CN1176663A - 用特定序列组合体检测核酸的方法 - Google Patents

用特定序列组合体检测核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1176663A
CN1176663A CN95197558.7A CN95197558A CN1176663A CN 1176663 A CN1176663 A CN 1176663A CN 95197558 A CN95197558 A CN 95197558A CN 1176663 A CN1176663 A CN 1176663A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
seq
tba
pna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN95197558.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1255551C (zh
Inventor
苏珊·威恩英格
阿瑟·M·威恩英格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gene Pool Inc
Original Assignee
Gene Pool Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gene Pool Inc filed Critical Gene Pool Inc
Publication of CN1176663A publication Critical patent/CN1176663A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1255551C publication Critical patent/CN1255551C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明是一种具有高度灵敏性和特异性的检测和定位样品中特定核酸序列的新方法。该方法和该方法中使用的新组合体涉及使用探针核酸、产生核酸结合区和使用靶核酸结合装配体来检测和定位靶核酸。即使存在具有类似序列的核酸,该方法也可以完成所说靶核酸的检测和定位。该方法使得各个特定结合事件所产生的信号高度扩增。具体地说,所说方法和组合体提供来用于检测样品中HIV和HPV核酸。这些方法和组合体可以用于疾病诊断、遗传监测、法医侦探以及核酸混合物分析。用于所说检测方法中的某些新组合体在预防或治疗病原性疾病上有用。

