Dervan, Science, Bd. 232 (1986), S. 464); Cu(II)-Phenanthrolin (gemäß Chen und Sigman, Science, Bd. 237 (1987), S. 1197); Klasse IIS-Restriktionsenzyme (gemäß Kim et al., Science, Bd. 240 (1988), S. 504); hybride DNAse (gemäß Corey et al., Biochem., Bd. 28 (1989), S. 8277); Bleomycin (gemäß Umezawa et al., J. Antibiot. (Tokyo) Ser. A, Bd. 19 (1986), S. 200); Neocarzinostatin (Goldberg et al., Second Annual Bristol-Myers Symposium in Cancer Research, Academic Press, New York (1981), S. 163); und Methidiumpropyl-EDTA-Fe(II) (gemäß Hertzberg et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 104 (1982), S. 313). Eine Entfernung von Proteinen, z. B. mit einer Protease, ist ebenfalls im allgemeinen erstrebenswert und Verfahren zur Durchführung der Entfernung von Proteinen aus Nucleinsäureproben ohne merklichen Nucleinsäureverlust sind aus dem Stand der Technik bekannt.
  • Die erfindungsgemäßen TNAs sollen eine ausreichende Länge aufweisen, so dass eine ausreichende Menge an doppelsträngigem Hybrid, das die TBR flankiert, vorhanden ist, so dass eine TBA ohne Störung durch unligierte Fragmentenden binden kann. Typischerweise werden Fragmente im Bereich von etwa 10 Nucleotiden bis etwa 100 000 Nucleotiden und vorzugsweise im Bereich von etwa 20 Nucleotiden bis etwa 1 000 Nucleotiden als durchschnittliche Größe für TNA-Fragmente verwendet. Zu Beispielen für spezifische TNA-Sequenzen, die nachgewiesen werden können, gehören Sequenzen, die zu PNA-Sequenzen komplementär sind, die hier zum Nachweis von normalen zellulären, abnormalen zellulären (z. B. in aktivierten Onkogenen, integrierten fremden Genen, genetisch defekten Genen) und pathogenspezifischen Nucleinsäuresequenzen, für die spezifische Nucleinsäure-Bindungsproteine bekannt sind oder die gemäß hier beschriebenen Verfahren hergestellt werden können, beschrieben werden. In 7 ist eine spezifische, mit HIV in Zusammenhang stehende TNA als SEQ ID NO: 37 dargestellt.
  • 4. Verlängerungen der PNA unter Verwendung von BNAs, deren Herstellung und Signalamplifikation.
  • Unter Hybridisierungsbedingungen können BNAs addiert werden, die mit den PNAs, PNA-BNA-Hybriden, BNAs und/oder BNA-BNA-Hybriden hybridisieren. Die vorerwähnten Additionen können in nicht-vektorialer, polymerer Weise oder in vektorialer Weise mit einer bekannten Ordnung von BNAs vorgenommen werden.
  • In 2a wird ein einfacher Booster vorgestellt. Ein Booster-Polymeres wird durch Addition von zwei BNAs gemäß Darstellung in 2a (Ib und Ic), die bei Kombination mit der PNA unter Hybridisierungsbedingungen PNA-BNA-BNA-Hybride bilden, die aus der PNA und "Booster"-Verlängerungen bestehen, wie in 2a (IIa, IIb, IIc und IId) dargestellt ist, wobei mindestens eine ungepaarte 1/2-BBR-Sequenz verbleibt. Jede ungepaarte 1/2-BBR-Sequenz gemäß Darstellung in 2a (IIa, IIb, IIc, IId) kann mit zusätzlichen BNAs unter Bildung von zusätzlichen "Booster"-Verlängerungen hybridisieren. Jede ungepaarte 1/2-BBR-Sequenz gemäß Darstellung in 2a (IIa, IIb, IIc und IId) kann mit addierten HNAs hybridisieren, wie in 2a (IIIa und IIIb) dargestellt. Die Hybridisierung der HNAs, die nicht mit zusätzlichen BNAs hybridisieren können, bewirkt eine "Maskierung" der Addition der BNAs an die PNA, wie in 2a (IVa, IVb, IVc und IVd) dargestellt.
  • Gemäß 2b ist es möglich, die Reihenfolge und die Komponenten der Verlängerungen an der PNA zu steuern und zu spezifizieren. Wenn eine einzelne BBR erforderlich ist, wird eine HNA, die die komplementäre Sequenz zur 1/2-BBR in der PNA enthält, an die PNA addiert, um eine einzelne BBR zu erzeugen und um etwaige "Booster"-Verlängerungen an der PNA zu maskieren. Wenn zusätzliche BBRs an die PNA zu addieren sind, kann eine kontrollierte Verlängerung der PNA erreicht werden.
  • Unter Bezugnahme auf 2b wird ein einfacher Booster vorgestellt. Eine vektorielle Polymererweiterung wird durch Addition einer BNA, die spezifisch für die PNA ist, erreicht, wie in 2b (Ia und IIa) dargestellt, die bei Kombination unter Hybridisierungsbedingungen mit der PNA zur Bildung von PNA-BNA-BNA-Hybriden führt, die aus der PNA und den "Booster"-Erweiterungen bestehen. Diese Erweiterungen sorgen bei Markierung mit einer OSA zur starken Amplifikation eines Signals, das bei Bindung einer PNA an eine TNA in einer Probe entsteht. Ferner wird durch Bindung von markierten BNAs an die BBRs im Polymeren eine zusätzliche Amplifikation erreicht.
  • Zur Herstellung der BNAs kann eine Anzahl von Verfahren herangezogen werden, wozu beispielsweise ein Synthese durch bekannte chemische Verfahren oder rekombinante DNA-Herstellungsverfahren gehören. Beim letztgenannten Verfahren lässt sich eine im wesentlichen unbegrenzte Anzahl an BNAs in einfacher und billiger Weise herstellen, indem man beispielsweise in Prokaryonten (z. B. E. coli) eine Plasmid-DNA mit mehrfachen Wiederholungen der spezifischen BNA-Sequenzen, die von Restriktionsstellen mit überhängenden Enden flankiert sind, erzeugt. Auf diese Weise lassen sich beispielsweise die linken oder rechten Operatorstellen des lambda-Bacteriophagen oder eine beliebige andere DNA oder andere Nucleinsäuresequenz, von der bekannt ist, dass sie spezifisch und fest an eine bestimmte BBA, z. B. ein DNA- oder RNA-Bindungsprotein, bindet, in einer im wesentlichen unbegrenzten Anzahl von Kopien erzeugen, wobei jede Kopie von einer EcoRI-, PstI-, BamHI- oder einer beliebigen anderen Stelle einer Anzahl von weiteren üblichen Restriktionsnuclease-Stellen flankiert ist. Alternativ kann ein Polymeres an wiederholten Stellen durch einzigartige Restriktionsstellen, die innerhalb des Polymeren nicht vorliegen, ausgeschnitten werden. Große Mengen an pBR322, pUC-Plasmid oder einem anderen Plasmid mit mehrfachen Kopien dieser Sequenzen werden nach bekannten Verfahren hergestellt, das Plasmid wird mit dem Restriktionsenzym an der Flanke der Polymerisationsstelle geschnitten und die freigesetzten mehrfachen Kopien der Operatoren werden entweder durch Chromatographie oder durch andere zweckmäßige, aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren isoliert. Die BNA wird sodann vor der Verwendung einer Strangtrennung unterzogen und ist sodann für die Polymerisation an eine PNA, die für eine einzelsträngige, komplementäre Kopie des Operators als eine 1/2-BBR kodiert, zugänglich. Die BNAs können vektoriell an der PNA polymerisiert werden, wobei man sich verschiedener Restriktionsenzyme bedient, die jede Wiederholungseinheit des Polymeren im Plasmid, das zur Herstellung der mehrfachen Kopien der BNA verwendet wird, flankieren. Alternativ kann das BNA-Polymere mit der PNA über Überhänge an einem oder beiden Enden des BNA-Polymeren hybridisiert werden, ohne dass eine Strangtrennung und Anlagerung der einzelnen BNA-Seqmente erforderlich ist. Beispiele für spezifische BNA-Sequenzen sind im vorstehenden Abschnitt mit der Bezeichnung "Beschreibung der Sequenzen" als SEQ ID NOs: 35–36 angegeben. Zur Stabilisierung des BNA-Polymeren kann DNA-Ligase verwendet werden, um die hybridisierten BNAs kovalent zu verknüpfen.
  • Haarnadelnucleinsäuren (HNAs) und ihre Herstellung.
  • Die hier beschriebenen HNAs umfassen mindestens zwei miteinander verbundene Hauptteile. Eine einzelsträngige Sequenz, die komplementär zu einer 1/2-BBR ist, und eine doppelsträngige Nucleinsäureregion, die unter Hybridisierungsbedingungen durch Selbstassoziation der selbstkomplementären Sequenzen innerhalb der HNA gebildet wird. Gemäß 1 (IIc) der Zeichnungen kann die 1/2-BBR in der HNA so konstruiert werden, dass sie komplementär zur 1/2-BBR-Sequenz in der PNA ist. Gemäß 1 (I, IIc und IIIc) der Zeichnungen bildet die vorerwähnte HNA bei Addition unter Hybridisierungsbedingungen an die PNA ein PNA-HNA-Hybrid mit einem Gehalt an einer BBR. Gemäß 1 (IIIc, IVc und Vc) der Zeichnungen kann ein PNA-HNA-Hybrid unter Hybridisierungsbedingungen bei Addition an die TNA ein TNA-PNA-HNA-Hybrid mit einem Gehalt an einer TBR und einer BBR bilden.
  • Gemäß 2a und 2b können die HNAs zur "Maskierung" oder zur Termination der Addition von BNA-Verlängerungen an die PNA verwendet werden. Die beiden BNAs in 2a (Ib und Ic) können miteinander unter Bildung des in 3 (IVb) dargestellten Hybrids assoziieren oder direkt und individuell mit der PNA hybridisieren, wie in 2a (Ia-c, IIa-d) dargestellt. Die beiden HNAs (in 2a (IIIa und IIIb) dargestellt) können die Hybridisierung der BNA an weitere BNAs, die sich von der PNA aus erstrecken, beenden, wie in 2a (IVa-d) dargestellt. Die HNA in 2a (IIIa) kann die PNA-BNA-Hybride beenden, wie in 2a (IIb und IId) dargestellt, sowie jegliches PNA-BNA-Hybrid mit einer einzelsträngigen 1/2-BBR, die komplementär zu der 1/2-BBR in der HNA ist, wie in 2a (IIIa) dargestellt. Gleichermaßen kann die in 2a (IIIb) dargestellte HNA die PNA-BNA-Hybride gemäß Darstellung in 2a (IIa und IIc) und beliebige PNA-BNA-Hybride mit zwei einzelsträngigen 1/2-BBRs, die komplementär zu den 1/2-BBRs in der in 2a (IIIb) dargestellten HNA sind, beenden.
  • HNAs werden konstruiert, die die PNA-BNA-Hybride beenden, die durch die sequenzielle Addition von BNAs an die PNA gemäß Darstellung in 2b konstruiert werden. Die einzelsträngigen 1/2-BBR-Sequenzen, die in 2b (Ia, IIIa, Va und VIIa) dargestellt sind, sind spezifisch komplementär zu den einzelsträngigen 1/2-BBR-Sequenzen, die in 2b (Ib, IIIb, Vb und VIIb) dargestellt sind, und erzeugen einzigartige, maskierte PNA-BNA-HNA-Hybride gemäß Darstellung in 2b (Ic, IIIc, Vc und VIIc).
  • Die selbstkomplementären Sequenzen in der HNA und die Schleifensequenz, die die selbstkomplementären Haarnadelsequenzen verknüpft, können beliebige Zusammensetzungen und Längen aufweisen, sofern sie nicht in wesentlichem Umfang die Präsentation der einzelsträngigen 1/2-BBR, die Bestandteil der HNA ist, durch die HNA stören oder hemmen oder selektiv die BBA oder die TBA binden. Die Schleifensequenzen sollen so ausgewählt werden, dass die Bildung der Schleife die Bildung der Haarnadel nicht stört. Als ein Beispiel für eine derartige HNA, die sich bei dieser Anwendung eignet, wird SEQ ID NO: 44 vorgelegt (vergl. die vorstehende Beschreibung von Sequenzen).
  • 6. Zielbindungsanordnungen (TBAs) und deren Herstellung.
  • Bei einer TBA kann es sich um eine beliebige Substanz handeln, die eine bestimmte TBR bindet, die durch Hybridisierung bestimmter TNAs und PNAs gebildet worden sind, mit der Maßgabe, dass die TBA die folgenden Eigenschaften aufweisen muss:
    • (a) Die TBA muss an TBR(s) in einer Weise binden, die hochgradig spezifisch für die TBR(s) von Interesse ist. Dies bedeutet, dass die TBA zwischen TBRs, die im TNA-PNA-Hybrid vorhanden sind, und ähnlichen Duplexsequenzen, die durch PNA-CNA-Hybride gebildet werden, unterscheiden muss. Die TBA muss an das PNA-CNA-Hybrid mit einer ausreichend geringen Avidität binden, dass beim Waschen des TBA-TNA-PNA-Komplexes das PNA-CNA-Hybrid verdrängt wird und das PNA-TNA-Hybrid nicht verdrängt wird.
    • (b) Die TBA muss in reaktionsfreudiger Weise die TBR(s) die durch die Hybridisierung der TNA mit der PNA erzeugt worden sind, binden. Bindungsaffinitäten im Bereich von 10-5 bis etwa 10-12 oder mehr werden im allgemeinen als ausreichend angesehen. Wie nachstehend ausgeführt, kann es in einigen Fällen erstrebenswert sein, eine bestimmte TBA zu verwenden, die eine sehr geringe Avidität für eine bestimmte TBR aufweist, die aber eine ausreichend erhöhte Affinität aufweist, wenn eine bestimmte Konfiguration von mehrfachen TBRs bereitgestellt wird, so dass das Quadrat der Affinität der TBA für jede TBR zu der Affinität wird, die für die bestimmte TBA relevant ist.
  • Zu Beispielen für DNA-Bindungskomponenten, die sich bei der Bildung von TBAs eignen, gehören (ohne Beschränkung hierauf) NF-kB, Papillomavirus-E2-Protein, Transkriptionsfaktor SP1, inaktive Restriktionsenzyme, Antikörper und dergl. Von jedem dieser Proteine ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass es Sequenzen enthält, die bestimmte Nucleinsäuresequenzen binden, wobei die Affinitäten dieser Wechselwirkungen bekannt sind. Natürlicherweise ist das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Verwendung dieser bekannten DNA-Bindungsproteine oder Fragmente davon beschränkt. Aus der vorliegenden Beschreibung ist es für den Fachmann ersichtlich, dass das vorliegende Verfahren leicht auf den Einsatz neuer TBAs, die mindestens die vorerwähnten erforderlichen Merkmale aufweisen, angewandt werden kann. So ist beispielsweise in WO-92/20698 ein sequenzspezifisches DNA-Bindungsmolekül beschrieben, das ein Oligonucleotid-Konjugat umfasst, das durch kovalente Bindung eines DNA-Bindungsarzneistoffes an ein triplexbildendes Oligonucleotid bindet. Das Verfahren dieser Druckschrift kann zur Herstellung neuer TBAs verwendet werden, die im vorliegenden Verfahren eingesetzt werden können, vorausgesetzt, dass die auf diese Weise gebildeten TBAs die vorerwähnten Kriterien erfüllen. Ferner können die Verfahren der US-Patente 5 096 815 und 5 198 346 sowie von WO-88/06601 zur Erzeugung neuer TBAs, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, herangezogen werden. Spezielle Antikörper oder Teile davon können eingesetzt werden (vergl. beispielsweise Blais, 1994).
  • Wenn es sich bei der TBA um ein Protein oder um einen Komplex von Proteinen handelt, ist es ersichtlich, dass beliebige Verfahren aus einer Anzahl von routinemäßigen Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, zur Herstellung der TBA eingesetzt werden können. Die TBA kann aus ihrer natürlich vorkommenden Umgebung in der Natur isoliert werden oder sie kann, wenn dies unzweckmäßig ist, durch übliche Techniken der Molekularbiologie erzeugt werden. Wenn man NF-kB als Beispiel heranzieht, so kann unter Verwendung der DNA-Bindungsbereiche mit p50- oder p65-Untereinheiten diese Bindungsanordnung nach rekombinanten Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind hergestellt werden (vergl. beispielsweise Ghosh, Cell, Bd. 62 (1990), S. 1019–1029, der die Klonierung der p50-DNA-Bindungsuntereinheit von NF-kB und die Homologie dieses Proteins zu rel und dorsal beschreibt).
