CN113341132B - 一种多重信号放大系统及其在酶联免疫斑点法检测中的应用 - Google Patents

一种多重信号放大系统及其在酶联免疫斑点法检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用多重信号放大系统进行酶联免疫斑点法的检测的方法，包括下述步骤：(1)固相基质上固定包被抗体或者抗原；(2)加入待检测细胞，或同时加入待检测细胞和细胞刺激物，作用一段时间；(3)加入抗体‑DNA/RNA连接链或者加入抗原‑DNA/RNA连接链，作用一定时间；(4)加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；(5)加入连接有修饰物a的DNA/RNA检测链，反应一定时间；(6)加入连接有结合物b的酶；(7)加入酶的底物；(8)定量分析固相基质上所形成的具有检测信号的免疫斑点的数量。本发明检测方法具有信号多重放大、检测限低、灵敏度更高、操作简便等优点。

Description

一种多重信号放大系统及其在酶联免疫斑点法检测中的应用
技术领域
本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种基于DNA/RNA互补配对的多重信号放大系统及其在酶联免疫斑点法检测中的应用。
背景技术
免疫斑点法是指将抗体结合到PVDF、醛基化多孔板等固相载体上，然后利用抗原抗体特异性结合检测细胞所分泌的细胞因子等物质的免疫学检测方法。酶联免疫斑点法(ELISPOT)是最常用的免疫斑点法，通过显色反应，在待检测细胞分泌可溶性蛋白等物质的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在仪器下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌特定物质的细胞的数量。传统的ELISPOT检测方法的检测灵敏度受限于酶和底物显色时的放大效果。为了提高传统ELISPOT检测方法的灵敏度，本发明采用DNA互补配对及相应的放大系统制备了一种检测灵敏度高的多级多重信号放大系统，并将其应用于酶联免疫斑点法的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行酶联免疫斑点法检测的方法，包括下述步骤：
(1)固相基质上固定包被抗体或者抗原；
(2)加入待检测细胞，或同时加入待检测细胞和细胞刺激物，作用一段时间；
(3)去除待检测细胞和/或细胞刺激物并洗涤；加入抗体-DNA/RNA连接链或者加入抗原-DNA/RNA连接链，作用一定时间；
(4)加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；
(5)加入修饰物a修饰的DNA/RNA检测链，反应一定时间；
(6)加入可与修饰DNA检测链上的修饰物a特异性结合的结合物b连接的酶；
(7)加入酶的底物进行反应；
(8)定量分析固相基质上所形成的具有检测信号的免疫斑点的数量。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，在固相基质上包被抗体或抗原后，加入封闭液进行封闭。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述待检测细胞包括但不限于人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述细胞刺激物为与细胞作用后可使细胞分泌抗原或抗体的物质。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述待检测细胞为未经刺激物刺激的待检测细胞，或已经和刺激物作用过的待检测细胞。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用可行的连接基团。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体/抗原-DNA/RNA连接链中，每个抗体/抗原分子连接一个或多个连接中间体。
本发明优选的技术方案中，所述抗体或抗原与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体/抗原-DNA/RNA连接链中，每个连接中间体连接1个或多个DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，所述用于连接抗体或抗原和DNA/RNA连接链的连接中间体中的两种官能团的比例为一比一、一比多中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述两种官能团不同时为相同的官能团。
本发明的优选技术方案中，步骤(4)中，可先连接一级DNA/RNA放大链，连接后再加入二级DNA/RNA放大链，根据需要连接更多级别DNA/RNA放大链。
本发明优选的技术方案中，所述检测信号可以连接于DNA/RNA检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
本发明优选的技术方案中，与检测链连接的修饰物a可以与酶上的结合物a特异性结合。
本发明优选的技术方案中，所述检测信号包括但不限于底物显色、底物沉积显色形成斑点、荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中可含有碱基重复单元。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(5≤n≤200)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(5≤n≤200)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(5≤n≤200)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(5≤n≤200)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(5≤n≤200)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(5≤n≤200)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(5≤n≤200)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(5≤n≤200)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(5≤n≤200)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(5≤n≤200)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(5≤n≤200)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(5≤n≤200)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(5≤n≤200)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(5≤n≤200)。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