Description

用特定序列组合体检测核酸的方法
发明背景1.发明所属技术领域
本发明提供了用于结合、检测和扩增样品中特定靶核酸序列检测结果(即使在有密切相关但不同的核酸存在下)的具有真实性和准确性的方法和组合体(composition)。所说的结合可以涉及将特定分子陪伴和装配成靶结合装配体，该装配体特异性地与由探针核酸和靶核酸序列杂交形成的靶结合区结合。所说的扩增可以涉及将特定分子陪伴和/或装配成辅助(booster)结合装配体，该装配体特异性地与由辅助核酸和探针核酸、靶核酸序列或其它辅助核酸杂交形成的辅助靶结合区结合。本发明也提供了一种涉及发夹核酸的方法和组合体，其提供来控制用于扩增中的特异性或非特异性伸延的辅助核酸和辅助结合装配体的大小。所说的检测涉及提供一种或几种检测标记，包括放射性、光或荧光发射酶以其它可检测的或可产生信号的分子，这些标记与探针核酸、靶结合装配体、辅助核酸、辅助核酸装配体或者发夹核酸相关联。本发明也提供了一种用于从生物体分离核酸片段的方法，所说核酸片段具有产生探针核酸和对所说片段和/或生物体唯一的TBA的TBA组份结合位点。本发明还提供了靶结合装配体在预防和治疗上的用途和用于这种用途的组合物(composition)。2.背景和相关技术的描述
在越来越多的场合，从样品中检测包含特定序列的核酸(此后称为靶核酸(TNA))是十分重要的。需要能够用最少的步骤，最简单的组份检测TNA，并排除其它类似的但不同的核酸(此后称为表亲核酸(CNA))的干扰。不需要扩增或其它检测后的步骤就可以检测特定的TNA并可以排除任何和所有表亲分子是合乎需要的。
尽管具有许多用固定化的或者标记的核酸作为探针检测TNA的方法，但是使用目前已知手段来区分与探针核酸(PNA)结合的TNA和与PNA结合的CNA。例如，CNA和PNA之间的一个或多个错配碱基仍可以导致无法和TNA-PNA杂交区分开来的CNA-PNA杂交。因此杂交本身并不是一个可用来表明PNA已经和唯一的TNA杂交的理想的指示。
具有许多场合，其中PNA会被用来试图确定在含有CNA的样品中TNA存在与否。如果没有附加的证实，在这种情况下PNA和任何CNA杂交会限制PNA用来检测TNA的应当具有的诊断值。而且，可以从含有许多CNA拷贝的样品中检测和定位低拷贝数的TNA而不需要产生额外的TNA拷贝是合乎需要的。可以证实CNA的存在(不依赖于TNA)而不需要样品中的TNA和CNA也是合乎需要的。
另外，能够扩增信号即使是特定TNA-PNA低频率杂交的信号是合乎需要的。为此目的，一种聚合标记的多个拷贝(此后称为辅助核酸(BNA))到TNA-PNA上的方法将是合乎需要的。
本发明提供了达到以上所期望的目的的方法，正如如下所综述的，本发明的组合体和方法在现有技术中还没有被报道过或者提示过。Keller，H.，M.M.Manak(1989)的DNA探针一书提供了本领域核酸检测状态的全面的和广泛的回顾。
一种用化学方法检测碱基错配以决定PNA杂交于CNA而不是TNA的方法已有报道。在Ford等的美国专利4,794,075中，讨论了一种把含有单一碱基错配的DNA片段和其完全配对的类似物区分开来的方法。双链片段中的单链区域被碳化二亚胺修饰，碳化二亚胺与未配对的鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)残基反应。线性双链DNA分子则不和碳化二亚胺反应，但含有单个碱基错配的DNA则定量地反应。在和碳化二亚胺反应后，将DNA分子在高浓度的聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，以便区分修饰和非修饰的片段。Ford等人使用这一技术来定位并纯化DNA序列(由于表型变异和遗传疾病产生了差异)。尽管这一方法在跟踪遗传物质的变异上有用，但这一方法需要许多步骤，需要昂贵的组份，而且这一方法不能提供直接的手段来确定PNA已杂交到样品中的除CNA之外的TNA上。
有些尝试试图确定至少一部份PNA和其它核酸之间的杂交是互补的。一种方法涉及检测转录产物，如果PNA杂交到核酸上足以被从包含在探针中的启动子转录，则产生该转录产物。在授给Dattagupta的美国专利5,215,899中公开了如何经过发夹探针扩增特定核酸序列，所说发夹探针在杂交并连接到靶序列上后能够被转录。所说探针包含单链的自身互补的序列，其在杂交条件下形成具有功能性启动子区的发夹结构，该探针还包含从发夹序列3′末端延伸的单链探针序列。一旦与互补于探针序列的靶序列杂交并且杂交的靶序列的3′末端和发夹探针的5′末端连接，在合适的RNA聚合酶和适当的核糖核苷三磷酸(rNTPs)存在下，所说靶序列就成为可转录的。通过将所需TNA序列与探针杂交，将TNA与PNA连接，将RNA聚合酶和rNTPs添加到分离的杂交体中，并使转录进行直到积累所需量的RNA转录产物来完成扩增。所说方法一般来说和具体地说涉及使用由单链未配对末端形成的发夹DNA来退火靶序列。当靶序列结合后，就能产生RNA转录产物。因此，所说方法涉及检测二级转录产物而不是用核酸结合装配体直接固定化和/或定位靶序列。CNA易于结合探针，互补性的缺乏并不一定干扰CNA-PNA杂交体的形成，所述杂交体会支持不需要的转录产物的形成。
如果互补性的缺乏干扰被限制性内切酶切割的杂交体CHA-PNA对的敏感性，结合到PNA上的CNA也可被检测。在Urdea的美国专利5,118,605和4,775,619提供了一些新的检测核酸分析物的方法。这些方法使用具有基本上同源于分析物中兴趣序列的寡核苷酸的多核苷酸。在预定的严格条件下，杂交的存在与否决定标记从支持物上的释放。多种方法被用来将标记结合到支持物上。当单链或双链裂解后，标记便可以从支持物释放，标记的释放可以被检测，作为样品中是否存在特定的多核苷酸序列的指示。但这一技术具有其缺点，因为尽管具有错，只要这一错配在内切酶识别位点之外，CNA-PNA对仍然可被限制性内切酶切割，此缺点将导致鉴别CNA-PNA杂交体的失败。
另一种方法用分支的DNA探针来检测核酸，授给Urdea的美国专利5,124,246公开了在生化分析中作为扩增子有用的直链或分支寡核苷酸多聚体，其包含：①至少一个和兴趣单链寡核苷酸序列(TNA)互补的第一单链寡核苷酸单位(PNA)，和②多重的第二单链寡核苷酸单位，其互补于单链标记的寡核苷酸。尽管描述了扩增的夹心核酸杂交和使用多聚体的免疫测定，但由于PNA-CNA间的杂交仍可以发生并导致产生不需要的信号，该方法具有局限性。
除了用来鉴别TNA的方法外，用来扩增这一DNA的方法也以公开。在授给Urdea的美国专利5,200,314中，具有分析物序列(TNA)的分析物多核苷酸链通过将所说的分析物多核苷酸在杂交条件下与捕获探针(PNA)接触在含有多核苷酸的样品中进行检测，所述捕获探针具有特异于TNA的第一结合配偶体(partner)，和特异于固相第三结合配偶体的第二结合序列。然后经结合配偶体之间的特异性结合将所形成的双链固定化，并从结合的物种上分离非结合的寡核苷酸。分析物多核苷酸可以也可以不从固相转移，然后经PCR扩增。每个PCR引物都具有可以和分析物多核苷酸杂交的多核苷酸区，至少一个引物还含有可以和固相结合配偶体结合的附加结合配偶体，扩增的产物经结合配偶体间的特异性结合从反应物混合物分离。并检测扩增产物。尽管(通过PCR)证实特定的核酸已和PNA杂交是可能的，但此种证实费用昂贵并且涉及多个步骤。
至于牵涉到双链核酸和DNA结合蛋白相互作用的报道，用含有单一蛋白结合位点的固定化DNA序列用于提纯此单一蛋白的方法已有描述。授给Kawaguchi的美国专利5,122,600公开了包含DNA链和载体的DNA-固定化的小球以及用此小球分离蛋白的方法，所述DNA链具有特异性结合特定蛋白质的碱基序列，所述载体具有不大于50μm不少于0.01μm的粒子大小，并不吸附任何蛋白质，所说的载体和所说的DNA链由化学键相互连接。由于这是一种蛋白质纯化方法，它既没有公开检测TNA的方法，也没有披露为了检测和定位特定TNA序列而使多于一种以上的蛋白质结合到双链核酸上的方法。
在EP0 453 301中，描述了一种用来检测样品中多核苷酸靶的方法。在此方法中，TNA中的序列由第一和第二PNA杂交到TNA上来检测。所述第一和第二PNA各自具有一段预先形成的双链序列或含有由链延伸形成的双链，其可以和核苷酸序列特异结合蛋白结合。没有公开也没有指出仅基于PNA与TNA之间形成双链，将核苷酸特异性结合蛋白结合到TNA和PNA之间形成的双链上的方法。
在美国专利4,556,643中，公开了一种非放射检测样品中的特定核苷酸序列的方法，其涉及含有DNA结合蛋白特异序列的探针的杂交。但这一公开既没有教导也没有提示这样一种方法，即仅基于存在于PNA中的序列与存在于TNA中的序列之间形成双链，将核苷酸特异性结合蛋白结合到TNA和PNA之间形成的双链上。发明概要
本发明公开了一种经采用探针核酸(PNA)检测特定靶核酸(TNA)序列的方法，所述探针在和TNA杂交后，可以和靶结合装配体(TBA)结合。每一个TBA结合至少一个PNA-TNA杂交对特异性区，靶结合区(TBR)。TBA由一个或多个分子组成，一个或多个此种分子以特异性和序列或构象依赖性方式结合到TBR上。TBA可含有一个或多个先导(piloting)序列，叫做“PILOTS”或“不对称序列”，其装配并限制TBA的核酸结合部份到特定的区域。PILOTS的作用是按照事先决定的方式形式装配特定核酸识别单位或其它先导物(pilots)(特定核酸识别单位连接到其上)成TBA。TBA也可含有一个或多个能够锚定或定位TBA的分子。本发明也公开了具有独特特征的新TBA，所述特征出人意料地不仅使TBA作为诊断工具有用，也使其作为预防和治疗化合物有用。本发明所公开的是有关利用PNA、TBR、TBA和TBA PILOTS的方法和组合体，包括用它们作为诊断及法医试验试剂盒的组份，和用新TBA作为预防和治疗剂。
除了TNA特异性序列外，PNA还可以含有一种或几种可以和在辅助核酸(BBR)中1/2 BBR互补杂交的序列1/2BBR。通过加入BNA到存在于PNA中起始1/2BBR上的杂交，以PNA-BNA的形式，然后以BNA-BNA杂交体的形式进行PNA的延伸。这些延伸产物可以含有一个或多个辅助结合区(BBR)，每一个BBR都具有结合辅助结合装配体(BBA)的能力。BBA由分子组成，其中的一个或多个分子可以以特异性和序列或构象依赖性方式和BBR结合。BBA可含有一个或多个先导序列，叫做“PILOTS”或“不对称序列”，其装配并限制TBA的核酸结合部份到特定的区域。PILOTS的作用是按照事先决定的方式形式装配特定核酸识别单位或其它先导物(pilots)(特定核酸识别单位连接到其上)成BBA。BBA也可含有锚定或定位BBA的分子，或者使得可以检测结合的BBA并从而检测TBA-TNA-PNA复合体(它们依次结合于其上)。本发明所公开的是有关利用1/2 BBR、BNA、BBR、BBA和BBA PILOTS的方法和组合体，包括用它们作为诊断及法医试验试剂盒的组份。
本发明公开了使用发夹核酸(HNA)作为加帽结构的方法和组合体。所述HNA含有自我杂交区和1/2 BBR单链区，在杂交条件下，其可和PNA中的1/2 BBR或者已结合到PNA上的BNA中的1/2 BBR杂交，终止BNA延伸到PNA或其它BNA上。
本发明公开了用于检测、定位和区分特定核酸序列的试验方法和产生包含PNA、TBA、TBR、BNA、BBR、BBA和HNA的试验试剂盒的方法和组合体，所述核酸序列包括在人细胞、人免疫缺损病毒(HIV)、人乳头状瘤病毒(HPV)和包括病毒和细胞在内的其它含核酸的体系中发现的核酸序列。
因此，本发明的一个目的是提供用于结合、检测和扩增检测样品中特定靶核酸序列(即使在有密切相关但不同的核酸存在下)的具有真实性和准确性的方法和组合体。
因此，本发明的一个目的是提供用于制备特异地和由探针核酸序列和靶核酸序列杂交所形成的靶结合区结合的靶结合装配体的方法和组合体。
本发明的另一个目的是提供用于制备特异地和由辅助核酸序列和探针核酸、辅助核酸和发夹核酸杂交所形成的辅助结合区结合的辅助结合装配体的方法和组合体。
本发明的另一目的是提供涉及发夹核酸的方法和组合体，所述发夹核酸可以控制用于扩增PNA-TNA杂交事件中的特异或非特异延伸的辅助核酸和辅助结合装配体的大小。
本发明的另一目的是提供用于选择、装配和陪伴特定核酸分子(每一个都具有核酸结合的辨别能力)成为靶和辅助结合装配体的方法和组合体。
本发明的另一目的是提供用于用辅助结合装配体和辅助核酸扩增检测结合到靶结合区上的靶结合装配体的方法和组合体。
本发明的另一目的是提供使得可以使用一种或多种可检测标记的方法和组合体，所述标记包括但不限于放射性标记，发光，荧光、酶促或其它信号产生分子。这些标记物在与探针核酸、靶结合装配体、辅助结合装配体、辅助核酸或发夹核酸相关的场合下使用。
本发明的另一目的是提供用于从生物体分离核酸片段的方法，所说核酸片段具有产生探针核酸和对所说片段或生物体唯一的TBA的TBA组份结合位点。附图简要说明
下列说明包含在图1中：图1-I是含有1/2 TBR和1/2 BBR的PNA，其是互补于TNA的单链序列；图1-IIA是TNA，图1-I的组份添加于其上，在杂交条件下，其结合PNA形成图1-IIIA的组份PNA-TNA杂交体，该杂交体含有至少一个TBR；图1-IVA是BNA，图1-IIIA的组份添加于其上，在杂交条件下，其结合图1-IIIA的1/2 BBR形成图PNA-BNA杂交体，该杂交体含有图1-VA所示的BBR。
图1-IIB是BNA，图1-I的组份添加于其上，在杂交条件下，其结合PNA形成图1-IIIB的组份PNA-TNA杂交体，该杂交体含有BBR；图1-VIA是TNA，图1-IIIB的组份添加于其上，在杂交条件下，其结合图1-IIIB的1/2 TBR形成PNA-BNA杂交体，该杂交体含有图1-VB所示的TBR。
图1-IIC是HNA，图1-I的组份添加于其上，在杂交条件下，其结合PNA形成图1-IIIC的组份PNA-HNA杂交体，该杂交体含有BBR；图1-VIC是TNA，图1-IIIC的组份添加于其上，在杂交条件下，其结合图1-IIIC的1/2 TBR形成PNA-BNA杂交体，该杂交体含有图1-VC所示的BBR。
所说的形成TBR和BBR的杂交体在本发明中是有用的，如图1所示，PNA和BNA可以包含非连接的支持物和/或指示剂(OSA)，或者连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；
图2A是BNA聚合到PNA上和由HNA加帽的策略的示意图。
图2B是经聚合BNA和加帽HNA来扩增PNA-TNA信号的策略的示意图。
图3是显示使用每个BNA含有多个1/2 BBR的BNA的示意图。
图4A是显示TBA和BBA与TBR和BBR结合，以及TBA辨别TNA和CNA的能力的示意图。按照这一实施方案，如果TBA固定在小珠、微量滴定平板表面或任何其它这样的表面上，则只有复合体例如复合体X被保留和检测，而诸如复合体XI之类的复合体不被保留和检测。
图4B是解释类似图4A所示的但在发生的顺序上略有不同那些事件的示意图。
图5是解释含有一个1/2 TBR和不含1/2 BBR的PNA到含有高达五个1/2TBR和一个1/2 BBR的PNA的示意图。每一数码(I，II，III，IV，V)的(A)和(B)成员形成一组，其在杂交到TNA上时，给((A)成员)或不给((B)成员)TBR提供可利用的1/2 BBR(用于经杂交到具有互补1/2 BBR的BNA上的扩增)。
图6A是解释含两个1/2 TBR的特定的TNA的示意图，当与PNA结合时，其形成两个密切相关的TBR，这两个TBR可以和两个TBA结合。一个1/2 BBR也被提供来供扩增使用。
图6B是显示与与图6A中相同的事件的示意图，所不同的是使用双TBA，以便在正常细胞样品中出现的单个TBR之间的区别可以与异常的双TBR相区别。
图6C是显示与图6A相同的方案的示意图，所不同的是TNA中的5个TBR被辨明。每一TBR可以与相同或不相同的TBA结合。TBA可以用不同的标记物标记，以便确定TNA中存在五个位点。
图6D是显示与图6C相似的相同事件的示意图，所不同的是显示了双TBA，扩展了图6B所示的对双TBA的使用。图6A，6B，6C和6D中的II项是HIV单链DNA或RNA。
图7显示作为TNA的HIV LTR和两个PNA以及用此PNA检测TNA的策略。
图8是本发明的一个实施方案的图解：其中靶结合装配体用于结合杂交体TNA-PNA。辅助结合装配体用于结合聚合的BNA。
图9是模(modular)TBA的图解，其中，装配序列，接头序列和不对称序列用于陪伴核酸识别位点一起形成TBA。
图10显示在HIV-特异性序列检测中有用的模TBA。
图11显示在人乳头瘤病毒序列检测中有用的模TBA。各E2单位实际上是E2 DNA结合部分的双体。
图12A是显示由于TBA的结合，TNA分级分离和迁移率变化的图解。
图12B是显示由于除TBA外的BBA的结合，TNA分级分离和迁移率增加的变化的图解。
图13显示检测缺失序列的策略。使用这一策略的例子是人类乳头瘤的整合测定。
图14显示经采用核酸识别单位、接头、装配和不对称序列装配高级TBA，以便形成对HIV LTR中结合位点特异性的各种靶结合装配体。
图15显示经采用DNA识别单位、接头、装配和不对称序列装配高级TBA，以便形成对HPV基因组中结合位点特异性的各种靶结合装配体。
图16显示由使用复合TBA获得的区别，内源竞争靶结合分子消除TBA结合到表亲核酸上的(但不是从含有多于一个被TBA识别的位点的合适的取向的TNA上消除)能力。
图17显示TBA被特异性地靶引以结合到序列错配位点上(并且优先结合在不含有所有的靶错配的表亲位点上的那些位点)的能力。序列简要描述
SEQ ID NO.1相应于图5-IA-1，显示第一类MHC NF-kB结合位点。
SEQ ID NO.2相应于图5(IA)，显示B2微球蛋白NF-kB结合位点。
SEQ ID NO.3相应于图5(IA)，显示K免疫球蛋白NF-kB结合位点。
SEQ ID NO.4相应于图5(IA)，显示一个HIV NF-kB结合位点。
SEQ ID NO.5相应于图5(IA)，显示一个HIV NF-kB结合位点。
SEQ ID NO.6相应于图5(IA)，显示c-myc NF-kB结合位点。
SEQ ID NO.7相应于图5(IIA)，显示双HIV NF-kB结合位点。
SEQ ID NO.8相应于图5(IIA)，显示双HIV NF-kB结合位点。
SEQ ID NO.9-16相应于图5(IIA)，显示双结合位点，其一为HIV NF-kB结合位点，另一为HIV SP1结合位点。
SEQ ID NO.17-18相应于图5(IIA)，显示双HIV SP1结合位点。
SEQ ID NO.19-31相应于图5(IIIA)，显示双HIV NF-kB结合位点和HIV SP1结合位点。
SEQ ID NO.32-33相应于图5(IVA)，显示四结合位点，其中两个位点为HIV NF-kB结合位点，另两个为HIV SP1结合位点。
SEQ ID NO.34相应于图(VIA)，显示5个结合位点，其中两个为HIVNF-kB结合位点，另三个为HIV-SP1结合位点。
SEQ ID NO.35是1/2 BBR的例子，在此情况下OL1，OL2和OL3元件是λ噬菌体左操纵子，包括插入序列。
SEQ ID NO.36是1/2 BBR的例子，在此情况下OR3，OR2，和OR1元件是λ噬菌体右操纵子，包括插入序列。
SEQ ID NO.37是HIV LTR。
SEQ ID NO.38是互补于HIV LTR之PNA的PNA。
SEQ ID NO.39是互补于HIV LTR的不同于SEQ ID NO.38的PNA的PNA。
SEQ ID NO.40是互补于HIV LTR的一部分的PNA，其也含有1/2 BBR和使BNA聚合到PNA上的悬挂序列。
SEQ ID NO.41是互补于SEQ ID NO.40 1/2 BBR的BNA。
SEQ ID NO.42是一个BNA，它将聚合到SEQ ID NO.41 BNA上，并且其和SEQ ID NO.40和41一起产生一个PstI识别位点。
SEQ ID NO.43是一个BNA，其互补于SEQ ID NO.42 BNA，并且其完成一BamHI识别位点。
SEQ ID NO.44是一HNA，其具有BamHI识别位点(它会与另一由SEQ IDNO.42和43产生的识别位点杂交，产生聚合物)。
SEQ ID NO.45是另一PNA，与SEQ ID NO.40相似，互补于HIV LTR的一部分。但不是与SEQ ID NO.40相同的序列。SEQ ID NO.45也编码一1/2 BBR序列和一突出端，其使得用Sphl识别位点开始BNA的聚合。
SEQ ID NO.46-62是人类乳头瘤病毒(HPV)特定PNA，一旦与HPV序列杂交，即形成和HPV DNA结合蛋白结合的TBR。
SEO ID NO.63-71是整合进TBA中的NF-kB DNA识别单位。
SEQ ID NO.72是一核定位序列。
SEQ ID NO.73是一SP1序列识别单位。
SEQ ID NO.74是一TATA结合蛋白识别单位。
SEQ ID NO.75-84是乳头瘤E2 DNA的识别单位。
SEQ ID NO.85-92是不对称序列。
SEQ ID NO.93是一arabidopsis TATA结合蛋白识别单位。
SEQ ID NO.94是一HPV-16-E2-1 DNA结合蛋白识别单位。
SEQ ID NO.95是一HPV-16-E2-2 DNA结合蛋白识别单位。
SEQ ID NO.96是一HPV-18-E2 DNA结合蛋白识别单位。
SEQ ID NO.97是一HPV-33-E2 DNA结合蛋白识别单位。
SEQ ID NO.98是一牛乳头瘤E2 DNA结合蛋白识别单位。
SEQ ID NO.99-102是例证性的接头序列。
SEQ ID NO.103是一例证性核定位信号序列。
SEQ ID NO.104-108是例证性陪伴序列。
SEQ ID NO.109-116是例证性装配TBA序列。
SEQ ID NO.117是共有NF-kB结合位点。
SEQ ID NO.118是HIV Tat氨基酸序列。
                                 缩写
Figure A9519755800221
           单链核酸           双链核酸           核酸上的结合区
Figure A9519755800224
                            无支持物和指示剂，或固体支持或其它定
                                位方式，包括但不限于连接到小珠上，聚
                                合物上和表面上和/或指示剂上＝OSA。BBA     辅助结合装配体BBR     辅助结合区BNA     辅助核酸CNA     表亲核酸1/2 BBR 单链区，当其与HNA或BNA的互补序列杂交时，可以结合
    BBA1/2 TBR PNA之单链区，当其与TNA的互补序列杂交时，可以结合
    TBAOSA     可有可无的支持物或连接PNA     探针核酸TBA     靶结合装配体TBR     靶结合区TNA     靶核酸
HNA    发夹核酸
                        定义
应当理解，在以下所公开的内容中，当提到靶结合装配体(TBA)、辅助结合装配体(BBA)、DNA结合蛋白、核酸结合蛋白或RNA结合蛋白这样一些术语时，意指包含结合到DNA或RNA靶核酸序列(TNA)上的分子的组合体，而不考虑其所来源的结合分子的类别的特殊性。这样，例如，采用来与人类免疫缺损病毒序列结合的TBA可以最类似于NF-KB转录因子，该因子典型地与DNA结合。但是，如本文所用的，人们应该理解可以使TBA最适地用于和特定序列组合体或构象的RNA序列结合。
本发明公开的检测方法的真实性在很大程度上取决于TBA和BBA与特定核酸基元的选择性结合。从本文的公开内容应该理解，TNA的TBA及BBA和相关序列的区别(表亲核酸或CNA)的基础可以是形成精确核酸探针(PNA)-靶核酸(TNA)杂交体片断(PNA-TNA杂交体)。然而，区别的基础也可以仅仅是特定构象的形成，同时可以不需要PNA-TNA杂交体中错配碱基对的完全缺失。因此，应该完全理解TBA或BBA操作的基础完全依靠TNA-PNA杂交体独有的任何特性，这种特性不同于任何PNA-CNA杂交体显示的特性，PNA-CNA杂交体可以在和给定的PNA接触的试验样品中形成。发明的详细描述
本发明提供了通过利用掺入特定核酸结合蛋白的靶结合装配体(TBA)特异性地鉴定样品中靶核酸(TNA)的方法。通过利用对给定TNA序列特异性的探针核酸(PNAs)和对所说的双螺旋靶结合区(TBR)特异性的TBA(靶结合区是在杂交体TNA-PNA序列形成的基础上形成的)，形成稳定的TBA-TNA-PNA复合体。此外，通过提供PNA中的特异的可扩增序列，除特异性地对由TBA识别的TBR的形成有贡献的序列外，检测PNA和TNA的结合并扩增这种检测。为了这个目的，利用了大量的核酸扩增系统的任何一个，包括聚合酶链式反应或利用分枝DNA技术，其每一个分支上都含有可检测的标记。具体地说，本文描述了新型扩增方法，在这种方法中，PNA的可扩增的部分含有这样的序列，辅助核酸(BNA)在其上可以发生聚合。依据每一个BNA-PNA杂交体的形成，形成了辅助结合区，其和辅助结合装配体特异性结合。如果存在可检测标记，TNA-PNA提供必要的无条件的原始TNA-PNA结合事件的扩增。
按照本发明，应把TNA理解为含有特定核酸序列。所说的TBA应理解为可特异而紧密地和形成的TNA-PNA杂交体结合的任一分子装配体。TBA包括一个或多个分子，其序列对结合到TBR上是足够的。已知的DNA结合区，既可以直接用作所说的TBA的组分，也可以根据本文提供的教导进行修饰。最容易得到的分子是DNA结合蛋白的DNA结合区。已知许多DNA或RNA结合蛋白既可以直接用作已知的未修饰的蛋白，或所说的TBA也可以是根据本文提供的特殊教导修饰后核酸结合蛋白。在后一种情况下，所需要的特殊修饰应该包括优化结合亲合力、去除不必要的活性(如核酸酶活性和在其它和TBA组分有亲和力的分子存在的情况下所说的TBA的识别力)、优化靶序列超过密切相关的序列的选择性、优化稳定性。
根据本发明可以利用的DNA结合蛋白的例子是转录因子NF-kB(p50和p65)的结合蛋白，NF-IL6，NF-AT，rel，TBP，乳头状瘤病毒E2蛋白，sp1，噬菌体λ的cro和C1阻遏蛋白和其它已知的蛋白(其DNA结合蛋白已经分离、克隆、测序、定性)。此外，任何其它的DNA结合蛋白或作为与TBR杂交体或BBR结合的充要条件的部分蛋白都包括在内。这包括蛋白或具有改变的DNA结合活性的野生型蛋白或蛋白的部分，以及产生的具有改变的DNA结合特异性的蛋白，例如，DNA结合识别螺旋从一个蛋白到另一个蛋白的互相交换。此外，具有核酸结合及其它核酸功能的蛋白，如限制性内切酶，也可以用作所说的核酸结合的功能物。在DNA-RNA杂交体及RNA-RNA杂交体中和靶区结合的蛋白都包括在内(见，例如Shi 1995，DeStefano 993，Zhu 1995，Gonzalcs 1994，Salazar1993，Jaishree 1993，Wang 1992，Roberts 1992，Kainz 1992，Salagar 1993(6))。利用陪伴结合装配体部分的分子可以构建结合装配体，以便获得特定组分的组合(combination)和几何构象。这一分子指定为PILOT。Pilot可以由蛋白质或任何有机或无机材料组合而成，这些有机或无机材料的组合在TBA或BBA成员之间获得组合选择和/或诱导特定几何构象。陪伴分子是一稳定构架，TBA或BBA依靠它组建，这样提供了TBA或BBA的正确构象，同时除去了天然产生的核酸结合蛋白的不需要的特性。此实施方案的具体例子是，以修饰的噬菌体λcro蛋白作为陪伴分子，提供了所说的多效转录因子NF-kB的修饰体。每一个NF-kB结合二聚体保留对NF-kB结合位点的微小亲合力，同时结合装配体显示了有利于制造、稳定和特异的特征。
鉴于以上所述，下文详细地描述了本发明的各方面和实施方案。
1.探针核酸(PNA)及其制备：本发明的PNA至少包括三个连接在一起的主要部分：参见附图1(I)，所说的PNA的第一部分是一个或多个碱基序列，指定为“1/2 TBR”。参见图1(I和IIa)，PNA中的1/2 TBR与样品中兴趣序列互补，TNA包含一个1/2 TBR。参见附图1(IIIa)，在杂交条件下，当TNA加入到PNA中时，形成了含有一个TBR的PNA-TNA杂交体。参见附图1(I)，所述PNA的第二部分是一碱基序列，指导为“1/2 BBR”。参见图1(I，IIb，IIc和IVa)，PNA的1/2 BBR与BNA或HNA中的1/2 BBR互补。参见附图1(IIIb，IIIc和Va)，在杂交条件下向PNA中加入BNA或HNA，分别形成含有BBR的PNA-BNA杂交体或PNA-HNA杂交体。参见附图1(I)，所述PNA的第三部分是OSA，由方框中一个园圈代表。OSA不是支持物和/或指示剂、或者是固体支持物或其它的定位方式和/或指示剂，所述定位方式包括但不限于连接到小珠，聚合物和表面(这些物质共价或非共价地结合到PNA上，但特异性地与PNA相关)上。OSA可以是帮助分离和/或定位的原子或分子，如可通过各种物理手段检测的固体支持物结合基或标记，这些物理方法包括但不限于释放的粒子或光子的吸收或成象。将指示剂连在寡聚核苷酸上或用固体支持物固定寡聚核苷酸的方法是本领域公知的(见Keller和Manak，Supra，本文一并参考)。
本发明所说的PNA可用任何合适的方法制备。通常这种方法包括寡聚核酸的合成和可复制载体的克隆。核酸合成方法在本领域是广为人知的。在合成或克隆时，有必要进行链纯化和分离以便该产品用作纯化的PNA。制备RNA探针的方法是公知的(参见Blais(1993)，Blais(1994)的例子，该方法使用体外转录，采用结合了T7 RNA聚合酶启动子PCR反应)。
本领域技术人员应理解所说的PNA的长度和特定序列依赖于TNA中被检测的长度和序列，以及获得紧密特异结合所使用的特定TBA的结构(参见以下有关TBA的讨论)。一般来说，PNA的序列长度在10到300个核苷酸之间是足够的，对本文所列举的实施方案，需要具有15-100个核苷酸的长度。
应该理解可以组建这种PNA，目的是使之含有多于一个的1/2 TBR和产生一个或多个TBA、相同或不同的TBR，以及在PNA和TNA杂交体基础上被新型双螺旋或多螺旋TBA(参见以下有关这些新TBA的描述)识别的复合体TBR。图5具体说明了含有一个或多个1/2 TBR的具体PNA。相应于图5(Ia，IIa，IIIa，IVc和IIa)显示的1/2 TBR的具体序列见SEQ ID NOS.1-34(见前面描述的序列)。
如图2a和图2b所示，包括1/2 TBR的PNA可以和一个或多个BNA杂交(见以下描述)，同时这种聚合BNA可以是任何需要的可能的长度，此链用于TNA-PNA杂交事件的扩增。优选的是，在这种PNA中存在约0到约10个1/2BBR。
如图6a和6b所示，所说的PNA可以包含几个相同或不同的1/2 TBR，其可以与TNA中的几个1/2 TBR杂交。每次一个PNA中的1/2 TBR与TNA中1/2 TBR配对，即形成一个靶结合区(TBR)，其可以结合一个TBA。并且，没有必要所有的TBR都在单链的连续的PNA上。这样，在本发明的一个实施方案中，采用两种不同的PNA来检测特定的TNA序列。作为本发明这方面的一个说明，图7是人体免疫缺陷病毒(HIV)的长末端重复序列(LTR)的代表。本领域已经知道，HIV LTR包括两个非常接近NF-KB结合位点和三个SP1结合位点，其中的NF-KA和SP1已知是DNA结合蛋白。图7包括两个PNA，PNA1(SEQ ID NO.38)和PNA2(SEQ ID NO.39)，每个都与所示的TNA(SEQ ID NO.37)的反链互补，其包含两个HIV LTR的NF-kB结合位点和三个SP1结合位点。根据本发明的这一方面，PNA1与图7所表示的TNA下划线的用“+”  标记的碱基特异杂交，PNA2与图7所表示的TNA下划线的用“＝”标记的碱基特异杂交。PNA1或PNA2都包含可以与BNA的1/2 BBR序列(见下文)杂交的序列(序列上用“#”或“*”标记)。此外，PNA1或PNA2都可以用OSA进行不同的标记，比如用荧光素或罗丹明等荧光团，其可以让两种探针都与TNA确切地结合。如果只发现一个标记或两个标记都没发现，则推断这个TNA在检测的样品中不存在。
图7所示实施方案的另一个方面，显示了一种改变本测定特异性的方法。通过改变PNA1和PNA2之间缺口的长度，这样就改变了仍未杂交的TNA区，实施本发明，可以改变这种测定的分辨性。
为了更清楚地举例说明本发明的这个方面，有必要强调所说的TBR可以具有螺旋结构。这样，当PNA1在螺旋的一面产生出TBR，PNA2在螺旋的同一侧或不同侧产生出又一TBR，视两个TBR(图7下划线部分)中间部位的距离而定。如果每个结合位点中间都是相距10.5碱基的完整产物，TBR就会在螺旋的同一侧；如果是相距10.5碱基非完整产物，那么TBR就会在螺旋的两侧。在这种方式中，任何由TBA识别PNA1 TBR以及TBA识别PNA2 TBR在结合上的协调性都是可以控制的(见Hochschild，A.，M.Ptashne[1986]细胞44：681-687，显示出噬菌体λ阻遏物和在一个DNA螺旋上彼此定位在不同距离的两个不同操纵子位点的结合效应)。如Perkinks等([1993]EMBO J.12：3551-3558)所述，NF-kB和SP1位点的协调对HIVLTR的激活是必要的。但是，从本发明的目的来说，可以通过提供能和两种位点自发结合的单一、新型结合蛋白，来利用HIV LTR上的两个NF-kB和三个SP1结合位点标志，但必须在两个位点的间距几何学上可行的条件下。这一点受所选择的TBA和使用的PNA的结构限制。这样，在图7所举的实施例中，可以使用两个探针，这两个探针之间有一个足够大的单链DNA区，即使NF-kB和SP1结合位点在螺旋的两个不同侧面，两个探针间的这个单链区提供一个足够灵活的“绞链区(hinge)”，使DNA可以同时弯曲和扭曲以容纳几何构型的TBA。另外，可以通过缩短探针间距离来设计一个更严格的检测方法，这样DNA只能弯曲，不能扭曲。最后，探针间距可以很近，或使用单一PNA，所以DNA仅能弯曲，无法扭曲。这样，对任何给定的需要的靶核酸间的分辨程度，此图举例说明了并并使得可以产生检测系统，所述靶核酸具有相似的序列，但这些序列具有不同的并列位置。
作为一种诊断和法医学鉴定HIV的试剂盒，本领域的技术人员应该懂得前面所述的关于本发明的各方面允许选择诊断和法医学鉴定试剂盒的组份以使其在任何时候与当时所知的流行爱滋病病毒菌株或其它病原菌或疾病状况相匹配。本领域的技术人员还应该意识到，检测爱滋病的感染不是本发明的独有用途；由于爱滋病病毒基因的突变性，对于这样的诊断，基因的突变是最复杂的实验环境因素之一。恰恰是在这种易变的条件中，本发明方法的灵活性连同其能区别非常紧密相关的序列的能力是最值得注意的。在突变较少的环境中，不必实施本发明的那些复杂方法，这些方法是经得起检验的。这样，用于诊断乳头状瘤病毒感染的试剂盒中，所有TBA-TBR相互作用的区别特性都可以得到，其也具有利用BNAs和BBA来扩增信号的能力，但是也可以利用一个单一简单的PNA，如SEQ ID NO.46-62中任何一个，其鉴别独有的乳头状瘤病毒序列，这种序列和TBA的结合也是公知的，例如乳头状瘤病毒E2蛋白或其变形DNA结合蛋白(参见Hegde等[1992]自然359：505-512；Monini等[1991]病毒学杂志65：2124-2130)。
在使用本方法检测一个特定TNA以估价是否存在特定核酸，这种核酸与黑素瘤、肝细菌瘤、乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌或卵巢癌相关，TNA可以从怀疑含有癌细胞的器官和液体的活体组织材料中获得。为了检测基因的缺失，TNA可以从含有感染细胞的病人样品中获得。为了检测发酵中的污染物和在生产食品，化学试剂或生物工程产品或废物生物处理过程中的产品，TNA样品可以从发酵或处理过程中不同阶段获得。为了检测食品和药品的病原体或污染物，TNA样品可以从如下方面获得：食品或药品；清理食物所用的工具或与食物相接触的表面；与食物接触的液体；加工材料；与食品、药物或生物样品的生产相关或与其接触的液体或其它物质，这些物质从与食品、药物或其它产品相接触的物质中获得。
2.辅助核酸(BNA)，辅助结合区(BBR)和它们的制备
本发明的BNA包括至少一个或多个与OSA结合的1/2 BBR。所说的1/2 BBR可以与包含在PNA、其它BNA或HNA中的1/2 BBR杂交。
参考附图1(I、IIb和IIIb)，最简单的BNA包括二部分。参见附图1(IIb)，最简单BNA的第一部分是一段与所说的PNA中命名为“1/2 BBR”的序列互补的碱基序列。参考附图1(IIb)，最简单BNA的第二部分是OSA。OSA不是支持物和/或指示剂、或者是固体支持物或其它的定位方式和/或指示剂，所述定位方式包括但不限于连接到小珠，聚合物和表面(这些物质共价或非共价地结合到PNA上，但特异性地与PNA相关)上。
参考附图2a(II和III)，所说的BNA可以含有一个以上的1/2 BBR序列。图3(II)所示的BNA包括一段与图3(I)所示的PNA及两段其它1/2 BBR序列互补的序列。图3(III)所示的BNA含有两个1/2 BBR序列，它们与图3(II)所示的BNA上两个1/2 BBR序列互补，加至“n”个额外1/2 BBR用于和额外的BNA聚合。
在杂交的条件下，图3(II)所示的BNA，当与图3(I)所示的PNA组合在一起时，产生了一个如图3(IVa)所示PNA-BNA杂交体，这一杂交体含有一个BBR和具有二额外1/2 BBR或“辅助”序列的非杂交突出端(extension)。通过所说的杂交产生的BBR在序列上可以相同，相似或不同。通过所说的杂交而产生的BBR可以结合相同的、相似或不同的BBA(见下面)。BNA的制备和PNA的制备相似。
在杂交条件下，图3(IVb)所示的BNA-BNA杂交体，当与图3(Vb)所示的PNA结合后，产生如图3(VI)所示的PNA-BNA杂交体，其包含一个BBR，两个额外的含有BBR的BNA-BNA杂交体，和一个带有额外1/2 BBR序列的非杂交突出端，一个“辅助”序列。通过所说的杂交产生的BBR可以在序列上相同，相似或不同。通过所说的杂交产生的BBR可以结合相等，相似或不同的BBA(见下面)。BNA可以以类似于制备PNA的方式制备。
3.靶核酸(TNA)和它们的制备
按照本方法，检测和扩增通过检测特定TNA而产生的信号的第一步是在一个合适的混和液中将PNA与这一靶物质杂交。这种杂交是在本领域公知的合适的条件下完成的。
可能或已知含有预计的TNA的样品可以由各种来源获得。它可以是生物样品、食物或农业样品、环境样品等等。使用本方法检测用于医疗诊断或法医学检测的特定TNA时，TNA可以从活体组织样品，体液或尿液、血液、牛奶、脑脊髓液、唾液、颌下腺液、粪便、肺抽提液、喉或生殖器官样品等的提取液。另外，检测可以在体内进行(见例Embtetson 1993，Patterson1993，Adams 1994)。
因此，对脊椎动物(包括哺乳动物和人)或者对下列任何一种或所有兴趣微生物特异性的PNA可以按照本发明的方法设想和使用：
棒杆菌属
    白喉棒杆菌
芽孢杆菌属
    苏云金芽孢杆菌
肺炎球菌属
肺炎双球菌链球菌属
酿脓链球菌
唾液链球菌葡萄球菌属
金黄色葡萄球菌
白色葡萄球菌假单胞菌属
Pseudomonas stutzen奈瑟氏球菌属
脑膜炎奈瑟氏球菌
淋病奈瑟氏球菌肠杆菌属
大肠杆菌
产气气杆菌
肺炎克雷伯氏菌    大肠肝菌状的细胞
伤寒沙门氏菌
猪霍乱沙门氏菌    沙门氏菌
鼠伤寒沙门氏菌
痢疾志贺氏菌
施氏志贺氏菌
阿糖迟酵志贺氏菌
弗氏志贺氏菌      志贺氏菌
鲍氏志贺氏菌
索氏志贺氏菌其他肠杆菌
普通变形菌
奇异变形菌        变形杆菌类
摩氏变形菌
铜绿假单胞菌
粪产碱菌
霍乱弧菌嗜血杆菌-博德特氏菌属组
流感嗜血菌，杜克雷氏嗜血杆菌
Hemophilus hemophilus
埃及嗜血菌
副流感嗜血菌
百日咳博德特氏菌巴斯德氏菌属
鼠疫巴斯德氏菌
土拉巴斯德氏菌布鲁氏菌属
马尔他布鲁氏菌
流产布鲁氏菌
猪布鲁氏菌需氧芽孢形成细菌
炭疽芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌
巨大芽孢杆菌
蜡状芽孢杆菌厌氧芽孢形成细菌
肉毒梭菌
破伤风梭菌
产气荚膜梭菌
诺氏梭菌
败毒梭菌
溶组织梭菌
第三梭菌
双酶菌
生孢梭菌分枝杆菌属
结核分枝杆菌
牛分枝杆菌
鸟分枝杆菌
麻疯分枝杆菌
副结核分枝杆菌放线菌属(类真菌细菌)
衣氏放线菌
牛型放线菌
内氏放线菌
星状诺卡尔菌
巴西诺卡氏菌螺旋体
苍白密螺旋体
极细密螺旋体
斑点病密螺旋体
减少螺菌
念珠状链杆菌
回归热疏螺旋体
出血黄疸钩端螺旋体
犬钩端螺旋体锥虫支原体
肺浆支原体其他病原体
单核细胞增生利斯特氏菌
猪丹毒丹毒丝菌
念珠状链杆菌
肉芽多诺万氏菌
杆状巴尔通氏体立克次氏体族(类细菌寄生虫)
普氏立克次氏体
莫赛氏立克次氏体
立氏立克次氏体
康纳次氏立克次氏体
澳大利亚立克次氏体
西伯利亚立克次氏体
螨立克次氏体
Ricketrsia tsursugamushi
伯耐梯氏立克次氏体
五日热立克次氏体衣原体属(不能归类的寄生细菌/病毒)
衣原体属病原体(命名不确定)真菌
新型隐球酵母
皮炎芽生菌
荚膜组织胞浆菌
粗球孢子菌
巴西芽生菌
白假丝酵母
烟曲霉
丛生毛霉(伞枝犁头霉)
米根霉
少根根霉               藻状菌纲
变黑色根霉
申克氏孢子丝菌
Flonsecaea pedrosoi
Fonsecaea compact
Fonsecacae dermatidis
腐肉枝孢
疣状瓶霉
构巢曲霉
足肿马杜拉放线菌
灰色马杜拉放线菌
波伊德氏霉样真菌
甄氏瓶霉
石膏状小孢子菌
须发藓菌
Keratinomyces ajelloi
狗小孢霉
深红色发癣菌
头癣小孢霉病毒
腺病毒疱疹病毒
单纯疱疹
水痘(小鸡痘)
带状疱疹(Shingles)
病毒B
细胞肥大病毒痘病毒
天花(天花)
牛痘
牛囊尾蚴痘病毒
副牛痘
触染性软疣细小核糖核酸病毒
脊髓灰质炎病毒
柯萨奇病毒
Echoviruses
鼻病毒粘液病毒
流感(A，B和C)
副流感1
流行性腮腺炎病毒
纽卡斯尔疾病病毒
麻疹病毒
牛疫病毒
犬瘟热病毒
呼吸合胞体病毒
风疹病毒节肢介体病毒
东方马脑炎病毒
西方马脑炎病毒
Sindbis病毒
Chikugunyavirus
赛姆利基森林病毒
Mayora病毒
圣路易斯脑炎病毒
加利福尼亚脑炎病毒
科洛拉多蜱热病毒
黄热病病毒
Dengue病毒呼吸道肠道病毒
呼吸道肠道病毒13型逆转录病毒
人类免疫缺损病毒(HIV)
人类T-细胞淋巴营养病毒III(HTLV)肝炎
肝炎A病毒
肝炎B病毒
肝炎非A-非B病毒
肝炎C，D，E肿瘤病毒
劳舍尔氏白血病病毒
Gross病毒
马隆尼氏白血病病毒
人类乳头瘤病毒
本领域的技术人员会理解，一般需要以这样一种方式来处理可能含有特定TNA样品，即产生和所说的PNA容易杂交的片断。有必要对实验样品进行处理，以便完成用于杂交的TNA的释放或提取用于杂交的TNA，如通过把血液样品或其它细胞露置于低渗透压条件中，或者采取别的更为剧烈的方法破碎样品。当认为TNA是以双链形式存在时，自然需要通过本领域公知的方法分开双链，使TNA能以单链形式进行杂交，这些方法包括但不仅限于加热或有限度地露置在碱环境中，可以通过另外加入单链PNA而中和碱并使得可以发生杂交。制备RNA靶的方法是公知的(参见Waterhouse1993和Mitchell 1992)。
含有TNA的核酸片段通常需要降低样品的粘度并增加TNA和PNA的可接触性。通过本领域任意的和特定的方法得到这种片断。这样，例如，已知以特定的频率在分析的特异基因组中切割的核酸酶，可以用来产生一种已知平均分子量的片段。此外，其它的核酸酶，磷酸二酯酶，核酸外切酶和内切酶，物理切碎或超声波处理均是用于此目的的可行方法。这些方法是本领域公知的。为了获得DNA片段，一般优选使用限制性内切酶。然而也可以通过各种化学方法获得DNA片断，例如使用下列类型的试剂：EBTA-FE(II)(见Stroebel等(1988)，美国化学会杂志，110：7921，或Dervan(1986)科学，232：464)；CU(II)-菲咯啉(见Chen和Sigman(1987)，科学，237：1197)；IIS级限制性内切酶(见Kim等(1988)，科学，240：504)；杂交DNA酶(见Corey等。(1989)，生物化学，28：8277)；争光霉素(见Umezawa等，(1986)，抗生素杂志，(Tokyo)Ser.A.19：200)；neocarzinotatin(见Goldberg等.(1981)，癌症研究第二届Bristol-Myecs会议，学术出版社，纽约，p.163)，以及methidiumpropyl-EDTA-FE(II)(见Hertzberg等.(1982).美国化学会杂志，104：313)。一般需要用蛋白酶处理除去蛋白质，有效地除去核酸样品之中的蛋白又不损伤核酸的方法也是本领域公知的。
本发明的TNA应该有足够长度，以便在TBR两侧有足够数量的双链杂交体，这样，TBA能够免受不连接的片段末端的干扰而进行结合。一般地，大约10到大约100,000个核苷酸范围内的片断，优选的是大约20到大约1000个核苷酸范围内的片断，作为TNA片段的平均大小。能被检测的特定TNA序列的例子是和本文描述的PNA序列互补的序列，这种PNA序列用于检测正常细胞的、不正常细胞的(如有激活的致癌基因、整合的外源基因、遗学上具有缺陷的基因)、以及病原特异性的核酸序列，由于这种序列的特异性核酸结合蛋白是已知的，或可根据本文描述的方法产生。参见图7，一种和HIV相关的特异TNA示于SEQ ID NO.37中。
4.用于BNA的PNA的突出端及其制备和信号扩增
在杂交条件下，可以加入BNA，其与PNA、PNA-BNA杂交体、BNA和/或BNA-BNA杂交体杂交。可以以非媒介聚合物方式或以媒介的方式用已知顺序的BNA完成前面所述的加入。
参见图2a，给出了一个简单的辅助。通过加入如2a(Ib和Ic)所示的两种BNA产生了辅助聚合物，BNA在杂交条件下与PNA结合，形成PNA-BNA-BNA杂交体，这种杂交体含有PNA和“辅助”突出端(如图2a(IIa，IIb，IIc和IId)所示)，留下至少一个未配对的1/2 BBR序列。每个未配对的1/2BBR序列(如图2a(IIa，IIb，IIc和IId)所示)，可与添加的BNA杂交形成“辅助”突出端。每个未配对的1/2 BBR序列(如图2a(IIa，IIb，IIc和IId)所示)，又可以与添加的HNA(如图2a(IIIa和IIIb))杂交。不能与添加的BNA杂交的HNA，其杂交作用覆盖了BNA加入到PNA上，如图2a(IVa，IVb，IVc和IVd)所示。
参照2b所示，有可能控制和指定PNA突出端的顺序和组份。如果需要单一的BBR，可把包含一个与PNA中的1/2 BBR互补的序列的HNA加入到PNA中，这样就可产生一个单独的BBR并“覆盖”任何PNA“辅助”突出端。如果把添加的BBR加入到PNA中，就可以形成PNA的受控制的突出端。
参照2b所示，给出了一个简单的辅助。媒介(vectorial)聚合物的突出端可采用加入对PNA(如图2B(IA和IB)所示)特异性BNA完成，这种BNA可在杂交的条件下与PNA杂交，形成PNA-BNA-BNA杂交体，由PNA和“辅助”突出端组成。如果用OSA标记，这种突出端可提供用于极大地扩增任一信号的方法，这种信号是基于样品中PNA和TNA结合而产生的。并且，通过聚合物中的标记的BBA与BBR结合，还可完成附加扩增。
可以用许多方法制备BNA，包括，如通过化学合成方法或重组DNA产生方法。后一种方法可以简单廉价地产生无限量的BNA，如通过原核生物(如大肠杆菌)中的质粒DNA产生，这种质粒DNA含有多重复的特定BNA序列，其两侧是具有悬突末端的限制性酶切位点。通过这种方式，例如，可以以实质上无限量的拷贝产生噬菌体λ左侧或右侧的操纵位点、其它DNA、其它已知和特定BBA特异且紧密结合的核酸序列，如DNA或RNA结合蛋白序列，每一个拷贝的两侧是EcoRI，PstI，BamHI或其它许多常见的限制性内切酶位点的任何一个。此外，重复位点的聚合物可由不存在于聚合物内部的独有内切酶位点切除。可以通过本领域公知的方法产生大量的pBR322、pUC质粒，或其它带有这些序列多拷贝的质粒，在聚合位点两侧用限制性内切酶切开质粒，通过层析方法或本领域其它任何方便易行的方法分离自由的多拷贝操纵子。BNA在使用之前，分离成单链，然后聚合在一个编码操纵子的单链互补拷贝的PNA上(即1/2 BBR)。通过利用质粒上的每个重复聚合物两侧的不同的限制性内切酶，把BNA媒介聚合在PNA上，以产生多拷贝的BNA。此外，可以通过BNA聚合物一端或两端的悬突端杂交BNA聚合物和所说的PNA，这样就不需要分离双链和对BNA片段进行退火处理。以上提到的特异BNA序列的例子见序列描述部分，为SEQ ID NO.35-36。为了稳定BNA聚合物，可用DNA连接酶共价连接杂交的BNA。
5.发夹核酸(HNA)及其制备
本发明的HNA至少包括两个主要的组成部分：一个单链的序列，其与1/2BBR互补；和一个双链的核酸区，其在杂交条件下通过HNA内部的自我互补序列的自我连接而形成。参见附图1(IIc)，可以构建HNA中的1/2 BBR以使其与PNA中的1/2 BBR序列互补。参见附图1(I，IIc和IIIc)，在杂交条件下，把前述的HNA加入到PNA中，其则形成含有BBR的PNA-HNA杂交体。参见附图1(IIIc，IVc和Vc)，在杂交条件下，PNA-HNA杂交体在加入TNA之后，可形成含有一个TBR和BBR的TNA-PNA-HNA杂交体。
如图2a和2b所示，可以用HNA“覆盖”或终止加入的相对于PNA的BNA的突出端。图2a(Ib和Ic)中所示的两个BNA分子可缔合形成图3(IVb)所示的杂交体，或者直接单独与PNA杂交(如图2a(Ia-c，IIa-d)所示)。两个HNA分子(图2a(IIIa和IIIb所示)可以终止BNA与其它BNA的杂交，这些BNA从PNA延伸(图2a(IVa-d))。图2a(IIa)所示的HNA可终止图2a(IIb和IId)所示的PNA-BNA杂交体的形式和任何一种带有一条单链1/2 BBR的PNA-BNA杂交体，这种单链1/2 BBR与图2a(IIIa)所示的HNA中1/2 BBR序列互补。同样地，图2a(IIb)所示的HNA可终止图2a(IIa和IIc)所示的PNA-BNA杂交体和任何一种带有单链1/2 BBR的PNA-BNA杂交体，这种1/2BBR与图2a(IIIb)所示的HNA中1/2 BBR序列互补。
构建HNA，其能终止由连续加入BNA到PNA中而构建的PNA-BNA杂交体的形成(见图2b)。图2b(Ia、IIIa、Va和VIIa)中所示的单链1/2 BBR序列(见)与图2b(Ib、IIIb、Vb和IIIb)中所示的单链1/2 BBR序列特异性互补，并可以产生独有的加帽的PNA-BNA-HNA杂交体(图2b(Ic、IIIc、Vc和VIIc)。
HNA中的自互补序列和连接自互补发夹序列的环状序列，只要其实质上不由HNA干扰或抑制单链1/2 BBR(包含部分HNA)的存在或选择性地结合BBA或TBA，就可以有任何的组成和任意长度。应该选择环状序列以使环的形成不阻碍发夹的形成。在此项应用中，提供的有用的HNA例子是SEQ IDNO.44(见前面的序列描述部分)。
6.靶结合装配体(TBA)及其制备
TBA可以是与由特定TNA和PNA杂交形成的TBR结合的任何一种物质。条件是TBA必须具有至少下列特点：
(a)TBA必须以以对兴趣TBR(s)高度特异性的方式与TBR(s)结合。也就是说，TBA必须区分存在于TNA-PNA杂交体中的TBR和由PNA-CNA杂交体形成的类似的双链序列。TBA必须与PNA-CNA杂交体有足够低的亲和力，这样通过洗脱TBA-TNA-PNA复合体，除去PNA-CNA杂交体而不除去PNA-TNA杂交体。
(B)TBA必须与由TNA与PNA杂交形成的TBR极易结合。一般认为结合亲和力在10-5到10-12或更高的范围内是足够的。在以下的描述中，在某些情况下，需要利用对特定TBR具有非常低的亲和力的特异TBA，但是当提供多聚TBR的特异构型时，TBA的亲和力则极大地增加，这样对于每个TBR的TBA亲和力的平方则是有关这个特异TBA的亲和力。
在TBA形成中有用的DNA结合组份的例子包括但不限于：NF-KB、乳头状瘤病毒E2蛋白、转录因子SP1、无活性的限制性内切酶、抗体等。本领域认为每种这样的蛋白都含有和特异核酸序列结合的序列，它们之间的亲和力是已知的。自然，本发明的方法不限于这些已知DNA结合蛋白及其片断的使用。从本公开内容可知，对于本领域一般技术人员很明显，可以容易地把本发明的方法施用到新型TBA的使用中，这种TBA至少需要具有上面所说的特性。比如，在WO92/20698中，描述了包含寡聚核苷酸偶联物的序列特异性DNA结合分子，这种寡聚核苷酸偶联物是由DNA结合药物和三螺旋体形成的寡聚核苷酸共价连接而形成的。可以用本公开内容的方法产生新型TBA，以便按照本文的方法使用，条件是这样形成的TBA可以达到以上标准。此外，美国专利5,096,815，5,198,346和WO88/06601中的方法(本文一并参考)也可以用来产生新型TBA，以便按照本文的方法使用(见Blais(1994)的例子)。
不管TBA是一种蛋白质，或是蛋白质复合体，都可用本领域中很多方法路线的任何一种来产生TBA。TBA实际上可以从其自然产生的环境中分离，或者如这种方法不可行，则可用标准的分子生物学技术产生。这样，以NF-kB为例子，利用p50或p65亚单位的DNA结合部位，可以按照本领域已知的重组方法产生这个结合装配体(见Ghosh(1990)，细胞，62：1019-1029，描述了NF-kB的p50 DNA结合亚单位的克隆及这种蛋白对rel和dorsal的同源性)。
按照本发明，已知许多DNA和其它核酸的结合蛋白都可用作或用于TBA。一旦任何DNA、RNA：DNA、RNA或其它核酸结合蛋白的氨基酸序列已知，就可通过合成的方法制备编码这段蛋白的合适的DNA序列，或可以利用来源于合适组织的编码这种蛋白的mRNA的cDNA拷贝。并且可以获得编码这种蛋白的基因组拷贝，同时用本领域已知的方法切除内含子。另外，也可化学合成TBA。
一旦得到了编码序列，就可利用点直接突变改变氨基酸序列而产生突变的核酸结合蛋白，这种蛋白比原核酸结合蛋白质具有更需要的结合特性。例如，可以改变NF-kB的DNA结合部分的氨基酸顺序，使之成为NF-kB′分子，该分子能更紧密地结合在NF-kB的结合位点上(见下面HIV-检测和HIV-锁定(Lick)的例子)。
为了进一步了解本发明的这个方面，考虑到了以下几点。以NF-kB为例子，TBA可以利用自然产生的NF-kB分子制备。但是，由于该分子在细胞中的存在量极微，并且已克隆了这种DNA结合蛋白的亚单位，所以通过重组DNA的方法制备大量的复合体是可行的，并且在这种蛋白上已经完成了复合体的制备(见Ghosh(1990)，细胞，62：1019-1029)。NF-kB是一种和免疫、炎症和生长调节反应相关的基因多效性诱导物，这种反应是对原初病原(病毒、细菌或逆境)竞争或次生病原(炎症状细胞素)竞争的反应。NF-kB是一种二聚体DNA结合蛋白，包括p50和p65两个亚单位，两者都可以与特定DNA序列接触并结合。在非活跃时，NF-kB存在于细胞质中，与一个特定抑制物(I-KB)形成一个细胞质的异源三聚体。在活化时，抑制物解离，p50-p65二聚体通过一个特定细胞核定位信号(NLS)重新定位于细胞核中，在此与DNA结合，作为大量基因的转录激活体(见Grimm和baeuerle(1993)生物化学杂志，290：297-308，本文是有关NF-kB的综述文章)。
p50-p65二聚体与共有序列GGGAMTNYCC(SEQ ID NO.117)的配对序列以微微摩尔级亲和力结合，其精确序列的不同亲和力稍有不同。值得注意的是也观察到了p50和p65的同源二聚体的发生。这些同源二聚体具有不同的生化特性以及和结合序列不同的亲和力，结合序列存在于上面的共有序列中或和其相似。这样，根据TBA需要的结合特性，p50-p65异源二聚体，p50-p50同源二聚体，或p65-p65同源二聚体都可以利用。
图9以图解的形式说明了一种方法，利用这种方法可以产生各种各样的新型TBA，以便根据本发明的方法进行使用。TBA的核酸识别单位可以通过“陪伴”与类似的或不同的TBA核酸识别单位组装并缔合起来。所说的陪伴是一种结构，在这种结构上，可组装各种TBA识别因素，同时其能在核酸识别位点上提供各种需要的特性。所说的陪伴由能提供装配序列的序列组成。以便将同样或不同的核酸识别部分拉近并彼此稳定地连接。这样，例如，在指定的一种TBA与NF-kB TBR紧密结合的情况下，通过提供噬菌体λcro序列做为组装序列而装配TBA，这种序列和NF-kB p50或p65的核酸结合序列连接。p50或p65的核酸结合序列与cro序列连接，其连接位点在cro的羧基端或氨基端，或者在p50或p65的核酸识别位点的羧基端或氨基端。可以提供也可以不提供连接序列，以便在核酸结合位点上存在用于合适TBR结合的适当间距。
装配序列，例如上面所举的cro和CI序列(SEQ ID NO.104-108)，包含任何能够自然而牢固地与其它序列结合的寡聚小肽。对于cro，公知cro二聚体可与噬菌体λ的操纵子位点结合(Anderson等(1981)，自然，290：754-758；Harrison和asgarwal(1990)，生物化学年评，59：933-969)。cro的单体彼此紧密且特异地结合。这样，通过cro序列和DNA识别单位序列连接，即可产生牢固而紧密的缔合。
