EP1627228A1 - Verfahren und testsystem zur untersuchung und/oder zum nachweis von biomolekülen und/oder wirkstoffen in flüssigkeitsproben - Google Patents

Verfahren und testsystem zur untersuchung und/oder zum nachweis von biomolekülen und/oder wirkstoffen in flüssigkeitsproben

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Publication number
EP1627228A1
EP1627228A1 EP04738547A EP04738547A EP1627228A1 EP 1627228 A1 EP1627228 A1 EP 1627228A1 EP 04738547 A EP04738547 A EP 04738547A EP 04738547 A EP04738547 A EP 04738547A EP 1627228 A1 EP1627228 A1 EP 1627228A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
carrier particles
probe
dried
substance
detector molecules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04738547A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerhard Hermann
Ilona KÜHLMANN-RABENS
Uwe Schobel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Virion/Serion GmbH
Original Assignee
Institut Virion/Serion GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Virion/Serion GmbH filed Critical Institut Virion/Serion GmbH
Publication of EP1627228A1 publication Critical patent/EP1627228A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the invention relates to a method for examining and / or detecting the type and / or amount of at least one sample substance to be examined, in which (a) pre-metered amounts of carrier particles are provided which are loaded with probe or detector molecules, (b) these loaded carrier particles are in dried form, (c) (i) the carrier particles are brought into contact with a liquid which contains the sample substance (s) to be investigated or to be detected, the sample substance (s) also one or more defined marker sizes is / are marked, or (ii) the carrier particles simultaneously or sequentially in contact with the sample substance (s) and with marker or reporter substance (s) which are in the same or in different liquids are brought, and (d) after one or more reaction times during which the contacted sample substance (s) and probe or detector molecules and marker or rep bind local substance, at least one (but preferably two or more) defined marker size is analyzed, from which the amount of the sample substance (s) to be examined or detected can be concluded.
  • DE 33 22 373 C2 and EP 0 126 450 describe a method which enables the simultaneous determination of several antigens and / or antibodies from one sample.
  • a mixture of particles which are coated with different antibodies and / or antigens is mixed with a liquid which contains the antigens or antibodies to be examined or detected.
  • the bound antigens or antibodies are identified by adding a liquid with fluorescence-labeled antibodies and / or antigens which are associated with the antigens or antibodies to be detected or investigated react in a species-specific manner.
  • the analysis of the markings of the individual carrier particles is carried out with the aid of flow cytometers that have been specially adapted for particle measurements. From this analysis, the nature or the presence of the antigens or antibodies to be examined can be inferred. By suitable selection of the antibodies or antigens with which the carrier particles used are loaded, predetermined desired properties of the liquid to be examined or its ingredients can be examined. Depending on which antigens or antibodies are to be detected or analyzed in the liquid to be examined, test particles which are loaded with correspondingly corresponding antibodies or antigens can be used.
  • sample substance (s) denotes the biomolecules or active substances to be examined or detected.
  • biomolecules stands for all molecules and molecular fragments that occur naturally in the animate and inanimate nature and can be provided either by isolation processes or identical replication, in particular molecules in or from plant and animal cells, organs and organisms, in / from prokaryotes, into / from fungi, into / from viruses and phages, but also molecules such as virions, prions and the like or parts thereof (e.g. antigens, antibodies, DNA, DNA fragments, etc.).
  • active ingredients here stands for all molecules that have been created and synthesized by humans (e.g. synthetic drugs).
  • Probe molecules or detector molecules refer to those biomolecules and / or active substances with which the carrier particles are loaded or coated, i.e. which are on / on these carrier molecules.
  • Marker or reporter substance means those biomolecules and / or active substances which have a known, defined marker size, which is used for analysis, ie evaluated.
  • a marker or Reporter substance are in particular biomolecules or active substances that themselves fluorescence activity, phosphorescence activity, bioluminescence activity, chemiluminescence, chromophore activity,
  • the carrier particles or mixture of particles coated with the desired biomolecules / active substances as probe or detector molecules must be dispensed into a reaction vessel.
  • This pipetting step has a decisive influence on the quality of the test result, since it is used to concentrate the concentration on the particles Probe or detector molecules is set in the test solution.
  • the concentration of the biomolecules / active substances on the particles in the test solution has an influence on the test setting and the test level and thus on the evaluation of the examined sample material. Particle numbers deviating from the test setting also have an influence on the counting rates, e.g. B. in the analysis in a flow cytometer.
  • the invention is based on the object of further developing the known method in such a way that the disadvantages mentioned are avoided and that a simplified methodology with high sensitivity and specificity is possible.
  • This object is achieved with a method of the type mentioned at the outset, which is distinguished in that the carrier particles loaded with the probe or detector molecules are different in size and / or color, and in step (d) the size and / or Color of the carrier particles is analyzed.
  • “Different in terms of color” means in the present context that the carrier particles are provided with different color types or dyes (e.g. red, green, blue) as well as with different color intensities of the same color type / the same dye (e.g. in ten intensity levels from light red to dark red) ( are coded). When analyzing the color, the color type and / or the color intensity is consequently analyzed.
  • the carrier particles loaded or coated with the probe or detector molecules are provided in a predosed state in dried form. A laboratory worker can thus access the pre-metered amount of the coated carrier particles without first having to precisely determine the amount of the carrier particles in a complex pipetting step.
  • the pre-metered amount of carrier particles is provided in a dried, preferably freeze-dried form, there is also an extended shelf life for the probe or detector molecules with which the carrier particles are coated.
  • the provision of the carrier particles in freeze-dried form is particularly easy to do and precise.
  • the method according to the invention can be used both for examining the amount of a specific sample substance present (i.e. type of biomolecules or active substances) and for detecting whether a specific sample substance (i.e. corresponding biomolecules or active substances) is contained at all.
  • carrier particles are used for this purpose, which not only differ in color and / or size, but which are also loaded with different probe or detector molecules.
  • the predosed amount of carrier particles with probe or detector molecules located thereon can consist in particular of several groups of carrier particles, the individual groups firstly depending on the size and / or color (color type and / or color intensity) of the associated group Differentiate carrier particles and secondly by the type of probe or detector molecules on the carrier particles.
  • the carrier molecules of each individual group have the same size and color type / color intensity and are loaded with the same probe or detector molecules
  • the carrier molecules of two groups differ in their size and / or their color type and / or color intensity and they are loaded with different probe or detector molecules.
  • probe or detector molecules can be used which are complementary to the sample substance (s) and / or to the marker or reporter substance (s).
  • probe or detector molecules i.e. biomolecules or active substances
  • additional sample substance (s) biomolecules and / or active substances
  • sample molecule i.e. biomolecule or active substance
  • Carrier particles with probe or detector molecules are used which react (would) with the sample substances to be detected.
  • the method according to the invention can also be carried out using a competitive reaction.
  • the sample substance (s) and the probe or detector molecules are very similar or even the same and the marker or. Reporter substances are complementary to the sample substances and / or the probe or detector molecules.