  • Es sind zahlreiche DNA- und andere Nucleinsäure-Bindungsproteine bekannt, die als oder in erfindungsgemäßen TBAs verwendet werden können. Nachdem die Aminosäuresequenz einer beliebigen DNA-, RNA:DNA-, RNA- oder anderen Nucleinsäure-Bindungsproteinen bekannt ist, kann eine geeignete DNA-Sequenz, die für das Protein kodiert, entweder durch synthetische Maßnahmen hergestellt werden oder es kann eine cDNA-Kopie der mRNA, die für das Protein kodiert, aus einer geeigneten Gewebequelle verwendet werden. Ferner können genomische Kopien, die für das Protein kodieren, erhalten werden und Introns können daraus herausgespleisst werden, wobei man sich bekannter Verfahren bedient. Ferner lassen sich die TBAs auf chemischem Wege synthetisieren.
  • Nachdem eine geeignete Kodierungssequenz erhalten worden ist, kann eine positionsgerichtete Mutagenese durchgeführt werden, um die kodierte Aminosäuresequenz zu verändern und mutante Nucleinsäure-Bindungsproteine herzustellen, die im Vergleich zum ursprünglichen Nucleinsäure-Bindungsprotein erstrebenswertere Bindungseigenschaften aufweisen. Als ein Beispiel für dieses Verfahren kann die Aminosäuresequenz der DNA-Bindungsbereiche von NF-kB so verändert werden, dass ein NF-kB'-Molekül erzeugt wird, das eine engere Bindung mit der NF-kB-Bindungsstelle eingeht (vergl. die nachstehenden Beispiele – HIV-Nachweis und HIV-Sperre).
  • Um einen tieferen Einblick in diesen Aspekt der Erfindung zu gewinnen, wird auf folgende Überlegungen hingewiesen. Unter Verwendung von NF-kB als Beispiel lässt sich eine TBA unter Verwendung des natürlich auftretenden NF-kB-Moleküls herstellen. Da jedoch dieses Molekül in Zellen in verschwindend geringen Mengen vorliegt und da die Untereinheiten dieses DNA-Bindungsproteins kloniert worden sind, wäre es vernünftiger, große Mengen des Komplexes über rekombinante DNA-Maßnahmen herzustellen, wie es bereits für dieses Protein durchgeführt worden ist (vergl. beispielsweise Ghosh, Cell, Bd. 62 (1990), S. 1019–1029). NF-kB ist ein pleiotroper Induktor von Genen, der an immunologischen, entzündlichen und wachstumsregulatorischen Reaktionen auf primäre pathogene (virale, bakterielle oder stressbedingte) Belastungen oder sekundäre pathogene (entzündliches Cytokin) Belastungen beteiligt ist. NF-kB ist ein dimeres DNA-Bindungsprotein, das eine p50- und eine p65-Untereinheit umfasst, die beide mit spezifischen DNA-Sequenzen in Kontakt stehen und diese binden. In einem inaktivierten Zustand befindet sich NF-kB im zellulären Zytoplasma, komplexiert mit einem spezifischen Inhibitor, 1-kB, unter Bildung eines zytoplasmatischen Heterotrimeren. Bei Aktivierung wird der Inhibitor entkomplexiert und das p50-p65-Dimere positioniert sich über ein spezifisches nukleares Lokalisierungssignal (NLS) wieder in den Zellkern, wo es DNA binden kann und seine Rolle als ein transkriptioneller Aktivator von zahlreichen Genen ausüben kann (vergl. Grimm and Baeuerle, Biochem. J., Bd. 290 (1993), S. 297–308, bezüglich eines Übersichtsartikels über den Stand der Technik im Hinblick auf NF-kB).
  • Das p50-p65-Dimere bindet mit picomolarer Affinität an Sequenzen, die mit dem Konsensus GGGAMTNYCC (SEQ ID NO: 117) übereinstimmen, wobei geringfügig unterschiedliche Affinitäten von der exakten Sequenz abhängen. Es ist bemerkenswert, dass das Auftreten von Homodimeren von p50 und p65 ebenfalls beobachtet worden ist. Diese Homodimeren weisen unterschiedliche biochemische Eigenschaften sowie geringfügig unterschiedliche Affinitäten für Bindungssequenzen innerhalb des vorstehenden Konsensus und ähnlich zum vorstehenden Konsensus auf. Somit können je nach den erwünschten Bindungseigenschaften der TBA ein p50-p65 Heterodimeres, ein p50-p50-Homodimeres oder ein p65-p65-Homodimeres oder Fragmente der vorerwähnten Dimeren verwendet werden.
  • Ein Weg, gemäß dem verschiedene neue TBAs erzeugt werden können, ist schematisch in 9 dargestellt. Die Nucleinsäure-Erkennungseinheiten der TBA können mit ähnlichen oder unähnlichen TBA-Nucleinsäure-Erkennungseinheiten über einen "Begleiter" zusammengesetzt und assoziiert werden. Beim Begleiter handelt es sich um eine Struktur, an dem verschiedene TBA-Erkennungselemente angebaut sind und der den Nucleinsäure-Erkennungseinheiten erstrebenswerte Eigenschaften verleiht. Der Begleiter besteht aus einer beliebigen Sequenz, die solche Anordnungssequenzen ergibt, dass gleiche oder verschiedene Nucleinsäure-Erkennungseinheiten in eine enge und stabile Assoziation zueinander gebracht werden. Somit wird beispielsweise im Fall einer TBA, die zur engen Bindung an NF-kB-TBRs konzipiert ist, eine TBA zusammengebaut, indem man lambda-cro-Sequenzen als Anordnungssequenzen bereitstellt, die mit Nucleinsäure-Bindungssequenzen entweder für NF-kB-p50 oder -p65 verknüpft sind. Die p50- oder p65-Nucleinsäure-Bindungssequenzen sind mit den cro-Sequenzen entweder am Carboxy- oder am Aminoterminus von cro und entweder am Carboxy- oder Aminoterminus der Nucleinsäure-Erkennungseinheit von p50 oder p65 verknüpft. Die Verknüpfungssequenzen werden gegebenenfalls bereitgestellt, um einen geeigneten Abstand der Nucleinsäure-Erkennungseinheiten für eine optimale TBR-Bindung zu ermöglichen.
  • Die Anordnungssequenzen, die vorstehend beispielhaft durch die cro- und CI-Sequenzen (SEQ ID NOs: 104–108) beispielhaft belegt worden sind, umfassen beliebige stabile Oligopeptide, die in natürlicher und fester Weise an ähnliche Sequenzen binden. Somit ist es im Fall von cro bekannt, dass ein Dimeres von cro an die lambda-Bacteriophagen-Operatorstellen bindet (Anderson et al., Nature, Bd. 290 (1981), S. 754–758; Harrison und Aggarwal, Am. Rev. Biochem., Bd. 59 (1990), S. 933–969). Die Monomereinheiten von cro unterliegen einer engen und spezifischen Assoziation miteinander. Somit wird durch Verknüpfung von DNA-Erkennungseinheitssequenzen mit den cro-Sequenzen eine enge und feste Assoziation erreicht.
  • Die optischen Linkersequenzen umfassen eine beliebige Aminosäuresequenz, die den TBA Zusammenbau oder die Nucleinsäurebindung nicht stört und die nicht so labil ist, dass die Nucleinsäure-Erkennungseinheit aus der vollständigen TBA freigesetzt wird. Es ist erstrebenswert, jedoch nicht erforderlich, dass die Linkersequenzen kovalent mit anderen Bindungsanordnungskomponenten verknüpft sind. Die Assoziation soll spezifisch sein, so dass der Zusammenbau und die Herstellung der Bindungsanordnungen unterstützt wird. Zu Beispielen für derartige Sequenzen gehören (ohne Beschränkung hierauf) bekannte Sequenzen, wie sie zur Verknüpfung verschiedener Domänen in strukturellen Proteinen auftreten. Beispielsweise befindet sich im lambda-Repressorprotein eine Verknüpfungssequenz zwischen der DNA-Bindungsdomäne und der Dimerisationsdomäne, die sich für diesen Zweck eignet. Es sind zahlreiche weitere Sequenzen bekannt, wobei die genaue Sequenz für die Erfindung nicht kritisch ist, vorausgesetzt, dass eine routinemäßige experimentelle Prüfung durchgeführt wird, um die Stabilität und das störungsfreie Verhältnis zur Zielnucleinsäurebindung zu gewährleisten. Beispiele für derartige Sequenzen werden hier als MetSer und SEQ ID NOs: 99–102 bereitgestellt. Die Insertion von spezifischen, bekannten Proteolysestellen in diese Linker fällt ebenfalls unter den Umfang der Erfindung. Die Anwesenheit derartiger Stellen in den Linkersequenzen bietet Herstellungsvorteile, die es ermöglichen, verschiedene Moleküle am Begleitergerüst zusammenzubauen.
  • Neben den Nucleinsäure-Erkennungsstellen, fakultativen Verknüpfungssequenzen und Anordnungssequenzen weisen die erfindungsgemäßen neuen TBAs gegebenenfalls Asymmetrie- oder Pilot-TNA-Sequenzen und eine oder mehrere OSA-Einheiten auf. Die Asymmetriesequenzen werden bereitgestellt, um bestimmte erwünschte oder unerwünschte Assoziationen zu begünstigen oder zu verhindern. Beispielsweise werden für den Fall, dass eine TBA mit homodimeren p50-DNA-Erkennungseinheiten erwünscht ist, die Asymmetriesequenzen bereitgestellt, um die natürliche stärkere Assoziation von NF-kB-p50-Untereinheiten und -p65-Untereinheiten aufzubrechen, während die Anordnungssequenzen nicht daran gehindert werden, p50-Untereinheiten zusammenzubringen. Beispiele für derartige Sequenzen sind als SEQ ID NOs: 85–92 und SEQ ID NOs: 105 und 106 angegeben.
  • In einer unterschiedlichen Konfiguration werden NF-kB-p50-Untereinheitssequenzen in enge Assoziation mit Transkriptionsfaktor-SP1-DNA-Erkennungseinheitssequenzen gebracht. Dies ist für den Fall erwünscht, dass ein NF-kB-SP1-Bindungsmotiv von Bedeutung ist, wie bei HIV-LTR, wo ein Motiv mit mindestens sechs DNA-Bindungsprotein-Erkennungsstellen, zwei NF-kB-Stellen, drei SP1-Stellen und einer TATA-Stelle bekanntlich vorhanden sind. Da es ferner bekannt ist, dass die zweite NF-kB-Stelle und die erste SP1-Stelle von Bedeutung für die Regulation der HIV-Transkription sind (Perkins et al., Embo J., Bd. 12 (1993), S. 3551–3558), eignet sich diese bestimmte Konfiguration von TBA nicht nur beim Nachweis von HIV, sondern auch als Therapeutikum oder Prophylaktikum gegen HIV-Infektionen (vergl. die nachstehenden Ausführungen). Auf ähnliche Weise kann die lange Kontrollregion (LCR) von humanem Papillomavirus als Schlüsselkontrollregion zur erfindungsgemäßen Sondenbehandlung eingesetzt werden.
  • Im Hinblick auf die verschiedenen Elemente, die gemäß diesem Verfahren der TBA-Bildung kassettenartig assoziiert werden können, wird eine im wesentlichen unbegrenzte Vielzahl von TBAs erzeugt. In 10 werden eine Reihe von verschiedenen Molekülen mit der Bezeichnung "HIV-detect-I-IV" beispielhaft aufgeführt, wobei "CHAP" den Begleiter bedeutet, "nfkb" NF-kB-Untereinheiten bedeutet, "sp1" die Nucleinsäureerkennungseinheit des SP1-Transkriptionsfaktors bedeutet und "TATA" ein Dimeres der DNA-Erkennungseinheit eines TATA-Sequenz-DNA-Bindungsproteins (TBP), auch bekannt als TATA-Bindungsprotein oder TBP, bedeutet.
  • Diese Konfigurationen werden nachstehend beispielhaft erläutert und gehören alle als integrierende Bestandteile zur vorliegenden Erfindung.
  • In einer weiteren Konfiguration ist die in 9 dargestellte modulare Struktur zum Nachweis oder zur Behandlung oder zur Prophylaxe eines vollständig unterschiedlichen Pathogens geeignet. Gemäß 11 wird auf ähnliche Weise wie bei den vorstehend beschriebenen "HIV-detect-I-IV"-Molekülen eine Reihe von "HPV-Detect I-IV"-Molekülen erzeugt. Bei dieser Ausführungsform nützt man in vorteilhafter Weise die DNA-Bindungseigenschaften des E2-Proteins von humanem Papillomavirus (HPV) aus. Ferner werden die Rollen von SP1 und TBP ausgenützt, indem man spezifische DNA-Erkennungseinheiten bereitstellt, die dazu geeignet sind, diese Sequenzen im HPV-Genom zu binden. Bei der Bildung der E2-spezifishen TBAs zur Verwendung beim Nachweis einer HPV-Infektion kann es erstrebenswert sein, beliebige der Sequenzen SEQ ID NOs: 75–84 oder 93–98 als E2-DNA-Erkennungseinheiten zu verwenden. Eine TBA mit einem Gehalt an einer bovinen dimeren E2-DNA-Bindungsdomäne und einer humanen dimeren E2-DNA-Bindungsdomäne kann besonders wertvoll sein.
  • Die vorstehend beschriebenen verschiedenen Sequenzen können entweder unter Verwendung von reinen Oligopeptid-Ausgangsmaterialien chemisch verknüpft werden oder sie können durch Bereitstellung von rekombinanten Nucleinsäuren, die über den bekannten genetischen Code die verschiedenen Subelemente kodieren, verknüpft werden. Im Falle einer rekombinanten Erzeugung ist eine Verknüpfung von cro-Kodierungssequenzen mit Sequenzen von Nucleinsäure-Erkennungseinheiten unter Bildung von TBAs vorteilhaft, da cro im Begleiter nicht nur als eine Aufbausequenz wirkt, sondern auch die einwandfreie Faltung der Nucleinsäure-Erkennungselemente dirigiert. Beispielhafte Sequenzen für Begleiter sind als SEQ ID NOs: 104–108 angegeben. Ferner ermöglicht für den Fall, dass Strukturen höherer Ordnung mit einem Gehalt an mehrfachen Bindungsstellen angestrebt werden, wie es bei pentameter NF-kB/NF-kB/SP1/SP1/SP1-TBA der Fall ist, eine geeignete Konstruktion der Asymmetriesequenzen, dass derartige Strukturen hergestellt werden können.
  • Auf die vorgenannte Weise werden TBAs hergestellt, die ihre verwandten Bindungsstellen mit hoher Affinität binden. Beispielsweise ist zu erwarten, dass die NF-kB-DNA-Bindungskomponenten der TBAs von 10 die HIV-LTR mit einer Affinität von 10-8 bis 10-12 molar binden. Sequenzen, die sich als DNA-Erkennungseinheiten eignen, sind als SEC2 ID NOs: 63–71, 73–84, 93–98 und 104–108 angegeben und werden nachstehend beispielhaft erläutert.
  • Im Hinblick auf die vorstehende Beschreibung des dirigierten Zusammenbaus von Nucleinsäure-Bindungsproteinen und bei Verwendung von Anordnungs- und Asymmetrie-(oder Pilot)-Sequenzen ist es für den Fachmann ersichtlich, dass erfindungsgemäß ein allgemein anwendbares Verfahren zum Zusammensetzen von Proteinstrukturen bereitgestellt wird. Die Allgemeingültigkeit dieses Verfahrens wird ferner anhand eines weiteren Beispiels durch Berücksichtigung der Verwendung einer Antikörper-Epitop-Wechselwirkung beim Zusammenbau von angestrebten Strukturen nachgewiesen. Aufgrund der Spezifität kann eine DNA-Bindungsproteinstruktur zusammengesetzt werden, indem man eine NF-kB-p50-Untereinheit mit einem Antigen, z. B. einem zirkularisierten (über Disulfidbindungen) Melanozyten-stimulierenden Hormon (MSH), verknüpft. Dieses pro-MSH-Molekül kann sodann durch einen anti-MSH-Antikörper gebunden werden, um eine neue Nucleinsäure-Bindungsanordnung bereitzustellen, wobei das Antigen und der Antikörper als Anordnungssequenzen wirken.