可有可无的接头序列包含任何氨基酸序列，这种氨基酸序列不干扰TBA的装配或核酸的结合，并且不易发生变化以便从完整的TBA中释放出核酸识别单位。接头序列与其它结合装配组份应共价联接，这一点是需要的但不是必要的。这种缔合应该是特异性的，这样有利于结合装配体的装配和制造。这种序列的例子包括但不限于那些在结构蛋白中发现的连接各种区域的公知的序列。比如，在噬菌体λ阻抑蛋白中，在DNA结合区和二聚体区之间就有一个连接序列用于此目的。已知还有很多其它的这样序列，其精确的顺序不限于此发明，只要常规实验能保证其稳定性和对靶核酸结合的不干扰性。本文提供了这些序列的例子，为Met Ser和SEQ ID NO.99-102。在这些接头中插入特异性的已知的蛋白酶解位点也是本发明的组成部分。在接头序列中存在这类位点有助于进行制造，并且允许在陪伴框架上装配不同的分子。
除核酸识别单位，可有可无的接头序列，装配序列外，本发明的新TBA还可有或可无不对称或PILOT TNA序列以及一个或多个OSA单位。这些不对称序列用于促进或阻止某种需要或不需要的缔合。例如，当需要带有同源二聚体的p50 DNA识别单位TBA时，需要不对称序列打断自然条件下较牢固的NF-kB的p50亚单位与p65亚单位的缔合，但又不干扰装配序列使p50亚单位聚合。本文的例子是SEQ ID NO.85-92和SEQ ID NO.105和106。
在不同的构型中，NF-kB p50亚单位可和转录因子SP1 DNA识别单位紧密缔合。在某些情况下希望这种结合，即NF-kB/SP1结合基元是很有价值的时候，如在HIN LTR中，至少六个DNA结合蛋白识别位点，两个NF-kB，三个SP1，和一个TATA位点的结合部分已经证明是存在的。已知第二个NF-kB和第一个SP1位点对HIV转录调节是非常重要的(Perkins等.(1993)Embo J.12：3551-3558)，这种特定TBA构型不仅用于HIV的诊断，而且可用作HIV感染的治疗剂或预防剂(见下文)。同样地，按照本发明也可有用人类乳头状瘤病毒的长控制区(LCR)作为探针探测的主控制区。
由于能够缔合的不同组份和弹夹方式，按照本发明的TBA制备方法，实质上可以不受限制地产生各种TBA。图10中，列举了一系列不同的分子，即是“HIV-诊断I-IV”，其中的“CHAP”代表陪伴、“NFKB”代表NF-kB亚单位、“SP1”代表SP1转录因子的DNA识别单位、“TATA”代表TATA序列DNA结合蛋白(TBP)的DNA识别单位的二聚体，也称为TATA结合蛋白，或TBP。下文进一步列举了这些构型，其也是本发明的组成部分。
在另一种构型中，图9所示的模型结构是用于监测，处理和预防一种完全不同的病原。图11中，与上面描述的“HIV-诊断I-IV”分子的方式相似，产生了一系列“HPV-诊断I-IV”分子。在这种产品中，利用了人类乳头状瘤病毒(HPV)的E2蛋白的DNA结合的有利特性。此外，通过提供特异DNA识别单位来利用SP1和TBP，用这种特异DNA识别单位结合HPV基因组中的这些序列。在用于监测HPV感染的E2特定TBA的形成过程中，希望利用SEQ ID NO.75-84或93-98中的任何一种作为E2 DNA识别单位。含有牛E2二聚体和人E2二聚体的DNA结合区也许是特别有用的。
以上提到的各种序列可以通过使用纯寡聚核苷酸起动材料进行化学连接，或者通过提供重组核酸进行连接，这些重组核酸通过各种遗传密码编码各种亚单位。在重组产生过程中，把cro编码序列和核酸识别单位序列连在一起形成TBA是非常有利的，因为cro不仅在陪伴中充当装配序列，而且可以引导核酸识别单位进行适当的折叠。本文列举的陪伴序列见SEQ IDNO.104-108。并且，在希望得到含有多个结合位点的高级结构的过程中，如NF-kB/NF-kB/SP1/SP1/SP1 TBA的五聚体，正确地设计不对称序列使得能够制造这种结构。
以前面所述的方法，制备以高亲和力和其同类结合位点结合的TBA。比如：图10中TBA的NF-kB的DNA结合组份是计划以10-8和10-12摩尔的亲和力结合HIV-LTR的。DNA结合位点有用的序列见SEQ ID NO.63-71，73-84，93-98和104-108，下文还要引用。
由于前面使用装配序列或不对称序列的直接装配核酸结合蛋白的描述，本领域的技术人员会认识到本发明提供了装配蛋白结构的一般实用的方法。通过进一步的阐述和举例的方式、利用需要的结构的装配体中的抗体-抗原表位的相互作用的方式，进一步验证本了方法施用的普遍性。更详细地说，通过把NF-kB p50亚单位连到一个抗原上，如环形的(酶二硫键)黑色素细胞刺激激素(MSH)，抗原装配DNA结合蛋白结构。这种原-MSH分子可以通过抗MSH的抗体结合，形成一个新型核酸结合装配体，这个过程中抗原和抗体充当装配序列。
图9的模式结构表明可以用各种组份的不同结合体来装配大量不同的TBA。这样，一般结构的代表实例见SEQ ID NO.119-116。
7.辅助结合装配体(BBA)及其制备
BBA可以是和特定的BBR结合的任何物质，这种BBR是通过特定的PNA与BNA杂交而形成的，包括多个BNA(上至“n”且包括“n”的BNA，即BNAn，其中的“n”在理论上从0到无穷大，一般是在0到100之间)聚合在PNA上以用于信号扩增，条件是BBA必须具有至少以下两个特征：
(a)BBA必须以某种方式与BBR结合，其对兴趣BBR是高度特异性。也就是说，BBA必须区分存在于PNA-BNA杂交体中的BBR和BNA-CNA杂交体中类似的双链序列或其它的CNA。因此，在PNA-BNAn或PNA-BNAn-HNA杂交体的产生过程中，当甚至只有一个碱基错配，或构象差异(有或无碱基误配)，这种BBA必须以足够低的亲和力和杂交体聚合，以便在洗脱TBA-TNA-PNA-BNA复合体时，从CNA序列中除去了BBA而不是BBR序列。
(b)BBA必须极易结合BBR。在10-5到10-9或更高范围内的结合力一般认为是足够的。
BBA的例子包含但不限于cro和噬菌体λ阻抑蛋白CI。此外美国专利4,556,643，本文一并参考，其介绍了其它的DNA序列和特异结合蛋白，如阻遏子，组蛋白，DNA修饰酶类，及分解代谢产物基因的激活蛋白。也见EP0453301，本文一并参考，其提议了一大群核苷酸序列特异结合蛋白(NSSBPs)，例如四环素阻遏物，乳糖阻遏物以及色氨酸阻遏物。本领域已经认识到这些BBA的每一个都和特定的、已知的核酸序列结合，它们之间的亲和力也是已知的。当然，本发明的方法不限于使用这些已知的BBA。从本发明的公开内容可知，普通技术人员可以容易地施用新型至少具有本方法以上提到的所需特性的BBA的用途。
按照本发明的这方面，有用的新型BBA的例子包括基于已知的DNA或RNA或DNA：RNA结合蛋白基元的新型蛋白质，例如cro或入CI阻抑蛋白。优选的是对这些蛋白进行一些修饰，以提高本发明这些组分的操作性。这样，对一个分析来说，以希望加入高浓度的cro。cro的一个缺点是在高浓度时，cro与其靶DNA的结合将与cro-cro间的相互作用竞争。这样，例如，可以产生一种没有这种缺点的陪伴的或突变的cro。这种改变了的陪伴的例子见SEQ ID NO.105-106和108。本领域已知的方法，例如用多样的核酸群体产生新型靶结合蛋白及选择噬菌体和特定的、预先靶结合(例如，所谓的噬菌斑展示技术，参见上面有关新型TBA产生的讨论)的方法，都可以用来产生这种新型BBA以及前面提到的新型TBA。
无论BBA是一个蛋白质或蛋白质复合体，应该认识到可以利用本领域许多常规方法的任何一种来制备这种BBA。BBA事实上可从其自然产生的条件中分离，或者，如果这样不可行，可用标准的分子生物学技术来制备。例如，cro蛋白序列是已知的，噬菌体λ的任何分子克隆可用于获得编码cro的适当的核酸以用于重组体产生。此外，如果利用不同的TBA和TBR及BBR结合，本文描述的TBA也可用作BBA。
8.BBA和BBR用来定位和扩增PNA-TNA-TBA复合体定域的用途(见图8)
在本发明的一个实施方案中，使用了高度特异和极紧密结合的包含核酸结合组份的TBA，来产生可扩增的核酸夹层分析。按照本实施方案的一个方面，用第一个TBA包裹一个固体支持物以产生固定化的TBA。在溶液中，PNA和TNA在杂交条件下接触，然后与固定化的TBA接触。只有那些能够形成由固定化TBA识别的特异TBR的PNA-TNA相互作用才能在洗脱后保留下来，该固体表面结合了TBA-TBR复合体。
结合的TBR的检测通过在杂交条件下辅助核酸、BNA和存在于PNA上的1/2 BBR结合来完成。以这种方式，既使只有单一的TBA-TBR复合体结合在固定化TBA上，也可以通过聚合众多的BNA在固定化TNA上来产生一个扩增的信号。每一个和TNA结合的BNA产生一个BBR，它可和BBA结合，就象TBA固定在固体表面一样，可以选择BBA使它们能非常紧密且特异性地和特定核酸结构结合。这样，按照这一实施方案，固定化的TBA可以包含NF-kB的DNA结合蛋白，它非常特异地且紧密地与NF-kB结合位点结合，这一结合位点是基于TNA与PNA杂交而形成的。
因为，公知在正常人的基因组与人类免疫缺陷病毒(HIV)的长末端重复序列中都存在NF-kB结合位点，本发明提供了一种能区别 “正常”人类的结合位点和由于HIV感染而在细胞中出现的结合位点的方法。因此，在一个设计来确定人DNA样品中是否存在HIV DNA的测试中，可以把HIV NF-kB结合位点看成TNA，正常人的NF-kB结合位点看成CNA。按照本发明的方法，区别TNA和CNA可以通过利用如下事实来完成，即在HIV LTR中，有两个NF-kB结合位点，后面紧接着三个SP1位点(见Koken等。[1992]病毒学191：968-972)，而发现具有同样序列的细胞NF-kB结合位点不是一前一后的。
在TNA包含不只一个1/2 TBR时，希望实施TBA的诊断和预防应用时，可以使用不只一个的TBA，每个TBA都具有与TNA-PNA复合体中的TBR结合的能力。在这种情况下，选择对TBR亲和力小于野生型DNA或RNA结合区的DNA或RNA结合区是有利的，这种结合区作为所说的TBA的组分。假设那些与众多TBR结合的TBA既可以在与它们的TBR结合之前聚合在一起，也可以在与它们的TBR结合之后聚集在一起，在其它非靶基因组中，除非TBR具有空间上结合已装配的TBA复合体的能力，单个的TBA将不会阻碍相应的TBR。在这儿特别声明的作为本发明一个部分的多聚TBA复合体的一个特征是：预计这种多聚复合体与TNA内单个位点的亲和力极大地减小。然而，由于其结合能力相对于单个的TBA极大地增加，预计这种TBA复合体不和任何单个的TBR与活体内相应蛋白质之间的结合发生竞争，但却和含有TBR的PNA-TNA杂交体的序列紧密结合，这种TBR用于TBA中每个装配的核酸结合组份。装配TBA复合体并调整单个TBA中的接头以便包含在TBA复合体中的核酸结合区到达这些靶并与之结合。
一旦TNA-PNA杂交体形成并与固定化TBA接触，未结合上的核酸则可从固定化表面洗脱掉并可检测固定化的杂交体。可以用几种方法中的任何一个来完成这个过程。本发明的一个方面是，PNA用一种OSA标记，如放射性核素，有色颗粒，或有能力产生带色反应产物的酶。并且，这种PNA除了具有一个或多个1/2 TBR外，也可以含有至少一个1/2 BBR。对这种1/2BBR序列进行选择以便其与BNA中独有的1/2 BBR序列互补。在上面描述的实施例中，例如，其中的TBA是NF-kB以及在TNA-PNA杂交体上形成的TBR是一个或多个NF-kB的结合位点时，1/2 BBR可提供噬菌体λ操纵子左端或右端的可杂交(即是单链的，互补的)的序列(见，例如，Ptashne[1982]，科学的美国(Scientific American)247：128-140，以及该文关于这些操纵子序列所引用的参考文献)。这些序列可以以载体的形式聚合在PNA1/2 BBR上(见图2和3)，提供“n”个BBR，每个BBR形成一个cro结合位点。以酶法、放射性或其它方法标记的cro与TBA-TNA-PNA-(BNA)n复合体接触。以这种方式，可产生一个高度选择性的和扩增的信号。用含有单个1/2 TBR的PNA产生的信号表明分析的成功，完成了TBA-TBR的结合及BNA的聚合结果从细胞位点产生信号(例如，从CNA)。当使用双聚TBA时，信号的缺乏表明在TNA中没有HIV LTRs，因为不存在双NF-kB结合位点。另一方面，使用双聚NF-kB时信号的出现表明有HIV感染。本发明此实施例前面所述的一个具体例子，见例6所描述的HIV检测试剂盒。
自然，本领域的技术人员应该认识到前面所述的描述可以在选择PNA，TNA，TBA，BNA和BBA有几种修改。并且，在非HIV的其它系统中，本领域的技术人员应意识到以上描述的一般方法可同样使用。然而，其它的使用可以比以上描述的方法更简单，因为使用的TBA可以不识别任何正常细胞位点因而采取双聚合法，或其它能区别TNA和CNA方法都可以。在设计用于其它系统的探针和结合装配体时，本领域技术人员应遵守下面的原则和注意事项。
在以上所述的实施方案中，要求用NF-kB蛋白的DNA-结合部分作为TBA和用NF-kB识别结合组份作为TBR，是因为这些组份形成一个重要的HIV复制的“控制点”。也就是说，已知HIV需要在其复制生命周期中用NF-kB作为一个关键组份。按照本文描述的方法，可以选择其它病原体的类似控制点并作为检测的基础。
从以上描述的本发明的一般特性和操作方式，本领域的技术人员应认识到有很多实践本发明的具体方式。例如，本发明的方法适用于美国专利4690691和5310650(′691和′650专利)描述的使用层析测试盒的方法和装置。在那些专利中，利用孔状培养基固定TNA或捕获探针，利用一种溶液传输流动相到“捕获区”，如果固定的是TNA，流动相中则含有标记的PNA；如果固定的是捕获探针，流动相则含有TNA。通过直接固定或捕获，一旦TNA结合到捕获区，在捕获区内色谱分析标记的PNA同时检测任何结合的标记。
本发明采用这种系统，改进了捕获区的子结合装配体的利用，因而，捕获的只是完美相配的TBR序列或其它代表核酸构型的TBR，这种TBR和TNA-PNA双螺旋体中的TBA特异结合，其中TNA与CNA的区别依靠前面描述的TBA灵敏区别TNA与CNA的方法。
一旦TNA-PNA杂交体与固定化的TBA结合，就可以通过加入BNA或捕获区层析分析的BNA而扩增信号。最后，可以通过加入BNA或捕获区层析分析的BNA而进一步扩增信号。以这种方式，通过提供增加那些专利所述方法的特异性和灵敏性的额外能力(通过扩增)，本发明提高了专利′691与′650所述分析各步的简便性。为了显示该方法的细节和该文本所述特殊操作条件的教导(该条件下，本发明的组分和方法也是适用的)，专利′691与′650的公开内容本文一并参考。
本领域的技术人员也会认识到本发明的方法适合用于微孔滴板或自动分析。因此，并入本发明方法的仪器的用途自然在本公开内容和有关权利要求范围内。这样，例如，本发明可采用的仪器，如AbbottLaboratories(Cabbott Park，IL)的IMx桌面分析仪。设计IMX目前是来进行荧光极化免疫分析(MEZA，见Kier[1983]KCLA3：13-15)和微粒酶联免疫分析(MEZA，见实验医学，Vol.20，NO.1，January 1989，PP.47-49)。用本发明的TBA作为捕获分子，这种捕获分子包裹在悬浮于溶液中的亚微粒(平均＜0.5μm)大小的微粒上，可以容易地把MEZA法转变成核酸检测的方法。将TBA包裹的微粒转入反应细胞中。然后IMx将样品(杂合的PNA-TNA)转入反应细胞中，与TBA形成一个复合体。经过一段适当时间的培养，将溶液转移到惰性的玻璃纤维基质上，颗粒物与其具有强的亲和力因而微粒粘在其上。在通过玻璃纤维基质过滤反应液之前或之后加入BNA和BBA，或依据TNA-PNA杂交体的特定结构，使用另外的信号扩增和检测方法。对固定化的复合体进行洗脱，未结合上的物质通过玻璃纤维基质流出来。
用碱性磷酸酶标记BBA或其它形式(放射性的，酶学的，荧光的)标记BBA的方法检测结合的复合体。在碱性磷酸酶标记BBA的情况下，可以加入荧光底物4-甲基umbelliferyl磷酸盐或类似的试剂。另外，可以通过直接以这种试剂或类似试剂标记BBA的方法而省去酶。不管哪种情况，荧光或其它信号都与PNA-TNA杂交体的数量成比例。
用IMx制造商所描述的前表面荧光计的方法来检测基质表面的荧光。通过一些小的调整，这一方法可以由常规实验来完善仪器，例如Imx用于核酸杂交和核酸-TBA相互作用的检测，本发明完全适用于TNA样品的自动分析。
9.本发明的其它诊断应用
虽然，从前面的描述可知能以多种不同的方式利用本发明，但本发明另外众多的应用也是相当有价值的，例如，在移动延迟系统中的应用。
在本发明的这个实施例中，依下列各项对公知的电泳迁移率变动分析(EMSA)进行了改进(见图12a和12b)。
通过随机切割或通过特定的限制性核酸内切酶处理的方法把DNA样品切成片段。然后将DNA样品分成相等的两份，将特定的TNA加入到第一份中但不加入第二份中。然后将两等分试样在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上电泳。比较两份样品的DNA带型(通过溴化乙锭结合或通过电泳前放射性标记的方法显示)。具有TBA特异结合位点的DNA片段在通过电泳介质迁移时受阻。用合适的TBA，任何数量的DNA或其它核酸都可以以此种方式追踪。
在以上描述的EMSA的改进中，TNA的片断与PNA杂交并被分离在第一部分中。分离的DNA与适当的TBA反应同时注意到DNA片段的迁移率发生变化。如上文描述，加入BBA可能会增加这种阻滞(见Vijg及其所引用的有关已知的二维核酸电泳技术的文献，对于这种技术可直接应用本方法)。
10.治疗应用
由于本文描述的新型TBA具有紧密且选择性的核酸结合特征，所以考虑到这些化合物除了诊断上的应用外，还可用于治疗。这样，由于在临近的组合中存在NF-kB p50和SP1 DNA识别单位(见图10，HIV-检测II)，具有紧密及特异地与HIV-LTR结合的特性的TBA，可以用来结合到HIV-LTR上而阻止HIV基因组的某些关键因素的转录。TBA装配序列独有的这种特征允许重组载体把编码TBA的DNA导入细胞并把表达的序列正确地折叠。一旦进入细胞，p50亚单位上的细胞核定位信号将引导TBA进入细胞核并紧密地与任何整合的HIV的LTR结合，结果有效地控制了病原。在预防模式中，对有可能暴露在HIV中的人施用足够剂量的TBA或一个可以表达TBA的重组载体，这样阻断任何可能侵入人体的HIV。在这种模式中，TBA的使用类似于用特异性免疫球蛋白的被动保护。在治疗或预防模式，使用NLS序列替代用于诊断模式中的OSA。例举的NLS序列见SEQ ID NO.72和103(另见Heinzingen 1994和bukinsky 1993，分别描述了HIV Vpr和gag蛋白质的NLS序列)。在任何情况下，以药学上可接受的载体施用TBA，如无菌盐溶液，与磷酯体结合或以重组载体的形式，优选的方法应该能指导TBA在选择的细胞类型中表达，或取决于蛋白质的转递系统。
II.本发明的实施方案
由于前面的描述和下面的实施例，本领域的技术人员会理解本文描述了并使得可以实施本发明的各种实施方案，这些实施方案包括：
1.一种探针核酸(PNA)，该核酸包含：
(A)单链序列1/2 TBR，该序列在杂交条件下可以和存在于靶核酸(TNA)中的1/2 TBR形成杂交体TBR；
(B)单链序列1/2 BBR，该序列在杂交条件下可以和辅助核酸(BNA)中的0-10个1/2 BBR形成杂交体BBR；和
(C)OSA，其不是连接的支持物和/或指示剂，或者是连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述的定位方式包括但不限于连接到小殊上，聚合物上和表面上；其中所说的TBR可以以高亲和力和TBA结合，所说的TBA是一种能够区分配对的TBR和具有未配对的核苷酸的TBR的物质，并且，所说的BBR可以以高亲和力和BBA结合，所说的BBA是一种能够区分配对的BBR和具有未配对的核苷酸的BBR的物质。这一实施方案包括TRR(其是核酸结合蛋白识别位点，例如HIV LTR)在其它病原体中的核酸结合蛋白识别位点，其中某些以上已说明。本发明的这一实施方案的PNA可以产生TBR，后者是存在于病原体基因组中的核酸结合蛋白识别位点或者是与人基因组中的病理状态或发酵过程中污染物相关的结合位点。
2.一种辅助核酸(BNA)，该核酸包含：
(A)1/2 BBR，其具有和PNA或另外的BNA中1/2 BBR序列互补的序列，并且其在杂交条件下可以和PNA形成杂交体BBR；
(B)OSA，其不是连接的支持物和/或指示剂，或者是连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述的定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；和
(C)附加的杂交位点1/2 BBR，用来和附加的BNA杂交；其中所说的BBR可以以高亲和力和BBA结合，所说的BBA是一种能够区分配对的BBR和具有未配对的核苷酸的BBR的物质。
3.一种发夹核酸(HNA)，该核酸包含单链序列1/2 BBR，该序列在杂交条件下能够形成发夹结构，并且同时和BNA结合形成能够结合BBA的BBR，其中所说的BBR可以以高亲和力和BBA结合，所说的BBA是一种能够区分完美的BBR和具有未配对的核苷酸的BBR的物质。
4.一种用于检测特定TNA序列的方法，该方法包括以下步骤：
(A)使所说的TNA与权利要求1的PNA杂交；
(B)使所说的TNA与含有1/2 BBR的BNA杂交，所说1/2 BBR的序列和PNA中的1/2 BBR序列互补；
(C)将含有TBR和BBR的步骤(A)和(B)的产物加入到含有TBA的表面、液体或其它介质中；
(D)将BBA加入到步骤C的混合物中，其中所说的BBA包含：
(I)能够选择性地结合BBR的分子或分子的一部分；
(II)可检测的指示剂；和
(E)检测连接到BBA上的指示剂所产生的信号。这一方法包括使用蛋白质指示剂包括可以催化反应导致产生有色反应产物的酶，也包括象放射性核素，有色小球之类的指示剂。
5.一种用于检测样品中特定靶核酸TNA存在的方法，该方法包括以下步骤：
(A)使所说的样品和探针核酸PNA接触，如果样品中存在所说的TNA，则PNA与TNA杂交形成靶结合区TBR，此TBR可以和靶结合装配体TBA结合；和
(B)使已经和所说的PNA接触的样品和TBA接触，此TBA可以结合任何由所说的PNA与样品中所说的TNA杂交形成的TBR。
6.一种具有高灵敏性和特异性的检测和定位特定核酸序列的方法，该方法包括：
(A)将含有1/2 BBR和1/2 TBR的PNA加入到含有或怀疑含有包含1/2 TBR序列的TNA样品中，以形成具有靶结合区的复合体TBR，此TBR由分别存在于PNA和TNA中的互补1/2 TBR的杂交形成；
(B)将步骤A中形成的TBR结合到固定化的TBA上，以形成TBA-TNA-PNA复合体；
(C)将包含辅助结合区1/2 BBR的辅助核酸BNA加入到步骤B中形成的复合体中，以便BNA中的1/2 BBR与存在于PNA中的1/2 BBR序列杂交，或者加入到存在于已经和PNA结合的BNA中的1/2 BBR上形成BBR，以便形成TBA-TNA-PNA-(BNA)n复合体；
(D)将含有1/2 BBR序列的发夹核酸HNA加入到步骤C中形成的复合体中，以便HNA中的1/2 BBR和任何存在于步骤C的复合体的BNA中的可获得的1/2 BBR序列杂交，由此在步骤C的TBA-TNA-PNA-(BNA)n复合体上加帽使BNA延伸，形成TBA-TNA-PNA-(BNA)n-HNA复合体；
(E)将和指示剂部分连接的辅助结合装配体加入到步骤D中所形成的TBA-TNA-PNA-(BNA)n-HNA复合体中，以便形成TBA-TNA-PNA(BNA-BBA)n-HNA复合体；和
(F)检测由连接到步骤(E)中TBA-TNA-PNA-(BNA-BBA)n-HNA复合体中的TBA，PNA，BNA，BBA或HNA上的指示剂所产生的信号；其中所说的TNA包含：
(i)一个或多个特定1/2 TBR核酸序列，此特定序列在特定样品中的存在与否有待证实；所说的PNA包含：
(i)单链序列1/2 TBR，该序列在杂交条件下可以和存在于靶核酸(TNA)中的1/2 TBR形成杂交体TBR；
(ii)单链序列1/2 BBR，该序列在杂交条件下可以和辅助核酸(BNA)中的0-10个1/2 BBR形成杂交体BBR；和
(iii)OSA，其不是连接的支持物和/或指示剂，或者是连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述的定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；所说的BNA包含：
(i)1/2 BBR，其具有和PNA或另外的BNA中1/2 BBR序列互补的序列，并且其在杂交条件下可以和PNA形成杂交体BBR；
(ii)OSA，其不是连接的支持物和/或指示剂，或者是连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述的定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；和
(iii)附加的其它BNA的杂交位点1/2 BBR；
(iv)序列1/2 BBR，其可以与已经和PNA杂交的BNA杂交；所说的BBA包含：
(i)能够选择性地结合BBR的分子或分子的一部分；和
(ii)OSA，其不是连接的支持物和/或指示剂，或者是连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述的定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；并且所说的TBA包含
(i)能够选择性地结合TBR的分子或分子的一部分；和
(ii)无连接的支持物和/或指示剂，或者连接的支持物或其它定位方式，包括，但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上和/或指示剂上；
7.一种用于检测靶多核苷酸存在的改进的固相杂交方法，所述的固相杂交方法涉及将靶多核苷酸(如果存在于样品中)直接或经媒介俘获结构固定化在固相的俘获位点上；在所说的固定化过程之前、之中或之后将一种可检测的标记连接到所说的靶多核苷酸(如果存在)上，并且在俘获位点上检测所说的标记(如果具有任何所说的标记存在)，所述改进包括：
(A)使用靶结合装配体TBA作为达到固定化所说的靶多核苷酸的手段，其中所说的TBA只结合到由特定的探针核酸PNA和所说的的靶核酸形成的独特的杂交体上，以便形成可以被所说的TBA识别的完美的靶结合区TBR；和
(B)在PNA中包含进可以结合辅助核酸BNA的单链核酸1/2BBR，所说辅助核酸含有单链互补1/2 BBR，当其和PNA中的1/2 BBR杂交时，形成可以和标记的辅助结合装配体BBA结合的BBR。
8.一种靶结合装配体TBA，其包含一个或多个核酸识别单位、接头序列、装配序列、不对称序列、核定位信号序列(NLS)和OSA。所说的核酸识别单位可以是NF-kB结合单位、SP1结合单位、TATA结合单位、人乳头状瘤病毒结合单位、HIV LTR结合单位或特定序列(其检测是所需的，并且其可以通过与TBA特定缔合完成)的任何其它片段的结合单位。这样的核酸识别单位包括但不限于这里作为举例的这样一些：SEQ ID NO.63、SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67、SEQ IDNO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71、SEQ IDNO.72和SEQ ID NO.73。接头序列，例如寡肽，不干扰核酸识别单位的核酸识功能，并且提供核酸识别单位与剩余TBA间隔的稳定性和控制。这种接头序列是本领域已知的，包括但不限于来源于结构蛋白区域间一级序列的寡肽序列。装配序列包括寡肽序列，此寡肽序列指导核酸识别单位的折叠和缔合。这种序列优选的例子是来源于λ噬菌体cro蛋白寡肽。所说的不对称序列指导核酸识别序列和装配序列以预定的顺序缔合。这种不对称序列的例子是来源于胰岛素、松驰素、促性腺激素、FSH、HCG、LH、ACTH的序列，包括但不限于SEQ ID NO.85-92。参照图14和15，SEQ IDNo.85是“A”序列，SEQ ID No.86是“B”序列；SEQ ID No.87是“A”序列，SEQ ID No.88是“B”序列；SEQ ID No.89是人松弛素“A”序列，SEQ ID No.90是人松弛素“B”序列；SEQ ID No.91是skate“A”序列，SEQ ID No.92是skate“B”序列。此外，所说的TBA可以含有核定位序列NLS，其指导与所说的NLS相关的蛋白质或复合体迁移和摄入到细胞核中。这样的NLS序列的例子是SEQ ID NO.72和SEQ ID NO.103。TBA优选的具体例子是HIV Detect I-IV或HPV DectectI-IV，和SEQ ID NO.109-116。
9.使用本发明的新TBA的方法，包括但不限于使用TBA结合靶核酸样品中特定的核酸序列的方法，该方法包括：
(A)裂解靶核酸样品中的核酸；
(B)在杂交条件下，使裂解的核酸与和特定的兴趣核酸互补的探针核酸接触，其中在所说的的探针核酸与所说的特定的兴趣核酸序列杂交时，形成所说的TBA特异性地结合到其中的靶结合区。
在这一方法中，所说的探针核酸除了具有和所说的特定的兴趣核酸互补的序列外，还具有附加序列，此附加序列可与辅助核酸结合，形成辅助结合位点，标记的辅助结合装配体可以结合到此结合位点上，提供显示和扩增探针核酸和兴趣靶核酸序列结合的信号。
本发明不需要裂解靶核酸的另一方面涉及将预防和治疗有效量的所说TBA施用给需要此种治疗的病人，该方法包括以提纯的蛋白复合体的形式或以重组载体(进入病人体内后可以表达TBA)的形式施用TBA，以便TBA和特定的核酸序列结合达到所期望的治疗和预防结果。这可以包括提供可由常规实验确定的足以阻止病原体活性感染的剂量。当以指导TBA体内表达和折叠的重组表达载体提供时，重组核酸的剂量可以实质上较低。特别是以非病原体病毒载体形式提供时。使用TBA的方法也包括监测靶核酸样品中核酸移动性的改变，以便TBA和样品中特定的核酸片段结合改变此片段的移动性作为核酸大小的函数。所述方法的这一方面提供了为特定的畸变(例如可能在与新陈代谢相关的过程中发现的)分析核酸片段的有用的方法。
10.诊断或法医试验试剂盒，该试剂盒在确定感染的存在、疾病的易感性或包含特定核酸源的样品。
11.一种用于在体内装配多聚体TBA方法，该方法包括将组份TBA引入到细胞中，所说的TBA组份每个都应含有核酸识别单位、装配序列、不对称序列和核定位信号序列，如果足迹法实验表明需要接头序列来获得多聚体TBA的最适的几何学，则接头序列也可以包含在其中。当体内表达各组份TBA和经由各组份TBA的DNA识别单位邻近地结合到在细胞核中或细胞其它区域遇到的核酸序列上时，组份表达的TBA通过所说的装配和不对称序列被装配成多聚体TBA。如上所述，这样的多聚体TBA具有以高的亲和力特异性地结合到特定靶序列中的TBR上但根本不结合到表亲核酸上或者以非常低的亲和力结合到表亲核酸上的优点。
本发明以上的描述会使本领域技术人员明白本发明的优选的实施方案和最佳方式。不将发明主题限制在此后给出的具体例子中，以下实施例提供来指定本领域技术人员实施本发明的方法。在Sambrook，Fritsch和Maniatis(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY中描述了标准的重组DNA技术，没有描述较近期的内容，因为现在这些已经完全在本领域技术人员的知识范围内。
实施例1-PNA的制备及标记
可以通过本领域已知的各种方法制备核酸探针(PNA)。这样，限定序列的单链多核苷酸的PNA可以按照Merrifield的固相化学合成方法进行制备。可以利用通过商业途径可以得到的技术经自动合成的方法制备PNA，例如使用Biosystems、ABI和其它制造者生产和销售的树脂和仪器。另外，通过已知的重组DNA方法，体内合成特定的PNA序列，例如通过将双链PNA克隆进能在大肠杆菌中复制的载体中，则可以制备大量的双链PNA。可以把PNA聚合物克隆进这种载体，这样对于每摩尔的载体，通过用位于PNA序列两侧的限制片断消化载体，可以释放几摩尔的PNA。继合成或重组产生之后，通过本领域公知的方法纯化PNA，如通过凝胶电泳或高压液相色谱技术。如果PNA以双链形式产生，在其用于检测靶核酸序列的杂交分析之前，用加热或本领域已知的其它方法将PNA的双链分离。
选择PNA中的特定碱基序列，这些序列反映了TNA中被检测的序列，但条件是，根据本发明，PNA含有一个1/2 TBR序列，此序列是基于PNA和TNA杂交形成TBR的之一。由于本领域中实际上有无限量的这样的序列，所以对于任何给定的应用，技术人员能够选择到合适的PNA序列。HIV LTR序列就是这样一个序列，其在编码部分LTR的PNA与编码HIV LTR的TNA杂交后，形成可以与NF-kB或SP1 DNA结合蛋白结合的TBR。
除了在杂交基础上形成TBR的序列，PNA还可以含有1/2 BBR。这一序列是指在和辅助核酸BNA杂交后可以形成BBR的序列，BBR序列能结合BBA。优选的BBA是对BBR序列有高度亲合力的DNA结合蛋白。
在这个具体的例子中，杂交发生在有一个1/2 TBR的PNA(见SEQ ID NO.4)和该序列3端的1/2 TBR(见SEQ ID NO.35)之间。编码这些序列的PNA在使用中可以不标记或者用同位素如P32，S35标记或按照本领域已知的方法用类似的同位素标记。另外，PNA也可以和直径0.01到10微米的胶粒结合，将这些胶粒染色以便于视觉检测。这种标记形成如说明书所描述的OSA。这种探针与HIV LTR序列杂交形成了结合NF-kB的TBR。此外，PNA与具有互补1/2 BBR的BNA杂交形成噬菌体λ的左操纵子，这种操纵子或者与cro或与λ阻抑蛋白结合。
以上面描述类似的方法，使用PNA，其中所说的1/2 TBR是SEQ ID NO.5或SEQ ID NOS.7-34的任何一个，另外一个1/2 BBR，如SEQ ID NO.35或36，在前一个1/2 TBR的3′端或者5′端。
实施例2-BNA的制备和标记
与实施例1中所描述的制备和标记PNA的方法相似，按照本领域已知的方法制备和标记BNA。美国专利4,556,643所描述的方法，本文一并参考(具体参见例1)，可以通过将其克隆到一个可复制的载体中而大量产生编码特异核酸结合序列的核酸序列。并且，和其所公开的内容相似，以这种方式，可以共线性产生1/2 TBR和1/2 BBR，但不同的是，按照本发明，1/2 TBR自身形成一个核酸结合组份的识别位点，而1/2 BBR，尽管形成一个核酸结合组份识别位点，但还可以通过把BNA聚合在结合PNA的TNA上，而提供了扩增基于这种1/2 TBR和TNA中的互补序列结合而产生的信号的方法。为了实现这种扩增，给如SEQ ID NO.35的序列(这种序列能够编码噬菌体λ左操纵子)装配额外的序列，这样在BNA和PNA杂交的基础上，在BNA的一端或两端就形成了突出端序列。
BNA媒介聚合在TNA上的具体例子见SEQ ID NO.40-43。在这一例子中，SEQ ID NO.40编码2个1/2 TBR，这2个1/2 TBR与TNA上的2个1/2 TBR杂交而形成2个NF-kB结合位点，同时还提供了一个噬菌体左操纵子1/2BBR，该序列的3′端是一个限制酶PstI的识别位点。加入BNA(SEQ ID NO.41)及与PNA中的1/2 BBR互补的1/2 BBR(SEQ ID NO.40)，就形成一个完整的BBR同时形成一个完整的PstI识别位点，留下一个4碱基的突中端用于和额外的BNA杂交。因此，加入3′端有一个4碱基序列的SEQ ID NO.42，其与SEQ ID NO.4和41杂交后剩下的4个碱基的突出端互补。此外，给SEQID NO.42在5′端装配一个5碱基的序列，该序列是BamHI识别位点的组成部分。通过加入SEQ ID NO.43的BNA，可进一步扩展BNA生长聚合体，SEQ ID NO.43的BNA和SEQ ID NO.42互补，形成一个完整的BBR同时形成完整的BamHI识别位点，并且，留下一个还可和具有互补序列的BNA杂交的4碱基的突出端。通过这种方式，可以广泛的杂交BNA，结果极大地扩增了单一PNA与TNA杂交作用的信号。
和实施例1中所述的PNA一样，利用BNA可以以不标记形式或按照本领域已知的和实施例1所描述的方法对其进行标记。产生BNA聚合物时，向PNA-TNA复合体直接加入BNA而形成BNA聚合体是值得欣赏的，而不是通过向PNA-TNA复合体中顺序添加BNA。形成这种BNA聚合物的一个简易方法包含重组产生载体，在该载体中给BNA聚合物在其任何一端提供一个独有的限制酶切位点。把含有多个BBR的多聚体BNA从载体上切下来，并和基于PNA和TNA杂交保留在PNA上的单链1/2 BBR杂交。通过在PNA上提供和BNA聚合物上的突出端互补的单链序列来完成这一过程，其中突出端是BNA聚合物从产生载体上切割下来时产生的。
实施例3-HNA的产生和它们用于加帽BNA聚合物的用途
按照本领域用于产生核苷酸的已知方法，如例1和例2中产生PNA和BNA的方法产生本发明的HNA。但是，在生产HNA的过程中，特异设计HNA的序列，以便HNA的实质性部分形成一个自我配对的回文序列而形成一个发夹结构，同时，在剩余的单链部分形成足够的碱基以便能与例2所描述的BNA的生长链的单链序列杂交。
在这一实施例中，提供HNA(SEQ ID NO.44)以加帽例2中在加入BNA(SEQID NO.43)之后，和PNA杂交的BNA的突出端。因为SEQ ID NO.44除了具有一个形成一个稳定发卡结构的回文序列，还在HNAs的5′端有一段序列，这段序列完善通过SEQ ID NO.42和43的杂交而形成的BamHI序列，所以上述过程能够完成。自然，在说明本发明的过程中，只加入3个BNA而终止聚合物是为了简便说明的目的。如上所述，这一聚合过程实质上可以无限地连续扩增PNA-TNA杂交过程中的信号。一旦HNA与BNA的生长链杂交，则加帽该聚合物，并且失去聚合物的突出端。
实施例4-TBA和BBA的制备、标记和其固定
根据本发明可以使用的TBA和BBA包括任何特异性地和PNA、TNA和BNA杂交后形成的TBR和BBR结合的物质。使用DNA结合蛋白形成这种物质的一例。
在这个例子中，所说的TBA是DNA结合部分p50的二聚体，所说的BBA是λcro蛋白。这些蛋白可以通过本领域已知的方法生产。已经克隆了编码这些蛋白的基因。这样，依据本领域已知的方法能够重组产生这些蛋白并对其进行纯化。并且可按照本领域已知的方法标记这些蛋白，或者通过放射性同位素标记(如放射性碘)，或者用酶标记(如β-半乳糖酶或辣根过氧化物酶)，或者通过萤光染料标记(如萤光素或罗丹明)。另外，可以把TBA和BBA中的任何一个或两个固定在固相表面，如微量滴定板表面或微粒的表面(直径介于0.01至10微米的彩色粒子)。TBA和BBA的标记可以相同也可以不同。
在这一例子中，含有二聚p50 DNA结合区的TBA用罗丹明标记，而BBA，cro蛋白，用萤光素标记。因此，经过和本专利公开内容和前面与下面的例子所描述的PNA、TNA、BNA和HNAs的杂交，核酸杂交体(如果形式)，和过量标记的TNA和cro接触。这些标记的萤光信号通过已知的方法来测量，二种信号的检测结果都表明TNA上存在1/2 TBR序列。NF-kB和cro的萤光产生的差异信号能够量度BNA在PNA-TBA杂交体上的聚合引起的信号扩增程度。按照本发明的方法，预计扩增可从一倍至一千倍。
实施例5-两个PNA和一个TNA的杂交以及TNA和CAN的区别
所用的PNA，PNA1(SEQ ID NO.40)和PNA2(SEQ ID NO.45)，以十倍于实验样品中TNA的摩尔浓度的量使用。在该实施例中，一个分离的双链HIVLTR，其中一条链具有图7所示的SEQ ID NO.37序列，另一条链与图7所示序列互补，用作TNA。在此实施例中也使用了一个分离的双链CNA，其中的一条链与SEQ ID NOS.37的序列相同，除了在图7所示的第一个NF-kB结合位点的中心，即图7的1位，“A”代替“T”；因此互补链在那个位点上和SEQ ID NOS.40的PNA错配。
把SEQ ID NOS.40和SEQ ID NOS.45的序列都加入到不同的反应中，第一个序列包括上述的TNA，而第二个序列包括上述的CNA。把样品溶解在合适的杂交缓冲液中，例如10mM Tris(pH7.5)、1mM EDTA。把样品加热到90℃保持大约5分钟，使样品中双链的TNA和CAN链分离，然后冷却样品使PNA，TNA和CNA的链退火。
杂交结束后，可以根据已知的方法检测杂交，如根据已知的方法计算基于碱基组份的t1/2和退火温度，SEQ ID NOS.40的PNA和加入的BNA多聚合(和实施例2一样)，SEQ ID NOS.45的PNA2探针与始于Sph1识别位点突出端的BNA进行多聚合。在加入BNA并短时间杂交后，不同的样品分别加入用共价固定的NF-kB包被的颗粒上，允许NF-kB和TNA及CNA样品中形成的任何TBR结合。大约结合15分钟后，用大约3倍体积的合适洗脱缓冲液洗脱样品两次，所用的缓冲液如10mM Tris(pH7.5)、100mM氯化钠，或已确定不会影响NF-kB或噬菌体λCI阻抑蛋白结合活性的另外缓冲液。每次洗脱后，颗粒都通过重力或短时间离心而沉降下来。这样就去除了那些没有正确地经PNA1和TNA杂交而形成的NF-kB结合位点的核酸。
最后一次洗脱后，把标记的噬菌体λ的CI阻抑蛋白加到每一个样品中，这些噬菌体λCI阻抑蛋白用放射性同位素标记(如放射性碘)、或用酶标记(如辣根过氧化物酶)、或者用带颜色的颗粒、或者用萤光标记物标记。然后用几倍体积(约2倍)的合适洗脱缓冲液洗脱样品几次(约3次)，缓冲液如10mM Tris，pH7.5、100mM氯化钠，或已确定不会影响NF-kB或噬菌体λCI阻抑蛋白结合活性的另外缓冲液。每次洗脱后，颗粒都通过重力或短时间离心而沉降下来。最后一次沉降或离心之后，通过检测结合的放射性量、酶分析中释放的颜色、结合的颗粒的颜色、或荧光来定量结合的标记物。另外，也可以加入一种抗-CI的抗体并使用一种标准的三明治式酶联免疫测试或放射免疫测试为检测结合的阻抑蛋白。另外，作为阴性对照(背景)，所有的上述操作都在另一种样品中依次进行，这种样品中的颗粒不含固定的NF-kB。
前面检测的结果是，对照和含CNA的样品具都有相似的低度信号而含TNA的样品则具有远远高于背景的信号。
实施例6-A.检测HIV的试剂盒
A.试剂盒组成：
1.微量滴定板
2.在tris缓冲液盐水中重组产生的NF-kB溶液1mg/ml
3.含有单链HIV PNA的管(预先混合的编码2个NF-kB1/2结合位点的寡核苷酸混合物，即SEQ.ID.No.7和8的混合物)
4.含有单链人基因组PNA(SEQ ID NO.1)的管
5.含有核酸酶(PstI)的管
6.含有蛋白酶的管
7.含有预先聚合的BNAs，100个重复单位的噬菌体λOR的管，其被HNA加帽但具有自由的1/2 BBR以便结合PNA-TNA杂交体
8.含有结合cro的辣根过氧化物酶(hrp)的管
9.含有hrp染色底物的管
10.Tris缓冲液盐水100ml
11.小刀
12.反应管A、B、C，每个管含有250ml蒸馏水
13.医用滴管
B.检测方法
(a)用在tris缓冲液盐水中重组产生的NF-kB溶液(项2)1mg/ml，浸没微量滴定板(项1)，4℃下旋转过夜。
(b)用小刀(相11)刺破手指取出三滴试验者的血，在A、B、C反应管(项12)中各悬浮一滴血。
(c)在每个管中用医用滴管(项12)悬浮一滴蛋白酶溶液(项6)，振动管，静置5分钟。
(d)用医用滴管在管A-C的每个管中滴一滴核酸酶溶液(项5)，振动管，然后静置10分钟。
(e)把一滴项3的溶液加入管A中(试验样品)；一滴项4的溶液滴入管B中(阳性对照)；一滴盐水(项12)加入管C中(阴性对照)。将管在热水中加热至50℃，然后经一小时冷却至室温。
(f)杂交可在步骤(d)中发生时，从表面和微量滴定板上除去多余的蛋白(步骤(a)中)，用Tris缓冲液盐水冲洗盘子(管10)。
(g)从步骤(e)始把管A-C中的样品转移到有3个微孔的微量滴定板中，放置1个小时，不断摇动。
(h)用Tris缓冲液盐水冲洗含有管A-C内容物的微量滴定板微孔，再倒空。
(i)把一滴项7的溶液加入到每个微孔中，与结合在盘上的任何1/2 BBR杂交，一小时后，再用Tris缓冲液盐水冲洗三次。
(j)把一滴项8的溶液加入到每个微孔中，使cro可以与任何附着的BNAs结合，10分钟后，然后再用1毫升Tris缓冲液盐水洗脱5次。
(k)在每个微孔中加入一滴hrp底物，颜色反应即可发生。
C.结果
如果微孔A和B都显出颜色反应，而微孔C中无颜色反应，检验结果有效，被检对象感染了爱滋病。如果仅仅微孔A显示颜色反应，或者微孔C显出颜色反应，则检验的操作不正确，结果无效。如果微孔A和C不显示颜色反应但是微孔B显示颜色反应，则该检验有效，该个体没有感染爱滋病。
实施例7-各种新型TBA的产生
根据本发明使用的新型TNA按如下过程制备：
(a)NFkB/NF-kB(HIV-Detect I).把编码任意一种SEQ ID NOS.63-71或一种类似于NF-kB DNA结合蛋白的核酸以读框形式融入到另一个编码装配序列，如cro的核酸序列上，这样NF-kB DNA识别序列可在cro序列的氨基端或者羧基端编码。在NF-kB序列和cro序列之间可以提供也可以不提供一个接头序列。在cro的另一端，可以提供也可以不提供一个核定位序列，例如SEQ ID NOS.72。并且，在cro末端可以提供也可以不提供不被NF-kB识别序列利用的不对称序列。完整的TNA序列的例子如下所示。
(b)NF-kB/SP1(HIV-Detect II).以上文(a)中描述的相似方式，制备一个编码一个NF-kB识别区的重组编码序列。在另一个构建中，包括编码SP1 DNA识别部分的编码序列而不是SEQ ID NOS.63-72。这一序列编码SEQ ID NOS.73的序列的所有部分或功能部分，这部分是具有DNA结合功能的SP1转录因子的组成部分(参见Kadonaga等[1987]细胞51：1079-1090)。把NF-kB编码载体和SP1-编码载体共转染到一个适合的表达系统，这种表达系统是本领域公知的。在SP1和NF-kB识别单位通过陪伴装配之后，加入单体的NF-kB识别单位以完成NF-kB识别二聚体的聚合。不对称序列阻止NF-kB或SP1二聚体的形成，相反却指导NFKB-SP1异源二聚体的形成(即，爱滋病-检测II)，然后通过本领域已知的方法把这种异源二聚体从表达系统(哺乳动物或细菌细胞)中分离出来。
(c)SP1/SP1 TBA(HIV-Detect III).如上文(b)所述，制备SP1-编码的TBA构建体。但是，只有把构建体转染到表达系统时，才具有允许SP1-SP1二聚体形成的不对称序列。
(d)SP1-TATA(HIV-Detect IV).如上文(b)所述，产生SP1-编码的TBA重组体。此外，用和SP1 TBA-编码的构建体中的序列互补的不对称序列制备了编码具有结合序列的TBA的重组序列，SEQ ID NO.74或其它编码TATA结合位点的序列。通过标准的方法把这些构建体共转染并把异源二聚体分离出来，这些方法包括在具有适当的SP1-TATA靶结合区的DNA柱上的亲和纯化法。
(e)SP1-E2(HPV-Detect I).按上文(b)所述的方法制备SP1-编码的构建体，通过利用编码SEQ ID NO.75-84和94-98任何一个的序列(这些序列是乳头状瘤病毒E2 DNA识别位点(见Hegde等)[1992]自然，359：505-512)或其它识别位点)，制备一种E2 TBA-编码的构建体并把其和编码SP1 TBA的构建体共转化或共转染。在E2-SP1识别单位通过陪伴装配之后，加入单体E2识别单位以形成完整的E2识别二聚体。按照已知的方法把异源二聚体分离出来。
(f)E2-E2(HPV-Detect II)如上文(e)所述，制备E2 TBA-编码的构建体，除了包含不对称序列，这种序列允许E2二聚体的形成。然后把表达的二聚体用已知的方法分离出来，这些方法包括在DNA亲和柱上用于二聚的E2的结合位点的亲和纯化方法。
(g)E2-TATA(HPV-Detect IV)如上文(e)和(d)所述，分别制备结合TBA的E2和TATA，除了包含不对称序列，这些序列能促进异源二聚体而不是同源二聚体的形成。然后，使这些构建体共表达并分离异源二聚体。
(h)TATA-TATA(HPV-Detect IV)  如(a)和(d)中所述，通过使用促进同源二聚体形成的不对称序列制备和TBA-编码的构建体结合的TATA，同时分离同源二聚体。
(i)其它TBA如上文所述关于HIV和HPV的TBA，任何关于病原体或疾病状态的TBA都可通过鉴定特定DNA结合蛋白，以及通过使用合适接头、装配体和不对称序列而形成表达构建体来制备。
实施例8
以实施例5所述的类似分析方式，通过使用实施例6中制备的双链NF-kB-SP1结合蛋白而产生一种更严格的分析方法。因此，可以加长图7所示和实施5所使用的探针以缩小探针间距离从而减少TNA中DNA的自由度。
实施例9-“高级”TBA的产生
通过恰当使用不对称序列，产生TBA，这些TBA是特定DNA识别单位的二聚体，三聚体，四聚体，五聚体或六聚体。在这一方式中，产生一个六聚体TBA，先要通过使用能够促进二聚体形成的不对称序列产生一个NF-kBp50二聚体TBA。此外，这个不对称序列可以促使这个p50二聚体与一个SP1-SP1二聚体四聚化。最后，另外加入不对称序列指导具有核定位序列的二聚体参入而形成一个六聚体。这个过程的完成是通过加入，例如，胰岛素的不对称序列，其实质上形成六聚体。SEQ ID NOS.-85(A)和86(B)、87(A)和88(B)、89(A)和90(B)、以及91(A)和92(B)(参与图13和14)指导这一六聚体的形成。
因为其对HIV-LTR有非常高的亲合力，可以通过使用一个多聚的TBA来产生此六聚体，具有这种结构并用于此目的多聚体化合物本文称为“HIV-Lock”。
最佳HIV-Lock是通过结合在HIV-LTR的TBR上的TBA的足迹法(按照本领域公知的方法)来定义的，用这种方法来证实对多聚的TBA复合体的形成具有贡献的每个DNA结合蛋白的结合亲合力，参照能衍生出TBA的DNA结合识别单位的任意自然靶序列(如CNA)的亲合力而下移。任何对HIV TBA亲合力的并发丢失都可通过下述的聚合物形成而得到极大地补偿。
TBA每个组份与其TBR的结合和通过不对称序列形成二聚体的装配过程存在竞争。这种竞争可以通过在每个TBA组份中调整陪伴和不对称序列之间的接头而解除，这样就解开了这些竞争过程。所造成的TBA不对称性和装配组份在扩散方向上的降低(增加了有效浓度)导致了多聚复合体有效地形成。
在足迹的基础上，调整接头的长度和组成以便更好地区别靶HIV序列和自然序列。在这种方式下，虽然每个TBA组份将对CNA和TBR序列具有低亲合性，但聚合的复合体将对现已扩展的多聚复合体识别的TBR具有更高的亲合力(是TBA聚合物每个组份识别的TBR的亲合力的平方)，同时对CNA仍具有低亲合力。以同样方式，制备除HIV-Lock以外的其它多聚的TBA复合体。
以这种方式产生的TBA包括如下序列，它们可以通过连接蛋白亚单位或编码这些亚单位的核酸序列而装配起来，如下所示：
组合(set)    连接的序列组
A            I+II+III
B            IV+V+III
C            IV+III其中I-V组所包括的序列选自：
组           所选自的序列
I            SEQ ID NO.85-92的任何序列
II           Met Ser，连接到SEQ ID NO.104-106的任何序列上，其各
             自连接到SEQ ID NO.99上。
III          连接到SEQ ID NO.75-84或94-98之任一上的SEQ ID NO.100，
             连接到SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.93上的SEQ ID NO.
             101；或连接到SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.93上的SEQ ID
             NO.102；或者SEQ ID NO.72，103，73，或63-71的任
             何序列。
IV           SEQ ID NO.104-106的任何序列
V            SEQ ID NO.99。
这样的TBA的具体例子是SEQ ID NO.109-116，按如下装配
组合 SEQ  IDNO. 连接的序列
A 109 85+蛋氨酸丝氨酸+104+99+100+94
  A   110   85+蛋氨酸丝氨酸+104+99+72
  A   111   86+蛋氨酸丝氨酸+105+99+102+74
  A   112   86+蛋氨酸丝氨酸+106+99+73
  A   113   89+蛋氨酸丝氨酸+106+99+63
  C   114   106+64
  C   115   105+64
  B   116   106+99+73
以这种方式，通过在合适的不对称序列、装配序列和DNA的识别单位之间进行选择，可以形成许多不同的TBA。并且，这些系列，例如SEQ ID NO.114和115，将和非SEQ ID NO.114或115的二聚体的其它序列结合，由于在突变装配序列中的电性排斥作用不会形成二聚体(SEQ ID NO.104是cro；SEQ ID NO.105是一个新型突变的，负电性的cro，SEQ ID NO.106是一个新型突变的正电性的cro)。
当然，对于给定的这些TBA的氨基酸顺序，本领域的一般技术人员可以生产出编码这些序列的核酸克隆，而这些重组克隆自然是本发明的组成部分。
实施例10-用“HIV-LOCK”检测HIV
以与实施例6非常相似方法，用实施例9产出的“HIV-LOCK”作为TBA，试剂2，得到类似结果。
实施例11-用“HIV-LOCK”对损献血样进行HIV检测
当不限制待测血的质量时，检验捐献的血样是否有HIV污染，使用类似实施例6的检验，但是对A-C的每个管，把约5毫升血样在桌式离心机上离心沉淀下来。其它试剂用量根据需要按比例加大以便于处理样品中大量的TNA。
实施例12-作为抗HIV治疗剂的“HIV-LOCK”
把按照实施例9产生的“HIV-LOCK”在脂质体中制成1mg/ml的溶液，然后将其静脉注射到通过检测已确认感染HIV的个体中。注射剂量为每千克体重约0.1mg至100mg的“HIV-LOCK”，24小时后，监测病人血清中的HIV p24的浓度。有必要经常重复这种治疗，如血清中p24水平上升时。
实施例13-HIV-TBA构建体作为治疗剂的使用
使用重组逆转录病毒或类似载体把一个编码结合TBA的HIV-LTR的构建体传送到感染的病人身上。载体编码陪伴，如cro，和用于p50结合部分的DNA序列。同样的载体还编码一个陪伴，SP1 TBA在其上折叠。提供不对称序列，以便当p50-TBA和SP1-TBA共同在一个HIV感染的细胞中进行体内表达后，这些TBA之间立即进行结合，同时防止任何在p50 DNA结合区与体内p50或p65单体之间的结合。在TBA中也提供了NLS，以便一旦形成二聚体，TBA快速定位至细胞核中并与整合的HIV序列特异性结合，于是防止了任何从那个位点的转录。
为了此目的，需要选择编码DNA结合区的序列以便把表达的单体装配在不结合到人体自然序列的TBA上。这样，只有当TBA的组分和其靶序列结合后，TBA的所有组分间才能结合，形成一个能够紧密地特异性地结合HIV-LTR的复合体。
实施例14-用于人类乳头状瘤病毒的诊断试剂盒
用于人类乳头状瘤病毒的这种诊断剂利用了已知的有差异的良性和恶性HPV，提供了一个能表明病人体内恶性肿瘤的敏感性的检测手段。人类乳头状瘤病毒是一组与高等脊髓动物良性扁形上皮细胞肿痛相关的小DNA病毒。至少已发现了27种不同类型的HPV；其中许多和特定的医疗损害相关。其中有5种，HPV-6，HPV-11，HPV-16，HPV-18和HPV-33和人生殖道的损伤相关。总的来说，已经发现HPV-6和HPV-11的DNA与生殖道的良性损伤相关。已经发现HPV-16，HPV-18和HPV-33与预恶性和恶性损伤相关，并且能在大多数由子宫颈肿瘤细胞系产生的细胞中转录。HPV-16，HPV-18和HPV-33可能仅是一大系列与恶性人子宫颈肿瘤相关的HPV DNAs的2个成员。
动物模型表明良性乳头状瘤病毒损伤可以在一个辅致癌物质存在的情况下发展成为恶性损伤。已经在子宫颈肿瘤的转移瘤中发现了HPV DNA。在恶性子宫颈肿瘤损伤中，HPV DNA一般整合在人基因组上，但也有一些染色体外的HP VDNA存在。HPV的整合形成原病毒，一般导致病毒E2开放阅读框架(ORF)的破裂。尽管使E2开放阅读框架破裂，对几个子宫颈癌细胞系的检查显示了其的转录活性并整合了HPV-16和HPV-18。检测存在于人子宫颈癌细胞系SiHa和CaSKi中的HPV-16基因组时，发现HIV-16的整合存在差异。在SiHa细胞系中，单一HPV-16基因组的整合发生在碱基3132和3384之上，E1和E2 ORFs的破坏是缺失了0.3KB的序列。另外50个碱基在HPV-16 DNA上的缺失，造成了E2和E4 ORFs的融合。HPV-16 DNA的5′部分，包括损坏了的E2 ORF，连接到连续的人右端序列上。另外，在E1 ORFs中间的1138位上检测到了单一添加的鸟嘌呤。碱基的添加使E1a和E1b ORFs融合成一个单一E1 ORFs。
可以在基因库中得到HPV-16的完整基因组，保藏号为K02118；可以在基因库中得到HPV-33的完整基因组，保藏号为M12732；可以在基因库中得到HPV-18的完整基因组，保藏号为X05015。