  • the sample substance (s) compete with the probe or detector molecules for binding to the labeled complementary marker or reporter substance. Is not a Containing sample substance particles in the liquid, bind all marker or reporter substance particles to the probe / detector molecules and thus to the carrier particles and are detected. If, on the other hand, many sample substance particles are present, all the marker or reporter substance particles bind to the sample substance particles and not to the probe / detector molecules and thus not to the carrier particles and are therefore not detected.
  • the predosed and dried or freeze-dried carrier particles are provided as pellets.
  • compacts are used which contain the dried or freeze-dried carrier particles in a predosed form. These compacts are easy to handle and can be used in any reaction vessel.
  • a further development of this method variant provides that different groups of pressings are used, which differ in the different loading of the carrier particles contained therein with probe or detector molecules, the carrier particles of each individual compact being loaded with the same probe or detector molecules.
  • a single squeeze can be provided for an infection serological test during pregnancy (so-called pregnancy panel), which contains carrier particles of different sizes and / or of different colors, which contain probe or detector molecules for the antigens and / or antibodies of rubella, toxoplasmosis , CMV, HSV, VZV, parvovirus and others are loaded, each carrier particle species being loaded with a specific probe or detector molecule species.
  • pregnancy panel contains carrier particles of different sizes and / or of different colors, which contain probe or detector molecules for the antigens and / or antibodies of rubella, toxoplasmosis , CMV, HSV, VZV, parvovirus and others are loaded, each carrier particle species being loaded with a specific probe or detector molecule species.
  • a set of several pressings can be provided for an infection serological test for vaccination control, each press only having a single, specific group of carrier particles loaded with a specific type of probe or detector molecule, for example: for the antigen and / or Contains antibodies from tetanus, diphtheria, pertussis and the like. These individual compacts can then be mixed individually depending on the question.
  • the predosed, dried or freeze-dried carrier particles can just as well be unpressed in reaction vessels such as e.g. Micro-titer plates or tubes are provided, and these reaction vessels can then be used directly for the analysis of the liquid to be examined without further additional measures.
  • the laboratory technician only has to fill the liquid to be examined into this reaction vessel in order to bring it into contact with the predosed and thus known amount of freeze-dried carrier particles, a transfer process or a quantity determination is no longer necessary.
  • a fluorescent dye is proposed as a defined marker size for the sample substance (s) in the liquid, so that the fluorescence is consequently evaluated in step d) of the method according to the invention.
  • the process according to the invention can be simplified particularly advantageously by providing the predosed carrier particles loaded with probe or detector molecules together with a predosed amount of marker or reporter substance (s) in dried or freeze-dried form.
  • the marker or reporter substance (s) has the property of reacting with the species to be examined or detected. It can consist of one or more components, and it can have one or more structures complementary to the probe or detector molecules and / or sample substance (s).
  • the present invention also relates to a test system (kit) for use in the examination and / or detection method according to the invention, which is characterized in that it is different in size and / or color (color type and / or color intensity) from groups of probes or Detector molecules loaded carrier particles, which are pre-metered in dried form.
  • kit for use in the examination and / or detection method according to the invention, which is characterized in that it is different in size and / or color (color type and / or color intensity) from groups of probes or Detector molecules loaded carrier particles, which are pre-metered in dried form.
  • the coding of the carrier particles with respect to the color is preferably carried out in a known manner by introducing one or more fluorophores, possibly in different concentrations, into the carrier particles or by attaching one or more identical or different fluorescent nanoparticles to the surface of the carrier particles.
  • This test system (kit) according to the invention can be used directly by a laboratory worker without a pipetting or dispensing step, so that an essential source of error is reduced in the manner described.
  • Such test systems (kits) can be prepared in large quantities in advance and as such z. B. be distributed.
  • the carrier particles in the test system are preferably in freeze-dried form.
  • the test system can comprise different groups of carrier particles in terms of size and / or color, the carrier particles of each group being loaded with identical probe or detector molecules and the carrier particles of different groups carrying different probe or detector molecules.
  • the dried or freeze-dried carrier particles are preferably present in the test system either pre-metered in the form of one or more compact (s) or pre-metered unpressed in a reaction vessel.
  • the test system additionally comprises at least one marker or reporter substance which can react with the sample substance (s) to be examined in a species-specific manner.
  • This marker or reporter substance can in particular be a fluorescence activity, phosphorescence activity, bioluminescence activity,
  • the marker or reporter substance (s) is / are preferably included either in the pressings or in the reaction vessels filled with the carrier particles and can / may consist of one or more components.
  • test systems are preferably manufactured at a central location and sold from there, so that after acquisition in the laboratory they can be used directly for the desired examinations without an additional dispensing or pipetting step.
  • FIG. 1 shows by way of example (of course, other temperature and pressure profiles are also conceivable) the temperature or pressure profile during freeze drying when carrying out a manufacturing method according to the invention for the test systems (kits) according to the invention.
  • Example 1 Infection serological examination in pregnant women variant 1
  • sample substance for example antigens and / or antibodies from rubella, toxoplasmosis, CMV, HSV, VZV, parvovirus in the serum sample of a pregnant woman
  • different sized carrier particles with different Probe or detector molecules, namely probe or detector molecules for these and possibly other antigens and / or antibodies, loaded, pre-dosed, freeze-dried and - either unpressed in a reaction vessel or pressed into a press - provided.
  • Probe or detector molecules namely probe or detector molecules for these and possibly other antigens and / or antibodies, loaded, pre-dosed, freeze-dried and - either unpressed in a reaction vessel or pressed into a press - provided.
  • a laboratory worker uses such a reaction vessel or such a pressure with a pre-metered amount of carrier particles.
  • the laboratory worker brings the pressure or the unpressed amount of carrier particles in the reaction vessel into contact with the liquid to be examined, which contains the sample substance (s), namely with the serum sample, in one or the reaction vessel.
  • he adds a certain amount of marker or reporter substance (s).
  • This step is superfluous if the marker or reporter substance (s) are already dried together with the carrier particles loaded with probe or detector molecules, pre-metered and either pressed into a press or unpressed into a reaction vessel. After the reaction time, different sample substance (s) and similar marker or reporter substance are bound to the carrier particles.
  • the size of the carrier particles e.g. in a flow cytometer adapted for particle measurements - the type and by analyzing the defined marker size (s) of the sample substance (s) and / or marker or reporter substance (s) can be based on the amount of sample substance ( en) be trapped in the liquid to be examined.
  • washing steps can be carried out at the end of the respective reaction times.
  • Example 1 As in Example 1, but instead of the differently sized carrier particles, differently colored carrier particles, namely those with regard to the type of color and / or color intensity, are used and mixed with the different probes. Load detector molecules.
  • the different carrier particles and thus the type (type) of the probe or detector molecules bound to them and the type (type) of the sample substances (s) thus detected can be detected by analyzing the different color or color intensity, and by analyzing the defined marker size ( n) the sample substance (s) and / or the marker or reporter substance (s), conclusions can be drawn about the amount of the sample substance (s) in the liquid to be examined
  • Example 3 Infection serological examination in pregnant women - variant 3
  • carrier particles are used which are different in size and color, the different colors being in a different color type or a different color intensity (with the same color type) can.