  • Die in 9 dargestellte modulare Struktur zeigt, dass eine große Vielzahl von TBAs unter Verwendung verschiedener Kombinationen von Komponenten zusammengesetzt werden können. Somit sind repräsentative Ausführungsformen dieser allgemeinen Struktur als SEQ ID NOs: 109–116 angegeben.
  • 7. Booster-Bindungsanordnungen (BBAs) und deren Herstellung.
  • Bei einer BBA kann es sich um eine beliebige Substanz handeln, die eine bestimmte BBR, die durch Hybridisierung von bestimmten PNAs und BNAs gebildet worden ist, bindet, einschließlich dann, wenn mehrfache BNAs (bis zu und einschließlich "n" BNAs, d. h. BNAn, wobei "n" theoretisch 0–∞ bedeutet, in der Praxis aber etwa 1 bis 100 beträgt) an die PNA für die Signalamplifikation polymerisiert werden, vorausgesetzt, dass die BBA die folgenden Eigenschaften aufweist:
    • (a) Die BBA muss die BBRs in einer Weise binden, die hochgradig spezifisch für die BBR von Interesse ist. Dies bedeutet, die BBA muss zwischen BBRs, die im PNA-BNA-Hybrid vorhanden sind, und ähnlichen Duplexsequenzen in BNA-CNA-Hybriden oder anderen CNAs unterscheiden. Sogar für den Fall, dass eine einzelne Basenfehlpaarung oder Konformationsunterschiede mit oder ohne Basenfehlpaarungen bei der Herstellung des PNA-BNAn- oder PNA-BNAn-HNA-Hybrids aufgetreten sind, muss die BBA das Hybrid mit einer ausreichend geringen Avidität binden, dass beim Waschen des TBA-TNA-PNA-BNAn-Komplexes die BBA von den CNA-Sequenzen verdrängt wird, jedoch nicht die BBR-Sequenzen.
    • (b) Die BBA muss in reaktionsfreudiger Weise die BBRs) binden. Bindungsaffinitäten im Bereich von 10-5 bis etwa 10-9 oder mehr werden im allgemeinen als ausreichend angesehen.
  • Zu Beispielen für BBAs gehören (ohne Beschränkung hierauf) cro und das lambda-Bacteriophagen-Repressorprotein CI. Ferner wird auf das US-Patent 4 556 643 verwiesen, worin weitere DNA-Sequenzen und spezifische Bindungsproteine, wie Repressoren, Histone, DNA-Modifikationsenzyme und Katabolitgen-Aktivatorprotein, vorgeschlagen werden. Verwiesen wird auch auf EP-0 453 301, wo darauf hingewiesen wird, dass eine Vielzahl von für Nucleotidsequenzen spezifischen Bindungsproteinen (NSSBPs), wie der Tetracyclin-Repressor, der Iac-Repressor und der Tryptophan-Repressor, existieren. Von jeder dieser BBAs ist es aus dem Stand der Technik bekannt, dass sie bestimmte, bekannte Nucleinsäuresequenzen bindet. Ferner sind die Affinitäten dieser Wechselwirkungen bekannt. Natürlicherweise ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Verwendung dieser bekannten BBAs beschränkt. Aufgrund der vorliegenden Beschreibung kann der Fachmann leicht die Verwendung neuer BBAs, die mindestens die vorstehend geschilderten notwendigen Eigenschaften aufweisen, für das vorliegende Verfahren einsetzen.
  • Zu Beispielen für neue BBAs, die für diesen Aspekt der Erfindung geeignet sind, gehören neue Proteine auf der Grundlage des Motivs eines bekannten DNA- oder RNA- oder DNA:RNA-Bindungsproteins, wie cro oder das lambda-CI-Repressorprotein. Vorzugsweise werden derartige Modifikationen vorgenommen, um die Handhabung dieser erfindungsgemäßen Komponenten zu verbessern. So kann es erstrebenswert sein, eine hohe Konzentration an cro einem Test zuzusetzen. Eine der negativen Eigenschaften von cro besteht darin, dass bei hohen Konzentrationen die Bindung von cro an sein DNA-Ziel in Konkurrenz mit cro-cro-Wechselwirkungen tritt. Somit kann beispielsweise ein begleitetes oder mutiertes cro hergestellt werden, das nicht mit diesem Nachteil behaftet ist. Zu Beispielen für derartige veränderte Begleiter gehören SEQ ID NOs: 105–106 und 108. Aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren, wie die Herstellung von neuen Zielbindungsproteinen unter Verwendung verschiedenartiger Populationen von Nucleinsäuren und die Auswahl einer Bacteriophagen-Bindung an bestimmte, vorgewählte Ziele (sogenannte Phagen-Display-Technik, vergl. die Erörterung zur Herstellung neuer TBAs), können dazu herangezogen werden, derartige neue BBAs sowie die vorerwähnten neuen TBAs herzustellen.
  • Wenn es sich bei der BBA um ein Protein oder um einen Komplex von Proteinen handelt, ist es ersichtlich, dass zahlreiche routinemäßige Verfahren aus dem Stand der Technik zur Herstellung der BBA verwendet werden können. Die BBA kann aus ihrer natürlichen Umgebung isoliert werden oder, wenn dies unzweckmäßig ist, kann sie durch übliche Techniken der Molekularbiologie isoliert werden. So ist beispielsweise die Sequenz des cro-Proteins bekannt und ein beliebiger Molekülklon des lambda-Bacteriophagen kann dazu herangezogen werden, geeignete Nucleinsäuren zu erhalten, die für cro kodieren, um dessen rekombinante Erzeugung zu ermöglichen. Ferner können die hier beschriebenen TBAs als BBAs verwendet werden, vorausgesetzt, dass verschiedene TBAs zur Bindung von TBRs und BBRs eingesetzt werden.
  • 8. Verwendung von BBAs und BBRs zur Lokalisation und zur Amplifikation der Lokalisation der PNA-TNA-TBA-Komplexe (vergl. 8).
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die hochgradig spezifische und äußerst enge Bindung von TBAs, die aus Nucleinsäure-Bindungskomponenten bestehen, zur Bereitstellung eines amplifizierbaren Nucleinsäure-Sandwichtests verwendet. Gemäß einem Aspekt dieser Ausführungsform wird ein fester Träger mit einer ersten TBA beschichtet, wodurch eine immobilisierte TBA erzeugt wird. In Lösung werden eine PNA und eine TNA unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht und sodann mit der immobilisierten TBA kontaktiert. Nur die PNA-TNA-Wechselwirkungen, die die spezifische TBR bilden, die durch die immobilisierte TBA erkannt wird, werden beim Auswaschen der festen Oberfläche, die den TBA-TBR-Komplex bindet, zurückgehalten.
  • Der Nachweis der gebundenen TBR wird durch Bindung von Booster-Nucleinsäuren, BNAs, an die 1/2-BBRs, die an den PNAs unter Hybridisierungsbedingungen vorhanden sind, erreicht. Auf diese Weise kann selbst dann, wenn nur ein einziger TBA-TBR-Komplex an der immobilisierten TBA gebunden ist, ein starkes, amplifiziertes Signal durch Polymerisation von mehrfachen BNAs an der immobilisierten TNA erzeugt werden. Jede BNA, die an die TNA bindet, bildet eine BBR, die durch BBAs gebunden werden kann, die wie die an der festen Oberfläche immobilisierten TBAs in Bezug auf ihre sehr enge und spezifische Bindung an bestimmten Nucleinsäurestrukturen ausgewählt werden können. Somit kann gemäß dieser Ausführungsform die immobilisierte TBA den DNA-Bindungsbereich von NF-kB enthalten, der in sehr spezifischer und enger Weise an NF-kB-Bindungsstellen bindet, die bei Hybridisierung der TNA und PNA unter Bildung einer derartigen Stelle gebildet werden.
  • Da es bekannt ist, dass NF-kB-Bindungsstellen sowohl im normalen humanen Genom als auch in langen terminalen Wiederholungssequenzen des humanen Immunschwächevirus (HIV) auftreten, stellt die Erfindung ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen den "normalen" humanen Stellen und den Stellen, die in Zellen aufgrund einer HIV-Infektion vorhanden sind, bereit. Daher können in einem Test, der zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von HIV-DNA in einer Probe von humaner DNA bestimmt ist, die HIV-NF-kB-Bindungsstellen als die TNA angesehen werden und die normalen humanen NF-kB-Bindungsstellen können als CNAs angesehen werden. Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Unterscheidung zwischen diesen TNAs und CNAs erreicht, indem man die Tatsache ausnützt, dass in der HIV-LTR zwei NF-kB-Bindungsstellen vorhanden sind, gefolgt von drei SPI-Stellen (vergl. beispielsweise Koken et al., Virology, Bd. 191 (1992), S. 968–972), während zelluläre NF-kB-Bindungsstellen mit den gleichen Sequenzen in Tandemstellung nicht auftreten.
  • In Fällen, bei denen die TNA mehr als eine 1/2-TBR enthält und es erstrebenswert ist, therapeutische und prophylaktische Anwendungen der TBAs zu verfolgen, kann es erstrebenswert sein, mehr als eine TBA zu verwenden, von denen jede die Fähigkeit hat, eine TBR im TNA-PNA-Komplex zu binden. In diesem Fall kann es vorteilhaft sein, als Komponenten der TBAs DNA-Bindungs- oder RNA-Bindungsdomänen mit einer geringeren Affinität für ihre TBR auszuwählen, als sie die Wildtyp-DNA-Bindungsdomäne oder -RNA-Bindungsdomäne aufweist. Aufgrund der Tatsache, dass die TBAs, die an der Bindung an den mehrfachen TBRs beteiligt sind, entweder vor der Bindung an ihre TBRs oder nach Bindung an ihre TBRs zusammengebaut werden, blockieren die einzelnen TBRs nicht die entsprechenden TBRs in den Genomen, die vom Zielgenom abweichen, es sei denn, die TBRs sind räumlich dazu befähigt, den zusammengebauten TBA-Komplex zu binden. Ein Merkmal der multimeren Anordnung von TBAs, das spezifisch hier als ein Bestandteil der Erfindung beansprucht wird, besteht darin, dass von einer multimeren Anordnung erwartet wird, dass sie eine wesentlich verringerte Affinität für eine einzelne Stelle innerhalb der TNA aufweist. Da jedoch die Bindung relativ zu jeder TBA drastisch erhöht ist, wäre vom TBA-Komplex zu erwarten, dass er nicht in situ um die Bindung einer einzigen TBR mit den entsprechenden nativen Proteinen konkurriert, sondern eine enge Bindung mit Sequenzen im PNA-TNA-Hybrid, das die TBRs für jede der Nucleinsäure-Bindungskomponenten, die in der TBA zusammengebaut sind, enthalten, eingeht. Der TBA-Komplex sollte so zusammengebaut und die Linker so in den einzelnen TBAs eingestellt werden, dass es möglich wird, dass die im TBA-Komplex enthaltenen Nucleinsäure-Bindungsregionen gleichzeitig diese Ziele erreichen und binden.
  • Nachdem die TNA-PNA-Hybride gebildet worden sind und mit der immobilisierten TBA in Kontakt gelangt sind, wird ungebundene Nucleinsäure von der immobilisierten Oberfläche abgewaschen und die immobilisierten Hybride werden nachgewiesen. Dies wird gemäß einem von verschiedenen Wegen erreicht. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die PNA mit einer OSA, z. B. einem Radionuclid, gefärbten Perlen oder einem Enzym, das zur Bildung eines gefärbten Reaktionsprodukts befähigt ist, markiert. Ferner kann die PNA zusätzlich zu ihrem Gehalt an einer oder mehreren 1/2-TBRs auch mindestens eine 1/2-BBR enthalten. Die 1/2-BBR-Sequenzen werden so ausgewählt, dass sie komplementär zu einzigartigen 1/2-BBR-Sequenzen in BNAs sind. Bei der vorstehend beschriebenen Ausführungsform, bei der es sich bei der TBA um NF-kB handelt und es sich bei der TBR, die bei der TNA-PNA-Hybridisierung gebildet wird, um eine oder mehrere NF-kB-Bindungsstellen handelt, können beispielsweise die 1/2-BBRs hybridisierbare (d. h. einzelsträngige, komplementäre) Sequenzen der linken oder rechten lambda-Bacteriophagen-Operatoren bereitstellen (vergl. beispielsweise Ptashne, Scientific American, Bd. 247 (1982), S. 128–140, und die darin genannten Literaturstellen bezüglich der Sequenzen für diese Operatoren). Diese Sequenzen können an den PNA-1/2-BBRs in vektormäßiger Weise polymerisiert werden (vergl. die 2 und 3), wobei bis zu "n" BBRs bereitgestellt werden und jede BBR eine cro-Bindungsstelle bildet. Enzymatisch, radioaktiv oder anderweitig markiertes cro wird mit dem TBA-TNA-PNA-(BNA)n-Komplex in Kontakt gebracht. Auf diese Weise wird ein hochgradig selektives und amplifiziertes Signal erzeugt. Das unter Verwendung einer PNA mit einer einzigen 1/2-TBR erzeugte Signal zeigt den Erfolg des Tests unter Erzielung einer TBA-TBR-Bindung und einer Polymerisation der BNAs unter Erzeugung eines Signals von zellulären Stellen (d. h. von CNAs) an. Das Fehlen eines Signals bei Verwendung einer dimerisierten TBA zeigt, dass in der TNA keine HIV-LTRs als doppelte NF-kB-Bindungsstellen vorhanden waren. Andererseits weist das Vorliegen eines Signals bei Verwendung des dimeren NF-kB auf eine HIV-Infektion hin. Ein spezielles Beispiel der vorstehenden Beschreibung dieser Ausführungsform der Erfindung findet sich in Beispiel 6, in dem ein HIV-Testkit beschrieben wird.
  • Selbstverständlich ist es für den Fachmann ersichtlich, dass die vorstehende Beschreibung verschiedenen Modifikationen in Bezug auf die Auswahl der PNAs. TNAs, TBAs, BNAs und BBAs unterzogen werden kann. Ferner ist es für den Fachmann ersichtlich, dass in von HIV abweichenden Systemen das vorstehend allgemein beschriebene Verfahren gleichermaßen angewandt werden kann. Jedoch können diese anderen Anwendungen einfacher als das vorstehend beschriebene Verfahren sein, da die verwendeten TBAs möglicherweise keine normalen zellulären Stellen erkennen und daher die Zuhilfenahme einer Dimerisierung oder anderer Verfahren zur Unterscheidung zwischen TNAs und CNAs weniger kritisch ist. Bei der Konzeption von Sonden und Bindungsanordnungen für diese anderen Systeme lässt sich der Fachmann von den folgenden Prinzipien und Überlegungen leiten.
  • Bei der vorstehend beschriebenen Ausführungsform besteht der Vorteil der Verwendung der DNA-Bindungsbereiche von NF-kB-Protein als die TBA und der NF-kB-Erkennungsbindungselemente als die TBRs darin, dass diese Elemente einen wichtigen "Kontrollpunkt" für die Replikation von HIV darstellen. Es ist nämlich bekannt, dass für HIV die Verwendung von NF-kB als ein kritisches Merkmal in seinem replikativen Lebenszyklus erforderlich ist. Ähnliche Kontrollpunkte für andere Pathogene werden ausgewählt und als Basis zum Nachweis gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet.
  • Aus der vorstehenden Beschreibung allgemeiner Merkmale der Erfindung und ihrer Anwendungsmöglichkeiten erkennt der Fachmann, dass es eine Vielzahl von speziellen Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung gibt. Beispielsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren auf Verfahren und Vorrichtungen anwendbar, bei denen chromatographische Testkits verwendet werden, die in den US-Patenten 4 690 691 und 5 310 650 (hier kurz als '691- und '650-Patente bezeichnet) beschrieben sind. Gemäß diesen Patenten wurde ein poröses Medium zur Immobilisierung entweder einer TNA oder einer Abfangsonde verwendet und ein Lösungsmittel wurde dazu eingesetzt, eine mobile Phase, die entweder eine markierte PNA enthielt, wenn die TNA immobilisiert war, oder die TNA enthielt, wenn eine Abfangsonde immobilisiert war, in die "Abfangzone" zu transportieren. Nachdem die TNA in der Abfangzone gebunden worden war, und zwar entweder durch direkte Immobilisierung oder durch Abfangen, wurde eine markierte PNA durch die Abfangzone chromatographiert und eine etwaige gebundene Markierung wurde nachgewiesen.