作为初始筛选，对于一个给定的子宫颈活体检查样品的HPV感染事实的确定是通过使用，例如PNA SEQ ID NO.46-53的任何一个或全部和一个上述的E2 TBA的简单“是/不是”的分析类型建立起来。(即片断DNA，结合PNA，用TBA固定，和用BNA和BBA进行检测)。
一旦发现活组织检查的样品呈现HPV阳性反应，通过分析病毒在人基因组的整合状态来获得关于HPV恶化可能的额外信息。
1.把宫颈活组织检查样品的DNA切成片断，杂交到具有SEQ ID NO.60序列的阻断探针上。这一探针和未切出0.3kb片段的所有DNA片段结合。
2.将活组织检查样品中的DNA暴露给具有SEQ ID NO.61序列的PNA。该探针只和缺失0.3kb片段的DNA片段结合(如果存在大的缺失片段，阻碍探针将阻碍其环出)。
3.具有SEQ ID NO.62序列的PNA与SEQ ID NO.4 1序列杂交形成一个BBR，这种BBR再与作为BBA的cro或λCI阻抑蛋白结合，留下一条能与SEQID NO.61序列上TATA位点杂交的单链段。这有助于在缺失的大段序列5′端形成TBR。
4.用具有TATA结合蛋白DNA识别单位的TBA固定TBR。
5.通过加入上述的BNA和BBA来检测结合的片断。
该分析的检测信号表明存在于TNA的HPV上有大片段DNA缺失。既然这种缺失与恶性化有关，此分析方法使得能深入了解HPV感染恶化的可能。通过进行基于这52-碱基片段缺失的类似分析可以证实这一结论，这段碱基片断和HPV-诱导的恶性化有关。
可以选择用于TBA的TBP识别单位来用于此分析，如，从SEQ ID NO.70和SEQ ID NO.93中进行选择。
实施例15-重组HIV-LOCKTM的产生
第一阶段制备用以产生HIV-LOCKTM的DNA。通过使用MutaGene的噬菌粒试剂盒来完成自然发生并已克隆的需要修饰的HIV-LOCKTM的组份。修改流程包括使用一个含有HIV-LockTM的每一个结合组份的Blue-script质粒。把这些质粒转化到感受态细胞中，培养含有尿嘧啶的噬菌粒。提取单链DNA并作为突变链的模板。合成包括所需突变(突变中包含并入一个新的限制酶切位点)的寡聚核苷酸，然后再用多聚核酸激酶和ATP处理。激酶处理过的寡聚核酸退火后和单链模板结合，按照MutaGene的程序(只是测序酶2.0作为聚合酶)合成和连接一条突变键。使用32P末端标记的与所导入的突变互补的核酸和通过分离这种质粒DNA及用导入的限制酶切位点鉴别突变体来筛选文库。也可以通过测序酶试剂盒进行测序来证实突变。用多面体启动子把HIV-LockTMDNA克隆到杆状病毒的表达系统中。
第二阶段使用杆状病毒产生HIV-LockTM蛋白。把Sf-9细胞培养至预定的密度(约1×106细胞/ml，Log指数期)，用含有HIV-LockTM构件的杆状病毒感染培养的细胞，然后收集含有HIV-LockTM的重组蛋白。在大规模产生中，细胞培养从烧瓶扩大到旋转器而后到生物反应器。感染后的第12，24，36和48小时时收集细胞以便提取蛋白。在整个过程中监测细胞存活指数。
第三阶段--纯化HIV-LockTM蛋白。为了方便下面的纯化，首先通过最大限度超速沉降离心把要收集的蛋白从微粒中分离出来。然后离心的产物经过滤消毒。提取物在4℃下以40,000rpm的速度离心约30分钟，等分试样再通过抗一种HIV-LockTM组份的多克隆兔抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白在10％SDS PAGE凝胶上电泳。
第四阶段-针对于HIV DNA的HIV-LockTM蛋白的检测。通过使用含有HIV长末端重复序列组份的寡聚核苷酸探针和含有和Kappa轻链和微球蛋白调节相关的NFKB结合的DNA的片段，进行迁移率变动分析。寡聚核苷酸退火后和其互补链结合并且末端用32P-ATP标记。
室温下通过在缓冲液混合少量(10-15M)放射性标记的HIV LTR DNA和稍大量的HIV-LockTM，10分钟进行足迹法检测。在加入蛋白之前加入二疏基乙醇。加入EDTA铁(二价)、过氧化氢和抗坏血酸钠然后培养反应混合物。加入熄灭剂，产物用变性胶电泳方法分析。这是依据不同蛋白浓度而操作的。把得到的凝胶用磷酸图像扫描仪作图，分析得到的高分辨度图象资料，提炼出与细胞DNA相关的HIV-LockTM与HIV DNA的结合亲合力。
可以使用多种设计和检测重复以发现HIVLockTM  和其它用于HIV及其它生物体的TBA的结合。这一过程使设计结合装配体成为可能，这种结合装配体不和野生型蛋白竞争基因组样品中的单一结合位点。用于其它生物体的TBA以及用于这些生物体体内序列的TNA可以通过使用前面所述的方法来产生。当要产生所有核酸的TBR时(包括DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂交体以及这些杂交体的组合)，这种方法是有效的。
实施例16-为了产生本发明的TBA和BBA，鉴别核酸结合分子的方法
在本发明的方法中，靶结合装配体和辅助结合装配体的装配是通过鉴别核酸结合分子，和以一种能得到区别特定靶序列和非常相关序列的TBA的方式连接该分子的核酸结合部分。一种鉴定核酸结合分子的方法包括如下步骤：
1.获得含有靶核酸的生物样品。这种样品可以是，例如，感染病原体的一种生物体或组织提取物。
2.破碎样品以使核酸暴露出来，同时降低样品中核酸大小的复杂程度。
3.把第一等分切成片断的核酸加入到对照缓冲液介质中，再把第二等分的样品加入到含有已知分布型的核酸结合分子的对照缓冲液介质中。
4.分析两个等分试样以鉴定含有靶结合分子的试样相对于对照试样，行为发生改变的片断。这个过程可以通过单相凝胶电泳，双相凝胶电泳，高压液相色谱，纸色谱或任何可以揭示和核酸结合分子结合的核酸片断(相对于没有结合的核酸片断)的不同行为的方法来完成。
5.鉴定和分离那些当和核酸结合分子相接时行为的确发生改变的核酸片断和，或对核酸结合片断进行测序以确定是否存在已知的核酸结合分子基元，或直接鉴定结合在核酸片断上的核酸结合分子。后者可以通过，例如，把电泳核酸的双相框架和能够结合不同核酸结合分子的不同标记的抗体接触来完成。
在此方法中，优选使用核酸基元作为诊断或治疗的目的，其中的靶核酸有不止一个可利用的核酸结合分子靶。以这种方式，可以产生复杂的靶结合装配体，利用邻近的不同核酸结合分子类型以增强由该个体鉴定的核酸结合组份装配的TBA的特异性。然后把核酸结合分子的各个核酸结合部分装配成一个上述的完整的TBA，例如HIV-LockTM。
实施例17-鉴定样品中特定RNA序列的方法
按照本发明的方法和组合体可以特异性地鉴定任何核酸序列。样品中靶HIV RNA的鉴定是通过获得含有HIV RNA的病人血样或其它生物液体或提抽物样品，然后检测TAR的结合位点来完成的。Tat是一个HIV复制的正调节因子，其和HIV RNA的TAR区结合。以最小的自然生成机率，完全具有活性的HIV-Tat形式含有72个氨基酸，本文的SEQ Id NO.118。Tat至少具有2个功能区，和反式激活来源于HIV长末端重复序列(HIV LTR)的基因表达。Tat和TAR中的自杂交序列形成的RNA茎环结构结合，茎环结构恰在HIV LTR的5′端。HIV TAR RNA形成一个两核苷酸突起和两个茎环结构(Rhim等1994病毒学：202，202-211)。Tat(SEQ Id.118)结合在比Tat突变体具有更低的亲合力的结构上，Tat的这种突变体，其中58位丙氨酸突变为苏氨酸或65位组氨酸突变为天冬氨酸。(Derse等1993，病毒学：194，530-536)。本发明中这些过程的使用如下：
1.切断生物样品使核酸暴露出来，同时降低核酸大小复杂性。
2.将TBA与鉴定TAR结合蛋白序列的杂交体和HIV基团组中邻近端的侧面序列的样品接触。用于此目的TBA是装配到利用Tat作为HIV RNA特异性结合分子的cro陪伴上。为了提供特异性，例如HIV TAR位点和与其紧密相关的由于其它病原体如巨细胞病毒的存在而出现的TAR位点间的交叉作用，TBA还具有一个识别DNA-RNA杂交体此靶的抗体组份，这种靶结合区是在探针核酸和HIV LTR RNA结合后产生的。
3.通过用过量的具有更高亲合力的Tat异变体(58位丙氨酸突变为苏氨酸或65位组氨酸突变为天冬氨酸)和反应物接触，消除由于Tat结合到由污染物(表亲RNAs)如CMV TAR序列而形成的HIV RNA的TAR区所引起的交叉作用。通过这种方法，由于TBA结合到一个表亲RNA而形成的单一结合过程就会被来自Tat异变体的核酸样品竞争下来。另一方面，通过恰当选择由抗体和Tat引起的双重结合的亲合力，不会从真正的靶序列上把TBA置换下来。图16具体说明了此过程。同样方法的另一方面，TBA可以是这样一种物质，其上可以使用能够识别核酸片断的抗体，而不是使用Tat的突变体，并且使用的TBA可以是双抗体TBA。
本方法的另一种形式，可以使用和HIV LTR RNA杂交的核酸探针。因此，可以产生LTR sp1位点的双链片断，用作靶结合区的一部分。HIV RNA区在位于LTR5′端但和其更靠近的TAR区的侧面。把含有Tat和2个Sp1结合位点的TBA装配以提供Tat结合TAR以及Sp1结合Sp1的结合位点。然后通过加入适当的BNA、BBA和HNAs而进行扩增和检测。在另外一种情况下，可以使用Seq.ID.38和Seq.ID.39(见图7)的PNA。使用一个含有一个或多个Sp1结合单位和一个抗体单位的TBA，用来结合由样品RNA和Seq.ID.38 PNA而产生的DNA-RNA杂交体。然后加入适当的BNA、BBA和HNAs以便扩增信号。
自然，本领域的技术人员会认识到可以使用其它TBA和TNA的组合来优化本文所例举的方法。
应该理解，本文所描述的实施例和实施方案只是为了具体说明本发明，本领域的技术人员可以根据其进行修改和变化，并且这些修改和变化包含在本申请的精神和范围内以及所附的权利要求书的范围内。应该理解本文所提供的序列只是作为示范，并且其它受到这些序列提示的类似序列也可以在本发明的方法中使用。应该理解尽管本文提供的序列可以设计成线性，但可以以环状或其它替换性形式使用，同时，尽管这些序列不是作为反义链而设计的，但是可以以编码或非编码形式或者和编码或非编码互补序列结合的形式使用。
                   序列表(1)一般信息：(i)申请人：申请人名称：THE GENE POOL，INC.街道地址：300 Queen Anne Ave.N.，Suite 392城市：Seattle州/省：华盛顿国家：美国邮编：98109-4599电话号码：(206)526-8617    传真号：(ii)发明名称：用特异性序列组合物检测核酸的方法(iii)序列数：118(iv)联系地址：(A)联系人：Saliwanchik & Saliwanchik(B)街道：2421 N.W.41st St.，Suite A-1(C)城市：Gainesville(D)州：弗罗里达(E)国家：美国(F)邮编：32606(v)计算机可读形式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容机(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)目前申请资料：(A)申请号：(B)申请日：(C)分类：(viii)律师/代理人信息：(A)姓名：Bencen，Gerard H(B)登记号：35,746(C)参考/证书号：GP-100.C1(ix)电讯信息：(A)电话：(904)375-8100(B)传真：(904)372-5800(2)SEQ ID NO：1信息：(i)序列特征：(A)长度：13个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TGGGGATTCC CCA                                            13(2)SEQ ID NO：2信息：(i)序列特征：(A)长度：13个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：AAGGGACTTT CCC                                            13(2)SEQ ID NO：3信息：(i)序列特征：(A)长度：13个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：AGGGGACTTT CCG                                            13(2)SEQ ID NO：4信息：(i)序列特征：(A)长度：15个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GCTGGGGACT TTCCA                                          15(2)SEQ ID NO：5信息：(i)序列特征：(A)长度：15个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：ACAAGGGACT TTCCG                                          15(2)SEQ ID NO：6信息：(i)序列特征：(A)长度：13个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CCGGGTTTTC CCC                                            13(2)SEQ ID NO：7信息：(i)序列特征：(A)长度：27个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：AAGGGACTTT  CCGCTGGGGA  CTTTCCA                           27(2)SEQ ID NO：8信息：(i)序列特征：(A)长度：27个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：AAGGGACTTT CCGCTGGGGA CTTTCCG                             27(2)SEQ ID NO：9信息：(i)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：GCTGGGGACT TTCCAGGGAG GCGTGG                              26(2)SEQ ID NO：10信息：(i)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：GCTGGGGACT TTCCAGGGGA GGTGTG                              26(2)SEQ ID NO：11信息：(i)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GCTGGGGACT TTCCGGGGAG CGTGGC                              26(2)SEQ ID NO：12信息：(i)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GCTGGGGACT TTCCGGGGAG GCGCGG                              26(2)SEQ ID NO：13信息：(i)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GCTGGGGACT TTCCAGAGAG GCGTGG                              26(2)SEQ ID NO：14信息：(i)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：GCTGGGGACT TTCCAGGGGA GGCGTG                              26(2)SEQ ID NO：15信息：(i)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：GCTGGGGACT TTCCAGGGAG GCGTGG                              26(2)SEQ ID NO：16信息：(i)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：GCTGGGGACT TTCCAGGGAG GCTGCC                              26(2)SEQ ID NO：17信息：(i)序列特征：(A)长度：33个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：TTTCCAGGGA GGCGTGGCCT GGGCGGGACT GGG                      33(2)SEQ ID NO：18信息：(i)序列特征：(A)长度：33个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGT CCC
                                                      33(2)SEQ ID NO：19信息：(i)序列特征：(A)长度：45个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCCT         45(2)SEQ ID NO：20信息：(i)序列特征：(A)长度：46个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：CAGCAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGGAGGTG TGGCCT        46(2)SEQ ID NO：21信息：(i)序列特征：(A)长度：46个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：CATCAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGGAGGTG TGGCCT        46(2)SEQ ID NO：22信息：(i)序列特征：(A)长度：46个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：CAACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGGAGGTG TGGCCT        46(2)SEQ ID NO：23信息：(i)序列特征：(A)长度：45个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCAT         45(2)SEQ ID NO：24信息：(i)序列特征：(A)长度：44个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC GGGGAGCGTG GCCT          44(2)SEQ ID NO：25信息：(i)序列特征：(A)长度：44个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC GGGGAGGCGC GGCT          44(2)SEQ ID NO：26信息：(i)序列特征：(A)长度：45个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGAGAGGCGT GGACT         45(2)SEQ ID NO：27信息：(i)序列特征：(A)长度：46个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGGAGGCG TGGACT        46(2)SEQ ID NO：28信息：(i)序列特征：(A)长度：46个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：CTACAGGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGGGAG        46(2)SEQ ID NO：29信息：(i)序列特征：(A)长度：43个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：CTACAGGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCTG CCT           43(2)SEQ ID NO：30信息：(i)序列特征：(A)长度：48个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCCTGGGCG GGACTGGG      48(2)SEQ ID NO：31信息：(i)序列特征：(A)长度：45个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：TTTCCAGGGA GGCGTGGCCT GGGCGGGACT GGGGAGTGGC GTCCC         45(2)SEQ ID NO：32信息：(i)序列特征：(A)长度：59个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCCTGGGCG GGACTGGGG    59(2)SEQ ID NO：33信息：(i)序列特征：(A)长度：59个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：℃DNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：TTTCCGCTGG GGACTTTCCA GGGAGGCGTG GCCTGGGCGG GACTGGGGAG TGGCGTCCC    59(2)SEQ ID NO：34信息：(i)序列特征：(A)长度：70个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCCTGGGCG GGACTGGGGA    60GTGGCGTCCC                                                           70(2)SEQ ID NO：35信息：(i)序列特征：(A)长度：61个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：TATCACCGCC AGTGGTATTT ATGTCAACAC CGCCAGAGAT AATTTATCAC CGCAGATGGT    60T                                                                    61(2)SEQ ID NO：36信息：(i)序列特征：(A)长度：64个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：TATCACCGCA AGGGATAAAT ATCTAACACC GTGCGTGTTG ACTATTTTAC CTCTGGCGGT    60CATA                                                                 64(2)SEQ ID NO：37信息：(i)序列特征：(A)长度：70个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCCTGGGCG GGACTGGGGA    60GTGGCGTCCC                                                           70(2)SEQ ID NO：38信息：(i)序列特征：(A)长度：37个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGG                             37(2)SEQ ID NO：39信息：(i)序列特征：(A)长度：22个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：CGGGACTGGG GAGTGGCGTC CC
                                                                  22(2)SEQ ID NO：40信息：(i)序列特征：(A)长度：103个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGTAT CACCGCCAGT GGTATTTATG    60TCAACACCGC CAGAGATAAT TTATCACCGC AGATGGTTCT GCA                      103(2)SEQ ID NO：41信息：(i)序列特征：(A)长度：62个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)M(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：GAACCATCTG CGGTGATAAA TTATCTCTGG CGGTGTTGAC ATAAATACCA CTGGCGGTGA    60TA                                                                   62(2)SEQ ID NO：42信息：(i)序列特征：(A)长度：71个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：GATCCAACCA TCTGCGGTGA TAAATTATCT CTGGCGGTGT TGACATAAAT ACCACTGGCG    60GTGATACTGC A                                                         71(2)SEQ ID NO：43信息：(i)序列特征：(A)长度：63个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：GTATCACCGC CAGTGGTATT TATGTCAACA CCGCCAGAGA TAATTTATCA CCGCAGATGG    60TTG                                                                  63(2)SEQ ID NO：44信息：(i)序列特征：(A)长度：21个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：GATCCGGGGG GATACCCCCC G                                              21(2)SEQ ID NO：45信息：(i)序列特征：(A)长度：91个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：CGGGACTGGG GAGTGGCGTC  CCTATCACCG CAAGGGATAA ATATCTAACA CCGTGCGTGT    60TGACTATTTT ACCTCTGGCG GTGATAGCAT G                                    91(2)SEQ ID NO：46信息：(i)序列特征：(A)长度：53个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：CTAAGGGCGT AACCGAAATC GGTTGAACCG AAACCGGTTA GTATAAAAGC AGA    53(2)SEQ ID NO：47信息：(i)序列特征：(A)长度：54个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：AAAAGGGAGT AACCGAAAC GGTCGGGACC GAAAACGGTG TATATAAAAG ATGT    54(2)SEQ ID NO：48信息：(i)序列特征：(A)长度：54个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：AGTAGGGTGT AACCGAAAGC GGTTCAACCG AAAACGGTGC ATATATAAAG CAAA    54(2)SEQ ID NO：49信息：(i)序列特征：(A)长度：24个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：GCTTCAACCG AATTCGGTTG CATG                                     24(2)SEQ ID NO：50信息：(i)序列特征：(A)长度：24个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：TGTGCAACCG ATTTCGGTTG CCTT                                24(2)SEQ ID NO：51信息：(i)序列特征：(A)长度：24个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：TATGCAACCG AAATAGGTTG GGCA                                24(2)SEQ ID NO：52信息：(i)序列特征：(A)长度：24个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：TGCCTAACCG TTTTCGGTTA CTTG
                                                      24(2)SEQ ID NO：53信息：(i)序列特征：(A)长度：24个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：53：GGACTAACCG TTTTAGGTCA TATT                                24(2)SEQ ID NO：54信息：(i)序列特征：(A)长度：52个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：GACGACTATC CAGCGACCAA GATCAGAGCC AGACACCGGA AACCCCTGCC AC    52(2)SEQ ID NO：55信息：(i)序列特征：(A)长度：53个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：GACGACACGG TATCCGCTAC TCAGCTTGTT AAACAGCTAC AGCACACCCC CTC    53(2)SEQ ID NO：56信息：(i)序列特征：(A)长度：60个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：GACGACGACC TGCAGACACC ACAGACACCG CCCAGCCCCT TACAAAGCTG TTCTGTGCAG    60(2)SEQ ID NO：57信息：(i)序列特征：(A)长度：68个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：57：CATACCAAAG CCGTCGCCTT GGGCACCGAA GAAACACAAC CACTAAGTTG TTGCACAGAG    60ACTCAGTG                                                             68(2)SEQ ID NO：58信息：(i)序列特征：(A)长度：77个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：TAATGTAATT GATTGTAATG ACTCTATGTG CAGTACCAGT ACCGTATTCC AGCACCGTGT    60CCGTGGGCAC CGCAAAG                                                   77(2)SEQ ID NO：59信息：(i)序列特征：(A)长度：80个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：ACAGACAACG ATAACCGACC ACCACAAGCA GCGGCCAAAC ACCCCGCCTT GGACAATAGA    60ACAGCACGTA CTGCAACTAA                                                80(2)SEQ ID NO：60信息：(i)序列特征：(A)长度：266个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：CATATGCAAT ACAATGCATT ATACAAACTG GACACATATA TATATTTGTG AAGAAGCATC   60AGTAACTGTG GTAGAGGGTC AAGTTGACTA TTATGGTTTA TATTATGTTC ATGAAGGAAT  120ACGAACATAT TTTGTGCAGT TTAAAGATGA TGCAGAAAAA TATAGTAAAA ATAAAGTATG  180GGAAGTTCAT GCGGGTGGTC AGGTAATATT ATGTCCTACA TCTGTGTTTA GCAGCAACGA  240AGTATCCTCT CCTGAAATTA TTAGGC                                       266(2)SEQ ID NO：61信息：(i)序列特征：(A)长度：95个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：AGGATGTATA AAAAAACATG GATATACAGT GGAAGTGCAG TTTGATGGAG ACATATGCTA  60TTAGGCAGCA CTTGGCCAAC CACCCCGCCG CGACC                             95(2)SEQ ID NO：62信息：(i)序列特征：(A)长度：81个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：CATGTTTTTT TATACATCCA TATCACCGCC AGTGGTATTT ATGTCAACAC CGCCAGAGAT    60AATTTATCAC CGCAGATGGT T                                              81(2)SEQ ID NO：63信息：(i)序列特征：(A)长度：322个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：63：Met Ala Asp Asp Asp Pro Tyr Gly Thr Gly Gln Met Phe His Leu Asn1               5                   10                  15Thr Ala Leu Thr His Ser Ile Phe Asn Ala Glu Leu Tyr Ser Pro Glu
        20                  25                  30Ile Pro Leu Ser Thr Asp Gly Pro Tyr Leu Gln Ile Leu Glu Gln Pro
    35                  40                  45Lys Gln Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Val Cys Glu Gly Pro Ser His
50                  55                  60Gly Gly Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Asn Lys Lys Ser Tyr Pro65                  70                  75                  80Gln Val Lys Ile Cys Asn Tyr Val Gly Pro Ala Lys Val Ile Val Gln
            85                  90                  95Leu Val Thr Asn Gly Lys Asn Ile His Leu His Ala His Ser Leu Val
        100                 105                 110Gly Lys His Cys Glu Asp Gly Val Cys Thr Val Thr Ala Gly Pro Lys
    115                 120                 125Asp Met Val Val Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile Leu His Val Thr Lys
130                 135                 140Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met Thr Glu Ala Cys Ile145                 150                 155                 160Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Ser Asp Leu Ala Tyr Leu
            165                 170                 175Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Thr Asp Arg Glu Lys Glu
        180                 185                 190Ile Ile Arg Gln Ala Ala Val Gln Gln Thr Lys Glu Met Asp Leu Ser
    195                 200                 205Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro Asp Ser Thr Gly Ser
210                 215                 220Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp Ala Ile Tyr Asp Ser225                 230                 235                 240Lys Ala Pro Asn Ala ser Asn Leu Lys Ile Val Arg Met Asp Arg Thr
            245                 250                 255Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr Leu Leu Cys Asp Lys
        260                 265                 270Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr Glu Glu Glu Glu Asn
    275                 280                 285Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser Pro Thr Asp Val His
290                 295                 300Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Asp Val Asn305                 310                 315                 320Ile Thr(2)SEQ ID NO：64信息：(i)序列特征：(A)长度：325个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：64：Met Ala Glu Asp Asp Pro Tyr Leu Gly Arg Pro Glu Gln Met Phe His1               5                   10                  15Leu Asp Pro Ser Leu Thr His Thr Ile Phe Asn Pro Glu Val Phe Gln
        20                  25                  30Pro Gln Met Ala Leu Pro Thr Ala Asp Gly Pro Tyr Leu Gln Ile Leu
    35                  40                  45Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Val Cys Glu Gly
50                  55                  60Pro Ser His Gly Gly Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Asn Lys Lys65                  70                  75                  80Ser Tyr Pro Gln Val Lys Ile Cys Asn Tyr Val Gly Pro Ala Lys Val
            85                  90                  95Ile Val Gln Leu Val Thr Asn Gly Lys Asn Ile His Leu His Ala His
        100                 105                 110Ser Leu Val Gly Lys His Cys Glu Asp Gly Ile Cys Thr Val Thr Ala
    115                 120                 125Gly Pro Glu Asp Cys Val His Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile Leu His
130                 135                 140Val Thr Lys Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met Thr Glu145                 150                 155                 160Ala Cys Ile Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Pro Asp Leu
            165                 170                 175Ala Tyr Leu Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Gly Asp Arg
        180                 185                 190Glu Lys Glu Leu Ile Arg Gln Ala Ala Leu Gln Gln Thr Lys Glu Met
    195                 200                 205Asp Leu Ser Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro Asp Ser
210                 215                 220Thr Gly Ser Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp Ala Ile225                 230                 235                 240Tyr Asp Ser Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val Arg Met
            245                 250                 255Asp Arg Thr Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr Leu Leu
        260                 265                 270Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr Glu Glu
    275                 280                 285Glu Glu Asn Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser Pro Thr
290                 295                 300Asp Val His Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys Tyr Lys305                 310                 315                 320Asp Ile Asn Ile Thr
            325(2)SEQ ID NO：65信息：(i)序列特征：(A)长度：268个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：65：Met Glu Pro Ala Asp Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Gln Pro Glu Trp Gly1               5                   10                  15Glu Gln Glu Pro Gly Gly Ala Thr Pro Phe Val Glu Ile Leu Glu Gln
        20                  25                  30Pro Lys Gln Arg Gly Met Arg Phe Arg Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser
    35                  40                  45Ala Gly Ser Ile Pro Gly Glu His Ser Thr Asp Ser Ala Arg Thr His
50                  55                  60Pro Thr Ile Arg Val Asn His Tyr Arg Gly Pro Gly Arg Val Arg Val65                  70                  75                  80Ser Leu Val Thr Lys Asp Pro Pro His Gly Pro His Pro His Glu Leu
            85                  90                  95Val Gly Arg His Cys Gln His Gly Tyr Tyr Glu Ala Glu Leu Ser Pro
        100                 105                 110Asp Arg Ser Ile His Ser Phe Gln Asn Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys
    115                 120                 125Lys Arg Glu Leu Glu Ala Ala Val Ala Glu Arg Ile Arg Thr Asn Asn
130                 135                 140Asn Pro Phe Asn Val Pro Met Glu Glu Arg Gly Ala Glu Tyr Asp Leu145                 150                 155                 160Ser Ala Val Arg Leu Cys Phe Gln Val Trp Val Asn Gly Pro Gly Gly
            165                 170                 175Leu Cys Pro Leu Pro Pro Val Leu Ser Gln Pro Ile Tyr Asp Asn Arg
        180                 185                 190Ala Pro Ser Thr Ala Glu Leu Arg Ile Leu Pro Gly Asp Arg Asn Ser
    195                 200                 205Gly Ser Cys Gln Gly Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val
210                 215                 220Gln Lys Glu Asp Ile Glu Val Arg Phe Trp Ala Glu Gly Trp Glu Ala225                 230                 235                 240Lys Gly Ser Phe Ala Ala Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val
            245                 250                 255Phe Arg Thr Pro Pro Phe Arg Glu Arg Ser Leu Arg
        260                 265(2)SEQ ID NO：66信息：(i)序列特征：(A)长度：263个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：Met Asp Asp Leu Phe Pro Leu Ile Phe Pro Ser Glu Pro Ala Gln Ala1               5                   10                  15Ser Gly Pro Tyr Val Glu Ile Ile Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Met
        20                  25                  30Arg Phe Arg Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly
    35                  40                  45Glu Arg Ser Thr Asp Thr Thr Lys Thr His Pro Thr Ile Lys Ile Asn
50                  55                  60Gly Tyr Thr Gly Pro Gly Thr Val Arg Ile Ser Leu Val Thr Lys Asp65                  70                  75                  80Pro Pro His Arg Pro His Pro His Glu Leu Val Gly Lys Asp Cys Arg
            85                  90                  95Asp Gly Tyr Tyr Glu Ala Asp Leu Cys Pro Asp Arg Ser Ile His Ser
        100                 105                 110Phe Gln Asn Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Arg Asp Leu Glu Gln
    115                 120                 125Ala Ile Ser Gln Arg Ile Gln Thr Asn Asn Asn Pro Phe His Val Pro
130                 135                 140Ile Glu Glu Gln Arg Gly Asp Tyr Asp Leu Asn Ala Val Arg Leu Cys145                 150                 155                 160Phe Gln Val Thr Val Arg Asp Pro Ala Gly Arg Pro Leu Leu Leu Thr
            165                 170                 175Pro Val Leu Ser His Pro Ile Phe Asp Asn Arg Ala Pro Asn Thr Ala
        180                 185                 190Glu Leu Lys Ile Cys Arg Val Asn Arg Asn Ser Gly Ser Cys Leu Gly
    195                 200                 205Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Glu Asp Ile
210                 215                 220Glu Val Tyr Phe Thr Gly Pro Gly Trp Glu Ala Arg Gly Ser Phe Ser225                 230                 235                 240Gln Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Pro
            245                 250                 255Tyr Ala Asp Pro Ser Leu Gln
        260(2)SEQ ID NO：67信息：(i)序列特征：(A)长度：263个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：67：Met Asp Glu Leu Phe Pro Leu Ile Phe Pro Ala Glu Pro Ala Gln Ala1               5                   10                  15Ser Gly Pro Tyr Val Glu Ile Ile Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Met