  • Carrier particles of the same size and color type or color intensity, ie the same coding are loaded with probe or detector molecules of the same type (type)
  • carrier particles with a different size and / or color type and / or color intensity, ie with a different coding are labeled with a load another type (type) of probe or detector molecules.
  • the various carrier particles and thus the type of probe or detector molecules bound to them and the type of sample substances (s) detected with them can be detected, and by analyzing the defined marker size (n ) of the sample substance (s) and / or the marker or reporter substance (s), conclusions can be drawn about the amount of the sample substance (s) in the liquid to be examined
  • Example 4 Detection of sample substance (s) without using marker or reporter substance (s)
  • nucleic acid sequences e.g. DNA
  • Sample substance (s) e.g. a particular DNA
  • the DNA to be detected is first amplified. This step can be carried out with primers which have already been fluorescence-labeled, so that the amplified products of the DNA to be detected (ie the sample substance) already contain a fluorophore.
  • Carrier particles are probe or detector molecules, e.g. in the form of a second
  • Probe or detector DNA on / on the carrier particles Probe or detector DNA on / on the carrier particles.
  • marker or reporter substance is not necessary.
  • a test system according to Example 5 is therefore proposed for carrying out this method.
  • a test system according to Example 6 is suitable for carrying out this method variant, namely a test system which comprises carrier particles loaded with probe or detector DNA and labeled or unlabeled marker or reporter DNA in dried, predosed form.
  • Example 5 Production and composition of a test system (kit) according to the invention - variant 1
  • carrier particles with the same or with different codes
  • carrier particles are dispensed into reaction vessels in defined quantities and under precisely monitored conditions, preferably using a special buffer stabilizer system (e.g. 50 M phosphate buffer, 150 mM sodium chloride, 0, 02% sodium azide, 8 g / L gelatin hydrolyzate, pH 7.4, additional scaffolding agents and auxiliaries such as sucrose, phenylalanine) are used.
  • a special buffer stabilizer system e.g. 50 M phosphate buffer, 150 mM sodium chloride, 0, 02% sodium azide, 8 g / L gelatin hydrolyzate, pH 7.4, additional scaffolding agents and auxiliaries such as sucrose, phenylalanine
  • the carrier particles are homogenized using ultrasound and / or mechanical stirring.
  • These pre-metered carrier particles are then dried by means of freeze drying or other drying processes and are thus made more durable and easier to handle.
  • a temperature and pressure profile is preferably used, as can be seen in FIG. 1.
  • carrier particles of the same coding and loaded with only one type (type) of probe or detector molecules either (a) carrier particles of the same coding and loaded with only one type (type) of probe or detector molecules, or (b) carrier particles of the same coding but loaded with different types (different types) Probe or detector molecules or (c) carrier particles of different coding and loaded with only one type (type) of probe or detector molecules per coding.
  • these carrier particles loaded with probe or detector molecules can be formed into pressings, each of these pellets containing a predetermined amount of carrier particles.
  • the mixture of carrier particles can be produced individually by combining appropriate compacts in a reaction vessel.
  • Example 6 Production and composition of a test system (kit) according to the invention - variant 2
  • the carrier particles loaded with the probe or detector molecules are dispensed into the reaction vessels together with a defined amount of marker or reporter substance (s) using a special buffer stabilizer system under precisely monitored conditions, by means of freeze drying or other drying processes and finally provided pressed or unpressed into reaction vessels.

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Abstract

Das Verfahren zur Untersuchung und/oder zum Nachweis der Art und/oder Menge wenigstens einer Probensubstanz ist durch forlgende Merkmale gekennzeichnet: Vordosierte Mengen von hinsichtlich Größe und/oder Farbe (Farbenart und/oder Farbenintensität) verschiedenen, mit Sonden-/Detektormolekülen beladenen und getrockneten Trägerpartikeln werden bereitgestellt. Diese Trägerpartikel werden entweder (i) mit einer Flüssigkeit in Kontakt gebracht, die die zu untersuchende(n) bzw. nachzuweisende(n) Probensubstanz(en) enthält, wobei die Probensubstanz(en) mit einer und/oder mehreren definierten Markierungsgrößen markiert sind, oder sie werden (ii) mit Probensubstanz(en) und mit Marker-/Reportersubstanz(en), die sich in derselben oder in verschiedenen Flüssigkeiten befinden, gleichzeitig oder sequenziell in Kontakt gebracht. Nach einer oder mehreren Reaktionszeiten wird die Größe und/oder Farbe der Trägerpartikel und wenigstens eine Markierungsgröße der Probensubstanz(en) und/oder Marker-/Reportersubstanz(en) analysiert, woraus auf die Art und/oder Menge der Probensubstanz(en) geschlossen werden kann. Das Testsystem ist dadurch gekennzeichnet, daß es hinsichtlich Größe und/oder Farbe verschiedene Gruppen von mit Sonden- bzw. Detektormolekülen beladene Trägerpartikel umfaßt, die in getrockneter Form vordosiert vorliegen.

Description

Verfahren und Testsystem zur Untersuchung und/oder zum Nachweis von Biomolekülen und/oder Wirkstoffen in Flüssigkeitsproben
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung und/oder zum Nachweis der Art und/oder Menge wenigstens einer zu untersuchenden Probensubstanz, bei dem (a) vordosierte Mengen Trägerpartikel bereit gestellt werden, die mit Sonden- bzw. Detektormolekülen beladen sind, (b) diese beladenen Trägepartikel in getrockneter Form vorliegen, (c) (i) die Trägerpartikel mit einer Flüssigkeit, die die zu untersuchende(n) bzw. nachzuweisende(n) Probensubstanz(en) enthält, in Kontakt gebracht werden, wobei die Probensubstanz(en) mit einer oder mehreren definierten Markierungsgrößen markiert ist/sind, oder (ii) die Trägerpartikel mit der/den Probensubstanz(en) und mit Marker- bzw. Reportersubstanz(en), die sich in derselben oder in verschiedenen Flüssigkeiten befinden, gleichzeitig oder sequentiell in Kontakt gebracht werden, und (d) nach einer oder mehreren Reaktionszeiten, während der die in Kontakt gebrachten Probensubstanz(en) und Sonden- bzw. Detektormoleküle und Marker- bzw. Reportersubstanz binden können, wenigstens eine (vorzugsweise jedoch zwei oder mehr) definierte Markierungsgröße analysiert wird, aus der auf die Menge der zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Probensubstanz(en) geschlossen werden kann.