  • Durch Anpassung der vorliegenden Erfindung an ein derartiges System ergibt sich eine Verbesserung in Bezug auf die Verwendung einer Zielbindungsanordnung in der Abfangzone und daher das Abfangen nur von perfekt passenden TBR-Sequenzen oder anderen TBRs, die Nucleinsäure-Bestätigungen darstellen, die spezifisch durch die TBA innerhalb der TNA-PNA-Duplexe gebunden sind, und zwar aufgrund der vorstehend beschriebenen empfindlichen Unterscheidung durch die TBA zwischen TNAs und CNAs.
  • Nachdem die TNA-PMA-Hybride an die immobilisierte TBA gebunden sind, wird das Signal durch Zugabe von BNAs oder durch Chromatographie von BNAs durch die Abfangzone verstärkt. Schließlich kann das Signal weiter durch Zugabe von BBAs oder durch Chromatographie von markierten BBAs durch die Abfangzone verstärkt werden. Auf diese Weise wird die einfache Durchführung der Analysenstufen, die in den '691- und '650-Patenten beschrieben werden, verbessert, indem man die zusätzliche Möglichkeit eröffnet, die Spezifität und durch Amplifikation die Empfindlichkeit des in diesen Patenten beschriebenen Verfahrens zu erhöhen.
  • Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Mikrotiterplatten oder automatisiert ausgeführt werden kann. Die Verwendung von Maschinen, bei denen das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wird, fällt daher natürlicherweise unter den Umfang der vorliegenden Offenbarung und der beigefügten Ansprüche. Somit ist die Erfindung beispielsweise zur Verwendung in Instrumenten, wie dem IMx-Tischanalysiergerät der Fa. Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) anwendbar. Das IMx-Gerät wird derzeit zur Durchführung eines fluoreszierenden Polarisationsimmunoassays (FPZA, vergl. Kier KCLA, Bd. 3 (1983), S. 13–15) sowie eines Mikroteilchen-Enzymimmunoassays (MEZA, vergl. Laboratory Medicine, Bd. 20, 1. Januar 1989, S. 47–49) eingesetzt. Das MEZA-Verfahren lässt sich leicht in ein Nucleinsäure-Nachweisverfahren unter Anwendung der vorliegenden Erfindung umwandeln, indem man eine TBA als Abfangmolekül verwendet, das auf ein in Lösung suspendiertes Mikroteilchen von Submikrongröße (< 0,5 μm im Durchschnitt) aufgebracht ist. Die mit TBA beschichteten Mikroteilchen werden in eine Reaktionszelle pipettiert. Das IMx pipettiert sodann eine Probe (hybridisierte PNA-TNA) in die Reaktionszelle, wodurch ein Komplex mit der TBA gebildet wird. Nach einer entsprechenden Inkubationsdauer wird die Lösung auf eine inerte Glasfasermatrix übertragen, zu der die Teilchen eine starke Affinität aufweisen und an der die Mikroteilchen haften. Entweder vor oder nach Filtration des Reaktionsgemisches durch die Glasfasermatrix werden BNAs und BBAs zugegeben oder andere Signalamplifikations- und Nachweismittel verwendet, die von der spezifischen Bildung von TNA-PNA-Hybriden abhängen. Der immobilisierte Komplex wird ausgewaschen und das ungebundene Material fließt durch die Glasfasermatrix.
  • Die gebundenen Komplexe werden mittels BBAs, die mit alkalischer Phosphatase markiert sind, oder mit anderweitig markierten BBAs (radioaktiv, enzymatisch, fluoreszierend) nachgewiesen. Im Fall von mit alkalischer Phosphatase markierten BBAs kann das fluoreszierende Substrat 4-Methylumbelliferylphosphat oder ein ähnliches Reagenz zugesetzt werden. Alternativ kann das Enzym umgangen werden, indem man BBRs direkt mit diesem oder einem ähnlichen Reagenz markiert. Auf jeden Fall ist die Fluoreszenz oder ein anderes Signal proportional zur Menge der vorhandenen PNA-TNA-Hybride.
  • Die Fluoreszenz wird auf der Oberfläche der Matrix mittels eines Frontoberflächen-Fluorimeters gemäß den Angaben des Herstellers des IMx-Geräts nachgewiesen. Unter geringfügigen Anpassungen, die aufgrund routinemäßiger Experimente vorgenommen werden können und die zur Optimierung eines Instruments, wie des IMx, für eine Nucleinsäure-Hybridisierung und für Nucleinsäure-TBA-Wechselwirkungen dienen, kann die vorliegende Erfindung vollkommen an automatisierte Analysen von TNA-Proben angepasst werden.
  • 9. Weitere diagnostische Anwendungen der Erfindung.
  • Während die vorstehende Beschreibung es ermöglicht, die vorliegende Erfindung in einer Anzahl von verschiedenen Ausführungsformen anzuwenden, sind zahlreiche weitere Anwendungsmöglichkeiten ersichtlich, z. B. in einem Mobilitätsverzögerungssystem.
  • Bei dieser Ausführungsform der Erfindung wird eine Verbesserung des bekannten elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstests (EMSA) folgendermaßen erreicht (vergl. 12a und 12b):
    Eine DNA-Probe wird fragmentiert, entweder durch willkürliche Spaltung oder durch spezifische Restriktionsendonuclease-Behandlung. Die DNA in der Probe wird sodann in zwei gleiche Aliquotanteile aufgeteilt und eine spezifische TNA wird zum ersten Aliquotanteil, jedoch nicht zum zweiten gegeben. Der erste und zweite Aliquotanteil werden sodann in einem Acrylamid- oder Agarosegel der Elektrophorese unterworfen und das Muster von DNA-Banden (entweder durch Ethidiumbromid-Bindung oder durch radioaktive Markierung vor der Elektrophorese sichtbar gemacht) wird sodann für die beiden Aliquotanteile verglichen. DNA-Fragmente mit Bindungsstellen, für die die TBA spezifisch ist, unterliegen einer Verzögerung ihrer Wanderung durch das elektrophoretische Medium. Durch Verwendung einer geeigneten TBA können auf diese Weise eine beliebige Anzahl an DNA- oder anderen Nucleinsäuresequenzen aufgespürt werden.
  • Bei einer Modifikation des vorstehend beschriebenen EMSA-Tests wird fragmentierte TNA mit einer PNA hybridisiert und in einer ersten Dimension fraktioniert. Die fraktionierte DNA wird sodann mit einer geeigneten TBA umgesetzt und die Mobilitätsänderung der DNA-Fragmente wird festgestellt. Eine Verstärkung der Verzögerung ist durch Zugabe von BBAs auf die vorstehend beschriebene Weise möglich (vergl. beispielsweise Vijg und die darin zitierten Druckschriften für bekannte Techniken der zweidimensionalen Nucleinsäureelektrophorese, auf die das vorliegende Verfahren angewandt werden kann).
  • Die nachstehenden Beispiele bieten dem Fachmann weitere Richtlinien bezüglich der praktischen Durchführung der Erfindung. Eine Beschreibung üblicher rekombinanter DNA-Techniken findet sich bei Sambrook, Fritsch und Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, sowie in neueren Veröffentlichungen. Diese Techniken werden hier nicht beschrieben, da sie dem Fachmann geläufig sind.
  • Beispiel 1 – Herstellung von PNAs und Markierung von PNAs
  • Sondennucleinsäuren, PNAs, lassen sich nach bekannten Verfahren herstellen. So können einzelsträngige Polynucleotid-PNAs mit einer definierten Sequenz durch chemische Festphasensynthese gemäß Merrifield hergestellt werden. PNAs lassen sich durch eine automatisierte Synthese unter Einsatz einer handelsüblichen Technik herstellen, z. B. mit Harzen und Vorrichtungen, die von der Fa. Applied Biosystems, ABI, oder anderen Herstellern erzeugt oder vertrieben werden. Alternativ lassen sich bestimmte PNA-Sequenzen in vivo durch bekannte rekombinante DNA-Verfahren synthetisieren. Beispielsweise lassen sich durch Klonieren einer Duplex-PNA in einen Vektor, der in E. coli replizieren kann, große Mengen der Duplex-PNA herstellen. Multimere der PNA können so in den Vektor kloniert werden, dass pro 1 Mol Vektor mehrere Mol PNA bei Verdau des Vektors freigesetzt werden, wobei ein Restriktionsfragment die PNA-Sequenz flankiert. Im Anschluss an eine Synthese oder rekombinante Herstellung werden die PNAs durch bekannte Verfahren gereinigt, z. B. durch Gelelektrophorese oder Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC). Wenn die PNA als Duplex hergestellt wird, lassen sich die PNA-Stränge vor der Verwendung in einem Hybridisierungstest zum Nachweis von Zielnucleinsäuresequenzen durch Erwärmen oder andere bekannte Verfahren trennen.
  • Die spezifische Sequenz von Basen in der PNA wird so gewählt, dass sie die in einer TNA nachzuweisende Sequenz wiederspiegelt, mit der Maßgabe, dass erfindungsgemäß die PNA eine 1/2-TBR-Sequenz enthält, bei der es sich um eine Sequenz handelt, die bei Hybridisierung der PNA und TNA eine TBR bildet. Da aus dem Stand der Technik eine im wesentlichen unbegrenzte Anzahl an derartigen Sequenzen bekannt ist, wird die Wahl der PNA-Sequenz vom Fachmann für einen beliebigen gegeben Anwendungszweck getroffen. Bei der Sequenz der HIV-LTR handelt es sich um eine solche Sequenz, die bei Hybridisierung von Bereichen der LTR, die für eine PNA kodieren, mit TNAs, die für die HIV-LTR kodieren, TBRs bilden, die zur Bindung der NF-kB- oder SP1-DNA-Bindungsproteine befähigt sind.
  • Zusätzlich zu Sequenzen, die bei Hybridisierung eine TBR bilden, kann die PNA auch eine 1/2-BBR enthalten. Bei dieser Sequenz handelt es sich um eine Sequenz, die bei Hybridisierung mit einer Booster-Nucleinsäure, BNA, eine BBR bildet, die zur Bindung einer BBA befähigt ist. Bei der BBA handelt es sich vorzugsweise um ein DNA-Bindungsprotein mit hoher Affinität für die BBR-Sequenz.
  • In diesem speziellen Beispiel erfolgt eine Hybridisierung zwischen einer PNA mit einer 1/2-TBR, SEQ ID NO: 4, und am 3'-Ende dieser Sequenz, einer 1/2-BBR-Sequenz, die als SEQ ID NO: 35 dargestellt ist. Die PNA, die für diese Sequenzen kodiert, wird entweder ohne Markierung oder in einer mit einem radioaktiven Isotop, wie P32, S35 oder einem ähnlichen Isotop, markierten Form gemäß bekannten Verfahren verwendet. Alternativ wird die PNA an eine Perle mit einer Größe von 0,01 bis 10 μm gebunden, die für einen leichten visuellen Nachweis gefärbt sein kann. Diese Markierung bildet die OSA gemäß den Angaben in der Beschreibung. Diese Sonde hybridisiert mit HIV-LTR-Sequenzen unter Bildung einer TBR, die NF-kB bindet. Ferner hybridisiert die PNA mit BNAs mit einer komplementären 1/2-BBR unter Bildung eines linken lambda- Bacteriophagen-Operators, der entweder cro oder lambda-Repressorproteine bindet.
  • Auf ähnliche Weise, wie es vorstehend beschrieben wurde, werden PNAs verwendet, bei denen es sich bei der 1/2-TBR um eine beliebige der Sequenzen SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NOs: 7–34 handelt und sich eine 1/2-BBR, wie SEQ ID NO: 35 oder SEQ ID NO: 36 sich am 3'-Ende oder am 5'-Ende der 1/2-TBR befindet.
  • Beispiel 2 – Herstellung und Markierung von BNAs
  • Auf ähnliche Weise wie bei den in Beispiel 1 zur Herstellung und Markierung von PNAs beschriebenen Verfahren werden BNAs gemäß bekannten Verfahren hergestellt und markiert. Wie im US-Patent 4 556 643 beschrieben (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht; insbesondere Beispiel 1), lassen sich Nucleinsäuresequenzen, die für bestimmte Nucleinsäure-Bindungssequenzen kodieren, in großen Mengen durch Klonieren in einen replizierbaren Vektor herstellen. Ferner lassen sich ähnlich wie gemäß dieser Druckschrift die 1/2-TBR- und 1/2-BBR-Sequenzen auf diese Weise kolinear herstellen, jedoch mit dem Unterschied, dass erfindungsgemäß die 1/2-TBR-Sequenz selbst eine Nucleinsäure-Bindungskomponenten-Erkennungsstelle bildet und die 1/2-BBR zwar eine Nucleinsäure-Bindungskomponenten-Erkennungsstelle bildet, jedoch auch ein Mittel zur Amplifikation des Signals darstellt, das bei Bindung der 1/2-TBR an komplementäre Sequenzen in der TNA entsteht, indem für die Polymerisation von BNAs an der TNA-gebundenen PNA gesorgt wird. Um dies zu ermöglichen, wird eine Sequenz, wie SEQ ID NO: 35, die für den linken Operator des lambda-Bacteriophagen kodiert, mit zusätzlichen Sequenzen versehen, so dass eine Überhangsequenz an einem oder beiden Enden der BNA bei Hybridisierung mit der PNA gebildet wird.
  • Als ein spezifisches Beispiel wird eine vektorielle Polymerisation von BNAs an einer TNA durch SEQ ID NOs: 40–43 bereitgestellt. In diesem Beispiel kodiert SEQ ID NO: 40 für zwei 1/2-TBRs, die mit zwei 1/2-TBRs in einer TNA unter Bildung von zwei NF-kB-Bindungsstellen hybridisieren, während gleichzeitig ein linker lambda-Bacteriophagen-Operator 1/2-BBR bereitgestellt wird, der zusätzlich am 3'-Ende mit der Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym PstI terminiert ist. Eine Addition der BNA, SEQ ID NO: 41, mit der 1/2-BBR, die komplementär mit der 1/2-BBR an der PNA ist, SEQ ID NO: 40, vervollständigt die BBR, während gleichzeitig die PstI-Erkennungsstelle vervollständigt wird, wobei ein Überhang von vier Basen für die Hybridisierung mit weiteren BNAs verbleibt. Demgemäß wird SEQ ID NO: 42 addiert, die am 3'-Ende eine Sequenz mit vier Basenpaaren aufweist, die komplementär zum Überhang von vier Basen, die bei der Hybridisierung von SEQ ID NOs: 40 und 41 verbleiben, ist. Ferner ist SEQ ID NO: 42 mit einer Sequenz von fünf Basen an ihrem 5'-Ende versehen, die einen Teil einer BamHI-Erkennungsstelle bilden. Das wachsende Polymere aus BNAs wird weiter durch Addition der BNA SEQ ID NO: 43 verlängert, die komplementär zu SEQ ID NO: 42 ist, wobei die BBR vervollständigt wird und gleichzeitig die BamHI-Erkennungsstelle vervollständigt wird und ein Überhang von vier Basen verbleibt, der zusätzlich mit BNAs mit komplementären Sequenzen hybridisiert werden kann. Auf diese Weise können die BNAs in umfangreicher Weise hybridisiert werden, so dass das Signal eines einzelsträngigen PNA-TNA-Hybridisierungsereignisses stark amplifiziert wird.
  • Wie bei den in Beispiel 1 beschriebenen PNAs können die BNAs in einer unmarkierten Form verwendet werden oder sie können gemäß bekannten und in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren markiert werden. Ferner ist es ersichtlich, dass anstelle der Herstellung des BNA-Polymeren durch sequentielle Addition von BNAs an den PNA-TNA-Komplex das BNA-Polymere vorher gebildet und direkt an den PNA-TNA-Komplex addiert werden kann. Ein einfaches Verfahren zur vorherigen Bildung eines derartigen BNA-Polymeren umfasst die rekombinante Erzeugung eines Vektors, in dem Multimere der BNA mit einer einzigen Restriktionsstelle an jedem Ende des Polymeren vorgesehen sind. Dieses Polymere von BNAs mit einem Gehalt an mehrfachen BBRs wird aus dem Vektor geschnitten und hybridisiert mit einer einzelsträngigen 1/2-BBR, die bei Hybridisierung der PNA und der TNA im PNA verbleibt. Dies wird erreicht, indem man eine einzelsträngige Sequenz in der PNA bereitstellt, die mit einem Überhang komplementär ist, der im BNA-Polymeren beim Ausschneiden aus dem Produktionsvektor gebildet wird.