修饰物-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
修饰物-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
修饰物-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
修饰物-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
修饰物-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
修饰物-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
修饰物-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
修饰物-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
修饰物-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
修饰物-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明的另一目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行酶联免疫斑点法检测的检测系统，所述检测系统包括可以与包被抗体或包被抗原结合的固相基质、可以与固相基质结合的包被抗体或包被抗原、经过刺激或未经任何刺激可以分泌特定物质的细胞、抗体/抗原-DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、连有修饰物a的DNA/RNA检测链、连有结合物b的酶、可被酶催化显色的底物，其中，多重信号放大系统包括抗体/抗原-DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、连有修饰物a的DNA/RNA检测链、连有结合物b的酶、可被酶催化显色的底物，用于将细胞分泌的信号放大后进行检测。
本发明优选的技术方案中，所述包被抗体或包被抗原、细胞分泌的特定物质、抗体/抗原-DNA/RNA连接链三者可以形成双抗体夹心或者双抗原夹心的结构。
本发明的优选技术方案中，所述固相基质为可吸附包被抗体/抗原或者通过化学键包被抗体/抗原的固相基质。
本发明的优选技术方案中，所述固相基质选自多孔板、PVDF膜、醛基化的固相基质的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述包被抗体或抗原选自任何可与相应抗原或抗体结合，并可被包被于固相基质的抗体或抗原。
本发明的优选技术方案中，所述抗体或抗原可通过化学键、吸附等作用包被于固相基质。
本发明优选的技术方案中，所述细胞包括但不限于人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述细胞刺激物为与细胞作用后可使细胞分泌任何抗原或抗体的物质。
本发明优选的技术方案中，所述待检测信号可以连接于DNA/RNA检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中可含有碱基重复单元。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(5≤n≤200)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(5≤n≤200)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(5≤n≤200)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(5≤n≤200)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(5≤n≤200)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(5≤n≤200)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(5≤n≤200)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(5≤n≤200)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(5≤n≤200)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(5≤n≤200)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(5≤n≤200)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(5≤n≤200)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(5≤n≤200)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(5≤n≤200)。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
修饰物-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
修饰物-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
修饰物-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
修饰物-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
修饰物-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
修饰物-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
修饰物-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
修饰物-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
修饰物-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