In DE 33 22 373 C2 und EP 0 126 450 ist ein Verfahren beschrieben, welches die simultane Bestimmung von mehreren Antigenen und/oder Antikörpern aus einer Probe ermöglicht. Eine Mischung aus Partikeln, die mit unterschiedlichen Antikörpern und/oder Antigenen beschichtet sind, wird mit einer Flüssigkeit gemischt, die die zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Antigene bzw. Antikörper enthält. Nach einer definierten Reaktionszeit, in der die nachzuweisenden Antigene bzw. Antikörper von den an die Trägerpartikel beschichteten Antikörpern bzw. Antigenen gebunden werden, erfolgt die Identifizierung der gebundenen Antigene bzw. Antikörper durch Zugabe einer Flüssigkeit mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und/oder Antigenen, die mit den nachzuweisenden bzw. zu untersuchenden Antigenen bzw. Antikörpern speziesspezifisch reagieren. Die Analyse der Markierungen der einzelnen Trägerpartikei erfolgt mit Hilfe von speziell für Partikelmessungen abgestimmten Durchflußzytometem. Aus dieser Analyse kann auf die Beschaffenheit bzw. auf das Vorhandensein von zu untersuchenden Antigenen bzw. Antikörpern rückgeschlossen werden. Durch geeignete Auswahl der Antikörper bzw. Antigene, mit denen die verwendeten Trägerpartikel beladen sind, können vorbestimmte gewünschte Eigenschaften der zu untersuchenden Flüssigkeit bzw. ihrer Inhaltsstoffe untersucht werden. Je nachdem, welche Antigene bzw. Antikörper in der zu untersuchenden Flüssigkeit nachgewiesen bzw. analysiert werden sollen, können Testpartikel, die mit entsprechend korrespondierenden Antikörpern bzw. Antigenen beladen sind, verwendet werden.
Im vorliegenden Text werden mit "Probensubstanz(en)" die zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Biomoleküle bzw. Wirkstoffe bezeichnet. Hierbei steht der Begriff "Biomoleküle" für alle Moleküle und Molekülfragmente, die natürlicherweise in der belebten und unbelebten Natur vorkommen und entweder durch Isolierungsverfahren oder identische Nachbildung bereit gestellt werden können, insbesondere Moleküle in bzw. aus pflanzlichen und tierischen Zellen, Organen und Organismen, in/aus Prokaryonten, in/aus Pilzen, in/aus Viren und Phagen, aber auch Moleküle wie Virionen, Prione und ähnliche oder Teile davon (z. B. Antigene, Antikörper, DNA, DNA-Fragmente, etc.).
Der Begriff "Wirkstoffe" steht hier für alle Moleküle, die von Menschenhand kreiert und synthetisiert wurden (z. B. synthetische Medikamente).
Mit "Sondenmolekülen bzw. Detektormolekülen" werden diejenigen Biomoleküle und/oder Wirkstoffe bezeichnet, mit denen die Trägerpartikel beladen bzw. beschichtet sind, d.h. die sich auf/an diesen Trägermolekülen befinden.
Mit "Marker- bzw. Reportersubstanz" werden diejenigen Biomoleküle und/oder Wirkstoffe bezeichnet, die eine bekannte, definierte Markierungsgröße aufweisen, welche zur Analyse herangezogen d.h. ausgewertet wird. Als eine solche Markerbzw. Reportersubstanz kommen insbesondere Biomoleküle oder Wirkstoffe in Betracht, die selbst Fluoreszenzaktivität, Phosphoreszenzaktivität, Biolumineszenzaktivität, Chemielumineszenz, Chromophorenaktivität,
Radioaktivität oder Enzymaktivität aufweisen oder die mit Molekülen gekoppelt sind, die eine oder mehrere dieser Aktivitäten aufweisen.
Das im Stand der Technik bekannte Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
- Dispensierung der Mischung aus Partikeln, die mit zweiten Anttkörpem/Antigenen als Sonden- bzw. Detektormoleküle beschichtet sind, in ein Reaktionsgefäß,
- Zugabe einer Flüssigkeit, die die zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden ersten Antigene/Antikörper als Probensubstanz(en) enthält,
- Inkubation,
- Waschen der Trägerpartikel nach Ende der Reaktionszeit zum Entfernen der nicht gebundenen Substanzen und Moleküle,
- Zugabe einer Flüssigkeit mit fluoreszenzmarkierten dritten Antikörpern und/oder Antigenen als Marker- bzw. Reportersubstanz(en), die mit den nachzuweisenden oder zu untersuchenden ersten Antigenen/Antikörpem (d.h. der Probensubstanz(en)) spezies-spezifisch reagieren,
- Inkubation,
- Waschen zum Entfernen der nicht gebundenen Substanzen und Moleküle, und
- Analyse der Markierungen der einzelnen Trägerpartikel mit Hilfe von speziell für Trägerpartikel-Messungen abgestimmten Durchflußzytometem.
Zu Beginn des Analyseverfahrens ist eine Dispensierung der mit den gewünschten Biomolekülen/Wirkstoffen als Sonden- bzw. Detektormolekülen beschichteten Trägerpartikel bzw. -partikelmischung in ein Reaktionsgefäß vorzunehmen. Dieser Pipettierschritt beeinflußt die Qualität des Untersuchungsergebnisses ganz entscheidend, da hiermit die Konzentration der auf den Partikeln befindlichen Sonden- bzw. Detektormolekülen in der Testlösung festgelegt wird. Die Konzentration der auf den Partikeln befindlichen Biomolekülen/Wirkstoffen in der Testlösung hat Einfluß auf die Testeinstellung und das Testniveau und damit auf die Bewertung des untersuchten Probenmaterials. Von der Testeinstellung abweichende Partikelzahlen haben auch Einfluß auf die Zählraten z. B. bei der Analyse in einem Durchflußzytometer.
Werden die zu dispensierenden Trägerpartikel z. B. in wäßrigen Pufferlösungen (z. B. PBS) geliefert, kommt es aufgrund der höheren Dichte der Trägerpartikel (z. B. 1 ,05 g/ml für Trägerpartikel aus Polystyrol) zu einem Sedimentationsprozeß. Vor der Weiterverwendung muß somit eine Homogenisierung der Suspension durchgeführt werden, wobei das Schäumen der Suspension und die Bildung von Luftblasen sorgfältig vermieden werden muß. Im darauffolgenden Prozeß muß darauf geachtet werden, daß eine erneute Sedimentation der Trägerpartikel vermieden wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das bekannte Verfahren derart weiterzuentwickeln, daß die genannten Nachteile vermieden sind und daß eine vereinfachte Verfahrensführung bei gleichzeitig hoher Sensitivität und Spezifität möglich ist.
Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren der eingangs genannten Art, das sich dadurch auszeichnet, daß die mit den Sonden- bzw. Detektormolekülen beladenen Trägerpartikel hinsichtlich Größe und/oder Farbe verschieden sind, und daß in Schritt (d) auch die Größe und/oder Farbe der Trägerpartikel analysiert wird.