  • Beispiel 3 – Herstellung von HNAs und deren Verwendung zur Maskierung von BNA-Polymeren
  • Die erfindungsgemäßen HNAs werden gemäß bekannten Verfahren für die Herstellung von Polynucleotiden gemäß den Angaben in den Beispielen 1 und 2 für PNAs und BNAs hergestellt. Bei der Herstellung von HNAs wird jedoch die Sequenz der HNA spezifisch so konzipiert, dass ein wesentlicher Bereich der HNA ein selbst-komplementäres Palindrom unter Bildung einer Haarnadel bildet, während gleichzeitig in einzelsträngiger Form eine ausreichende Basenzahl zurückbleibt, um eine Hybridisierung mit einzelsträngigen Sequenzen in der wachsenden Kette von BNAs gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 zu ermöglichen.
  • In diesem Beispiel wird eine HNA gemäß SEQ ID NO: 44 bereitgestellt, um die Verlängerung der BNAs an der PNA in Beispiel 2 nach Addition der BNA SEQ ID NO: 43 zu maskieren. Dies wird erreicht, da SEQ ID NO: 44 zwar eine Palindromsequenz, die eine stabile Haarnadel bildet, aufweist, jedoch auch eine Sequenz am 5'-Ende der HNA aufweist, die die BamHI-Sequenz, die durch die Hybridisierung von SEQ ID NO: 42 und SEQ ID NO: 43 gebildet wird, vervollständigt. Selbstverständlich dient die Termination des Polymeren nach Addition von nur drei BNAs dazu, die Erfindung in einfacher Weise darzustellen. Wie vorstehend ausgeführt, kann diese Polymerisation im wesentlichen in unbegrenzter Weise fortgesetzt werden, um das Signal des PNA-TNA-Hybridisierungsereignisses zu amplifizieren. Nachdem die HNA mit der wachsenden Kette von BNAs hybridisiert hat, wird das Polymere maskiert und es ist keine weitere Verlängerung des Polymeren mehr möglich.
  • Beispiel 4 – Herstellung von TBAs und BBAs und deren Markierung und Immobilisierung
  • Die TBAs und BBAs, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen beliebige Substanzen, die spezifisch die TBRs und BBRs, die durch Hybridisierung der PNAs, TNAs und BNAs gebildet worden sind, binden. Die Verwendung von DNA-Bindungsproteinen stellt ein Beispiel für derartige Substanzen dar.
  • Beispielsweise handelt es sich bei der TBA um das Dimere des DNA-Bindungsbereichs von p50 und bei der BBA um das lambda-cro-Protein. Diese Proteine lassen sich nach bekannten Verfahren herstellen. Die Gene für diese beiden Proteine wurden kloniert. Somit werden diese Proteine nach bekannten Verfahren in rekombinanter Weise hergestellt und gereinigt. Ferner werden diese Proteine entweder mit einem Radioisotop, z. B. mit radioaktivem Iod, oder mit einem Enzym, wie beta-Galactosidase oder Meerrettich-peroxidase, oder mit einem fluoreszierenden Farbstoff, wie Fluorescein oder Rhodamin, gemäß bekannten Verfahren markiert. Außerdem können die TBA und/oder BBA an einer festen Oberfläche immobilisiert werden, z. B. an der Oberfläche einer Mikrotiterplatte oder an der Oberfläche einer Perle, z. B. einer gefärbten Perle mit einem Durchmesser von 0,01 bis 10 μm. Die Markierungen an den TBAs und BBAs können gleich oder verschieden sein.
  • In diesem Beispiel wird die TBA mit einem Gehalt an der dimeren p50-DNA-Bindungsdomäne mit Rhodamin markiert, während die BBA, cro, mit Fluorescein markiert wird. Demgemäß werden bei Hybridisierung der PNAs, TNAs, BNAs und HNAs, wie sie in der vorliegenden Beschreibung und den vorstehenden und folgenden Beispielen beschrieben werden, die gegebenenfalls gebildeten Nucleinsäurehybride mit überschüssiger markierter TBA und cro in Kontakt gebracht. Die Fluoreszenz dieser Markierungen wird gemäß bekannten Verfahren gemessen und der Nachweis beider Signale stellt ein Anzeichen für die Anwesenheit von 1/2-TBR-Sequenzen in der TNA dar. Das durch die Fluoreszenz des NF-kB und cro erzeugte Differenzsignal stellt ein Maß für den Umfang dar, bis zu dem die Polymerisation von BNAs am PNA-TBA-Hybrid zur Amplifikation des Signals geführt hat. Eine Amplifikation von 1- bis über 1000-fach kommt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in Betracht.
  • Beispiel 5 – Hybridisierung von zwei PNAs mit einer TNA und Unterscheidung zwischen einer TNA und einer CNA
  • Die PNAs, PNA1, SEQ ID NO: 40, und PNA2, SEQ ID NO: 45, werden in einem etwa 10-fachen molaren Überschuss gegenüber der Konzentration an TNAs in einer Testprobe verwendet. In diesem Beispiel wird eine isolierte Duplex-HIV-LTR, bei der ein Strang die in 7 dargestellte SEQ ID NO: 37 aufweist und der andere Strang komplementär zu der in 7 dargestellten Sequenz ist, als TNA verwendet. Ferner wird in diesem Beispiel eine isolierte Duplex-CNA verwendet, von der ein Strang die gleiche Sequenz wie SEQ ID NO: 37 aufweist, mit der Ausnahme, dass in der ersten NF-kB-Bindungsstelle, die in 7 dargestellt ist, in der Mitte der Bindungsstelle in Position 1 in 7 sich anstelle eines "T" ein "A" befindet, weswegen der komplementäre Strang davon an dieser Position nicht zur SEQ ID NO: 40-PNA passt.
  • SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 45 werden beide zu getrennten Reaktionsgemischen gegeben, wobei das erste die vorstehend beschriebene TNA und das zweite die vorstehend beschriebene CNA enthält. Die Proben werden in einem geeigneten Hybridisierungspuffer, wie 10 mM Tris (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA, solubilisiert. Die Proben werden sodann etwa 5 Minuten auf etwa 90°C erwärmt, um die Duplex-TNAs und -CNAs in den Proben einer Strangtrennung zu unterwerten. Anschließend lässt man die Proben abkühlen, um eine Anlagerung der Stränge von PNAs, TNAs und CNAs zu ermöglichen.
  • Nachdem die Hybridisierung beendet ist, was nach bekannten Verfahren festgestellt werden kann, beispielsweise durch Berechnung der t1/2 auf der Grundlage der Basenzusammensetzungen und der Anlagerungstemperatur gemäß bekannten Verfahren, wird die SEQ ID NO: 40-PNA durch Addition von BNAs gemäß Beispiel 2 polymerisiert und die SEQ ID NO: 45-PNA2-Sonde wird mit BNAs beginnend mit dem SphI-Erkennungsstellen-Überhang polymerisiert. Im Anschluss an die Addition der BNAs und eine kurze Hybridisierungsperiode werden die getrennten Proben zu Perlen gegeben, die mit kovalent immobilisiertem NF-kB beschichtet sind. Man lässt das NF-kB an etwaige gebildete TBRs in den TNA- und CNA-Proben binden. Nach etwa 15-minütiger Bindungszeit werden die Proben 2-mal mit etwa 3 Volumenteilen eines entsprechenden Waschpuffers, wie 10 mM Tris, pH-Wert 7,5, 100 mM NaCl, oder eines anderen Puffers gewaschen, von dem vorher festgestellt worden ist, dass er NF-kB oder die lambda-Bacteriophagen-CI-Repressorprotein-Bindungsaktivität nicht stört. Nach jedem Waschvorgang lässt man die Perlen unter Schwerkrafteinwirkung oder durch kurze Zentrifugation absetzen. Dadurch werden etwaige Nucleinsäuren entfernt, die keine perfekte NF-kB-Bindungsstelle aufweisen, die durch Hybridisierung der PNA1- und TNA-Sequenzen gebildet worden sind.
  • Nach dem letzten Waschvorgang wird lambda-Bacteriophagen-Cl-Repressorprotein, das mit einem radioaktiven Isotop, wie radioaktivem Iod, oder mit einem Enzym, wie Meerrettich-peroxidase, mit gefärbten Perlen oder mit einer fluoreszierenden Markierung markiert ist, zu den einzelnen Proben gegeben. Die Proben werden sodann mehrmals (etwa 3-mal) mit mehreren Volumenteilen (etwa 2) eines geeigneten Waschpuffers, wie 10 mM Tris, pH-Wert 7,5, 100 mM NaCl, oder eines anderen Puffers gewaschen, von dem vorher festgestellt worden ist, dass er NF-kB oder die lambda-Bacteriophagen-CI-Repressorprotein-Bindungsaktivität nicht stört. Nach jedem Waschvorgang lässt man die Perlen unter Schwerkrafteinwirkung oder durch kurze Zentrifugation absetzen. Nach dem letzten Absetzen oder Zentrifugieren wird die gebundene Markierung quantitativ bestimmt, indem man die gebundene Radioaktivität, die bei einem enzymatischen Test freigesetzte Farbe, die Farbe von gebundenen Perlen oder die Fluoreszenz nachweist. Alternativ kann ein anti-CI-Antikörper zugesetzt werden und ein üblicher Sandwich-ELISA- oder Radioimmuntest kann zum Nachweis von gebundenem Repressor durchgeführt werden. Außerdem werden als eine negative Kontrolle (Hintergrund) alle vorstehenden Maßnahmen parallel mit einer Probe durchgeführt, in der Perlen ohne immobilisiertes NF-kB verwendet werden.
  • Als Ergebnis des vorstehenden Tests weisen die Kontrollproben und die CNA enthaltenden Proben ähnlich geringe Signale auf, während die TNA enthaltende Probe ein Signal aufweist, das deutlich über dem Hintergrund liegt.
  • Beispiel 6 – Testkit für den Nachweis von HIV
  • A. Bestandteile des Kits
    • 1. Mikrotiterplatte
    • 2. 1 mg/ml-Lösung von auf rekombinantem Wege hergestelltem NF- kB in Tris-gepufferter Kochsalzlösung
    • 3. Röhrchen mit einem Gehalt an einzelsträngigen HIV-PNAs (ein Gemisch von vorher vermischten Oligonucleotiden, die für zwei NF-kB-1/2-Bindungsstellen kodieren, d. h. ein Gemisch von SEQ ID NOs: 7 und 8).
    • 4. Röhrchen mit einem Gehalt an einzelsträngiger humaner genomischer PNA, SEQ ID NO: 1
    • 5. Röhrchen mit Nuclease (PstI)
    • 6. Röhrchen mit Protease
    • 7. Röhrchen mit einem Gehalt an vorher polymerisierten BNAs, 100 Wiederholungseinheiten von lambda-Bacteriophagen Or, maskiert mit einer HNA, jedoch mit freien 1/2-BBRs, die für die Bindung an PNA-TNA-Hybride verfügbar sind.
    • 8. Röhrchen mit Meerrettich-peroxidase (hrp), konjugiert mit cro
    • 9. Röhrchen mit hrp-gefärbtem Substrat
    • 10. Tris-gepufferte Kochsalzlösung, 100 ml
    • 11. Lanzette
    • 12. Reaktionsröhrchen A, B und C, jeweils mit einem Gehalt an 250 μl destilliertem Wasser
    • 13. Medizin-Tropfvorrichtung
  • B. Testverfahren
    • (a) Die Mikrotiterplatte (Gegenstand 1) wird mit der Lösung aus auf rekombinantem Wege hergestelltem NF-kB (Gegenstand 2) in einer Konzentration von 1 mg/ml in Tris-gepufferter Kochsalzlösung über Nacht bei 4°C unter Rütteln beschichtet.
    • (b) 3 Tropfen Blut der Testperson werden erhalten, indem man mit der Lanzette (Gegenstand 11) in den Finger einer Person einsticht. 1 Bluttropfen wird in jedem der Röhrchen A, B und C (Gegenstand 12) verteilt.
    • (c) In jedes Röhrchen wird mit der Medizin-Tropfvorrichtung (Gegenstand 12) 1 Tropfen Proteaselösung (Reagenz 6) gegeben. Man bewegt das Röhrchen und lässt es sodann 5 Minuten absetzen.
    • (d) Ein Tropfen Nuclease (Reagenz 5) wird in jedes der Röhrchen A–C unter Verwendung der Medizin-Tropfvorrichtung gegeben. Man bewegt die Röhrchen und lässt sie 10 Minuten absetzen.
    • (e) 1 Tropfen von Reagenz 3 wird in das Röhrchen A (Testprobe) gegeben. 1 Tropfen von Reagenz 4 wird in das Röhrchen B (positive Kontrolle) gegeben. 1 Tropfen Kochsalzlösung (Reagenz 12) wird als negative Kontrolle dem Röhrchen C zugesetzt. Die Röhrchen werden in heißem Wasser auf 50°C erwärmt. Sodann lässt man sie innerhalb von 1 Stunde auf Raumtemperatur abkühlen.
    • (f) Während der Durchführung der Hybridisierung in Stufe (d) lässt man überschüssiges Protein von der Oberfläche der Mikrotiterplatte von Stufe (a) ablaufen. Die Platte wird mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (Röhrchen 10) gespült.
    • (g) Der Inhalt der Röhrchen A–C von Stufe (e) wird auf drei Vertiefungen der Mikrotiterplatte übertragen und 1 Stunde unter Rütteln stehengelassen.
    • (h) Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die den Inhalt der Röhrchen A–C enthalten, werden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gespült und entleert.
    • (i) 1 Tropfen von Reagenz 7 wird in jede Vertiefung gegeben. Innerhalb von 1 Stunde lässt man die Hybridisierung mit etwaigen 1/2-BBR-Stellen, die an der Platte gebunden sind, ablaufen, wonach 3-mal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gespült wird.
    • (j) 1 Tropfen Reagenz 8 wird in jede Vertiefung gegeben und man lässt cro innerhalb von 10 Minuten an etwaige gebundene BNA binden, wonach 5-mal mit je 1 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen wird.
    • (k) 1 Tropfen hrp-Substrat wird in jede Vertiefung gegeben, wonach man die Farbentwicklung ablaufen lässt.
  • C. Ergebnisse
  • Wenn die Vertiefungen A und B beide eine Farbentwicklung zeigen, die in der Vertiefung C nicht auftritt, ist der Test aussagekräftig und das Subjekt leidet an einer HIV-Infektion. Wenn nur die Vertiefung A eine Farbentwicklung zeigt oder wenn nur die Vertiefung C eine Farbentwicklung zeigt, war die Testdurchführung nicht korrekt und der Test ist nicht aussagekräftig. Wenn die Vertiefungen A und C keine Farbentwicklung zeigen, jedoch bei B eine Farbentwicklung auftritt, ist der Test aussagekräftig und das Individuum ist nicht mit HIV infiziert.
  • Beispiel 7 – Herstellung von verschiedenen neuen TBAs
  • Neue TBAs zur erfindungsgemäßen Verwendung werden folgendermaßen hergestellt:
    • (a) NF-kBI/NF-kB (HIV-Detect I). Eine Nucleinsäure, die für eine der Sequenzen SEQ ID NOs: 63–71 oder ein ähnliches NF-kB-DNA-Bindungsprotein kodiert, wird im Raster mit einer Nucleotidsequenz, die für eine Anordnungssequenz, wie cro, kodiert, so fusioniert, dass die NF-kB-DNA-Erkennungssequenz am Amino- oder Carboxyterminus der cro-Sequenz kodiert wird. Gegebenenfalls wird eine Linkersequenz zwischen der NF-kB-Sequenz und der cro-Sequenz vorgesehen. Am anderen Terminus von cro wird gegebenenfalls eine nukleare Lokalisierungssignalsequenz, wie SEQ ID NO: 72, vorgesehen. Ferner werden gegebenenfalls Asymmetriesequenzen am cro-Terminus, der von der NF-kB-Erkennungssequenz nicht verwendet wird, vorgesehen. Beispiele für vollständige TBAs sind nachstehend aufgeführt.