修饰物-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明的另一目的在于提供一种多重信号放大系统，所述多重信号放大系统包括可以显色的底物、连有结合物b的酶、连有修饰物a的DNA/RNA检测链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、抗体或抗原分子、连接DNA/RNA连接链与抗体或抗原的连接中间体，其中，DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链可互补配对后连接，或者，DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接，其中，各链之间的碱基可互补配对相互连接。
本发明优选的技术方案中，一个抗体或抗原的连接中间体可以连接一条或多条DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，所述连接物b可以和修饰物a特异性结合。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链直接互补配对连接为DNA/RNA检测链的碱基可直接与DNA/RNA连接链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链直接与DNA/RNA连接链互补配对时，互补配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，同时DNA/RNA放大链的部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述DNA/RNA放大链再与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者DNA/RNA放大链部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一级DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，一级DNA/RNA放大链与一条或多条二级DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级DNA/RNA放大链与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，根据需要二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
本发明优选的技术方案中，所述多条放大链为两条及以上放大链。
本发明优选的技术方案中，所述多级放大为两级及以上放大。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA检测链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA连接链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链与DNA/RNA放大链部分片段互补配对时，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，一条DNA/RNA放大链与其他多条放大链的部分片段互补配对时，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，不同级DNA/RNA放大链之间互补配对时(例如，一级连接二级时，二级连接三级时，以此类推)，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链互补配对时，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明的优选技术方案中，DNA/RNA连接链之间、同一级DNA/RNA放大链之间(例如，一级链之间的配对，二级链之间的配对)、DNA/RNA检测链之间的可配对部分碱基长度为0-5个碱基对。
本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中可含有碱基重复单元。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(5≤n≤200)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(5≤n≤200)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(5≤n≤200)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(5≤n≤200)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(5≤n≤200)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(5≤n≤200)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(5≤n≤200)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(5≤n≤200)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(5≤n≤200)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(5≤n≤200)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(5≤n≤200)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(5≤n≤200)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(5≤n≤200)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(5≤n≤200)。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
修饰物-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
修饰物-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
修饰物-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
修饰物-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
修饰物-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
修饰物-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
修饰物-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
修饰物-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
修饰物-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