"Hinsichtlich Farbe verschieden" bedeutet im vorliegenden Kontext, daß die Trägerpartikel sowohl mit verschiedenen Farbarten bzw. Farbstoffen (z.B. rot, grün, blau) als auch mit verschiedenen Farbintensitäten derselben Farbart/desselben Farbstoffs (z.B. in zehn Intensitätsstufen von hellrot bis dunkelrot) versehen (codiert) sind bzw. sein können. Bei der Analyse der Farbe wird folglich die Farbart und/oder die Farbintensität analysiert. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die mit den Sonden- bzw. Detektormolekülen beladenen bzw. beschichteten Trägerpartikel vordosiert in getrockneter Form bereitgestellt. Ein Labormitarbeiter kann so auf die vordosierte Menge der beschichteten Trägerpartikel zurückgreifen, ohne daß er zunächst in einem aufwendigen Pipettierschritt die Menge der Trägerpartikel genau festlegen müßte. Bei der Untersuchung bzw. dem Nachweis der Probensubstanz(en) ist dieser besonders kritische und fehlerintensive Schritt also nicht mehr notwendig und das Verfahren kann somit auch unter vereinfachten Bedingungen ohne große Expertise durchgeführt werden. Der Schritt der genauen Festlegung der Menge der Trägerpartikel wird im Vorhinein bei der Herstellung entsprechender Testsysteme vorgenommen.
Da die vordosierte Menge an Trägerpartikeln in getrockneter, vorzugsweise in gefriergetrockneter Form bereitgestellt wird, ist zudem eine verlängerte Haltbarkeit der Sonden- bzw. Detektormoleküle gegeben, mit denen die Trägerpartikel beschichtet sind.
Die Bereitstellung der Trägerpartikel in gefriergetrockneter Form ist besonders einfach zu bewerkstelligen und präzise.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl zur Untersuchung der Menge einer bestimmten vorhandenen Probensubstanz ( d.h. Sorte von Biomolekülen bzw. Wirkstoffen) als auch zum Nachweis, ob überhaupt eine bestimmte Probensubstanz (d.h. entsprechende Biomoleküle oder Wirkstoffe) enthalten sind, verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante werden hierfür Trägepartikel eingesetzt, die nicht nur nach Farbe und/oder Größe verschieden sind, sondern die zudem mit unterschiedlichen Sonden- bzw. Detektormolekülen beladen sind. Die vordosierte Menge an Trägerpartikeln mit darauf befindlichen Sonden- bzw. Detektormolekülen kann insbesondere zu diesem Zweck aus mehreren Gruppen von Trägerpartikeln bestehen, wobei sich die einzelnen Gruppen erstens durch die Größe und/oder Färbung (Farbart und/oder Farbintensität) der dazugehörigen Trägerpartikel und zweitens durch die Art der Sonden- bzw. Detektormolekülen auf den Trägerpartikeln voneinander unterscheiden. Mit anderen Worten: die Trägermoleküle jeder einzelnen Gruppe weisen die gleiche Größe und Farbart/Farbintensität auf und sind mit den gleichen Sonden- bzw. Detektormolekülen beladen, die Trägermoleküle zweier Gruppen unterscheiden sich in ihrer Größe und/oder ihrer Farbart und/oder Farbintensität und sie sind mit unterschiedlichen Sonden- bzw. Detektormoleküle beladen. Mit dieser Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Nachweis bzw. eine Untersuchung unterschiedlicher Probensubstanzen in derselben Testflüssigkeit in einem einzigen Untersuchungsdurchgang auf einfachste Art und Weise durchführbar.
Es können hierbei Sonden- bzw. Detektormoleküle eingesetzt werden, die zu der/den Probensubstanzen und/oder zu der/den Marker- bzw. Reportersubstanz(en) komplementär sind. Als komplementär werden dabei derartige Sonden- bzw. Detektormoleküle (d.h. Biomoleküle oder Wirkstoffe) bezeichnet, die über eine Affinitäts- bzw. Hybridisierungsreaktion und/oder kovalente Reaktion weitere Probensubstanz(en) (Biomoleküle und/oder Wirkstoffe) binden.
Um zu prüfen, ob in einer Flüssigkeitsprobe eine bestimmte Sorte Probenmoleküle (d.h. Biomoleküle bzw. Wirkstoff) überhaupt enthalten ist, werden vorzugsweise. Trägerpartikel mit Sonden- bzw. Detektormolekülen eingesetzt, die mit den gegebenenfalls nachzuweisenden Probensubstanzen reagieren (würden).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch unter Ausnutzung einer kompetitiven Reaktion durchgeführt werden. Hierbei sind die Probensubstanz(en) und die Sonden- bzw. Detektormolekülen sehr ähnlich oder sogar gleich und die Markerbzw. Reportersubstanzen sind komplementär zu den Probensubstanzen und/oder den Sonden- bzw. Detektormolekülen. Bei der kompetitiven Reaktion konkurrieren die Probensubstanz(en) mit den Sonden- bzw. Detektormoleküle um die Bindung zu der markierten komplementären Marker- bzw. Reportersubstanz. Ist kein Probensubstanzteilchen in der Flüssigkeit enthalten, binden alle Marker- bzw. Reportersubstanzteilchen an die Sonden-/Detektormoleküle und damit an die Trägerpartikel und werden detektiert. Sind andererseits viele Probensubstanzteilchen vorhanden, binden alle Marker- bzw. Reportersubstanzteilchen an die Probensubstanzteilchen und nicht an die Sonden- /Detektormoleküle und somit nicht an die Trägerpartikel und werden infolgedessen nicht detektiert.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die vordosierten und getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikel als Presslinge bereitgestellt. Mit anderen Worten: es werden Presslinge verwendet, die die getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikel in vordosierter Form enthalten. Diese Presslinge sind leicht zu handhaben und können in beliebigen Reaktionsgefäßen eingesetzt werden.
Eine Weiterbildung dieser Verfahrensvariante sieht vor, daß verschiedene Gruppen von Pressungen verwendet werden, die sich durch die unterschiedliche Beladung der darin enthaltenen Trägerpartikel mit Sonden- bzw. Detektormolekülen unterscheiden, wobei die Trägerpartikel jedes einzelnen Presslings mit den gleichen Sonden- bzw. Detektormolekülen beladen sind.
Beispielsweise kann für einen infektionsserologischen Test während der Schwangerschaft (sog. Schwangerschaftspanel") ein einziger Pressung bereitgestellt werden, der verschieden große und/oder verschieden farbige Trägerpartikel enthält, die mit Sonden- bzw. Detektormolekülen für die Antigene und/oder Antikörper von Röteln, Toxoplasmose, CMV, HSV, VZV, Parvovirus u.a. beladen sind, wobei jede Trägerpartikelspezies mit einer bestimmten Sonden- bzw. Detektormolekülspezies beladen ist.
Gleichermaßen gut kann beispielsweise für einen infektionsserologischen Test zur Impfkontrolle ein Set von mehreren Pressungen bereitgestellt werden wobei jeder Pressung nur eine einzige, bestimmte Gruppe von Trägerpartikeln beladen mit einer bestimmten Art Sonden- bzw. Detektormolekül z.B: für die Antigen und/oder Antikörper von Tetanus, Diphtherie, Pertussis u.ä enthält. Diese einzelnen Presslinge können dann individuell je nach Fragestellung zusammengemischt werden.