    • (b) NF-kB/SP1 (HIV-Detect II). Auf ähnliche Weise wie im vorstehenden Abschnitt (a) wird eine rekombinante Kodierungssequenz, die für eine NF-kB-Erkennungsdomäne kodiert, hergestellt. In einem getrennten Konstrukt wird anstelle von SEQ ID NOs: 63–72 die Kodierungssequenz für den DNA-Erkennungsbereich von SP1 aufgenommen. Eine derartige Sequenz sollte für die Gesamtheit oder einen funktionellen Teil von SEQ ID NO: 73 kodieren, wobei es sich um den Bereich des SP1-Transkriptionsfaktors handelt, der eine DNA-Bindung zeigt (vergl. Kadonaga et al., Cell, Bd. 51 (1987), S. 1079–1090). Der NF-kB-Kodierungsvektor und der SP1-Kodierungsvektor werden sodann in ein geeignetes Expressionssystem, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, kotransfiziert. Eine monomere NF-kB-Erkennungseinheit wird an das vollständige NF-kB-Erkennungsdimere nach dem Zusammenbau der SP1- und NF-kB-Erkennungseinheiten durch den Begleiter addiert. Die Asymmetriesequenzen verhindern die Bildung von NF-kB- oder SP1-Dimeren und dirigieren stattdessen die Bildung von NF-kB-SP1-Heterodimeren (d. h. HIV-Detect II), die dann aus dem Expressionssystem (Säugetier- oder Bakterienzellen) durch bekannte Verfahren isoliert werden.
    • (c) SP1/SP1-TBAs (HIV-Detect III). Wie im vorstehenden Abschnitt (b) beschrieben, wird ein für SP1 kodierendes TBA-Konstrukt hergestellt. Jedoch wird nur dieses Konstrukt in das Expressionssystem transfiziert, und Asymmetriesequenzen, die die Bildung von SP1-SP1-Dimeren ermöglichen, werden aufgenommen.
    • (d) SP1-TATA (HIV-Detect IV). Wie im vorstehenden Abschnitt (b) beschrieben, wird eine für SP1 kodierende TBA-Rekombinante hergestellt. Ferner wird eine Rekombinante, die für eine TBA mit einer Bindungssequenz kodiert, SEQ ID NO: 74, oder eine ähnliche Sequenz, die für eine TATA-Erkennungseinheit kodiert, mit Asymmetriesequenzen, die komplementär zu denen sind, die im für SP1-TBA kodierenden Konstrukt enthalten sind, hergestellt. Diese Konstrukte werden kotransfiziert und die Heterodimeren werden durch übliche Verfahren isoliert, einschließlich Affinitätsreinigung an einer DNA-Säule mit den entsprechenden SPA1-TATA-Zielbindungsregionen.
    • (e) SP1-E2 (HPV-Detect I). Ein für SP1 kodierendes Konstrukt wird gemäß dem vorstehenden Abschnitt (b) hergestellt. Ein für E2-TBA kodierendes Konstrukt wird unter Verwendung einer Sequenz, die für eine der Sequenzen SEQ ID NOs: 75–84 und 94–98, bei denen es sich um Papillomavirus-E2-DNA-Erkennungseinheiten handelt (vergl. Hegde et al., Nature, Bd. 359 (1992), S. 505–512), oder ähnliche Erkennungseinheiten kodiert, hergestellt und mit dem für SP1-TBA kodierenden Konstrukt kotransformiert oder kotransfiziert. Die monomere E2-Erkennungseinheit wird an das vollständige E2-Erkennungsdimere addiert, nachdem der Zusammenbau der E2-SP1-Erkennungseinheit durch den Begleiter erfolgt ist. Das heterodimere HPV-Detect I wird nach bekannten Verfahren isoliert.
    • (f) E2–E2 (HPV-Detect II). Wie im vorstehenden Abschnitt (e) beschrieben, wird ein für E2-TBA kodierendes Konstrukt hergestellt, mit der Ausnahme, dass Asymmetriesequenzen aufgenommen werden, die die Bildung von E2-Dimeren ermöglichen. Die exprimierten Dimeren werden sodann nach bekannten Verfahren isoliert, unter Einschluss der Affinität für eine dimere E2-Bindungsstelle an einer DNA-Affinitätssäule.
    • (g) E2-TATA (HPV-Detect III). Wie in den vorstehenden Abschnitten (e) und (d) ausgeführt, werden E2- bzw. TATA-Bindungs-TBAs hergestellt, mit der Ausnahme, dass Asymmetriesequenzen aufgenommen werden, die die Bildung von Heterodimeren anstelle von Homodimeren verstärken. Diese Konstrukte werden sodann koexprimiert und die Heterodimeren werden isoliert.
    • (h) TATA-TATA (HPV-Detect IV). Wie vorstehend in den Abschnitten (a) und (d) beschrieben, wird ein TATA-bindendes, TBA-kodierendes Konstrukt unter Verwendung von Asymmetriesequenzen hergestellt, die die Bildung dieses Homodimeren begünstigen, und das Homodimere wird isoliert.
    • (i) Weitere TBAs. Wie vorstehend für HIV- und HPV-TBAs beschrieben, können TBAs für ein beliebiges vorgegebenes Pathogen oder Krankheitszustand hergestellt werden, indem man spezifische DNA-Bindungsproteine identifiziert und ein Expressionskonstrukt unter Verwendung von geeigneten Linker-Anordnungs- und Asymmetriesequenzen bildet.
  • Beispiel 8
  • Auf ähnliche Weise wie bei dem in Beispiel 5 beschriebenen Test, ergibt sich ein stringenterer Test durch Verwendung des Duplex-NF-kB-SP1-Bindungsproteins, das gemäß Beispiel 6 hergestellt worden ist. Demgemäß können die in 7 dargestellten und in Beispiel 5 verwendeten Sonden verlängert werden, um den Intersondenabstand zu verringern und dadurch die Flexibilität der DNA in der TNA zu verringern.
  • Beispiel 9 – Herstellung von TBAs von "hoher Ordnung"
  • Durch geeignete Verwendung von Asymmetriesequenzen werden TBAs hergestellt, bei denen es sich um Dimere, Trimere, Tetramere, Pentamere oder Hexamere von bestimmten DNA-Erkennungseinheiten handelt. Auf diese Weise wird eine hexamere TBA hergestellt, indem man zunächst eine erste dimere NF-kB-p50-TBA unter Verwendung von Asymmetriesequenzen, die die Bildung des Dimeren ermöglichen, herstellt. Ferner ermöglichen die Asymmetriesequenzen die Tetramerisierung des p50-Dimeren mit einem SP1-SP1-Dimeren. Schließlich dirigieren zusätzliche Asymmetriesequenzen die Hexamerisierung mit einem Dimeren, das nukleare Lokalisierungssequenzen aufweist. Dies wird erreicht, indem man beispielsweise Asymmetriesequenzen aus Insulin, das in der Natur Hexamere bildet, aufnimmt. Diese Hexamerbildung wird durch die Sequenzen SEQ ID NOs: 85 (A) und 86 (B), 87 (A) und 88 (B), 89 (A) und 90 (B), und 91 (A) und 92 (B) dirigiert (vergl. die 13 und 14).
  • Aufgrund der äußerst hohen Affinität für die HIV-LTR, die unter Verwendung von multimerer TBA erzeugt werden kann, werden die Verbindungen, die diese Struktur aufweisen und die für diesen Zweck verwendet werden können, hier als "HIV-Lock" bezeichnet.
  • Ein optimales HIV-Lock wird durch "Fußabdruckbildung" (gemäß bekannten Verfahren) von an TBRs gebundenen TBAs in der HIV-LTR definiert, um zu bestätigen, dass die Bindungsaffinität der einzelnen DNA-Bindungsproteine, die zur Bildung des multimeren TBA-Komplexes beitragen, relativ zur Affinität für eine beliebige natürliche Zielsequenz (d. h. CNAs), aus der die DNA-Bindungserkennungseinheit der TBA abgeleitet ist, nach unten verschoben ist. Ein etwaiger gleichzeitiger Verlust an Bindungsaffinität für die HIV-TBRs wird bei Bildung des Multimeren gemäß den vorstehenden Ausführungen überkompensiert.
  • Es kann eine Konkurrenz zwischen der Bindung der einzelnen Komponenten-TBAs um ihre TBR und Anordnung über Asymmetriesequenzen zur Bildung des Multimeren vorliegen. Dies wird vermieden, indem man die Linker zwischen den Begleiter und den Asymmetriesequenzen in jeder TBA-Komponente so einstellt, dass diese konkurrierenden Ereignisse entkoppelt werden. Die sich ergebende Verringerung der Dimensionalität der Diffusion (effektive Konzentrationszunahme) für die TBA-Asymmetrie und -Anordnungskomponenten führt zu einer wirksamen Bildung des multimeren Komplexes.
  • Auf der Basis der "Fußabdruckbildung" werden die Länge und die Zusammensetzung von Linkern so eingestellt, dass eine optimale Unterscheidung zwischen Ziel-HIV-Sequenzen und natürlichen Sequenzen erreicht wird. Auf diese Weise weisen zwar die einzelnen Komponenten-TBAs eine geringe Affinität für CNA- und TBR-Sequenzen auf, jedoch weist der multimere Komplex eine äußerst hohe Affinität für die nunmehr erweiterte TBR, die durch den multimeren Komplex erkannt wird, auf (Quadrat der Affinität der einzelnen TBRs, die durch jede Komponenten-TBA der multimeren TBA erkannt wird), während er noch eine geringe Affinität für CNAs besitzt. Auf die gleiche Weise werden weitere multimere TBA-Komplexe (abgesehen von HIV-Lock) hergestellt.
  • Zu TBAs, die auf diese Weise hergestellt werden können, gehören die folgenden Sequenzen, die durch Verknüpfung entweder von Proteinuntereinheiten oder von Nucleinsäuresequenzen, die für diese Untereinheiten kodieren, auf folgende Weise zusammengesetzt werden:
    Set Verknüpfung von Sequenzen der Gruppen
    A I + II + III
    B IV + V + III
    C IV + III
    wobei die Gruppen I–V aus Sequenzen bestehen, die ausgewählt sind aus:
    Gruppe Ausgewählt aus den Sequenzen
    I Beliebige der Sequenzen SEQ ID NOs: 85–92
    II Met Ser, verknüpft mit einer beliebigen der Sequenzen SEQ ID NOs: 104–106, die jeweils mit SEQ ID NO: 99 verknüpft sind.
    III SEQ ID NO: 100, verknüpft mit einer beliebigen der Sequenzen SEQ ID NOs: 75–84 oder 94–98; SEQ ID NO: 101, verknüpft mit entweder SEQ ID NO: 74 oder SEQ ID NO: 93; oder SEQ ID NO: 102, verknüpft mit SEQ ID NO: 74 oder SEQ ID NO: 93; oder beliebige der Sequenzen SEQ ID NO: 72, 103, 73 oder 63–71.
    IV Beliebige der Sequenzen SEQ ID NOs: 104–106.
    V SEQ ID NO: 99.
  • Spezielle Beispiele für derartige TBAs sind die Sequenzen SEQ ID NOs: 109–116, die folgendermaßen zusammengesetzt sind:
    Figure 00590001
  • Auf diese Weise lassen sich unter Auswahl zwischen geeigneten Asymmetriesequenzen, Anordnungssequenzen und DNA-Erkennungseinheiten zahlreiche verschiedene TBAs bilden. Ferner assoziieren Sätze dieser Sequenzen, wie SEQ ID NOs: 114 und 115, miteinander, während Dimere von SEQ ID NO: 114 oder 115 aufgrund der Ladungsabstoßung in den mutierten Anordnungssequenzen nicht gebildet werden (SEQ ID NO: 104 ist cro; SEQ ID NO: 105 ist ein neues mutieres, negativ geladenes cro und SEQ ID NO: 106 ist ein neues mutierttes, positiv geladenes cro).
  • Selbstverständlich kann der Fachmann aufgrund der gegebenen Aminosäuresequenz dieser TBAs rekombinante Nucleinsäureklone herstellen, die für diese TBAs kodieren. Derartige rekombinante Klone gehören selbstverständlich zum Gegenstand der Erfindung.
  • Beispiel 10 – HIV-Test unter Verwendung von "HIV-LOCK"
  • Im wesentlichen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 wird das gemäß Beispiel 9 verwendete "HIV-LOCK" als TBA, Reagenz 2, verwendet, wobei ähnliche Ergebnisse erzielt werden.
  • Beispiel 11 – HIV-Test unter Verwendung von "HIV-LOCK" beim Testen für Blutspendezwecke
  • Wenn die zu testende Blutmenge keinen beschränkenden Faktor darstellt, wie es bei Proben von Blut für Blutspendezwecke, die auf HIV-Kontamination zu testen sind, der Fall ist, werden ähnliche Tests wie in Beispiel 6 durchgeführt, wobei aber für jedes der Röhrchen A–C etwa 5 ml Blut in einer Tischzentrifuge pelletisiert werden. Die Mengen der übrigen Reagenzien werden je nach Bedarf vergrößert, um die größere TNA-Menge, die in der Probe vorhanden ist, handzuhaben.
  • Beispiel 12 – "HIV-LOCK°' als therapeutisches anti-HIV-Mittel
  • Das gemäß Beispiel 9 hergestellte "HIV-LOCK" wird in Form einer 1 mg/ml-Lösung in Liposomen zubereitet und intravenös einem Subjekt injiziert, bei dem ein Test auf HIV durchgeführt und eine entsprechende Infektion bestätigt worden ist. Eine Dosis von etwa 0,1 mg bis 100 mg von "HIV-LOCK"/kg Körpermasse wird innerhalb von 24 Stunden infundiert und die Konzentration an HIV-p24 im Serum des Patienten wird überwacht. Die Behandlung wird so oft als erforderlich wiederholt, z. B. wenn im Serum ein Anstieg von p24 erfolgt.
  • Beispiel 13 – Verwendung eines HIV-TBA-Konstrukts als Therapeutikum
  • Ein rekombinanter retroviraler Vektor oder dergl. wird zur Abgabe eines Konstrukts, das für eine HIV-LTR-bindende-TBA kodiert, an einen infizierten Patienten verwendet. Der Vektor kodiert für einen Begleiter, wie cro, und DNA-Sequenzen für Bindungsbereiche von p50. Der gleiche Vektor kodiert auch für einen Begleiter, an dem sich eine SP1-TBA faltet. Asymmetriesequenzen werden bereitgestellt, so dass bei Koexpression der p50-TBA und der SP1-TBA in einer einzelnen, HIV-infizierten Zelle in vivo es zu einer sofortigen Assoziation zwischen diesen TBAs kommt, während gleichzeitig jegliche Assoziation zwischen dem DNA-Bindungsbereich von p50 und endogenen p50- oder p65-Monomeren verhindert wird. NLS-Sequenzen werden ferner in den TBAs bereitgestellt, so dass bei der Dimerbildung die TBA sofort in den Zellkern umzieht und spezifisch an integrierte HIV-Sequenzen bindet, so dass jegliche Transkription von diesem Locus verhindert wird.
  • Zu diesem Zweck ist es erstrebenswert, Sequenzen auszuwählen, die für DNA-Bindungsdomänen kodieren, so dass die exprimierten Monomeren in einer TBA zusammengesetzt werden, die nicht an natürliche humane Sequenzen bindet. Somit kommt es nur bei Bindung der TBA-Komponenten an ihre Zielsequenzen zu einer Assoziation zwischen sämtlichen Komponenten der TBA unter Bildung eines Komplexes, der eng und spezifisch an die HIV-LTR bindet.
  • Beispiel 14 – Diagnostisches Testkit für humanes Papillomavirus
  • Dieses Diagnostikum für humanes Papillomavirus nützt den bekannten Unterschied zwischen gutartigem und karzinogenem HPV aus, um einen Test bereitzustellen, der bei einem Patienten einen Hinweis auf die Anfälligkeit für einen malignen Zustand gibt. Die Papillomaviren gehören zu einer Gruppe von kleinen DNA-Viren, die mit gutartigen squamösen Epithelzelltumoren in höheren Wirbeltieren assoziiert sind. Es wurden mindestens 27 verschiedene humane Typen von Papillomaviren (HPVs) aufgefunden. Viele davon sind mit spezifischen klinischen Läsionen assoziiert. 4 davon, nämlich HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18 und HPV-33 sind mit humanen Läsionen des Genitaltrakts assoziiert. Im allgemeinen wurde festgestellt, dass HPV-6- und HPV-11-DNAs mit gutartigen Läsionen des Genitaltrakts assoziiert sind. Ferner wurde von HPV-16, HPV-18 und HPV-33 festgestellt, dass sie mit prämalignen und malignen Läsionen assoziiert sind und in den meisten Zelllinien, die aus Zervikalkarzinomen erhalten worden sind, transkribiert werden. HPV-16, HPV-18 und HPV-33 sind vermutlich nur drei Mitglieder einer großen Gruppe von HPV-DNAs, die mit malignen, humanen Zervikalkarzinomen assoziiert sind.