修饰物-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体两端或中间任意位置双功能化，一官能团连接抗体或抗原上对应的官能团，另一官能团连接DNA/RNA连接链上对应的官能团，连接中间体的双官能团中两种官能团的比例为一比一或一比多的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述抗体、抗原、DNA或RNA上用于与连接中间体反应或连接的官能团包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体上的双官能团中的一种官能团与抗原或抗体上的包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体上的双官能团中的另一种官能团可以与DNA/RNA上的包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
本发明优选的技术方案中，所述与连接中间体相连的抗体或抗原分子，一个抗体或抗原分子可连接一个或同时连接多个连接中间体。
本发明优选的技术方案中，所述与连接中间体相连的DNA/RNA连接链，一个一个连接中间体可连接一个或同时连接多个DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，所述检测链连接有修饰物a。
本发明优选的技术方案中，所述修饰物a可以连接于DNA/RNA检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
本发明优选的技术方案中，所述待检测信号选自但不限于底物显色、底物显色形成的斑点、荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统可应用于免疫斑点法的检测中。
本发明的另一目的在于提供一种多重信号放大系统，所述的多重信号放大系统采用DNA/RNA放大链，其中，所述的DNA/RNA放大链可为一条或多条。
本发明的优选技术方案中，所述的DNA/RNA放大链可为一级放大或多级放大。
本发明的优选技术方案中，当DNA/RNA放大链为一条或多条时，DNA/RNA放大链部分片段与DNA/RNA连接链碱基互补配对，同时DNA/RNA放大链的部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明的优选技术方案中，当DNA/RNA放大链为多条时，一条DNA/RNA放大链部分片段与DNA/RNA检测链碱基互补配对，同时与其他多条DNA/RNA放大链部分片段互补配对。
本发明优选的技术方案中，当DNA/RNA放大链为多条时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述DNA/RNA放大链再与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者DNA/RNA放大链部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，当DNA/RNA放大链为多级放大时，DNA/RNA连接链与一级DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，一级DNA/RNA放大链与一条或多条二级DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级DNA/RNA放大链与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA检测链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA连接链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，根据需要二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
本发明优选的技术方案中，所述多条放大链为两条及以上放大链。
本发明优选的技术方案中，所述多级放大为两级及以上放大。
本发明的另一目的在于提供一种DNA/RNA放大链，该放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(5≤n≤200)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(5≤n≤200)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(5≤n≤200)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(5≤n≤200)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(5≤n≤200)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(5≤n≤200)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(5≤n≤200)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(5≤n≤200)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(5≤n≤200)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(5≤n≤200)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(5≤n≤200)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(5≤n≤200)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(5≤n≤200)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(5≤n≤200)。
本发明的另一目的在于提供一种DNA/RNA连接链，该连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明的另一目的在于提供一种DNA/RNA检测链，该检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
修饰物-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
修饰物-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
修饰物-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
修饰物-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
修饰物-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
修饰物-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