Die vordosierten, getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikel können ebensogut unverpresst in Reaktionsgefäßen wie z.B. Mikro-Titerplatten oder Röhrchen bereitgestellt werden, und diese Reaktionsgefäße können dann ohne weitere zusätzliche Maßnahmen direkt zur Analyse der zu untersuchenden Flüssigkeit eingesetzt werden. Der Laborant muß nur noch die zu untersuchende Flüssigkeit in dieses Reaktionsgefäß einfüllen, um sie mit der vordosierten und damit bekannten Menge an gefriergetrockneten Trägerpartikeln in Kontakt zu bringen, ein Umfüllprozeß oder eine Mengenbestimmung ist nicht mehr notwendig.
Als definierte Markierungsgröße für die Probensubstanz(en) in der Flüssigkeit wird ein Fluoreszenzfarbstoff vorgeschlagen, so daß in Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens infolgedessen die Fluoreszenz ausgewertet wird.
Besonders vorteilhaft läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch vereinfachen, daß die vordosierten, mit Sonden- bzw. Detektormolekülen beladenen Trägerpartikel zusammen mit einer vordosierten Menge an Marker- bzw. Reportersubstanz(en) in getrockneter bzw. gefriergetrockneter Form bereitgestellt werden. Die Marker- bzw. Reportersubstanz(en) weist/weisen hierbei die Eigenschaft auf, mit der zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Probensubstanz(en) spezies-spezifisch zu reagieren. Sie kann/können aus einer oder mehreren Komponenten bestehen, und sie kann/können eine oder mehrere zu den Sonden- bzw. Detektormolekülen und/oder Probensubstanz(en) komplementäre Strukturen aufweisen.
Bei einem solchen Verfahren, in der markierte Marker- bzw. Reportersubstanz(en) bereits mit den vordosierten Trägerpartikeln bereitgestellt werden, ist eine weitere Verringerung der Fehlerquote durch Einsparung eines weiteren Dispensierschrittes gewährleistet. Zusätzlich wird das Prozedere durch Reduktion der Anzahl der Verfahrensschritte weiter vereinfacht, denn im Gegensatz zu den oben geschilderten Verfahrensschritten des Standes der Technik sind bei dieser Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens nur noch die Zugabe einer Flüssigkeit, die ggf. die zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Probensubstanz(en) enthält, und die Analyse der Markierungen der einzelnen Trägerpartikel z. B. mit Hilfe von speziell für Partikelmessungen abgestimmten Durchflußzytometem notwendig.
Gegenstand vorliegender Erfindung ist auch ein Testsystem (Kit) zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Untersuchungs- und/oder Nachweisverfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es hinsichtlich Größe und/oder Farbe (Farbart und/oder Farbintensität) verschiedene Gruppen von mit Sonden- bzw. Detektormolekülen beladene Trägerpartikel umfaßt, die in getrockneter Form vordosiert vorliegen.
Die Kodierung der Trägerpartikel hinsichtlich der Farbe geschieht vorzugsweise in bekannter Weise durch Einbringen von einem oder mehreren Fluorophoren eventuell in unterschiedlichen Konzentrationen in die Trägerpartikel oder durch Anhängen von einem oder mehreren, gleichartige oder verschiedenartigen fluoreszierenden(n) Nanopartikel an die Oberfläche der Trägerpartikel. Dieses erfindungsgemäße Testsystem (Kit) kann von einem Laboranten ohne Pipettier- oder Dispensierschritt direkt verwendet werden, so daß in beschriebener Weise eine wesentliche Fehlerquelle reduziert ist. Solche Testsysteme (Kits) können in großen Mengen im Vorhinein hergestellt und als solche z. B. vertrieben werden.
Vorzugsweise liegen die Trägerpartikel in dem Testsystem (Kit) in gefriergetrockneter Form vor.
Das Testsystem kann hinsichtlich Größe und/oder Farbe verschiedene Gruppen von Trägerpartikeln umfassen, wobei die Trägerpartikel einer jeden Gruppe mit gleichartigen Sonden- bzw. Detektormoleküle beladen sind und die Trägerpartikel verschiedener Gruppen unterschiedliche Sonden- bzw. Detektormoleküle tragen. Die getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikeln liegen in dem Testsystem vorzugsweise entweder vordosiert in Form von einem oder mehreren Pressling(en) oder unverpresst vordosiert in einem Reaktionsgefäß vor.
Bei einer Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Testsystems ist vorgesehen, daß es zusätzlich wenigstens eine Marker- bzw. Reportersubstanz umfaßt, die mit zu untersuchenden Probensubstanz(en) spezies-spezifisch reagieren kann. Diese Marker- bzw. Reportersubstanz kann insbesondere eine Fluoreszenzaktivität, Phosphoreszenzaktivität, Biolumineszenzaktivität,
Chemielumineszenzaktivität, Chromophorenaktivität, Radioaktivität oder Enzymaktivität aufweisen.
Die Marker- bzw. Reportersubstanz(en) ist/sind vorzugsweise entweder in den Pressungen oder in den mit den Trägerpartikel befüllten Reaktionsgefäßen mit enthalten und kann/können aus einer oder mehreren Komponenten bestehen.
Für diese besonderen Ausführungsformen des Testsystems (Kits) bestehen die oben bereits für das erfindungsgemäße Verfahren beschriebenen Vorteile in analoger Weise.
Alle erfindungsgemäßen Testsysteme (Kits) werden vorzugsweise an zentraler Stelle hergestellt und von dort vertrieben, so daß sie nach Erwerb im Labor ohne zusätzlichen Dispensier- oder Pipettierschritt direkt für die gewünschten Untersuchungen eingesetzt werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Testsystem wird im folgenden anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Dabei versteh sich von selbst, daß die in den Beispielen beschriebene Vorgehensweise bei der betreffenden Untersuchung dem Prinzip nach auch für jede andere Untersuchung einer Flüssigkeitsprobe hinsichtlich darin befindlicher Probensubstanz(en) gilt. Figur 1 zeigt beispielhaft (denkbar sind natürlich auch andere Temperatur und Druckprofile) den Temperatur- bzw. Druckverlauf bei der Gefriertrocknung bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens für die erfindungsgemäßen Testsysteme (Kits).