  • Tiermodelle haben ergeben, dass gutartige Papillomavirus-Läsionen in Gegenwart eines Cokarzinogens sich zu malignen Läsionen entwickeln können. HPV-DNA wurde in Metastasen von Zervikalkarzinomen gefunden. Bei malignen zervikalen Läsionen ist HPV-DNA üblicherweise in das humane Genom integriert, es kann aber auch extrachromosomale HPV-DNA vorhanden sein. Eine Integration von HPV unter Bildung des Provirus führt im allgemeinen zum Aufbrechen des viralen E2-offenen Leserasters (ORF). Trotz des Aufbrechens des E2-ORF hat eine Prüfung von Zelllinien aus mehreren Zervikalkarzinomen das Vorliegen von transkriptional aktivem und integriertem HPV-16 und HPV-18 ergeben. Wenn HPV-16-Genome, die in den humanen Zervikalkarzinom-Zelllinien SiHa und CaSki vorhanden sind, untersucht werden, treten Unterschiede in der Integration von HPV-16 auf. In der SiHa-Linie erfolgte die einzige HPV-16-Genomintegration an den Basen 3132 und 3384 unter Aufbrechen der E1- und E2-ORFs mit einer Deletion von 0,3 kb. Eine weitere Deletion von 50 Basenpaaren von HPV-16-DNA führte zu einer Fusionierung der E2- und E4-ORFs. Der 5'-Bereich der HPV-16-DNA, der aus dem aufgebrochenen E2-ORF besteht, wird mit kontinuierlichen, humanen, rechten Flankierungssequenzen verknüpft. Ferner wird ein einzelnes zusätzliches Guanin am Nucleotid 1138 in der Mitte des E1-ORF festgestellt. Diese Basenpaaraddition führt zur Fusion der E1a- und E1b-ORFs zu einem einzigen E1-ORF.
  • Das vollständige Genom von HPV-16 ist bei GenBank unter der Hinterlegungsnummer K02718 erhältlich. Das vollständige Genom von HPV-33 ist bei GenBank unter der Hinterlegungsnummer M12732 erhältlich. Das vollständige Genom von HPV-18 ist bei GenBank unter der Hinterlegungsnummer X05015 erhältlich.
  • Im Rahmen eines vorläufigen Screenings wird die Tatsache einer HPV-Infektion bei einer gegebenen zervikalen Biopsieprobe durch eine einfache Analyse vom "Ja/Nein"-Typ festgestellt, wobei man beispielsweise beliebige oder sämtliche der PNAs SEQ ID NOs: 46–53 und eine E2-TBA gemäß den vorstehenden Ausführungen verwendet (d. h. Fragmentierung von DNA, Bindung der PNA, Immobilisierung mit der TBA und Nachweis des Signals mit BNAs und BBAs).
  • Nachdem bei einer Biopsieprobe eine positive Reaktion auf HPV festgestellt worden ist, erhält man zusätzliche Informationen bezüglich des malignen Potentials des HPV durch Analyse des Integrationsstatus des Virus in das humane Genom.
    • 1. Die DNA in der zervikalen Biopsieprobe wird fragmentiert und mit einer Blockierungssonde mit der Sequenz SEQ ID NO: 60 hybridisiert. Diese Sonde bindet an sämtliche Fragmente in der DNA, die nicht aus dem 0,3 kb-Fragment gespleisst worden sind.
    • 2. Die DNA in der Biopsieprobe wird einer PNA mit der Sequenz SEQ ID NO: 61 ausgesetzt. Diese Sonde bindet nur an Fragmente, bei denen das 0,3 kb-Fragment deletiert ist (die Blockierungssonde verhindert die Schleifenbildung der großen, gegebenenfalls vorhandenen Deletionssegmente).
    • 3. Eine PNA mit SEQ ID NO: 62 wird mit SEQ ID NO: 41 unter Bildung einer BBR hybridisiert, die an cro oder den lambda-CI-Repressor als eine BBA bindet, wobei ein einzelsträngiger Bereich zurückbleibt, der zur Hybridisierung mit der TATA-Stelle an SEQ ID NO: 61 befähigt ist. Dieser wird an eine TBR am 5'-Ende der großen Deletion addiert.
    • 4. Die TBR wird durch eine TBA mit einer TATA-Bindungsprotein-DNA-Erkennungseinheit immobilisiert.
    • 5. Die gebundenen Fragmente werden durch Addition von BNAs und BBAs gemäß den vorstehenden Ausführungen nachgewiesen.
  • Der Nachweis eines Signals bei diesem Test zeigt, dass das große Fragment in HPV, das in der TNA vorhanden ist, deletiert ist. Da eine derartige Deletion mit einer malignen Beschaffenheit korreliert, gibt dieser Test Aufschluss über das maligne Potential der HPV-Infektion. Diese Schlussfolgerung kann durch Durchführung eines analogen Tests auf der Basis der Deletion des 52-Basenpaarfragments, das ebenfalls in Korrelation mit einer HPV-induzierten malignen Beschaffenheit steht, bestätigt werden.
  • Die TBP-Erkennungseinheit, die in der TBA für diesen Test verwendet wird, kann beispielsweise aus einer Sequenz, z. B. den Sequenzen SEQ ID NO: 70 oder SEQ ID NO: 93, ausgewählt werden.
  • Beispiel 15 – Herstellung des rekombinanten HIV-LOCKR
  • Phase 1 – Herstellung der DNA zur Erzeugung des HIV-LockR.
  • Es wird eine in vitro-Mutagenese der Kodierungsregion der natürlich vorkommenden, klonierten Komponenten des HIV-LockR, das modifiziert werden muss, mit einem MutaGene Phagemid-Kit, durchgeführt. Das modifizierte Verfahren umfasst die Verwendung eines Blue-script-Plasmids, das jede der Bindungskomponenten von HIV-LockR enthält. Diese werden in kompetente Zellen transformiert und Uracil enthaltende Phagemide werden gezüchtet. Einzelsträngige DNA wird extrahiert und als Matrize für den mutagenen Strang verwendet. Oligonucleotide, die die erwünschten Mutationen enthalten, einschließlich des Einbaus einer neuen Restriktionsstelle, werden synthetisiert und mit Polynucleotid-kinase und ATP behandelt. Die mit Kinase behandelten Oligonucleotide werden an die einzelsträngige Matrize angelagert und ein mutagener Strang wird gemäß dem MutaGene-Verfahren synthetisiert und ligiert, mit der Ausnahme, dass Sequenase 2.0 die Polymerase darstellt. Bibliotheken werden einem Screening unter Verwendung beider γ32P-endmarkierten Nucleotide mit einem Gehalt an Sequenzen, die zu den eingeführten Mutationen komplementär sind, unterzogen, die Plasmid-DNA wird isoliert und die Mutanten werden auf der Grundlage der eingeführten Restriktionsstelle identifiziert. Die Mutationen werden ferner durch Sequenzierung mit einem Sequenase-Kit bestätigt. Die HIV-LockR-DNA wird in das Baculovirus-Expressionssystem mit einem Polyhedron-Promotor kloniert.
  • Phase 2 – Herstellung von HIV-LockR-Proteinen unter Verwendung von Baculovirus.
  • Sf-9-Zellen werden zu einer vorgegebenen Dichte (etwa 1 × 106 Zellen/ml, logarithmische Phase) gezüchtet, mit dem Baculovirus mit einem Gehalt an den HIV-LockR-Instruktionen infiziert und geerntet, um die rekombinanten Proteine mit einem Gehalt an HIV-LockR zu gewinnen. Bei der Vergrößerung des Verfahrensmaßstabs werden Kulturen aus Kolben auf Rotationsvorrichtungen und anschließend auf Bioreaktoren vergrößert. Im Anschluss an die Infektion wird das Protein der Zellen nach 12, 24, 36 und 48 Stunden gewonnen. Während des gesamten Verfahrens werden die Indices für die Lebensfähigkeit überwacht.
  • Phase 3 – Reinigung der HIV-LockR-Proteine.
  • Die geernteten Proteine werden zunächst durch Ultrafiltration von teilchenförmigen Produkten befreit, um die nachgeschaltete Reinigung zu erleichtern. Das zentrifugierte Produkt wird sodann steril filtriert. Extrakte werden 30 Minuten bei 4°C mit 40 000 U/min zentrifugiert und Aliquotanteile werden einer Immunopräzipitation mit polyklonalem Kaninchen-Antikörper gegen eine der HIV-LockR-Komponenten unterzogen. Immunopräzipierte Proteine lässt man an SDS-10 %-PAGE-Gel laufen.
  • Phase 4 – Test auf HIV-LockR-Proteine gegen HIV-DNA.
  • Mobilitätsverschiebungstests werden durchgeführt, wobei man eine Oligonucleotidsonde verwendet, die Elemente der langen terminalen HIV-Wiederholungseinheit und Fragmente mit einem Gehalt an NFKB-bindender DNA in Assoziation mit der leichten kappa-Kette unter Mikroglobulin-Regulation umfasst. Das Oligonucleotid wird an seinen komplementären Strang angelagert und mit γ-32P-ATP endmarkiert.
  • Ein "Fußabdruck" wird durch Kombination einer geringen Menge (10–15 M) an radioaktiv markierter HIV-LTR-DNA mit einer geringfügig größeren Menge an HIV-LockR in Puffer 10 Minuten bei Raumtemperatur vorgenommen. Vor der Zugabe von Protein wird Dithiothreit zugesetzt. Eisen(II), EDTA, Wasserstoffperoxid und Natriumascorbat werden zugesetzt und das Reaktionsgemisch wird inkubiert. Ein Abschreckmittel wird zugegeben und die Produkte werden unter Anwendung von denaturierender Gelelektrophorese analysiert. Dies wird für verschiedene Proteinkonzentrationen durchgeführt. Das erhaltene Gel wird unter Verwendung eines Phosphoimager-Scanners abgebildet und die erhaltene, hoch auflösende Bilddatei wird analysiert, um die Bindungsaffinität für HIV-LockR für die HIV-DNA. relativ zur zellulären DNA getrennt zu bestimmen.
  • Mehrfache Konstruktions- und Testwiederholungen können herangezogen werden, um die Bindung von HIV-LockR und anderen TBAs für HIV und andere Organismen erneut aufzufinden. Dieses Verfahren ermöglicht die Konstruktion von Bindungsanordnungen, so dass die Bindungsanordnung nicht mit dem Wildtypproteinen für einzelne Bindungsstellen in den Genomproben konkurrierend ist. Die Entwicklung von TBAs für andere Organismen und TNAs für Sequenzen innerhalb dieser Organismen kann unter Anwendung des vorerwähnten Verfahrens erfolgen. Dieses Verfahren ist bei der Herstellung von Bindungsanordnungen für sämtliche Nucleinsäure-TBRs, einschließlich DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Hybride und Kombinationen dieser Hybride, wertvoll.
  • Beispiel 16 – Verfahren zum Identifizieren von Nucleinsäure-Bindungsmolekülen zur Herstellung von TBAs und BBAs gemäß der Erfindung
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Zielbindungsanordnungen und Booster-Bindungsanordnungen zusammengesetzt, indem man Nucleinsäure-Bindungsmoleküle identifiziert und die Nucleinsäure-Bindungsbereiche der Moleküle so verknüpft, dass TBAs erhalten werden, die zwischen bestimmten Zielsequenzen und auch eng verwandten Sequenzen unterscheiden. Ein Verfahren zum Identifizieren der Nucleinsäure-Bindungsmoleküle umfasst die folgenden Stufen:
    • 1. Gewinnen einer biologischen Probe mit einem Gehalt an der Zielnucleinsäure. Es kann sich beispielsweise um einen Organismus oder einen mit einem Pathogen infizierten Gewebeextrakt handeln.
    • 2. Fragmentieren der Probe in der Weise, dass die Nucleinsäuren freigesetzt werden und die Größenkomplexizität der Nucleinsäuren in der Probe verringert wird.
    • 3. Kontaktieren eines ersten Aliquotanteils der fragmentierten Nucleinsäuren mit einem Kontrollpuffermedium und Kontaktieren eines zweiten Aliquotanteils der fragmentierten Nucleinsäuren mit dem Kontrollpuffermedium, das ein bekanntes Profil von Nucleinsäure-Bindungsmolekülen enthält.
    • 4. Analysieren der beiden Aliquotanteile zum Identifizieren von Fragmenten, die ein verändertes Verhalten in dem Aliquotanteil aufweisen, der mit den Zielbindungsmolekülen in Kontakt gebracht worden ist, verglichen mit dem Kontrollaliquotanteil. Dies wird durch eindimensionale Gelelektrophorese, zweidimensionale Gelelektrophorese, Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Papierchromatographie oder andere Maßnahmen erreicht, die ein unterschiedliches Verhalten der Nucleinsäurefragmente ergeben, wenn sie an ein Nucleinsäure-Bindungsmolekül gebunden sind, verglichen mit dem Zustand, wenn das Nucleinsäurefragment ungebunden ist.
    • 5. Identifizieren und Isolieren von Fragmenten, die ein verändertes Verhalten zeigen, wenn sie mit dem Nucleinsäure-Bindungsmolekül in Kontakt gebracht werden, und entweder Sequenzieren des Nucleinsäurefragments zur Bestimmung, ob bekannte Nucleinsäure-Bindungsmolekülmotive vorhanden sind, oder direktes Identifizieren des Nucleinsäure-Bindungsmoleküls, das an die Nucleinsäure gebunden ist. Der letztgenannte Vorgang lässt sich beispielsweise durchführen, indem man ein zweidimensionales Gitter der der Elektrophorese unterworfenen Nucleinsäuren mit unterschiedlich markierten Antikörpern in Kontakt bringt, die an die verschiedenen Nucleinsäure-Bindungsmoleküle binden.
  • Bei diesem Verfahren werden vorzugsweise Nucleinsäuremotive für diagnostische oder therapeutische Zwecke verwendet, wobei die Zielnucleinsäure mehr als ein einziges verwendbares Nucleinsäure-Bindungsmolekülziel aufweist. Auf diese Weise lässt sich eine komplexe Zielbindungsanordnung erzeugen, die die Nachbarschaft von verschiedenen Nucleinsäure-Bindungsmolekülmotiven ausnützt, um die Spezifität der TBA, die aus den einzelnen identifizierten Nucleinsäure-Bindungskomponenten zusammengebaut ist, zu verstärken. Die verschiedenen Nucleinsäure-Bindungsbereiche der Nucleinsäure-Bindungsmoleküle können sodann zu vollständigen TBAs zusammengesetzt werden, wie es vorstehend beispielsweise für HIV-LockR beschrieben worden ist.
  • Beispiel 17 – Verfahren zum Identifizieren von spezifischen RNA-Sequenzen in einer Probe
  • Mit den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen lassen sich beliebige Nucleinsäuresequenzen spezifisch identifizieren. Die Identifizierung einer Ziel-HIV-RNA in einer Probe wird erreicht, indem man vom Patienten eine Probe von Blut oder einer anderen biologischen Flüssigkeit oder einen Extrakt gewinnt, der möglicherweise die HIV-RNA enthält und einen Test auf die Anwesenheit von TAR-Bindungsstellen durchführt. Tat ist ein positiver Regulator der HIV-Replikation, der an die TAR-Region von HIV-RNA bindet. Die kleinste, natürlich auftretende, vollständig aktive Form von HIV-Tat weist eine Länge von 72 Aminosäuren auf, nämlich SEQ ID NO: 118. Tat enthält mindestens zwei funktionelle Domänen und transaktiviert die Genexpression von der langen terminalen HIV-Wiederholungseinheit (HIV-LTR). Tat bindet an eine RNA-Stammschleifenstruktur, die durch Selbsthybridisierung von Sequenzen in TAR gebildet wird, unmittelbar in 5'-Stellung zur HIV-LTR. HIV-TAR-RNA bildet einen Dinucleotid-Vorsprung und zwei Stammschleifenstrukturen (Rhim et al., Virology, Bd. 202 (1994), S. 202–211). Das Tat (SEQ ID NO: 118) bindet diese Struktur mit geringerer Avidität als Tat-Varianten, bei denen es sich bei Ala58 um einen Threoninrest handelt oder bei denen es sich bei His65 um einen Asp-Rest handelt (Derse et al., Virology, Bd. 194 (1993), S. 530–536). Unter Ausnutzung dieser Tatsachen wird das erfindungsgemäße Verfahren durch folgende Maßnahmen durchgeführt:
    • 1. Fragmentieren einer biologischen Probe, um die Nucleinsäuren freizusetzen und die Größenkomplexizität der Nucleinsäuren zu verringern.