修饰物-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
修饰物-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
修饰物-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
修饰物-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明的另一目的在于提供一种多重信号放大系统的制备方法，包括抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备、DNA/RNA放大链的制备。
本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备为抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链相连，其中，所述连接中间体具有双官能团，一官能团与抗体或抗原相连，另一官能团与DNA/RNA连接链相连。
本发明优选的技术方案中，所述抗体或抗原或者DNA/RNA连接链上的用于与连接中间体连接的官能团包括但不限于腙基、氨基、羧基、羟基、巯基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体的双官能团中一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羧基反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羟基的反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羧基结合，另一官能团可与羟基结合；或者一个官能团可与羧基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羟基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或任何其他可行的连接方案。
本发明优选的技术方案中，抗体或抗原上的氨基与连接中间体上的一个官能团反应连接，而DNA/RNA连接链上的巯基与连接中间体上的另一个官能团反应连接。
本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备包括下述步骤：
(1)将抗原或抗体、连接中间体，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-连接中间体；
(2)将抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，抗体或抗原、连接中间体的摩尔比为1:0.05-1:1000，优选为1:0.1-1:100。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，反应温度为1-25℃，优选为2-8℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，抗原或抗体-连接中间体可通过脱盐离心柱或者超滤或者透析进行纯化。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链的摩尔比为1:0.05-1:1000，优选为1:0.1-1:100。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，反应温度为1-25℃，优选为2-8℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述的抗原或抗体-DNA/RNA连接链可采用超滤离心纯化或透析纯化。
本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链连接成功的验证方法，包括使用质谱进行验证。
本发明优选的技术方案中，所述质谱选自基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)、电喷雾离子化质谱(ESI-MS)的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(5≤n≤200)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(5≤n≤200)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(5≤n≤200)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(5≤n≤200)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(5≤n≤200)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(5≤n≤200)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(5≤n≤200)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(5≤n≤200)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(5≤n≤200)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(5≤n≤200)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(5≤n≤200)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(5≤n≤200)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(5≤n≤200)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(5≤n≤200)。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链的制备方法包括下述步骤：
(1)将聚合酶和相应的引物、发卡结构、底物按一定比例混合并反应一定时间；
(2)反应完成后，灭活聚合酶，制得DNA/RNA放大链反应产物；
(3)所得DNA/RNA放大链直接使用或进行纯化后使用。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链合成后不纯化直接使用。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链合成后纯化时所采用的纯化方法包括但不限于切胶回收、高效液相色谱法，凝胶渗透色谱法、离子交换色谱法、超滤离心、透析、沉淀法、结晶法等纯化方法中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明的另一目的在于多重信号放大系统在酶联免疫斑点法检测中的应用。
本发明的另一目的在于多重信号放大检测系统在酶联免疫斑点法检测中的应用。
本发明中，“DNA/RNA”是指DNA或RNA。