Beispiel 1 : Infektionsserologische Untersuchung bei Schwangeren Variante 1
Um Informationen über das Vorhandensein und/oder die Beschaffenheit bestimmter Probensubstanz(en), beispielsweise Antigene und/oder Antikörper von Röteln, Toxoplasmose, CMV, HSV, VZV, Parvovirus in der Serumprobe einer schwangeren Frau, zu erhalten, werden unterschiedlich große Trägerpartikel mit unterschiedlichen Sonden- bzw. Detektormoleküle, nämlich Sonden- bzw. Detektormoleküle für diese und eventuell weitere Antigene und/oder Antikörper, beladen, vordosiert, gefriergetrocknet und - entweder unverpresst in einem Reaktionsgefäß oder zu einem Pressung verpresst - bereitgestellt. Zur Analyse dieser Serumprobe greift ein Labormitarbeiter auf ein solches Reaktionsgefäß oder einen solchen Pressung mit einer vordosierten Menge an Trägerpartikeln zurück. Er weiß, wieviele Trägerpartikel und damit Sonden- bzw. Detektormoleküle er einsetzt, und für welche der zu untersuchenden bzw. möglicherweise nachzuweisenden Probensubstanz(en) die Sonden- bzw. Detektormoleküle spezifisch sind. Der Labormitarbeiter bringt den Pressung oder die unverpresste Menge Trägerpartikel in dem Reaktionsgefäß mit der zu untersuchenden Flüssigkeit, die die Probensubstanz(en) enthält, nämlich mit der Serumprobe, in einem bzw. dem Reaktionsgefäß in Kontakt. Gleichzeitig oder sequentiell fügt er eine bestimmte Menge Marker- bzw. Reportersubstanz(en) hinzu.
Dieser Schritt erübrigt sich, falls die Marker- bzw. Reportersubstanz(en) bereits zusammen mit den mit Sonden- bzw. Detektormolekülen beladenen Trägerpartikeln getrocknet, vordosiert und entweder zu einem Pressung verpresst oder unverpresst in ein Reaktionsgefäß abgefüllt vorliegen. Nach Ablauf der Reaktionszeit sind an die Trägerpartikel unterschiedliche Probensubstanz(en) und gleichartige Marker- bzw. Reportersubstanz gebunden. Durch Analyse der Größe der Trägerpartikel - z.B. in einem für Partikelmessungen abgestimmten Durchflußzytometer - kann auf die Art und durch Analyse der definierten Markierungsgröße(n) der Probensubstanz(en) und/oder Marker- bzw. Reportersubstanz(en) kann auf die Menge Probensubstanz(en) in der zu untersuchenden Flüssigkeit zurückgeschlossen werden.
Zur Entfernung ungebundener Substanzen können am Ende der jeweiligen Reaktionszeiten an sich bekannte Waschschritte durchgeführt werden.
Beispiel 2: Infektionsserologische Untersuchung bei Schwangeren Variante 2
Wie Beispiel 1 , jedoch werden anstelle der verschieden großen Trägerpartikel verschieden farbige, nämlich hinsichtlich Farbeart und/oder Farbintensität verschiedene Trägerpartikel eingesetzt und mit den unterschiedlichen Sondenbzw. Detektormolekülen beladen.
Durch Analyse der unterschiedlichen Farbe bzw. Farbintensität sind die verschiedenen Trägerpartikel und damit die Art (Sorte) der an sie gebundenen Sonden- bzw. Detektormoleküle und die Art (Sorte) der damit detektierten Probensubstanzen(en) nachweisbar, und durch Analyse der definierten Markierungsgröße(n) der Probensubstanz(en) und/oder der Marker- bzw. Reportersubstanz(en) können Rückschlüsse auf die Menge der Probensubstanz(en) in der zu untersuchenden Flüssigkeit gezogen werden
Beispiel 3: Infektionsserologische Untersuchung bei Schwangeren - Variante 3
Wie Beispiel 2, jedoch werden Trägerpartikel eingesetzt, die verschiedene groß und verschieden farbig sind, wobei die Verschiedenfarbigkeit in einer unterschiedlichen Farbart oder einer unterschiedlichen Farbintensität (bei gleiche Farbart) bestehen kann. Trägerpartikel der gleichen Größe und Farbart oder Farbintensität, d.h. der gleiche Codierung, sind mit Sonden- bzw. Detektormolekülen der gleichen Art (Sorte) beladen, Trägerpartikel mit anderer Größe und/oder Farbart und/oder Farbintensität, d.h. mit anderer Codierung, sind mit einer anderen Art (Sorte) von Sonden- bzw. Detektormolekülen beladen.
Durch Analyse der unterschiedlichen Größe und/oder Farbart und/oder Farbintensität sind die verschiedenen Trägerpartikel und damit die Art der an sie gebundenen Sonden- bzw. Detektormoleküle und die Art der damit detektierten Probensubstanzen(en) nachweisbar, und durch Analyse der definierten Markierungsgröße(n) der Probensubstanz(en) und/oder der Marker- bzw. Reportersubstanz(en) können Rückschlüsse auf die Menge der Probensubstanz(en) in der zu untersuchenden Flüssigkeit gezogen werden
Beispiel 4: Nachweis von Probensubstanz(en) ohne Verwednung von Marker- bzw. Reportersubstanz(en)
Zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen (z. B. DNA) können bereits die
Probensubstanz(en), z.B. eine bestimmte DNA, fluoreszenzmarkiert sein. Für einen solchen Test wird die nachzuweisende DNA zunächst amplifiziert. Dieser Schritt kann mit bereits fluoreszenzmarkierten Primern erfolgen, so daß die Amplifikate der nachzuweisenden DNA (also der Probensubstanz) bereits einen Fluorophor enthalten.
An die hinsichtlich Größe und Farbe (Farbart und/oder Farbintensität) codierten
Trägerpartikel sind Sonden- bzw. Detektormoleküle, z.B. in Gestalt einer zweiten
(komplementären) DNA gekoppelt. Die fluoreszenzmarkierten Amplifikate der nachzuweisenden DNA ( Probensubstanz(en)) binden direkt an die (zweite)
Sonden- bzw. Detektor-DNA an/auf den Trägerpartikeln.
Der Einsatz von Marker- bzw. Reportersubstanz(en) ist nicht erforderlich. Zur
Durchführung dieses Verfahrens wird deshalb ein Testsystem gemäß Beispiel 5 vorgeschlagen.
Andererseits besteht auch die Möglichkeit, markierte und nicht markierte dritte
DNA-Moleküle als Marker- bzw. Reportersubstanzen einzusetzen, die als Brücke zwischen der Proben-DNA und der Sonden- bzw. Detektor-DNA fungieren. Zur Durchführung dieser Verfahrensvariante eignet sich ein Testsystem gemäß Beispiel 6, nämlich ein Testsystem , das mit Sonden- bzw. Detektor-DNA beladene Trägerpartikel und markierte oder nicht markierte Marker- bzw. Reporter-DNA in getrockneter, vordosierter Form umfaßt.