        20                  25                  30Arg Phe Arg Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly
    35                  40                  45Glu Arg Ser Thr Asp Thr Thr Lys Thr His Pro Thr Ile Lys Ile Asn
50                  55                  60Gly Tyr Thr Gly Pro Gly Thr Val Arg Ile Ser Leu Val Thr Lys Asp65                  70                  75                  80Pro Pro His Arg Pro His Pro His Glu Leu Val Gly Lys Asp Cys Arg
            85                  90                  95Asp Gly Phe Tyr Glu Ala Glu Leu Cys Pro Asp Arg Cys Ile His Ser
        100                 105                 110Phe Gln Asn Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Arg Asp Leu Glu Gln
    115                 120                 125Ala Ile Ser Gln Arg Ile Gln Thr Asn Asn Asn Pro Phe Gln Val Pro
130                 135                 140Ile Glu Glu Gln Arg Gly Asp Tyr Asp Leu Asn Ala Val Arg Leu Cys145                 150                 155                 160Phe Gln Val Thr Val Arg Asp Pro Ser Gly Arg Pro Leu Arg Leu Pro
            165                 170                 175Pro Val Leu Pro His Pro Ile Phe Asp Asn Arg Ala Pro Asn Thr Ala
        180                 185                 190Glu Leu Lys Ile Cys Arg Val Asn Arg Asn Ser Gly Ser Cys Leu Gly
    195                 200                 205Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Glu Asp Ile
210                 215                 220Glu Val Tyr Phe Thr Gly Pro Gly Trp Glu Ala Arg Gly Ser Phe Ser225                 230                 235                 240Gln Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Pro
            245                 250                 255Tyr Ala Asp Pro Ser Leu Gln
        260(2)SEQ ID NO：68信息：(i)序列特征：(A)长度：299个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：68：Met Phe Pro Asn Gln Asn Asn Gly Ala Ala Pro Gly Gln Gly Pro Ala1               5                   10                  15Val Asp Gly Gln Gln Ser Leu Asn Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Gln Gln
        20                  25                  30Gln Gln Gln Leu Ala Gln Ser Thr Lys Asn Val Arg Lys Lys Pro Tyr
    35                  40                  45Val Lys Ile Thr Glu Gln Pro Ala Gly Lys Ala Leu Arg Phe Arg Tyr
50                  55                  60Glu Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly Val Asn Ser Thr65                  70                  75                  80Pro Glu Asn Lys Thr Tyr Pro Thr Ile Glu Ile Val Gly Tyr Lys Gly
            85                  90                  95Arg Ala Val Val Val Val Ser Cys Val Thr Lys Asp Thr Pro Tyr Arg
        100                 105                 110Pro His Pro His Asn Leu Val Gly Lys Glu Gly Cys Lys Lys Gly Val
    115                 120                 125Cys Thr Leu Glu Ile Asn Ser Glu Thr Met Arg Ala Val Phe Ser Asn
130                 135                 140Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Lys Asp Ile Glu Ala Ala Leu Lys145                 150                 155                 160Ala Arg Glu Glu Ile Arg Val Asp Pro Phe Lys Thr Gly Phe Ser His
            165                 170                 175Arg Phe Gln Pro Ser Ser Ile Asp Leu Asn Ser Val Arg Leu Cys Phe
        180                 185                 190Gln Val Phe Met Glu Ser Glu Gln Lys Gly Arg Phe Thr Ser Pro Leu
    195                 200                 205Pro Pro Val Val Ser Glu Pro Ile Phe Asp Lys Lys Ala Met Ser Asp
210                 215                 220Leu Val Ile Cys Arg Leu Cys Ser Cys Ser Ala Thr Val Phe Gly Asn225                 230                 235                 240Thr Gln Ile Ile Leu Leu Cys Glu Lys Val Ala Lys Glu Asp Ile Ser
            245                 250                 255Val Arg Phe Phe Glu Glu Lys Asn Gly Gln Ser Val Trp Glu Ala Phe
        260                 265                 270Gly Asp Phe Gln His Thr Asp Val His Lys Gln Thr Ala Ile Thr Phe
    275                 280                 285Lys Thr Pro Arg Tyr His Thr Leu Asp Ile Thr
290                 295(2)SEQ ID NO：69信息：(i)序列特征：(A)长度：261个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：69：Met Asp Phe Leu Thr Asn Leu Arg Phe Thr Glu Gly Ile Ser Glu Pro1               5                   10                  15Tyr Ile Glu Ile Phe Glu Gln Pro Arg Gln Arg Gly Thr Arg Phe Arg
        20                  25                  30Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly Glu His Ser
    35                  40                  45Thr Asp Asn Asn Lys Thr Phe Pro Ser Ile Gln Ile Leu Asn Tyr Phe
50                  55                  60Gly Lys Val Lys Ile Arg Thr Thr Leu Val Thr Lys Asn Glu Pro Tyr65                  70                  75                  80Lys Pro His Pro His Asp Leu Val Gly Lys Gly Cys Arg Asp Gly Tyr
            85                  90                  95Tyr Glu Ala Glu Phe Gly Pro Glu Arg Gln Val Leu Ser Phe Gln Asn
        100                 105                 110Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Lys Asp Leu Lys Glu Ser Ile Ser
    115                 120                 125Leu Arg Ile Ser Lys Lys Asn Pro Phe Asn Val Pro Glu Glu Gln Leu
130                 135                 140His Asn Ile Asp Glu Tyr Asp Leu Asn Val Val Arg Leu Cys Phe Gln145                 150                 155                 160Ala Phe Leu Pro Asp Glu His Gly Asn Tyr Thr Leu Ala Leu Pro Pro
            165                 170                 175Leu Ile Ser Asn Pro Ile Tyr Asp Asn Arg Ala Pro Asn Thr Ala Glu
        180                 185                 190Leu Arg Ile Cys Arg Val Asn Lys Asn Cys Gly Ser Val Lys Gly Gly
    195                 200                 205Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Glu
210                 215                 220Val Arg Phe Val Leu Gly Asn Trp Glu Ala Lys Gly Ser Phe Ser Gln225                 230                 235                 240Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Pro Phe
            245                 250                 255Leu Gly Asp Ile Thr
        260(2)SEQ ID NO：70信息：(i)序列特征：(A)长度：262个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：70：Met Asp Phe Leu Thr Asn Leu Arg Phe Thr Glu Gly Ile Ser Glu Pro1               5                   10                  15Tyr Ile Glu Ile Phe Glu Gln Pro Arg Gln Arg Gly Met Arg Phe Arg
        20                  25                  30Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly Glu His Ser
    35                  40                  45Thr Asp Asn Asn Lys Thr Phe Pro Ser Ile Gln Ile Leu Asn Tyr Phe
50                  55                  60Gly Lys Val Lys Ile Arg Thr Thr Leu Val Thr Lys Asn Glu Pro Tyr65                  70                  75                  80Lys Pro His Pro His Asp Leu Val Gly Lys Gly Cys Arg Asp Gly Tyr
            85                  90                  95Tyr Glu Ala Glu Phe Gly Pro Glu Arg Gln Val Leu Ser Phe Gln Asn
        100                 105                 110Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Lys Asp Leu Lys Glu Ser Ile Ser
    115                 120                 125Leu Arg Ile Ser Lys Lys Ile Asn Pro Phe Asn Val Pro Glu Glu Gln
130                 135                 140Leu His Asn Ile Asp Glu Tyr Asp Leu Asn Val Val Arg Leu Cys Phe145                 150                 155                 160Gln Ala Phe Leu Pro Asp Glu His Gly Asn Tyr Thr Leu Ala Leu Pro
            165                 170                 175Pro Leu Ile Ser Asn Pro Ile Tyr Asp Asn Arg Ala Pro Asn Thr Ala
        180                 185                 190Glu Leu Arg Ile Cys Arg Val Asn Lys Asn cys Gly Ser Val Lys Gly
    195                 200                 205Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile
210                 215                 220Glu Val Arg Phe Val Leu Gly Asn Trp Glu Ala Lys Gly Ser Phe Ser225                 230                 235                 240Gln Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Pro
            245                 250                 255Phe Leu Gly Asp Ile Thr
        260(2)SEQ ID NO：71信息：(i)序列特征：(A)长度：314个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：71：Met Ser Asn Lys Lys Gln Ser Asn Arg Leu Thr Glu Gln His Lys Leu1               5                   10                  15Ser Gln Gly Val Ile Gly Ile Phe Gly Asp Tyr Ala Lys Ala His Asp
        20                  25                  30Leu Ala Val Gly Glu Val Ser Lys Leu Val Lys Lys Ala Leu Ser Asn
    35                  40                  45Glu Tyr Pro Gln Leu Ser Phe Arg Tyr Arg Asp Ser Ile Lys Lys Thr
50                  55                  60Glu Ile Asn Glu Ala Leu Lys Lys Ile Asp Pro Asp Leu Gly Gly Thr65                  70                  75                  80Leu Phe Val Ser Asn Ser Ser Ile Lys Pro Asp Gly Gly Ile Val Glu
            85                  90                  95Val Lys Asp Asp Tyr Gly Glu Trp Arg Val Val Leu Val Ala Glu Ala
        100                 105                 110Lys His Gln Gly Lys Asp Ile Ile Asn Ile Arg Asn Gly Leu Leu Val
    115                 120                 125Gly Lys Arg Gly Asp Gln Asp Leu Met Ala Ala Gly Asn Ala Ile Glu
130                 135                 140Arg Ser His Asn Ile Ser Glu Ile Ala Asn Phe Met Leu Ser Glu Ser145                 150                 155                 160His Phe Pro Tyr Val Leu Phe Leu Glu Gly Ser Asn Phe Leu Thr Glu
            165                 170                 175Asn Ile Ser Ile Thr Arg Pro Asp Gly Arg Val Val Asn Leu Glu Tyr
        180                 185                 190Asn Ser Gly Ser Glu Ser His Phe Pro Tyr Val Leu Phe Leu Glu Gly
    195                 200                 205Ser Asn Phe Leu Thr Glu Asn Ile Ser Ile Thr Arg Pro Asp Gly Arg
210                 215                 220Val Val Asn Leu Glu Tyr Asn Ser Gly Ile Leu Asn Arg Leu Asp Arg225                 230                 235                 240Leu Thr Ala Ala Asn Tyr Gly Met Pro Ile Asn Ser Asn Leu Cys Ile
            245                 250                 255Asn Lys Phe Val Asn His Lys Asp Lys Ser Ile Met Leu Gln Ala Ala
        260                 265                 270Ser Ile Tyr Thr Gln Gly Asp Gly Arg Glu Trp Asp Ser Lys Ile Met
    275                 280                 285Phe Glu Ile Met Phe Asp Ile Ser Thr Thr Ser Leu Arg Val Leu Gly
290                 295                 300Arg Asp Leu Phe Glu Gln Leu Thr Ser Lys305                 310(2)SEQ ID NO：72信息：(i)序列特征：(A)长度：17个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：Cys Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Lys1               5                   10                  15Thr(2)SEQ ID NO：73信息：(i)序列特征：(A)长度：168个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：73：Gly Asp Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys1               5                   10                  15Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp
        20                  25                  30His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys
    35                  40                  45Arg Phe Thr Arg Ser Asp Glu Leu Gln Arg His Lys Arg Thr His Thr
50                  55                  60Gly Glu Lys Lys Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg65                  70                  75                  80Ser Asp His Leu Ser Lys His Ile Lys Thr His Gln Asn Lys Lys Gly
            85                  90                  95Gly Pro Gly Val Ala Leu Ser Val Gly Thr Leu Pro Leu Asp Ser Gly
        100                 105                 110Ala Gly Ser Glu Gly Ser Gly Thr Ala Thr Pro Ser Ala Leu Ile Thr
    115                 120                 125Thr Asn Met Val Ala Met Glu Ala Ile Cys Pro Glu Gly Ile Ala Arg
130                 135                 140Leu Ala Asn Ser Gly Ile Asn Val Met Gln Val Ala Asp Leu Gln Ser145                 150                 155                 160Ile Asn Ile Ser Gly Asn Gly Phe
            165(2)SEQ ID NO：74信息：(i)序列特征：(A)长度：181个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：74：Ser Gly Ile Val Pro Gln Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu1               5                   10                  15Gly Cys Lys Leu Asp Leu Lys Thr Ile Ala Leu Arg Ala Arg Asn Ala
        20                  25                  30Glu Tyr Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu
    35                  40                  45Pro Arg Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ser Ser Gly Lys Met Val Cys Thr
50                  55                  60Gly Ala Lys Ser Glu Glu Gln Ser Arg Leu Ala Ala Arg Lys Tyr Ala65                  70                  75                  80Arg Val Val Gln Lys Leu Gly Phe Pro Ala Lys Phe Leu Asp Phe Lys
            85                  90                  95Ile Gln Asn Met Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu
        100                 105                 110Glu Gly Leu Val Leu Thr His Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu
    115                 120                 125Leu Phe Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Ile Lys Pro Arg Ile Val Leu
130                 135                 140Leu Ile Phe Val Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Gly Ala Lys Val Arg145                 150                 155                 160Ala Glu Ile Tyr Glu Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Ile Leu Lys Gly
            165                 170                 175Phe Arg Lys Thr Thr
        180(2)SEQ ID NO：75信息：(i)序列特征：(A)长度：85个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：75：Ser Cys Phe Ala Leu Ile Ser Gly Thr Ala Asn Gln Val Lys Cys Tyr1               5                   10                  15Arg Phe Arg Val Lys Lys Asn His Arg His Arg Tyr Glu Asn Cys Thr
        20                  25                  30Thr Thr Trp Phe Thr Val Ala Asp Asn Gly Ala Glu Arg Gln Gly Gln
    35                  40                  45Ala Gln Ile Leu Ile Thr Phe Gly Ser Pro Ser Gln Arg Gln Asp Phe
50                  55                  60Leu Lys His Val Pro Leu Pro Pro Gly Met Asn Ile Ser Gly Phe Thr65                  70                  75                  80Ala Ser Leu Asp Phe
            85(2)SEQ ID NO：76信息：(i)序列特征：(A)长度：87个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：76：Cys Pro Cys Leu Leu Ile Gly Thr Ser Gly Asn Gly Asn Gln Val Lys1               5                   10                  15Cys Tyr Ser Phe Arg Val Lys Arg Trp His Asp Arg Asp Lys Tyr His
        20                  25                  30His Thr Thr Thr Trp Trp Ala Val Gly Gly Gln Gly Ser Glu Arg Pro
    35                  40                  45Gly Asp Ala Thr Val Ile Val Thr Phe Lys Asp Gln Ser Gln Arg Ser
50                  55                  60His Phe Leu Gln Gln Val Pro Leu Pro Pro Gly Met Ser Ala His Gly65                  70                  75                  80Val Thr Met Thr Val Asp Phe
            85(2)SEQ ID NO：77信息：(i)序列特征：(A)长度：84个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：77：Pro Pro Val Ile Cys Leu Lys Gly Gly His Asn Gln Leu Lys Cys Leu1               5                   10                  15Arg Tyr Arg Leu Lys Ser Lys His Ser Ser Leu Phe Asp Cys Ile Ser
        20                  25                  30Thr Thr Trp Ser Trp Val Asp Thr Thr Ser Thr Cys Arg Leu Gly Ser
    35                  40                  45Gly Arg Met Leu Ile Lys Phe Ala Asp Ser Glu Gln Arg Asp Lys Phe
50                  55                  60Leu Ser Arg Val Pro Leu Pro Ser Thr Thr Gln Val Phe Leu Gly Asn65                  70                  75                  80Phe Tyr Gly Leu(2)SEQ ID NO：78信息：(i)序列特征：(A)长度：84个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：78：Pro Pro Val Ile Leu Val Arg Gly Gly Ala Asn Thr Leu Lys Cys Phe1               5                   10                  15Arg Asn Arg Ala Arg Val Arg Tyr Arg Gly Leu Phe Lys Tyr Phe Ser
        20                  25                  30Thr Thr Trp Ser Trp Val Ala Gly Asp Ser Thr Glu Arg Leu Gly Arg
    35                  40                  45Ser Arg Met Leu Ile Leu Phe Thr Ser Ala Cys Gln Arg Glu Lys Pro
50                  55                  60Asp Glu Thr Val Lys Tyr Pro Lys Gly Val Asp Thr Ser Tyr Gly Asn65                  70                  75                  80Leu Asp Ser Leu(2)SEQ ID NO：79信息：(i)序列特征：(A)长度：84个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：79：Pro Pro Val Val Cys Val Lys Gly Gly Ala Asn Gln Leu Lys Cys Leu1               5                   10                  15Arg Tyr Arg Leu Lys Ala Ser Thr Gln Val Asp Phe Asp Ser Ile Ser
        20                  25                  30Thr Thr Trp His Trp Thr Asp Arg Lys Asn Thr Glu Arg Ile Gly Ser
    35                  40                  45Ala Arg Met Leu Val Lys Phe Ile Asp Glu Ala Gln Arg Glu Lys Phe
50                  55                  60Leu Glu Arg Val Ala Leu Pro Arg Ser Val Ser Val Phe Leu Gly Gln65                  70                  75                  80Phe Asn Gly Ser(2)SEQ ID NO：80信息：(i)序列特征：(A)长度：84个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：80：Thr Pro Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Ser Asn Cys Leu Lys Cys Phe1               5                   10                  15Arg Tyr Arg Leu Asn Asp Lys Tyr Lys His Leu Phe Glu Leu Ala Ser
        20                  25                  30Ser Thr Trp His Trp Ala Ser Pro Glu Ala Pro His Lys Asn Ala Ile
    35                  40                  45Val Thr Leu Thr Tyr Ser Ser Glu Glu Gln Arg Gln Gln Phe Leu Asn
50                  55                  60Ser Val Lys Ile Pro Pro Thr Ile Arg His Lys Val Gly Phe Met Ser65                  70                  75                  80Leu His Leu Leu(2)SEQ ID NO：81信息：(i)序列特征：(A)长度：84个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：81：Thr Pro Ile Val Gln Phe Gln Gly Glu Ser Asn Cys Leu Lys Cys Phe1               5                   10                  15Arg Tyr Arg Leu Asn Arg Asp His Arg His Leu Phe Asp Leu Ile Ser
        20                  25                  30Ser Thr Trp His Trp Ala Ser Ser Lys Ala Pro His Lys His Ala Ile
    35                  40                  45Val Thr Val Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Gln Arg Gln Gln Phe Leu Asp
50                  55                  60Val Val Lys Ile Pro Pro Thr Ile Ser His Lys Leu Gly Phe Met Ser65                  70                  75                  80Leu His Leu Leu(2)SEQ ID NO：82信息：(i)序列特征：(A)长度：80个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：82：Thr Pro Ile Ile His Leu Lys Gly Asp Arg Asn Ser Leu Lys Cys Leu1               5                   10                  15Arg Tyr Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg Asp Ile Ser Ser
        20                  25                  30Thr Trp His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr
    35                  40                  45Val Thr Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe Leu Asn Thr Val
50                  55                  60Ala Ile Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr Asn Thr Met Tyr65                  70                  75                  80(2)SEQ ID NO：83信息：(i)序列特征：(A)长度：80个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：83：Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Cys Leu1               5                   10                  15Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser
        20                  25                  30Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Tyr Lys His Lys Ser Ala Ile Val
    35                  40                  45Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln
50                  55                  60Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile65                  70                  75                  80(2)SEQ ID NO：84信息：(i)序列特征：(A)长度：81个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：84：Ala Pro Ile Val His Leu Lys Gly Glu Ser Asn Ser Leu Lys Cys Leul               5                   10                  15Arg Tyr Arg Leu Lys Pro Tyr Asn Glu Leu Tyr Ser Ser Met Ser Ser
        20                  25                  30Thr Trp His Trp Thr Ser Asp Asn Lys Asn Ser Lys Asn Gly Ile Val
    35                  40                  45Thr Val Thr Phe Val Thr Gly Gln Gln Gln Gln Met Phe Leu Gly Thr
50                  55                  60Val Lys Ile Pro Pro Thr Val Gln Ile Ser Thr Gly Phe Met Thr Leu65                  70                  75                  80Val(2)SEQ ID NO：85信息：(i)序列特征：(A)长度：21个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：85：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1               5                   10                  15Glu Asn Tyr Cys Asn
        20(2)SEQ ID NO：86信息：(i)序列特征：(A)长度：30个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：86：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                   10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
        20                  25                  30(2)SEQ ID NO：87信息：(i)序列特征：(A)长度：21个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：87：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys  Ser Leu Tyr Gln Leu1               5                   10                   15Glu Asn Tyr Cys Asn
        20(2)SEQ ID NO：88信息：(i)序列特征：(A)长度：30个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：88：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                   10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
        20                  25                  30(2)SEQ ID NO：89信息：(i)序列特征：(A)长度：24个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：89：Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Ile1               5                   10                  15Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
        20(2)SEQ ID NO：90信息：(i)序列特征：(A)长度：33个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：90：Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Ile Cys Gly Arg Glu Leu Val1               5                   10                  15Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser
        20                  25                  30Leu(2)SEQ ID NO：91信息：(i)序列特征：(A)长度：24个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：91：Glu Glu Lys Met Gly Thr Ala Lys Lys Cys Cys Ala Ile Gly Cys Ser1               5                   10                  15Thr Glu Asp Phe Arg Met Val Cys
        20(2)SEQ ID NO：92信息：(i)序列特征：(A)长度：40个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：92：Arg Pro Asn Trp Glu Glu Arg Ser Arg Leu Cys Gly Arg Asp Leu Ile1               5                   10                  15Arg Ala Phe Ile Tyr Leu Cys Gly Gly Thr Arg Trp Thr Arg Leu Pro
        20                  25                  30Asn Phe Gly Asn Tyr Pro Ile Met
    35                  40(2)SEQ ID NO：93信息：(i)序列特征：(A)长度：182个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：93：Ser Gly Ile Val Pro Thr Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu1               5                   10                  15Asp Cys Lys Leu Asp Leu Lys Ala Ile Ala Leu Gln Ala Arg Asn Ala
        20                  25                  30Glu Tyr Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu
    35                  40                  45Pro Lys Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ala Ser Gly Lys Met Val Cys Thr
50                  55                  60Gly Ala Lys Ser Glu Asp Phe Ser Lys Met Ala Ala Arg Lys Tyr Ala65                  70                  75                  80Arg Ile Val Gln Lys Leu Gly Phe Pro Ala Lys Phe Lys Asp Phe Lys
            85                  90                  95Ile Gln Asn Ile Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu
        100                 105                 110Glu Gly Leu Ala Tyr Ser His Ala Ala Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu
    115                 120                 125Leu Phe Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Lys Val Pro Lys Ile Val Leu
130                 135                 140Leu Ile Phe Val Ser Gly Lys Ile Val Ile Thr Gly Ala Lys Met Arg145                 150                 155                 160Asp Glu Thr Tyr Lys Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Val Leu Ser Glu
            165                 170                 175Phe Arg Lys Ile Gln Gln
        180(2)SEQ ID NO：94信息：(i)序列特征：(A)长度：84个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：94：Asn Ser Asn Ser Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr1               5                   10                  15Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr
        20                  25                  30Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys
    35                  40                  45Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln
50                  55                  60Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly65                  70                  75                  80Phe Met Ser Ile(2)SEQ ID NO：95信息：(i)序列特征：(A)长度：84个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：95：Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr1               5                   10                  15Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr
        20                  25                  30Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys
    35                  40                  45Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln
50                  55                  60Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly65                  70                  75                  80Phe Met Ser Ile(2)SEQ ID NO：96信息：(i)序列特征：(A)长度：83个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：96：Ser Gly Asn Thr Thr Pro Ile Ile His Leu Lys Gly Asp Arg Asn Ser1               5                   10                  15Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg
        20                  25                  30Asp Ile Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr
    35                  40                  45Gly Ile Leu Thr Val Thr Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe
50                  55                  60Leu Asn Thr Val Ala Ile Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr65                  70                  75                  30Met Thr Met(2)SEQ ID NO：97信息：(i)序列特征：(A)长度：84个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：97：Ser Gly Asn Thr Ala Pro Ile Val His Leu Lys Gly Glu Ser Asn Ser1               5                   10                  15Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Leu Lys Pro Tyr Lys Glu Leu Tyr Ser
        20                  25                  30Ser Met Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Ser Asp Asn Lys Asn Ser Lys
    35                  40                  45Asn Gly Ile Val Thr Val Thr Phe Val Thr Glu Gln Gln Gln Gln Met
50                  55                  60Phe Leu Gly Thr Val Lys Ile Pro Pro Thr Val Gln Ile Ser Thr Gly65                  70                  75                  80Phe Met Thr Leu(2)SEQ ID NO：98信息：(i)序列特征：(A)长度：89个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：98：Ser Gly Asn Thr Ser Cys Phe Ala Leu Ile Ser Gly Thr Ala Asn Gln1               5                   10                  15Val Lys Cys Tyr Arg Phe Arg Val Lys Lys Asn His Arg His Arg Tyr
        20                  25                  30Glu Asn Cys Thr Thr Thr Trp Phe Thr Val Ala Asp Asn Gly Ala Glu
    35                  40                  45Arg Gln Gly Gln Ala Gln Ile Leu Ile Thr Phe Gly Ser Pro Ser Gln
50                  55                  60Arg Gln Asp Phe Leu Lys His Val Pro Leu Pro Pro Gly Met Asn Ile65                  70                  75                  80Ser Gly Phe Thr Ala Ser Leu Asp Phe
            85(2)SEQ ID NO：99信息：(i)序列特征：(A)长度：7个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：C-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：99：Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala1             5(2)SEQ ID NO：100信息：(i)序列特征：(A)长度：4个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：100：Asn Ser Asn Thr1(2)SEQ ID NO：101信息：(i)序列特征：(A)长度：4个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：101：Ser Gly Asn Thr1(2)SEQ ID NO：102信息：(i)序列特征：(A)长度：6个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：102：Ser Ser Gly Ser Ser Gly1               5(2)SEQ ID NO：103信息：(i)序列特征：(A)长度：15个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：103：Cys Tyr Pro Glu Ile Lys Asp Lys Glu Glu ValGln Arg Lys Arg1               5                   10                 15(2)SEQ ID NO：104信息：(i)序列特征：(A)长度：66个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：104：Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1               5                   10                  15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys
        20                  25                  30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly
    35                  40                  45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr
50                  55                  60Thr Ala65(2)SEQ ID NO：105信息：(i)序列特征：(A)长度：66个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：105：Met Glu Gln Glu Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1               5                   10                  15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys
        20                  25                  30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly
    35                  40                  45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr
50                  55                  60Thr Ala65(2)SEQ ID NO：106信息：(i)序列特征：(A)长度：66个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：106：Met Arg Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1               5                   10                  15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys
        20                  25                  30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly
    35                  40                  45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr
50                  55                  60Thr Ala65(2)SEQ ID NO：107信息：(i)序列特征：(A)长度：96个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：107：Ser Thr Lys Lys Lys Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Glu Asp Ala Arg1               5                   10                  15Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Asn Glu Leu Gly Leu Ser
        20                  25                  30Gln Glu Ser Val Ala Asp Lys Met Gly Met Gly Gln Ser Gly Val Gly
    35                  40                  45Ala Leu Phe Asn Gly Ile Asn Ala Leu Asn Ala Tyr Asn Ala Ala Leu
50                  55                  60Leu Ala Lys Ile Leu Lys Val Ser Val Glu Glu Phe Ser Pro Ser Ile65                  70                  75                  80Ala Arg Glu Ile Tyr Glu Met Tyr Glu Ala Val Ser Met Glu Pro Ser
            85                  90                  95(2)SEQ ID NO：108信息：(i)序列特征：(A)长度：96个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：108：Ser Thr Lys Lys Lys Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Glu Asp Ala Arg1               5                   10                  15Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Asn Glu Leu Gly Leu Ser
        20                  25                  30Gln Glu Ser Val Ala Asp Lys Met Gly Met Gly Gln Ser Gly Val Gly
    35                  40                  45Ala Leu Phe Asn Gly Ile Asn Ala Leu Asn Ala Tyr Asn Ala Ala Leu
50                  55                  60Leu Ala Lys Ile Leu Lys Val Ser Val Glu Glu Phe Ser Pro Ser Ile65                  70                  75                  80Ala Arg Glu Ile Tyr Glu Met Cys Glu Ala Val Ser Met Glu Pro Ser
            85                  90                  95(2)SEQ ID NO：109信息：(i)序列特征：(A)长度：180个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：109：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1               5                   10                  15Glu Asn Tyr Cys Asn Met Ser Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp
        20                  25                  30Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val
    35                  40                  45Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe
50                  55                  60Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro65                  70                  75                  80Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala
            85                  90                  95Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr
        100                 105                 110Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr
    115                 120                 125Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys
130                 135                 140Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln145                 150                 155                 160Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly
            165                 170                 175Phe Met Ser Ile
        180(2)SEQ ID NO：110信息：(i)序列特征：(A)长度：113个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：110：Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1               5                   10                  15Glu Asn Tyr Cys Asn Met Ser Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp
        20                  25                  30Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val
    35                  40                  45Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe
50                  55                  60Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro65                  70                  75                  80Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala
            85                  90                  95Cys Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Lys
        100                 105                 110Thr(2)SEQ ID NO：111信息：(i)序列特征：(A)长度：292个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：111：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                   10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Met Ser
        20                  25                  30Met Glu Gln Glu Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln
    35                  40                   45Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys
50                  55                  60Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly65                  70                  75                  80Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr
            85                  90                  95Thr Ala Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser
        100                 105                 110Gly Ile Val Pro Gln Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu Gly
    115                 120                 125Cys Lys Leu Asp Leu Lys Thr Ile Ala Leu Arg Ala Arg Asn Ala Glu
130                 135                 140Tyr Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu Pro145                 150                 155                 160Arg Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ser Ser Gly Lys Met Val Cys Thr Gly
            165                 170                 175Ala Lys Ser Glu Glu Gln Ser Arg Leu Ala Ala Arg Lys Tyr Ala Arg
        180                 185                 190Val Val Gln Lys Leu Gly Phe Pro Ala Lys Phe Leu Asp Phe Lys Ile
    195                 200                 205Gln Asn Met Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu Glu
210                 215                 220Gly Leu Val Leu Thr His Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu Leu225                 230                 235                 240Phe Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Ile Lys Pro Arg Ile Val Leu Leu
            245                 250                 255Ile Phe Val Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Gly Ala Lys Val Arg Ala
        260                 265                 270Glu Ile Tyr Glu Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Ile Leu Lys Gly Phe
    275                 280                 285Arg Lys Thr Thr
290(2)SEQ ID NO：112信息：(i)序列特征：(A)长度：273个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：112：Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                   10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Met Ser
        20                  25                  30Met Arg Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln
    35                  40                  45Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys
50                  55                  60Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly65                  70                  75                  80Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr
            85                  90                  95Thr Ala Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Gly Asp Pro Gly Lys Lys Lys
        100                 105                 110Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr
    115                 120                 125Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe
130                 135                 140Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Arg Ser Asp Glu145                 150                 155                 160Leu Gln Arg His Lys Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Lys Phe Ala Cys
            165                 170                 175Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp His Leu Ser Lys His
        180                 185                 190Ile Lys Thr His Gln Asn Lys Lys Gly Gly Pro Gly Val Ala Leu Ser
    195                 200                 205Val Gly Thr Leu Pro Leu Asp Ser Gly Ala Gly Ser Glu Gly Ser Gly
210                 215                 220Thr Ala Thr Pro Ser Ala Leu Ile Thr Thr Asn Met Val Ala Met Glu225                 230                 235                 240Ala Ile Cys Pro Glu Gly Ile Ala Arg Leu Ala Asn Ser Gly Ile Asn
            245                 250                 255Val Met Gln Val Ala Asp Leu Gln Ser Ile Asn Ile Ser Gly Asn Gly
        260                 265                 270Phe(2)SEQ ID NO：113信息：(i)序列特征：(A)长度：421个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：113：Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Ile1               5                   10                  15Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys Met Ser Met Arg Gln Arg Ile Thr
        20                  25                  30Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln Thr Lys Thr Ala Lys Asp
    35                  40                  45Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys Ala Ile His Ala Gly Arg
50                  55                  60Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly Ser Val Tyr Ala Glu Glu65                  70                  75                  80Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Ser Asn Lys Lys
            85                  90                  95Thr Thr Ala Met Ala Asp Asp Asp Pro Tyr Gly Thr Gly Gln Met Phe
        100                 105                 110His Leu Asn Thr Ala Leu Thr His Ser Ile Phe Asn Ala Glu Leu Tyr
    115                 120                 125Ser Pro Glu Ile Pro Leu Ser Thr Asp Gly Pro Tyr Leu Gln Ile Leu
130                 135                 140Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Val Cys Glu Gly145                 150                 155                 160Pro Ser His Gly Gly Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Asn Lys Lys
            165                 170                 175Ser Tyr Pro Gln Val Lys Ile Cys Asn Tyr Val Gly Pro Ala Lys Val
        180                 185                 190Ile Val Gln Leu Val Thr Asn Gly Lys Asn Ile His Leu His Ala His
    195                 200                 205Ser Leu Val Gly Lys His Cys Glu Asp Gly Val Cys Thr Val Thr Ala
210                 215                 220Gly Pro Lys Asp Met Val Val Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile Leu His225                 230                 235                 240Val Thr Lys Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met Thr Glu
            245                 250                 255Ala Cys Ile Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Ser Asp Leu
        260                 265                 270Ala Tyr Leu Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Thr Asp Arg
    275                 280                 285Glu Lys Glu Ile Ile Arg Gln Ala Ala Val Gln Gln Thr Lys Glu Met
290                 295                 300Asp Leu Ser Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro Asp Ser305                 310                 315                 320Thr Gly Ser Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp Ala Ile
            325                 330                 335Tyr Asp Ser Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val Arg Met
        340                 345                 350Asp Arg Thr Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr Leu Leu
    355                 360                 365Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr Glu Glu
370                 375                 380Glu Glu Asn Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser Pro Thr385                 390                 395                 400Asp Val His Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys Tyr Lys
            405                 410                 415Asp Val Asn Ile Tnr
        420(2)SEQ ID NO：114信息：(i)序列特征：(A)长度：391个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：114：Met Arg Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1               5                   10                  15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys
        20                  25                  30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly
    35                  40                  45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Pha Pro Ser Asn Lys Lys Thr
50                   55                 60Thr Ala Met Ala Glu Asp Asp Pro Tyr Leu Gly Arg Pro Glu Gln Met65                  70                  75                  80Phe His Leu Asp Pro Ser Leu Thr His Thr Ile Phe Asn Pro Glu Val
            85                  90                  95Phe Gln Pro Gln Met Ala Leu Pro Thr Ala Asp Gly Pro Tyr Leu Gln
        100                 105                 110Ile Leu Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Val Cys
    115                 120                 125Glu Gly Pro Ser His Gly Gly Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Asn
130                 135                 140Lys Lys Ser Tyr Pro Gln Val Lys Ile Cys Asn Tyr Val Gly Pro Ala145                 150                 155                 160Lys Val Ile Val Gln Leu Val Thr Asn Gly Lys Asn Ile His Leu His
            165                 170                 175Ala His Ser Leu Val Gly Lys His Cys Glu Asp Gly Ile Cys Thr Val
        180                 185                 190Thr Ala Gly Pro Glu Asp Cys Val His Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile
    195                 200                 205Leu His Val Thr Lys Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met
210                 215                 220Thr Glu Ala Cys Ile Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Pro225                 230                 235                 240Asp Leu Ala Tyr Leu Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Gly
            245                 250                 255Asp Arg Glu Lys Glu Leu Ile Arg Gln Ala Ala Leu Gln Gln Thr Lys
        260                 265                 270Glu Met Asp Leu Ser Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro
    275                 280                 285Asp Ser Thr Gly Ser Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp
290                 295                 300Ala Ile Tyr Asp Ser Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val305                 310                 3l5                 320Arg Met Asp Arg Thr Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr
            325                 330                 335Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr
        340                 345                 350Glu Glu Glu Glu Asn Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser
    355                 360                 365Pro Thr Asp Val His Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys
370                 375                 380Tyr Lys Asp Ile Asn Ile Thr385                 390(2)SEQ ID NO：115信息：(i)序列特征：(A)长度：391个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：115：Met Glu Gln Glu Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1               5                   10                  15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys
        20                  25                  30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly
    35                  40                  45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr
50                  55                  60Thr Ala Met Ala Glu Asp Asp Pro Tyr Leu Gly Arg Pro Glu Gln Met65                  70                  75                  80Phe His Leu Asp Pro Ser Leu Thr His Thr Ile Phe Asn Pro Glu Val
            85                  90                  95Phe Gln Pro Gln Met Ala Leu Pro Thr Ala Asp Gly Pro Tyr Leu Gln
        100                 105                 110Ile Leu Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Val Cys
    115                 120                 125Glu Gly Pro Ser His Gly Gly Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Asn
130                 135                 140Lys Lys Ser Tyr Pro Gln Val Lys Ile Cys Asn Tyr Val Gly Pro Ala145                 150                 155                 160Lys Val Ile Val Gln Leu Val Thr Asn Gly Lys Asn Ile His Leu His
            165                 170                 175Ala His Ser Leu Val Gly Lys His Cys Glu Asp Gly Ile Cys Thr Val
        180                 185                 190Thr Ala Gly Pro Glu Asp Cys Val His Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile
    195                 200                 205Leu His Val Thr Lys Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met
210                 215                 220Thr Glu Ala Cys Ile Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Pro225                 230                 235                 240Asp Leu Ala Tyr Leu Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Gly
            245                 250                 255Asp Arg Glu Lys Glu Leu Ile Arg Gln Ala Ala Leu Gln Gln Thr Lys
        260                 265                 270Glu Met Asp Leu Ser Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro
    275                 280                 285Asp Ser Thr Gly Ser Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp
290                 295                 300Ala Ile Tyr Asp Ser Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val305                 310                 315                 320Arg Met Asp Arg Thr Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr
            325                 330                 335Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr
        340                 345                 350Glu Glu Glu Glu Asn Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser
    355                 360                 365Pro Thr Asp Val His Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys
370                 375                 380Tyr Lys Asp Ile Asn Ile Thr385                 390(2)SEQ ID NO：116信息：(i)序列特征：(A)长度：241个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：116：Met Arg Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1               5                   10                  15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys20                  25                  30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly35                  40                  45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr50                  55                  60Thr Ala Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Gly Asp Pro Gly Lys Lys Lys65                  70                  75                  80Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr85                  90                  95Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe100                 105                 110Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Arg Ser Asp Glu115                 120                 125Leu Gln Arg His Lys Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Lys Phe Ala Cys130                 135                 140Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp His Leu Ser Lys His145                 150                 155                 160Ile Lys Thr His Gln Asn Lys Lys Gly Gly Pro Gly Val Ala Leu Ser165                 170                 175Val Gly Thr Leu Pro Leu Asp Ser Gly Ala Gly Ser Glu Gly Ser Gly180                 185                 190Thr Ala Thr Pro Ser Ala Leu Ile Thr Thr Asn Met Val Ala Met Glu195                 200                 205Ala Ile Cys Pro Glu Gly Ile Ala Arg Leu Ala Asn Ser Gly Ile Asn210                 215                 220Val Met Gln Val Ala Asp Leu Gln Ser Ile Asn Ile Ser Gly Asn Gly225                 230                 235                 240Phe(2)SEQ ID NO：117信息：(i)序列特征：(A)长度：10个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：117：(2)SEQ ID NO：118信息：(i)序列特征：(A)长度：72个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假拟：无(iv)反义：否(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：118：Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1               5                   10                  15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20                  25                  30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35                  40                  45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr50                  55                  60His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln65                  70