本发明中，“抗体/抗原”是指抗体或抗原。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明通过DNA/RNA连接链和一条或多条DNA/RNA放大链连接，DNA/RNA放大链与多个DNA/RNA检测链连接，实现信号一级多重放大；甚至，DNA/RNA放大链还可与多个DNA/RNA放大链连接，实现二级或二级以上的多重放大，本发明不仅实现了待检测细胞被激活后的单细胞水平的检测，并且很大程度地增强了酶联免疫斑点法的检测灵敏度。在目标分子密度较低的情况下，可实现信号放大，节约成本。
2、本发明可量化偶联到每个抗原或抗体上的DNA/RNA连接链的数量。
3、本发明放大链的制备方法具有通用性，可以用于设计和制备任意所需长度的放大链。
附图说明
图1抗体与DNA/RNA连接链的连接过程。抗体与连接中间体反应连接；抗体-连接中间体偶联物与DNA/RNA连接链反应结合；抗体与DNA/RNA连接链连接成为抗体-DNA/RNA连接链。
图2本发明所述检测系统信号放大的原理机制。其中图a表示一级多重信号放大系统示意图，图b表示二级多重信号放大系统示意图。(1)引物Z*-A、发夹结构和底物在酶的催化下，引物不断循环生成长链复合物1:Z*-AAAA…AA；(2)长链复合物1与抗体上的DNA/RNA连接链Z结合；(3)连接有修饰物的检测链A*A*与已经连接到抗体上的长链复合物1结合上；(4)连接有酶的结合物与修饰物特异性结合后，与底物相互作用实现成像检测；(5)与步骤1同理，引物在A*A*-B和发夹在酶的催化下，引物不断循环生成长链复合物2:A*A*-BBBB…BB；(6)长链复合物2与已经连接到抗体上的长链复合物1结合；(7)连接有修饰的检测链B*B*与已经连接到抗体上的长链复合物2结合；(8)连接有酶的结合物与修饰物特异性结合后，与底物相互作用实现成像检测。
Figure BDA0003103673900000231
代表抗体。
*代表互补链。例如单链DNA或RNA：A链表示某一DNA或RNA的序列，那么A*表示A链的互补链的序列。
Figure BDA0003103673900000241
与检测链相连的修饰物
Figure BDA0003103673900000242
连接有结合物的酶
图3一级多重放大系统的免疫斑点法检测抗原的流程。(1)在固相基质上包被抗体；(2)加入细胞，待其分泌抗原并与抗体a结合；(3)加入抗体-DNA/RNA连接链，使其与抗原和包被抗体的结合物形成双抗体夹心结构；(4)加入DNA/RNA一级多重放大链进行信号放大；(5)加入连接有修饰物的检测链；(6)加入连接有结合物的酶；(7)加入酶的底物进行成像检测。c,固相基质；d,包被抗体；e,细胞分泌的抗原；f,连接有连接链的检测抗体；g,一级放大链；i,连接有修饰物的检测链；j,连接有结合物的酶；k,酶催化底物后形成的斑点。
图4二级多重放大系统的免疫斑点法检测抗原的流程。
(1)在固相基质上包被抗体；(2)加入细胞，待其分泌抗原并与抗体a结合；(3)加入抗体-DNA/RNA连接链，使其与抗原和包被抗体的结合物形成双抗体夹心结构；(4)加入DNA/RNA一级多重放大链进行信号放大；(5)加入DNA/RNA二级多重放大链进行信号放大；(6)加入连接有修饰物的检测链；(7)加入连接有结合物的酶；(8)加入酶的底物进行成像检测。c,固相基质；d,包被抗体；e,细胞分泌的抗原；f,连接有连接链的检测抗体；g,一级多重放大链；h,二级多重放大链；i,连接有修饰物的检测链；j,连接有结合物的酶；k,酶催化底物后形成的斑点。
图5采用一级多重放大系统的酶联免疫斑点法检测被激活后可以分泌TNF-α的细胞数量与采用传统ELISPOT法检测被激活后可以分泌TNF-α的细胞数量。*：P＜0.05。
图6采用二级多重放大系统的酶联免疫斑点法检测被激活后可以分泌TNF-α的细胞数量与采用传统ELISPOT法检测被激活后可以分泌TNF-α的细胞数量。*：P＜0.05。
具体实施方式
下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明的实施例在免疫斑点法检测过程中检测的是抗原并且形成了双抗体夹心的结构，在实际应用过程中也可以检测抗体并形成双抗原夹心的结构。
本发明的实施例中修饰物a为生物素，结合物b为链亲和素，所采用的酶为碱性磷酸酶，底物为BCIP/NBTplus底物，在实际应用过程中也可以采用其他的修饰物a，其他的结合物b，其他的酶或者底物。
本发明实施例1-2中DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链的序列信息详见表1-表6。
表1.DNA连接链序列
DNA连接链编号 DNA连接链序列(从5'端到3'端)
连接链1 AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC
连接链2 TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG
连接链3 AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC
连接链4 GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG
连接链5 GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT
连接链6 CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC
表2.DNA放大链序列
Figure BDA0003103673900000251
Figure BDA0003103673900000261
表3.用于信号检测的检测链序列
检测链编号 检测链序列(从5'端到3'端)
i.1* 修饰物-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T
i.2* 修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T
i.3* 修饰物-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T
i.4* 修饰物-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T
i.5* 修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T
i.6* 修饰物-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T
i.7* 修饰物-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T
i.8* 修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T
i.9* 修饰物-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T
i.10* 修饰物-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T