    • 2. Kontaktieren einer TBA mit der Probe, die eine Hybrid-TAR-Bindungsproteinsequenz und eine benachbarte flankierende Sequenz im HIV-Genom identifiziert. Die zu diesem Zweck verwendete TBA wird an cro als Begleiter zusammengesetzt, wobei Tat als das spezifische HIV-RNA-Bindungsmolekül verwendet wird. Um Spezifität zu gewährleisten, so dass ein "Crosstalk" zwischen der HIV-TAR-Stelle und eng verwandten TAR-Stellen, die aufgrund von anderen Pathogenen, wie Cytomegalovirus, vorhanden sein können, vermieden wird, weist die TBA ferner eine Antikörper-Komponente auf, die die DNA-RNA-Hybrid-Zielbindungsregion erkennt, die gebildet wird, wenn eine Sondennucleinsäure die HIV-LTR-RNA bindet.
    • 3. Beseitigen eines jeglichen "Crosstalk", das durch die Bindung von Tat an die TAR-Region der HIV-RNA aufgrund von Verunreinigungen (Cousin-RNAs), wie die CMV-TAR-Sequenz, entsteht, durch Kontaktieren des Reaktionsgemisches mit überschüssiger Tat-Varianten (entweder die Ala58-Variante anstelle von Thr oder die His65-Variante anstelle von Asp), die mit größerer Avidität binden. Auf diese Weise werden einzelne Bindungsereignisse aufgrund der TBA-Bindung an Cousin-RNAs aus der Nucleinsäureprobe durch die Tat-Variante bekämpft. Andererseits wird durch entsprechende Auswahl der Affinität der Doppelbindung, die als Ergebnis von Antikörper und Tat erreicht wird, die TBA nicht von echten Zielen verdrängt. Dieses Verfahren wird in 16 erläutert. Gemäß einem weiteren Aspekt des gleichen Verfahrens kann es sich bei der TBA um ein Produkt handeln, bei dem anstelle der Verwendung einer Variante von Tat ein Antikörper verwendet wird, der dieses Nucleinsäuresegment erkennt, und die TBA wird als Doppelantikörper-TBA verwendet.
  • Bei einer alternativen Version dieses Verfahrens kann eine Sondennucleinsäure verwendet werden, die mit der HIV-LTR-RNA hybridisiert. Demgemäß kann ein Duplexsegment der LTR-sp1-Stellen als Bestandteil der Zielbindungsregion geschaffen werden. Diese Region der HIV-RNA flankiert die TAR-Region, die in 5'-Stellung zur LTR steht, sich aber in enger Nachbarschaft hierzu befindet. Eine TBA mit einem Gehalt an Tat und zwei Sp1-Bindungseinheiten wird begleitet, um eine Tat-Bindung an TAR und eine Sp1-Bindung an die Sp1-Bindungsstellen zu erreichen. Anschließend werden eine Amplifikation und ein Nachweis durch Addieren geeigneter BNAs, BBAs und HNAs durchgeführt. Gemäß einer weiteren Alternative können PNAs mit SEQ ID NO: 38 und SEQ ID NO: 39 (vergl. 7) verwendet werden. Eine TBA wird verwendet, die eine oder mehrere Sp1-Bindungseinheiten und eine Antikörpereinheit enthält, die an das DNA-RNA-Hybrid bindet, das aus der Proben-RNA und SEQ ID NO: 38-PNA erzeugt worden ist. Sodann werden zur Amplifikation des Signals geeignete BNAs, BBAs und HNAs addiert.
  • Selbstverständlich erkennt der Fachmann, dass andere TBA- und TNA-Kombinationen zur Optimierung der hier beispielhaft aufgeführten Verfahren verwendet werden können.
  • Es ist ersichtlich, dass die hier bereitgestellten Sequenzen nur beispielhaften Charakter haben und dass andere ähnliche Sequenzen, die dadurch nahegelegt werden, in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können. Ferner ist es ersichtlich, dass zwar beliebige Sequenzen, die hier bereitgestellt werden, als linear anzusehen sind, diese aber auch in kreisförmiger oder anderweitig abgeänderter Form verwendet werden können. Ferner werden die Sequenzen als nicht-antisense bezeichnet, sie können aber in der kodierenden oder nicht-kodierenden Form oder zur Bindung an kodierende oder nicht-kodierende komplementäre Sequenzen verwendet werden. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (14)

  1. Sondennucleinsäure (PNA), umfassend zwei verschiedene Sequenzen, bei denen es sich handelt um (a) eine einzelsträngige Sequenz (1/2-TBR), die unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung eines Hybrids (TBR) mit einer Zielnucleinsäure (TNA) befähigt ist; und (b) eine einzelsträngige Sequenz (1/2-BBR), die unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung eines Hybrids (BBR) mit einer in einer Booster-Nucleinsäure (BNA) vorhandenen einzelsträngigen Sequenz befähigt ist; wobei die TBR mit hoher Affinität zur Bindung an eine Substanz (TBA) befähigt ist, die zur Unterscheidung zwischen einem gepaarten Hybrid (TBR) und einem Hybrid mit ungepaarten Nucleotiden befähigt ist, und wobei die BBR mit hoher Affinität zur Bindung an eine Substanz (BBA) befähigt ist, die zur Unterscheidung zwischen einem gepaarten Hybrid (BBR) und einem Hybrid mit ungepaarten Nucleotiden befähigt ist.
  2. PNA nach Anspruch 1, wobei die TBR aus einer oder mehreren Erkennungsstellen für ein Nucleinsäure-Bindungsprotein, ein DNA-Bindungsprotein, ein DNA-RNA-Hybrid-Bindungsprotein oder ein RNA-Bindungsprotein besteht.
  3. PNA nach Anspruch 2, wobei die TBR eine Nucleinsäure-Bindungsprotein-Erkennungsstelle ist, die im Genom eines Pathogens vorhanden ist, oder eine Bindungsstelle, die mit einem pathogenen Zustand in einem Wirbeltiergenom assoziiert ist, oder eine Nucleinsäure-Bindungsprotein-Erkennungsstelle, die im Genom eines Organismus, der einen Fermentationsvorgang kontaminiert, vorhanden ist.
  4. PNA nach Anspruch 2, wobei es sich bei der TBR um HIV-LTR oder einen Teil davon handelt.
  5. Verfahren zum Nachweisen oder Lokalisieren einer spezifischen TNA-Sequenz, umfassend die folgenden Stufen: (a) Hybridisieren der TNA mit der PNA von Anspruch 1; (b) Hybridisieren der PNA mit einer BNA mit einem Gehalt an 1/2-BBR, dessen Sequenz zu einer 1/2-BBR-Sequenz in der PNA komplementär ist; (c) Zugeben der Produkte der Stufen (a) und (b) mit einem Gehalt an einer TBR und einer BBR zu einer Oberfläche, einer Flüssigkeit oder einem anderen Medium mit einem Gehalt an einer TBA; (d) Zugeben von BBAs zu dem Gemisch von Stufe (c), wobei die BBA folgendes umfasst: (i) ein Molekül oder einen Teil eines Moleküls, die zur selektiven Bindung an ein BBR befähigt sind; (ii) einen nachweisbaren Indikator; und (c) Nachweisen eines Signals, das durch den an die BBA befestigten Indikator erzeugt worden ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich beim Indikator um ein Protein, unter Einschluss von Enzymen, die zur Katalyse von Reaktionen befähigt sind, die zur Bildung von gefärbten Reaktionsprodukten führen; ein Radionuclid; oder gefärbte Perlen handelt.
  7. In vitro-Verfahren zum Amplifizieren des durch Bindung der PNA von Anspruch 1 an eine TNA erhaltenen Signals, umfassend die Bindung von BNAs an das PNA-TNA-Hybrid und die Bindung von markierten BBAs an die BNAs.
  8. Verfahren zum Nachweisen oder Lokalisieren von spezifischen Nucleinsäuresequenzen mit hochgradiger Empfindlichkeit und Spezifität, umfassend: (a) das Zugeben von PNAs gemäß der Definition in Anspruch 1 mit einem Gehalt an einer 1/2-BBR und einer 1/2-TBR zu einer Probe, die 1/2-TBR-Sequenzen enthält oder bei der ein solcher Gehalt vermutet wird, unter Bildung eines Komplexes mit Zielbindungsregionen, TBRs, die durch die Hybridisierung von komplementären 1/2-TBRs, die in den PNAs bzw. TNAs vorhanden sind, gebildet worden sind; (b) Binden der in Stufe (a) gebildeten TBRs an eine immobilisierte TBA unter Bildung eines TBA-TNA-PNA-Komplexes; (c) Zugeben von Booster-Nucleinsäuren, BNAs, mit einem Gehalt an Booster-Bindungsregionen, 1/2-BBRs, zu dem in Stufe (b) gebildeten Komplex, so dass die 1/2-BBRs in den BNAs mit den 1/2-BBR-Sequenzen, die in den PNAs vorhanden sind, oder mit 1/2-BBRs, die in den BNAs bereits an die PNA gebunden sind, hybridisieren, um BBRs zu bilden, so dass TBA-TNA-PNA-(BNA)n-Komplexe gebildet werden; (d) Zugeben von Haarnadel-Nucleinsäuren, HNAs, mit einem Gehalt an 1/2-BBR-Sequenzen zu dem in Stufe (c) gebildeten Komplex, so dass die 1/2-BBRs in den HNAs mit etwaigen verfügbaren 1/2-BBR-Sequenzen, die in den BNAs des Komplexes von Stufe (c) vorhanden sind, hybridisieren, wodurch die Erweiterung der BNAs an den TBA-TNA-PNA-(BNA)n-Komplexen von Stufe (c) unter Bildung von TBA-TNA-PNA-(BNA)n-HNA-Komplexen verkappt werden; (e) Zugeben von Booster-Bindungsanordnungen, BBAs, die mit Indikatorresten verknüpft sind, zu den in Stufe (d) gebildeten TBA-TNA-PNA-(BNA)n-HNA-Komplexen unter Bildung von TBA-TNA-PNA-(BNA-BBA)n-HNA-Komplexen; und (f) Nachweisen der Signale, die durch die Indikatorreste erzeugt worden sind, die mit den TBAs, PNAs, BNAs, BBAs oder HNAs in den TBA-TNA-PNA-(BNA-BBA)n-HNA-Komplexen von Stufe (e) verknüpft sind; wobei die TNA folgendes umfasst: (i) eine oder mehrere spezifische 1/2-TBR-Nucleinsäuresequenzen, deren Anwesenheit oder Abwesenheit in einer bestimmten Probe zu bestätigen ist; wobei die BNA folgendes umfasst: (i) ein 1/2-BBR gemäß Darstellung in 1 (IIb), die eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einer 1/2-BBR-Sequenz in einer PNA ist und die unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung eines Hybrids, HBR, mit der PNA befähigt ist; (ii) eine OSA, bei der es sich um einen nicht befestigten Träger oder Indikator oder um einen befestigten Träger oder eine andere Lokalisierungseinrichtung handelt, einschließlich, aber ohne Beschränkung hierauf, eine Befestigung an Perlen, Polymeren und Oberflächen, und/oder Indikatoren; (iii) zusätzliche Hybridisierungsstellen, 1/2-BBRs, für andere BNAs; und (iv) Sequenzen, 1/2-BBRs, die mit BNAs, die bereits mit der PNA hybridisiert sind, hybridisieren könnten; wobei die BBA folgendes umfasst: (i) ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, die zur selektiven Bindung an eine BBR befähigt sind; und (ii) eine OSA, bei der es sich um einen nicht befestigten Träger und/oder Indikator oder einen befestigten Träger oder eine andere Lokalisierungseinrichtung handelt, einschließlich, aber ohne Beschränkung hierauf, eine Befestigung an Perlen, Polymeren und Oberflächen, und/oder Indikatoren; und die TBA folgendes umfasst: (i) ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, die zur selektiven Bindung an eine TBR befähigt sind; und (ii) einen nicht befestigten Träger und/oder Indikator oder einen befestigten Träger oder eine andere Lokalisierungseinrichtung, unter Einschluss, aber ohne Beschränkung hierauf, einer Befestigung an Perlen, Polymere und Oberflächen, und/oder Indikatoren.
  9. Festphasen-Hybridisierungsverfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Zielpolynucleotids unter Verwendung einer PNA nach Anspruch 1, beinhaltend das Immobilisieren eines Zielpolynucleotids, sofern es in einer Testprobe vorhanden ist, auf direktem Wege oder über eine Zwischenabfangstruktur an einer festen Phase an einer Abfangstelle; vor, während oder nach der Immobilisierung das Befestigen einer nachweisbaren Markierung am Zielpolynucleotid, sofern vorhanden; und das Nachweisen dieser Markierung, sofern vorhanden, an der Abfangstelle; wobei die Immobilisierung die Verwendung einer Ziel-Bindungsanordnung (TBA) umfasst, die nur an ein besonderes Hybrid der Zielnucleinsäure und einer Sondennucleinsäure (PNA) bindet, die eine 1/2-BBR umfasst, die zur Bindung einer Booster-Nucleinsäure (BNA) befähigt ist, die ein einzelsträngiges, komplementäres 1/2-BBR enthält, das bei Hybridisierung mit der 1/2-BBR in der PNA eine BBR bindet, die zur Bindung von markierten Booster-Bindungsanordnungen (BBAs) befähigt ist, wobei die Ausdrücke TBA, BNA, BBR und BNA der Definition in Anspruch 1 entsprechen.
  10. Diagnostisches oder forensisches Testkit zum Nachweisen einer Zielnucleinsäuresequenz in einer Probe einer Nucleinsäure, umfassend erste und zweite Nucleinsäuresonden und erste und zweite Nucleinsäure-Bindungsproteine, wobei die erste Sonde eine zur Zielsequenz komplementäre Sequenz und eine zusätzliche Sequenz aufweist; wobei das erste Bindungsprotein spezifisch für den erste Sonde-Ziel-Duplex ist; wobei die zweite Sonde komplementär zur zusätzlichen Sequenz an der ersten Sonde ist; und wobei das zweite Bindungsprotein spezifisch an den erste Sonde-zweite Sonde-Duplex bindet und mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.
  11. Kit nach Anspruch 10, wobei die erste Sonde komplementär zu HIV-LTR ist und bei Hybridisierung der ersten Sonde mit HIV-LTR eine Bindungsstelle für NF-kB oder eine Untereinheit davon, SP1, TATA-Bindungsprotein, HIV-Detect I, II, III oder IV oder HIV-Lock, gebildet wird.
  12. Kit nach Anspruch 11, wobei es sich beim ersten Bindungsprotein um NF-kB oder eine Untereinheit davon, SP1, TATA-Bindungsprotein, HIV-Detect I, II, III oder IV oder HIV-Lock, handelt.
  13. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die erste Sonde zusätzlich zu ihrer komplementären Beschaffenheit zu HIV-LTR eine Sequenz umfasst, die für den linken oder rechten Operator des lambda-Bakteriophagen kodiert, und die zweite Sonde eine Sequenz umfasst, die zur linken oder rechten Operatorsequenz des lambda-Bakteriophagen komplementär ist, so dass bei Hybridisierung der ersten und zweiten Sonde eine Bindungsstelle für das CI-Repressorprotein des lambda-Bakteriophagen, das cro-Protein des lambda-Bakteriophagen oder ein Derivat oder ein Homologes davon gebildet wird.
  14. Kit nach Anspruch 13, wobei es sich beim zweiten Bindungsprotein um das CI-Repressorprotein des lambda-Bakteriophagen, das cro-Protein des lambda-Bakteriophagen oder ein Derivat oder ein Homologes davon handelt.
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