Beispiel 5: Herstellung und Zusammensetzung eines erfindungsgemäßen Testsystems (Kits) - Variante 1
Eine oder mehrer Sorten Trägerpartikel (,d.h Trägerpartikel mit derselben oder mit verschiedenen Codierungen) werden in definierten Mengen und unter genau überwachten Bedingungen in Reaktionsgefäße dispensiert, wobei vorzugsweise ein spezielles Puffer-Stabilisator-System (z.B. 50 M Phosphatpuffer, 150 mM Natriumchlorid, 0,02 % Natriumazid, 8 g/L Gelatine Hydrolysat, pH 7,4, zusätzlich Gerüstbildner und Hilfsstoffe wie z.B. Saccharose, Phenylalanin) verwendet wird. Falls erforderlich werden die Trägerpartikel mittels Ultraschall und/oder mechanischem Rühren homogenisiert. Anschließend werden diese vordosierten Trägerpartikel mittels Gefriertrocknung oder anderer Trocknungsverfahren getrocknet und damit haltbar und einfacher handhabbar gemacht. Hierbei wird vorzugsweise ein Temperatur- und Druckprofil eingesetzt, wie es der Figur 1 zu entnehmen ist. Je nachdem, für welche Analysen das Testsystem eingesetzt werden soll, werden entweder (a) Trägerpartikel derselben Codierung und beladen mit nur einer Art (Sorte) Sonden- bzw. Detektormoleküle, oder (b) Trägerpartikel derselben Codierung aber beladen mit verschiedenartigen (verschiednen Sorten) Sonden- bzw. Detektormolekülen oder (c) Trägerpartikel verschiedener Codierung und pro Codierung beladen mit nur einer Art (Sorte) Sonden- bzw. Detektormolekülen verwendet.
Nach der Trocknung/Gefriertrocknung können diese mit Sonden- bzw. Detektormolekülen beladenen Trägerpartikel zu Pressungen geformt werden, wobei diese Presslinge jeweils eine vorbestimmte Menge Trägerpartikel enthalten. lm Falle von Pressungen, die nur eine Sorte von Trägerpartikeln mit bestimmter Größe und bestimmter Farbart und/oder Farbintensität, d.h. die nur Trägerpartikel derselben Codierung enthalten, und wobei diese Trägerpartikel mit nur einer Art (Sorte) komplementärer Sonden- bzw. Detektormolekülen beladen sind, kann die Mischung der Trägerpartikel durch Kombination entsprechender Presslinge in einem Reaktionsgefäß individuell hergestellt werden.
Beispiel 6: Herstellung und Zusammensetzung eines erfindungsgemäßen Testsystems (Kits) - Variante 2
Wie Beispiel 5, jedoch werden die mit den Sonden- bzw. Detektormolekülen beladenen Trägerpartikeln zusammen mit einer definierten Menge Marker- bzw. Reportersubstanz(en) unter Verwendung eines speziellen Puffer-Stabilisator- Systems unter genau überwachten Bedingungen in die Reaktionsgefäße dispensiert, mittels Gefriertrocknung oder anderer Trocknungsverfahren getrocknet und schließlich zu Pressungen verpresst oder unverpresst in Reaktionsgefäße abgefüllt bereitgestellt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung und/oder zum Nachweis der Art und/oder Menge wenigstens einer Probensubstanz, bei dem a) vordosierte Mengen Trägerpartikel bereitgestellt werden, die mit Sondenbzw. Detektormolekülen beladen sind, b) diese beladenen Trägerpartikel in getrockneter Form und vorliegen, c) (i) die Trägerpartikel mit einer Flüssigkeit, die die zu untersuchende(n) bzw. nachzuweisende(n) Probensubstanz(en) enthält, in Kontakt gebracht werden, wobei die Probensubstanz(en) mit einer und/oder mehreren definierten Markierungsgrößen markiert sind, oder
(ii) die Trägerpartikel mit Probensubstanz(en) und mit Marker- bzw. Reportersubstanz(en), die sich in derselben oder in verschiedenen Flüssigkeiten befinden, gleichzeitig oder sequenziell in Kontakt gebracht werden, und d) nach einer oder mehreren Reaktionszeiten, während der die miteinander in Kontakt gebrachten Probensubstanz(en) und Sonden- bzw. Detektormoleküle und Marker- bzw. Reportersubstanz(en) binden können, wenigstens eine Markierungsgröße analysiert wird, aus der auf die Art und/oder Menge der Probensubstanz(en) geschlossen werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß die mit den Sonden- bzw. Detektormolekülen beladenen Trägerpartikel hinsichtlich Größe und/oder Farbe (Farbenart und/oder Farbenintensität) verschieden sind, und daß in Schritt (d) auch die Größe und/oder Farbe der Trägerpartikel analysiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerpartikel gefriergetrocknet sind.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nach Farbe und/oder Größe verschiedenen Trägerpartikel mit unterschiedlichen Sonden- bzw. Detektormolekülen beladen sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikel als Presslinge bereitgestellt werden.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 3 und 4, bei dem verschiedene Gruppen von Pressungen verwendet werden, die sich durch die unterschiedliche Beladung der darin enthaltenen Trägerpartikel mit Sonden- bzw. Detektormolekülen unterscheiden, wobei die Trägerpartikel jedes einzelnen Presslings mit den gleichen Sonden- bzw. Detektormolekülen beladen sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die getrockneten bzw. gefriergetrockneten Trägerpartikel in Reaktionsgefäßen vordosiert bereitgestellt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die definierte Markierungsgröße der Probensubstanz(en) ein Fluoreszenzfarbstoff ist und in Schritt d) die Fluoreszenz ausgewertet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Marker- bzw. Reportersubstanz Fluoreszenzaktivität, Phosphoreszenzaktivität, Biolumineszenzaktivität, Chemielumineszenz, Chromophorenaktivität, Radioaktivität oder Enzymaktivität aufweist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die vordosierten, mit Sonden- bzw. Detektormolekülen beladenen Trägerpartikel zusammen mit einer vordosierten Menge an Marker- bzw. Reportersubstanz(en), die dazu geeignet ist/sind, mit der zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Probensubstanz(en) spezies-spezifisch zu reagieren, in getrockneter bzw. gefriergetrockneter Form bereitgestellt werden
10. Testsystem zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es hinsichtlich Größe und/oder Farbe verschiedene Gruppen von mit Sonden- bzw. Detektormolekülen beladene Trägerpartikel umfaßt, die in getrockneter Form vordosiert vorliegen.
11. Testsystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerpartikel derselben Gruppe mit gleichartigen Sonden- bzw. Detektormoleküle beladen sind und die Trägerpartikel verschiedener Gruppen unterschiedliche Sonden- bzw. Detektormoleküle tragen.
12. Testsystem nach einem der Ansprüche 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerpartikel gefriergetrocknet vorliegen.
13. Testsystem nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die getrockneten Trägerpartikeln vordosiert in Form von einem oder mehreren Pressling(en) vorliegen.
14. Testsystem nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die getrockneten Trägerpartikeln vordosiert in einem Reaktionsgefäß vorliegen.
15. Testsystem nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich wenigstens eine Marker- bzw. Reportersubstanz umfaßt.
16. Testsystem nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Markerbzw. Reportersubstanz Fluoreszenzaktivität, Phosphoreszenzaktivität, Biolumineszenzaktivität, Chemielumineszenz, Chromophorenaktivität, Radioaktivität oder Enzymaktivität aufweist.
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