i.11* 修饰物-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T
i.12* 修饰物-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T
表4.用于制备DNA信号放大链的引物和发夹结构序列
Figure BDA0003103673900000262
Figure BDA0003103673900000271
表5.实施例1中可用于一级多重放大系统免疫斑点检测的连接链、放大链、检测链信息
检测抗原 连接链 放大链 检测链
IL-2 连接链1 C.1 i.1*
TGF-β 连接链2 C.2 i.2*
INF-γ 连接链3 C.3 i.3*
TNF-α 连接链4 C.4 i.4*
IL-10 连接链5 C.5 i.5*
IL-6 连接链6 C.6 i.6*
表6.实施例2中可用于二级多重放大系统免疫斑点检测的连接链、放大链、检测链信息
检测抗原 连接链 放大链 检测链
IL-2 连接链1 C.1(一级放大链)+C.7(二级放大链) i.7*
TGF-β 连接链2 C.2(一级放大链)+C.8(二级放大链) i.8*
INF-γ 连接链3 C.3(一级放大链)+C.9(二级放大链) i.9*
TNF-α 连接链4 C.4(一级放大链)+C.10(二级放大链) i.10*
IL-10 连接链5 C.5(一级放大链)+C.11(二级放大链) i.11*
IL-6 连接链6 C.6(一级放大链)+C.12(二级放大链) i.12*
对比例1采用传统ELISPOT方法检测TNF-α
(1)将包被抗体a(Anti-human TNF-αcapture antibody)用PBS缓冲液稀释至10μg/mL后包被至96孔板，并在4℃放置16小时。
(2)去除包被抗体a并用PBS缓冲液洗涤3遍，加入封闭液(1％BSA in PBS)，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液，用RPMI-1640培养基将人外周血单个核细胞(HPBMC)稀释至5×105/mL，将100μL稀释后的HPBMC与刺激物(20μg/mL PHA和20μg/mL LPS)混合并加入相应的孔中，在37℃，5％CO2条件下孵育16小时。
(4)去除细胞并用洗涤缓冲液(0.1％tween-20 in PBS)洗涤6遍，加入检测抗体b(Anti-human TNF-αdetection antibody)，用封闭液将检测抗体稀释至2μg/mL，并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤6遍，同时将链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶在PBS缓冲液中1:1000稀释，并将稀释后的链霉亲和素加入相应的孔中，室温孵育45分钟。
(6)去除链霉亲和素并用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用PBS缓冲液洗3遍，将BCIP/NBTplus底物(一片稀释于10mL的超纯水中)加入相应的孔中，室温孵育15分钟。
(7)去除底物，用水冲洗96孔板，并将96孔板在黑暗中晾干，进行检测分析。实验结果见图5和图6。
实施例1采用一级多重放大系统和酶联免疫斑点法检测抗原
在本实施例中，将一级多重放大系统应用于免疫斑点法检测被激活后可以分泌抗原TNF-α的细胞数量。
一、抗体和DNA连接体的制备
(1)将抗体(Anti-human TNF-αantibody)通过超滤离心管(100kDa MWCO)浓缩到2mg/mL，去除掉叠氮化物和其他防腐剂。
(2)通过脱盐离心柱(7000Da MWCO)将抗体交换至PBS缓冲液中(pH 7.4)。
(3)抗体与LC-SMCC(琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸盐])(摩尔比1:20)在4℃下反应3小时。
(4)通过脱盐离心柱(7000Da MWCO)去除多余的连接中间体。
(5)将已经与连接中间体相连接的抗体与纯化后的DNA连接链(AAATTCCTCTACCACCTACATCAC，摩尔比1:15)混合，4℃下反应12小时。
(6)通过超滤离心管(100kDa MWCO)纯化并浓缩抗体-DNA连接链。
(7)抗体与DNA连接链连接成功的验证：使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALD I-TOF)验证是否成功地将DNA连接链偶联到抗体上，并量化偶联到每个抗体上的DNA的数量。结果显示，每个抗体上连接上了1个DNA连接链。
二、DNA一级放大链的制备(以C.1放大链的制备为例)
(1)在100μL PBS反应液中分别加入10mM MgSO4，80units/ml的聚合酶，600μM的dATP/dCTP/dTTP，10μM发卡结构(h.1.1)和10μM相应的引物(p.1)，将反应液置于37℃反应9小时。
(2)反应完成后将反应液置于80℃作用20分钟以灭活酶。
(3)将反应产物与蛋白上样缓冲液(含30mM乙二胺四乙酸，50％甘油，0.25％二甲苯青，0.25％溴酚蓝)按照体积比9:1混合后，在95℃反应5分钟。
(4)制备6％TBE-UREA PAGE胶(还可用1％琼脂糖凝胶)，采用gelred为染料。
(5)凝胶放入电泳液中，将电压调至75V，运行30分钟，然后在泳道中分别加入样品和DL 1000 DNA marker，将电压调至200V，运行25分钟，结果如图5所示。
(6)将目的DNA条带从凝胶中切下，通过DNA回收试剂盒进行纯化回收，回收后的DNA进行冻干，-20℃进行保存。
三、采用免疫斑点法检测抗原
(1)将包被抗体(anti-human TNF-αcapture antibody)用PBS缓冲液稀释至10μg/mL，并包被至96孔板，4℃16小时。
(2)去除包被抗体并用PBS缓冲液洗涤3遍，加入封闭液(1％BSA in PBS)，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液，用RPMI-1640培养基将人外周血单个核细胞(HPBMC)稀释至5×105/mL，将100μL稀释后的HPBMC与刺激物(20μ/mL PHA和20μ/mL LPS)混合并加入相应的孔中，在37℃含5％CO2条件下孵育16小时。
(4)去除细胞并用洗涤缓冲液(0.1％tween-20 in PBS)洗涤6遍，加入检测抗体(anti-human TNF-αdetection antibody)-DNA连接链，(TNF-α抗体连接DNA连接链4)，用封闭液将检测抗体稀释至2μg/mL，并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤6遍，再用杂交洗涤缓冲液(15％甲酰胺,1mM EDTA)洗涤1遍，并加入DNA放大链C.4(60nM-150nM)，37℃孵育1.5h。
(6)去除DNA一级放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液(500mMNaCl in 1mM Tris-HCl)洗涤1遍，检测链i.4*(1μM)并于室温反应1小时，i.4*检测链连接有生物素(Biotin)。