Claims (51)

1.一种探针核酸(PNA)，该核酸包含：
(A)单链序列1/2 TBR，该序列在杂交条件下可以和存在于靶核酸(TNA)中的1/2 TBR形成杂交体TBR；
(B)单链序列1/2 BBR，该序列在杂交条件下可以和辅助核酸(BNA)中的约0-10个1/2 BBR形成杂交体BBR；和
(C)OSA，其不是连接的支持物和/或指示剂，或者是连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述的定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；其中所说的TBR可以以高亲和力和TBA结合，所说的TBA是一种能够区分配对的TBR和具有未配对的核苷酸的TBR的物质，并且，所说的BBR可以以高亲和力和BBA结合，所说的BBA是一种能够区分配对的BBR和具有未配对的核苷酸的BBR的物质。
2.一种辅助核酸(BNA)，该核酸包含：
(A)1/2 BBR，其具有和PNA或另外的BNA中1/2 BBR序列互补的序列，并且其在杂交条件下可以和PNA形成杂交体BBR；
(B)OSA，其不是连接的支持物和/或指示剂，或者是连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述的定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；和
(C)附加的杂交位点1/2 BBR，用来和附加的BNA杂交；其中所说的BBR可以以高亲和力和BBA结合，所说的BBA是一种能够区分配对的BBR和具有未配对的核苷酸的BBR的物质。
3.一种发夹核酸(HNA)，该核酸包含单链序列1/2 BBR，该序列在杂交条件下能够形成发夹结构，并且同时和BNA结合形成能够结合BBA的BBR，其中所说的BBR可以以高亲和力和BBA结合，所说的BBA是一种能够区分完美的BBR和具有未配对的核苷酸的BBR的物质。
4.权利要求1的PNA，其中所说的TBR由一个或多个核酸结合蛋白、DNA结合蛋白、DNA-RNA杂交结合蛋白或RNA结合蛋白的识别位点组成。
5.权利要求4的PNA，其中所说的TBR是存在于病原体基因组中的核酸结合蛋白识别位点，或者是和脊椎动物基因组病理状态相关的结合位点，或者是存在于污染发酵过程的生物体基因组中的核酸结合蛋白识别位点。
6.权利要求4的PNA，其中所说的TBR是HIV-LTR或其一部分。
7.一种用于检测和定位特定TNA序列的方法，该方法包括以下步骤：
(A)使所说的TNA与权利要求1的PNA杂交；
(B)使所说的TNA与含有1/2 BBR的BNA杂交，所说1/2 BBR的序列和PNA中的1/2 BBR序列互补；
(C)将含有TBR和BBR的步骤(A)和(B)的产物加入到含有TBA的表面、液体或其它介质中；
(D)将BBA加入到步骤C的混合物中，其中所说的BBA包含：
(I)能够选择性地结合BBR的分子或分子的一部分；
(II)可检测的指示剂；和
(E)检测连接到BBA上的指示剂所产生的信号。
8.权利要求7的方法，其中所说的指示剂是蛋白质，包括可以催化反应导致产生有色反应产物的酶，放射性核素，有色小球。
9.一种检测样品中特定靶核酸TNA存在的方法，该方法包括以下步骤：
(A)使所说的样品和探针核酸PNA接触，如果样品中存在所说的TNA，则PNA与TNA杂交形成靶结合区TBR，此TBR可以和靶结合装配体TBA结合；和
(B)使已经和所说的PNA接触的样品和TBA接触，此TBA可以结合任何由所说的PNA与样品中所说的TNA杂交形成的TBR。
10.一种具有高灵敏性和特异性的检测和定位特定核酸序列的方法，该方法包括：
(A)将含有1/2 BBR和1/2 TBR的PNA加入到含有或怀疑含有包含1/2 TBR序列的TNA样品中，以形成具有靶结合区TBR的复合体，此TBR由分别存在于PNA和TNA中的互补1/2 TBR的杂交形成；
(B)将步骤A中形成的TBR结合到固定化的TBA上，以形成TBA-TNA-PNA复合体；
(C)将包含辅助结合区1/2 BBR的辅助核酸BNA加入到步骤B中形成的复合体中，以便BNA中的1/2 BBR与存在于PNA中的1/2 BBR序列杂交，或者加入到存在于已经和PNA结合的BNA中的1/2 BBR上形成BBR，以便形成TBA-TNA-PNA-(BNA)n复合体；
(D)将含有1/2 BBR序列的发夹核酸HNA加入到步骤C中形成的复合体中，以便HNA中的1/2 BBR和任何存在于步骤C的复合体的BNA中的可用的1/2 BBR序列杂交，由此在步骤C的TBA-TNA-PNA-(BNA)n复合体上加帽使BNA延伸，形成TBA-TNA-PNA-(BNA)n-HNA复合体；
(E)将和指示剂部分连接的辅助结合装配体加入到步骤D中所形成的TBA-TNA-PNA-(BNA)n-HNA复合体中，以便形成TBA-TNA-PNA(BNA-BBA)n-HNA复合体；和
(F)检测由连接到步骤(E)中TBA-TNA-PNA-(BNA-BBA)n-HNA复合体中的TBA，PNA，BNA，BBA或HNA上的指示剂所产生的信号；其中所说的TNA包含：
(i)一个或多个特定1/2 TBR核酸序列，此特定序列在特定样品中的存在与否有待证实；所说的PNA包含：
(i)单链序列1/2 TBR，该序列在杂交条件下可以和存在于靶核酸(TNA)中的1/2 TBR形成杂交体TBR；
(ii)单链序列1/2 BBR，该序列在杂交条件下可以和辅助核酸(BNA)中的0-10个1/2 BBR形成杂交体BBR；和
(iii)OSA，其不是连接的支持物和/或指示剂，或者是连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述的定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；所说的BNA包含：
(i)1/2 BBR，其具有和PNA或另外的BNA中1/2 BBR序列互补的序列，并且其在杂交条件下可以和PNA形成杂交体BBR；
(ii)OSA，其不是连接的支持物和/或指示剂，或者是连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述的定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；和
(iii)附加的其它BNA的杂交位点1/2 BBR；
(iv)序列1/2 BBR，其可以与已经和PNA杂交的BNA杂交；所说的BBA包含：
(i)能够选择性地结合BBR的分子或分子的一部分；和
(ii)OSA，其不是连接的支持物和/或指示剂，或者是连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所述的定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；并且所说的TBA包含
(i)能够选择性地结合TBR的分子或分子的一部分；和
(ii)非连接的支持物和/或指示剂，或者连接的支持物或其它定位方式和/或指示剂，所说的定位方式包括但不限于连接到小珠上，聚合物上和表面上；
11.用于在固相中检测靶多核苷酸存在的杂交方法，该方法涉及将靶多核苷酸(如果存在于样品中)直接或经媒介俘获结构固定化在固相的俘获位点上；在所说的固定化过程之前、之中或之后将一种可检测的标记连接到所说的靶多核苷酸(如果存在)上，并且在俘获位点上检测所说的标记(如果具有任何所说的标记存在)，改进包括：
(A)使用靶结合装配体TBA作为达到固定化所说的靶多核苷酸的手段，其中所说的TBA只结合到由特定的探针核酸PNA和所说的的靶核酸形成的独特的杂交体上，以便形成可以被所说的TBA识别的完美的靶结合区TBR；和
(B)在PNA中包含进可以结合辅助核酸BNA的单链核酸1/2BBR，所说辅助核酸含有单链互补1/2 BBR，当其和PNA中的1/2 BBR杂交时，形成可以和标记的辅助结合装配体BBA结合的BBR。
12.一种靶结合装配体TBA或者辅助结合装配体BBA，其包含至少一个核酸识别单位，其中可以也可以不包含选自下组的一个或所有序列：接头序列、装配序列、不对称序列、核定位信号序列(NLS)和OSA。
13.权利要求12的TBA，其中所说的核酸识别单位选自下组：NF-kB结合单位、SP1结合单位、TATA结合单位、人乳头状瘤病毒E2结合单位、HPV LTR结合单位、HIV LTR结合单位和Tat。
14.权利要求13的TBA，其中所说的核酸识别单位具有选自下组的序列：SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.118。
15.权利要求12的TBA，其中所说的接头序列是寡肽，此寡肽不干扰核酸识别单位的核酸识别功能，并且提供核酸识别单位与剩余TBA间隔的稳定性和控制。
16.权利要求15的TBA，其中所说的接头序列是来源于结构蛋白区域间一级序列的寡肽序列。
17.权利要求12的TBA，其中所说的装配序列是一种寡肽序列，此寡肽序列指导核酸识别单位的折叠和缔合。
18.权利要求17的TBA，其中所说的装配序列来源于λ噬菌体cro蛋白或CI蛋白，并且选自下组：SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105、SEQID NO.106、SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108。
19.权利要求12的TBA，其中所说的不对称序列指导核酸识别序列和装配序列以预定的顺序缔合。
20.权利要求17的TBA，其中所说的不对称序列来源于胰岛素、促性腺激素、FSH、HCG、LH、ACTH或松驰素。
21.权利要求20的TBA、其中所说的不对称序列选自下组：SEQ IDNO.85、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ IDNO.89、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92。
22.权利要求12的TBA，其中所说的NLS是一种寡肽，此寡肽指导与所说的NLS相关的蛋白质或复合体迁移和摄入到细胞核中。
23.权利要求22的TBA，其中所说的NLS选自下组：SEQ ID NO.72和SEQ ID NO.103。
24.权利要求12的TBA，其是HIV Detect I-IV或HPV Dectect I-IV。
25.权利要求12的TBA，其具有选自下组的序列：SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.116。
26.一种使用权利要求12的TBA结合靶核酸样品中特定的核酸序列的方法，该方法包括：
(A)裂解靶核酸样品中的核酸；
(B)在杂交条件下，使裂解的核酸与和特定的兴趣核酸互补的探针核酸接触，其中在所说的的探针核酸与所说的特定的兴趣核酸序列杂交时，形成所说的TBA特异性地结合到其中的靶结合区。
27.权利要求26的方法，其中所说的探针核酸除了具有和所说的特定的兴趣核酸互补的序列外，还具有附加序列，此附加序列可与辅助核酸结合，形成辅助结合位点，标记的辅助结合装配体可以结合到此结合位点上，提供显示和扩增探针核酸和兴趣靶核酸序列结合的信号。
28.一种使用权利要求12的TBA的方法，其中将预防和治疗有效量的所说TBA施用给需要此种治疗的病人，该方法包括以提纯的蛋白复合体的形式或以重组载体(进入病人体内后可以表达TBA)的形式施用TBA，以便TBA和特定的核酸序列结合达到所期望的治疗和预防结果。
29.权利要求28方法，其中所说的TBA选自下组：SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.116，并且所说的病人是由HIV和HPV感染的病人。
30.权利要求26的方法，该方法还包括以下步骤：
(C)监测靶核酸样品中核酸移动性的改变，以便TBA和样品中特定的核酸片段结合改变此片段的移动性作为核酸大小的函数。
31.一种用于检测样品中具有特定序列组成的核酸的诊断或法医试验试剂盒，该试剂盒包含：
(A)第一个核酸探针，其互补于具有特定序列组成的核酸，此核酸在试验样品中的存在与否是所要确定的，其中所说的第一核酸探针和所说的具有特定序列组成的核酸杂交时，形成第一个核酸结合蛋白的结合位点，其中所说的第一核酸探针还含有和第二核酸探针互补的附加序列；
(B)第一核酸结合蛋白，其对由所说的第一核酸探针和所说的具有特定序列组成的核酸杂交形成的双链体是特异性的；
(C)第二核酸探针，其互补于所说的第一核酸探针中所说附加序列，当所说的第一和第二核酸探针杂交时，形成第二个核酸结合蛋白的结合位点。
(D)第二个核酸结合蛋白，其特异性地结合由所说第一核酸探针和所说第二核酸探针杂交形成的双链体，其中所说的第二核酸结合蛋白由可检测的标记标记。
32.权利要求31的诊断和法医试验试剂盒，其中所说的第一核酸探针与HIV LTR互补，由此当所说第一核酸探针和HIV LTR杂交时，形成NF-KB或其亚单位SP1、TATA结合蛋白、HIV-DetectI，II，III或IV、或者HIV-Lock的结合位点。
33.权利要求32的诊断或法医试验试剂盒，其中所说的第一核酸结合蛋白是NF-KB或其亚单位SP1、TATA结合蛋白、HIV-DetectI，II，III或IV、或者HIV-Lock。
34.权利要求33的诊断或法医试验试剂盒，其中所说的第一核酸探针除了和HIV LTR互补外还包含噬菌体λ左和右操纵子的编码序列，所说的第二核酸探针包含和所说的第一核酸探针中噬菌体λ左或右操纵子序列互补的序列，由此当所说的第一和所说的第二核酸探针杂交时，噬菌体λCI抑制子蛋白，噬菌体λcro蛋白或它们的衍生物或类似物的结合位点。
35.权利要求34的诊断或法医试验试剂盒，其中所说的第二核酸结合蛋白是噬菌体λCI抑制子蛋白，噬菌体λcro蛋白或它们的衍生物或类似物。
36.一种组合物，该组合物包含HIV-Lock或编码HIV-Lock的重组载体和药物上可接受的载体。
37.一种特异性地将核酸结合蛋白结合到与病理状态相关的核酸上的方法，该方法包括：
(A)选择存在于病理状态相关核酸序列中的特定构型的核酸结合蛋白序列作为靶序列，用以设计将与样品中那些特定构型的核酸序列(如果存在)杂交的核酸探针，并且保证在所说的核酸探针和选为靶的所说特定构型的核酸序列杂交时，形成可获得的核酸结合蛋白的结合位点；
(B)选择核酸结合蛋白，此蛋白特异性地和与病理状况相关的选择的特定构型的核酸结合蛋白序列结合，但此蛋白不和与所说病理状况不相关的序列结合。
(C)将所说的的核酸探针与怀疑含有存在于病理状态相关核酸序列中的所说特定构型的核酸结合蛋白序列的试验样品杂交；
(D)使所说的核酸结合蛋白和(B)中形成的任何一个杂交体接触。
(E)检测所说核酸结合蛋白和所说杂交体的任何结合。
38.权利要求37的方法，其中所说的特定构型的核酸结合蛋白序列选自病理状态发展的关键步骤或控制点。
39.权利要求9的方法，其中所说的方法以自动方式进行。
40.权利要求39的方法，其中所说的方法是在Abbott Laboratories IMx仪器上进行的。
41.权利要求9的方法，其是在微量滴定板上进行的。
42.一种用于扩增经将权利要求1的PNA和TNA结合产生的信号的方法，该方法包括将BNA结合到PNA-TNA杂交体上和将标记的BBA结合到BNA上。
43.一种用于装配核酸结合复合体的方法，该方法包括用不对称序列指导核酸结合复合体组份的缔合或者非缔合。
44.一种用于装配核酸结合复合体的方法，该方法包括使用来源于噬菌体λcro或CI的装配序列来装配核酸结合复合体的缔合组份。
45.一种使用装配，不对称，或先导序列来装配多聚体蛋白复合体的方法，该方法包括将待掺入到多聚体蛋白复合体中的亚单位连接到所说的装配，不对称或先导序列上，以及回收所说的多聚体复合体。
46.一种组合物，该组合物包含SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106或SEQ ID NO.108。
47.一种编码权利要求12的TBA或BBA的核酸。
48.权利要求12的TBA或者编码所说的TBA的核酸，其中所说的TBA的氨基酸序列选自下组：组合A、组合B和组合C，所说的各组合如以下所示：
组合    连接的序列组
A       I+II+III
B       IV+V+III
C       IV+III其中I-V组所包括的序列选自：
组      所选自的序列
I       SEQ ID NO.85-92的任何序列
II      Met Ser，连接到SEQ ID NO.104-106的任何序列上，其各
        自连接到SEQ ID NO.99上。
III     连接到SEQ ID NO.75-84或94-98之任一上的SEQ ID NO.100，
        连接到SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.93上的SEQ ID NO.
        101；或连接到SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.93上的SEQ ID
        NO.102；或者SEQ ID NO.72，103，73，或63-71的任
        何序列。
IV      SEQ ID NO.104-108的任何序列
V       SEQ ID NO.99。
49.一种用于在体内或原位装配多聚体TBA方法，该方法包括使用共价或非共价连接的蛋白或双层载体将组份TBA引入到细胞中，或者通过将编码TBA组份的核酸引入到细胞中来将组份TBA引入到细胞中，所说的TBA组份每个都含有DNA识别单位，装配序列，不对称序列，核定位信号序列和可有可无的接头序列，由此当经由各组份TBA的DNA识别单位邻近地结合到在细胞核中或细胞其它区域遇到的核酸序列上时，组份表达的TBA通过所说的装配和不对称序列装配成多聚体TBA。
50.一种用于鉴别核酸结合分子以便制备靶结合装配体或辅助结合装配体的方法，该方法包括：
(A)获得含有靶核酸的样品；
(B)破碎此样品以便在样品中暴露核酸并减少所说核酸大小的复杂性；
(C)使第一小份破碎的核酸和对照缓冲介质接触；使第二小份破碎的核酸和含有已知组成的核酸结合分子的对照缓冲介质接触；
(D)分析所说的两个小份，以鉴别和与对照缓冲介质接触的小份相比在与靶结合分子接触的小份中已改变行为的片段；
(E)鉴别和分离在和核酸结合分子接触时确实显示出改变的行为的，测定所说核酸片段的序列以确定是否存在已知的核酸结合分子基序或者直接鉴别结合到核酸上的核酸结合分子；和
(F)用装配、不对称核定位以及可有可无的接头序列合成含有产生改变的行为的核酸结合分子的TBA。
51.一种用于鉴别样品中特定核酸序列方法，该方法包括：
(A)破碎所说样品中的核酸以暴露核酸和降低核酸大小的复杂性；
(B)使TBA和样品接触，所说的TBA含有两个或多个核酸结合组份，每个组份具有相对弱的对TBR中的核酸识别单位的结合性，但是在组合时其提供对完整的TBR的强的结合性；和
(C)排除任何由TBA和含有单独识别单位的表亲核酸结合产生的“交叉对话”，其包括将所说样品和过量的核酸结合组份接触，该组份对含有单个识别单位的表亲核酸具有相对强的亲和力，但对于含有两个或多个核酸结合组份的完整TBR的结合而言，具有较TBA亲和力相对弱的结合力。
CN95197558.7A 1994-12-09 1995-12-07 用特定序列组合体检测核酸的方法 Expired - Fee Related CN1255551C (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/353476 1994-12-09
US08/353,476 1994-12-09
US08/353,476 US5871902A (en) 1994-12-09 1994-12-09 Sequence-specific detection of nucleic acid hybrids using a DNA-binding molecule or assembly capable of discriminating perfect hybrids from non-perfect hybrids

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200610071545.7A Division CN1936020A (zh) 1994-12-09 1995-12-07 用特定序列组合体检测核酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1176663A true CN1176663A (zh) 1998-03-18
CN1255551C CN1255551C (zh) 2006-05-10

Family

ID=23389290

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200610071545.7A Pending CN1936020A (zh) 1994-12-09 1995-12-07 用特定序列组合体检测核酸的方法
CN95197558.7A Expired - Fee Related CN1255551C (zh) 1994-12-09 1995-12-07 用特定序列组合体检测核酸的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200610071545.7A Pending CN1936020A (zh) 1994-12-09 1995-12-07 用特定序列组合体检测核酸的方法

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5871902A (zh)
EP (2) EP1820864A3 (zh)
JP (2) JPH10510157A (zh)
CN (2) CN1936020A (zh)
AT (1) ATE353372T1 (zh)
BR (1) BR9509977A (zh)
CA (1) CA2206127A1 (zh)
DE (1) DE69535384T2 (zh)
DK (1) DK0796344T3 (zh)
ES (1) ES2279516T3 (zh)
IL (2) IL150713A (zh)
MX (1) MX9704281A (zh)
NO (2) NO321557B1 (zh)
PT (1) PT796344E (zh)
WO (1) WO1996017956A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100507564C (zh) * 2002-04-09 2009-07-01 唐舜荣 改进的通过颗粒结合来检测靶分子的方法
CN104849228B (zh) * 2006-06-29 2018-04-13 皇家飞利浦电子股份有限公司 使用基于uv 光的dna 成像细胞术来检测和/或诊断癌症的体外方法
CN113166797A (zh) * 2018-12-21 2021-07-23 Illumina公司 基于核酸酶的rna耗尽

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050084885A1 (en) * 1994-01-18 2005-04-21 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
ATE407205T1 (de) 1994-08-20 2008-09-15 Gendaq Ltd Verbesserung in bezug auf bindungsproteine bei der erkennung von dna
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5871902A (en) * 1994-12-09 1999-02-16 The Gene Pool, Inc. Sequence-specific detection of nucleic acid hybrids using a DNA-binding molecule or assembly capable of discriminating perfect hybrids from non-perfect hybrids
US20030104361A1 (en) * 1997-09-29 2003-06-05 Susan Weininger Method of detection of nucleic acids with a specific sequence composition
US5853990A (en) 1996-07-26 1998-12-29 Edward E. Winger Real time homogeneous nucleotide assay
DE69723096T2 (de) 1996-10-04 2004-05-06 Dako A/S Sonden zur detektion von mycobakterien
GB9710809D0 (en) * 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
DE69942334D1 (de) 1998-03-02 2010-06-17 Massachusetts Inst Technology Poly-zinkfinger-proteine mit verbesserten linkern
US6391551B1 (en) 1998-03-13 2002-05-21 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US6312902B1 (en) 1998-03-13 2001-11-06 Promega Corporation Nucleic acid detection
US6235480B1 (en) * 1998-03-13 2001-05-22 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US6268146B1 (en) 1998-03-13 2001-07-31 Promega Corporation Analytical methods and materials for nucleic acid detection
US6703211B1 (en) 1998-03-13 2004-03-09 Promega Corporation Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP
US6335162B1 (en) 1998-03-13 2002-01-01 Promega Corporation Nucleic acid detection
US6270973B1 (en) 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Multiplex method for nucleic acid detection
US7090975B2 (en) 1998-03-13 2006-08-15 Promega Corporation Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection
US6270974B1 (en) 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Exogenous nucleic acid detection
NZ506987A (en) 1998-03-17 2003-01-31 Sangamo Biosciences Inc Nucleic acid binding proteins
US6287772B1 (en) 1998-04-29 2001-09-11 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences
US6664045B1 (en) 1998-06-18 2003-12-16 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of microorganisms
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6503717B2 (en) * 1999-12-06 2003-01-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
US6599692B1 (en) * 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) * 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US7030215B2 (en) * 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US20030104526A1 (en) * 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
CA2381750A1 (en) * 1999-08-13 2001-02-22 Nanogen, Inc. Microelectronic molecular descriptor array devices, methods, procedures, and formats for combinatorial selection of intermolecular ligand binding structures and for drug screening
US6428957B1 (en) 1999-11-08 2002-08-06 Agilent Technologies, Inc. Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
ATE355368T1 (de) * 2000-01-24 2006-03-15 Gendaq Ltd Nucleinsäure bindende polypeptide gekennzeichnet durch flexible linker verbundene nucleinsäuredomäne
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
US20020155427A1 (en) * 2000-04-03 2002-10-24 Cohenford Menashi A. Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes
AU2001286584A1 (en) * 2000-08-18 2002-03-04 Massachusetts Institute Of Technology Inhibition of protein-protein interaction
WO2002040632A2 (en) * 2000-11-17 2002-05-23 Wise John G Creation and identification of proteins having new dna binding specificities
AU2884102A (en) * 2000-12-07 2002-06-18 Sangamo Biosciences Inc Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
US7067317B2 (en) * 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
EP1288292A1 (en) * 2001-08-31 2003-03-05 Leids Universitair Medisch Centrum Long peptides of 22-40 amino acid residues that induce and/or enhance antigen specific immune responses.
AU2002243645A1 (en) * 2001-01-22 2002-07-30 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for dna binding and gene regulation in plants
US20040161753A1 (en) * 2001-11-16 2004-08-19 Wise John G. Creation and identification of proteins having new dna binding specificities
US7262054B2 (en) * 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
US7563600B2 (en) 2002-09-12 2009-07-21 Combimatrix Corporation Microarray synthesis and assembly of gene-length polynucleotides
JP2005304489A (ja) * 2004-03-24 2005-11-04 Sysmex Corp 標的物質検出用プローブセット及び標的物質検出方法。
JP2009530423A (ja) * 2006-03-21 2009-08-27 ワイス アミロイド生成性疾患を予防および処置するための方法
US20070231805A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-04 Baynes Brian M Nucleic acid assembly optimization using clamped mismatch binding proteins
WO2007136834A2 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Codon Devices, Inc. Combined extension and ligation for nucleic acid assembly
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
WO2008062479A2 (en) * 2006-11-21 2008-05-29 Jawaharlal Nehru Centre For Advanced Scientific Research A high sensitivity assay for molecular typing of biological sample, probes and a kit thereof
KR20110025993A (ko) * 2008-06-30 2011-03-14 바이오나노매트릭스, 인크. 단일-분자 전체 게놈 분석용 장치 및 방법
US20120214208A1 (en) * 2009-09-16 2012-08-23 Massey University Fusion polypeptides and uses thereof
US10207240B2 (en) 2009-11-03 2019-02-19 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
US9216414B2 (en) 2009-11-25 2015-12-22 Gen9, Inc. Microfluidic devices and methods for gene synthesis
US9217144B2 (en) 2010-01-07 2015-12-22 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
WO2012064975A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
JP6118725B2 (ja) 2010-11-12 2017-04-19 ジェン９・インコーポレイテッドＧｅｎ９，ＩＮＣ． 核酸合成のための方法およびデバイス
LT3594340T (lt) 2011-08-26 2021-10-25 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
US10081807B2 (en) 2012-04-24 2018-09-25 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
LT2864531T (lt) 2012-06-25 2019-03-12 Gen9, Inc. Nukleorūgšties konstravimo ir aukšto produktyvumo sekvenavimo būdai
JP2015536653A (ja) * 2012-11-15 2015-12-24 モレキュラー ディテクション イスラエル リミテッド Ｐｃｒ反応混合物及びそれを使用する方法
CN105039587A (zh) * 2015-04-20 2015-11-11 广东温氏食品集团股份有限公司 用于检测鸭腺病毒2型的引物对及试剂盒
CN105039586A (zh) * 2015-04-20 2015-11-11 广东温氏食品集团股份有限公司 检测鸭2型腺病毒的引物及试剂盒
CN114592022A (zh) * 2022-03-30 2022-06-07 南京大学 一种基于dna模板的长链tna合成方法

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4556643A (en) * 1982-07-26 1985-12-03 Agracetus Assay method and probe for polynucleotide sequences
US4948882A (en) * 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4623627A (en) * 1983-08-19 1986-11-18 Cetus Corporation Monoclonal antibody having specificity for the double-stranded conformation of native DNA and diagnostic methods using same
US4724202A (en) * 1983-12-12 1988-02-09 Molecular Diagnostics, Inc. Use of non-hybridizable nucleic acids for the detection of nucleic acid hybridization
US4777129A (en) * 1983-12-12 1988-10-11 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein
EP0146039A3 (en) * 1983-12-12 1986-08-27 Miles Inc. Hybridization assay with immobilization of hybrids by antihybrid binding
US4775619A (en) * 1984-10-16 1988-10-04 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US5118605A (en) * 1984-10-16 1992-06-02 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4751177A (en) * 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
US4794075A (en) * 1985-08-29 1988-12-27 Lifecodes Corporation Method for locating and purifying DNA containing single base mismatches
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
US5306614A (en) * 1986-01-22 1994-04-26 Institut Pasteur Methods and kits for diagnosing human immunodeficiency virus type 2(HIV-2)
US5310650A (en) * 1986-09-29 1994-05-10 Abbott Laboratoires Method and device for improved reaction kinetics in nucleic acid hybridizations
US4960691A (en) * 1986-09-29 1990-10-02 Abbott Laboratories Chromatographic test strip for determining ligands or receptors
WO1988006601A1 (en) * 1987-03-02 1988-09-07 Genex Corporation Gene repressors
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
JP2739068B2 (ja) * 1988-09-24 1998-04-08 春馬 川口 Ｄｎａ固定ミクロスフェア及びそれを用いるｄｎａ転写制御因子精製法
US5324829A (en) * 1988-12-16 1994-06-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. High specific activity nucleic acid probes having target recognition and signal generating moieties
US5198346A (en) * 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) * 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5556750A (en) * 1989-05-12 1996-09-17 Duke University Methods and kits for fractionating a population of DNA molecules based on the presence or absence of a base-pair mismatch utilizing mismatch repair systems
US5459039A (en) * 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
WO1991006679A1 (en) * 1989-10-24 1991-05-16 Stratagene An improved method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein
US5215899A (en) * 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
US5215882A (en) * 1989-11-30 1993-06-01 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Method of immobilizing nucleic acid on a solid surface for use in nucleic acid hybridization assays
WO1991011534A1 (en) * 1990-01-24 1991-08-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce A rapid and sensitive test for detecting hepatitis a virus
US5200314A (en) * 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
CA2039517C (en) * 1990-04-03 2006-11-07 David Segev Dna probe signal amplification
JPH04222599A (ja) * 1990-04-20 1992-08-12 Syntex Usa Inc 二重受容体ポリヌクレオチド検定方法
AU2028792A (en) * 1991-05-17 1992-12-30 Uab Research Foundation Sequence specific dna binding drugs
DK0519338T3 (da) * 1991-06-20 1996-10-28 Hoffmann La Roche Forbedrede fremgangsmåder til nukleinsyreamplifikation
EP0593618B1 (en) * 1991-06-27 1998-04-22 Genelabs Technologies, Inc. Screening assay for the detection of dna-binding molecules
WO1993015226A1 (en) * 1992-01-28 1993-08-05 President And Fellows Of Harvard College Method for nucleic acid hybridization using single-stranded dna binding protein
WO1993020233A1 (en) * 1992-03-27 1993-10-14 University Of Maryland At Baltimore Detection of gene mutations with mismatch repair enzymes
JPH05308999A (ja) * 1992-05-08 1993-11-22 Sumitomo Metal Ind Ltd Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ−Ｃ変異の判定法
AU682340B2 (en) * 1993-01-28 1997-10-02 Regents Of The University Of California, The TATA-binding protein associated factors, nucleic acids encoding TAFs, and methods of use
US5593834A (en) * 1993-06-17 1997-01-14 The Research Foundation Of State University Of New York Method of preparing DNA sequences with known ligand binding characteristics
US5871902A (en) * 1994-12-09 1999-02-16 The Gene Pool, Inc. Sequence-specific detection of nucleic acid hybrids using a DNA-binding molecule or assembly capable of discriminating perfect hybrids from non-perfect hybrids

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100507564C (zh) * 2002-04-09 2009-07-01 唐舜荣 改进的通过颗粒结合来检测靶分子的方法
CN104849228B (zh) * 2006-06-29 2018-04-13 皇家飞利浦电子股份有限公司 使用基于uv 光的dna 成像细胞术来检测和/或诊断癌症的体外方法
CN113166797A (zh) * 2018-12-21 2021-07-23 Illumina公司 基于核酸酶的rna耗尽
CN113166797B (zh) * 2018-12-21 2024-04-12 Illumina公司 基于核酸酶的rna耗尽
US11976271B2 (en) 2018-12-21 2024-05-07 Illumina, Inc. Nuclease-based RNA depletion

Also Published As

Publication number Publication date
NO321557B1 (no) 2006-05-29
WO1996017956A3 (en) 1997-07-24
JP4598722B2 (ja) 2010-12-15
NO20052968D0 (no) 2005-06-17
CN1936020A (zh) 2007-03-28
NO20052968L (no) 1997-08-11
EP0796344A1 (en) 1997-09-24
CA2206127A1 (en) 1996-06-13
BR9509977A (pt) 1998-06-09
IL116321A (en) 2004-09-27
EP0796344B1 (en) 2007-02-07
DE69535384T2 (de) 2007-09-13
DE69535384D1 (de) 2007-03-22
NO972611L (no) 1997-08-11
ES2279516T3 (es) 2007-08-16
NO972611D0 (no) 1997-06-06
IL150713A (en) 2011-02-28
MX9704281A (es) 1998-07-31
IL150713A0 (en) 2003-02-12
ATE353372T1 (de) 2007-02-15
JP2006320326A (ja) 2006-11-30
CN1255551C (zh) 2006-05-10
WO1996017956A2 (en) 1996-06-13
US5871902A (en) 1999-02-16
EP1820864A3 (en) 2008-01-23
IL116321A0 (en) 1996-03-31
PT796344E (pt) 2007-05-31
JPH10510157A (ja) 1998-10-06
DK0796344T3 (da) 2007-06-04
EP1820864A2 (en) 2007-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1176663A (zh) 用特定序列组合体检测核酸的方法
CN1167811C (zh) 酶原性核酸的检测方法,以及相关分子和试剂盒
CN1197962C (zh) 用于测序的改变的热稳定dna聚合酶
CN1898395A (zh) 基于引物的核酸的多重扩增的方法和试剂盒
CN1608139A (zh) 数字化分析
CN1350591A (zh) 以单一步骤制备和检测复合生物样品中的核酸
CN1361829A (zh) 利用特异性lna引物检测基因突变
CN1471588A (zh) 核酸扩增方法
CN1416467A (zh) 锌指结构域及其鉴定方法
CN1554664A (zh) 用于结核病诊断的化合物和方法
CN1977050A (zh) 丙型肝炎病毒基因型的确定
CN1491285A (zh) 致病微生物的检测方法
CA2588581A1 (en) Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses
CN100351393C (zh) 核苷酸多态性的检测方法
CN1071955A (zh) 分支杆菌引物及探针
CN1364199A (zh) 探针聚合物制备用探针、探针聚合物的制备方法及其应用
CN1636071A (zh) 细小病毒b19的诊断测试
CN1117876C (zh) 刺激促生长素抑制素和胰岛素产生的化合物的筛选方法
CN1675373A (zh) 用于鉴别水稻品种的方法
CN1798842A (zh) 核酸检测
US20050186624A1 (en) Method of detection in vitro of a target substance in a sample comprising the labelling of said substance with a reporter gene and with the sequences necessary for the expression of said reporter gene in vitro
US9868983B2 (en) Method for detecting nucleic acids by promoting branched DNA complex formation
CN1802439A (zh) 使用ⅲ型限制酶分离包括超过25个核苷酸的鉴定标志
CN1934275A (zh) 用嵌入染料标记的探针检测dna扩增的方法
CN1737165A (zh) 一种减少假阳性结果的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20060510

Termination date: 20111207