(7)去除检测链并用洗涤缓冲液洗涤3遍，同时将链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶在PBS缓冲液中1:1000稀释，并将稀释后的链霉亲和素修饰的酶加入相应的孔中，室温孵育45分钟。
(8)去除链霉亲和素并用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用PBS缓冲液洗3遍，将BCIP/NBTplus底物(一片稀释于10mL的超纯水中)加入相应的孔中，室温孵育15分钟。
(9)去除底物，用水冲洗96孔板，并将96孔板在黑暗中晾干，进行检测分析。
四、实验结果
结果如图5所示。将本发明所述一级多重放大系统与酶联免疫斑点法结合可以检测分泌抗原(细胞因子)的细胞数量。与传统酶联免疫斑点法(ELISPOT)法相比，本发明所述的一级多重信号放大系统修饰的免疫斑点法可以在相同的情况下可以检测出更多的斑点即可以检测出更多分泌细胞因子的细胞，说明本发明所述的免疫斑点法与传统的ELISPOT法相比灵敏度更高。
实施例2采用二级多重放大系统和酶联免疫斑点法检测抗原
在本实施例中，将二级多重放大系统应用于酶联免疫斑点法检测被激活后可以分泌抗原TNF-α的细胞数量。
一、抗体和DNA连接体的制备
本实施例采用以抗体蛋白上的氨基与GMBS(N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯)反应，再利用GMBS与DNA连接链上的巯基相连的方式来将抗体与DNA连接体相连，所使用的连接中间体具有双官能团，一端可与抗体相连，另一端可与DNA相连。具体实验步骤与实施例1相同。
二、信号放大系统中DNA一级放大链的制备
DNA一级放大链的制备过程和具体步骤与实施例1相同。
三、信号放大系统中DNA二级放大链的制备(例如：针对C.4一级放大链，需要制备C.10二级放大链，以下内容为C.10放大链的制备)
(1)在100μL PBS反应液中分别加入10mM MgSO4，80units/ml的聚合酶，600μM的dATP/dCTP/dTTP，10μM发卡结构(h.10.10)和10μM相应的引物(p.10)，将反应液置于37℃反应9小时。
(2)反应完成后将反应液置于80℃作用20分钟以灭活酶。
(3)将反应产物与蛋白上样缓冲液(Loading buffer)按照体积比9:1混合为样品，在95℃反应5分钟。
(4)制备6％TBE-UREA PAGE胶(还可采用1％琼脂糖凝胶)，采用gelred为染料。
(5)凝胶放入电泳液中，将电压调至75V，运行30分钟，之后在泳道中分别加入样品和DL 1000 DNA marker，将电压调至200V，运行25分钟。
(6)将目的DNA条带从凝胶中切下，通过DNA回收试剂盒进行纯化回收，回收后的DNA进行冻干，-20℃进行保存。
四、采用放大系统和免疫斑点法检测多种抗原
(1)将包被抗体(anti-human TNF-αcapture antibody)用PBS缓冲液稀释至10μg/mL，并包被至96孔板，4℃16小时。
(2)去除包被抗体并用PBS缓冲液洗涤3遍，加入封闭液(1％BSA in PBS)，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液，用RPMI-1640培养基将人外周血单个核细胞(HPBMC)稀释至5×105/mL，将100μL稀释后的HPBMC与刺激物(20μ/mL PHA和20μ/mL LPS)混合并加入相应的孔中，在37℃含5％CO2条件下孵育16小时。
(4)去除细胞并用洗涤缓冲液(0.1％tween-20 in PBS)洗涤6遍，加入检测抗体b(anti-human TNF-αdetection antibody)-DNA连接链(TNF-α抗体连接DNA连接链4)，用封闭液将各个检测抗体稀释至2μg/mL，并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除各个检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用杂交洗涤缓冲液(15％甲酰胺,1mM EDTA)洗涤1遍，并加入一级DNA放大链C.4(60nM-150nM)，37℃孵育1.5h。
(6)去除一级DNA放大链，用杂交洗涤液洗涤4次，然后加入与一级DNA放大链部分互补的4种二级DNA放大链C.10(60nM-150nM)，37℃孵育1.5h。
(7)去除二级DNA放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液(500mMNaCl in 1mM Tris-HCl)洗涤1遍，加入DNA检测链i.10*(1μM)，室温反应1小时，i.10*检测链连接有生物素(Biotin)。
(8)去除检测链并用洗涤缓冲液洗涤3遍，同时将链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶在PBS缓冲液中1:1000稀释，并将稀释后的链霉亲和素修饰的酶加入相应的孔中，室温孵育45分钟。
(9)去除链霉亲和素并用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用PBS缓冲液洗3遍，将BCIP/NBTplus底物(一片稀释于10mL的超纯水中)加入相应的孔中，室温孵育15分钟。
(10)去除底物，用水冲洗96孔板，并将96孔板在黑暗中晾干，进行检测分析。
五、实验结果
结果如图6所示。采用本发明所述多级多重放大系统与酶联免疫斑点法结合可以检测被激活后分泌抗原(细胞因子)的细胞数量；而且在相同的条件下，采用多级多重放大系统时可以比采用一级放大系统时和采用传统ELISPOT的方法时检测到更多的斑点，说明采用二级多重信号放大系统时该方法的检测灵敏度更高。与传统酶联免疫斑点法(ELISPOT)法相比，本发明所述的一级多重信号放大系统修饰的免疫斑点法可以在相同的情况下可以检测出更多的斑点即可以检测出更多分泌细胞因子的细胞，说明本发明所述的免疫斑点法与传统的ELISPOT法相比灵敏度更高。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。
序列表
<110> 艾克发（北京）生物技术有限公司
<120> 一种多重信号放大系统及其在酶联免疫斑点法检测中的应用
<150> 2020112536617
<151> 2020-11-11
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<150> 2020112562382
<151> 2020-11-11
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 3'端，反向dT修饰
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<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 33
aaatactctc gggccttttg gcccgagagt atttgagagt att 43
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 34
acaacttaac gggccttttg gcccgttaag ttgtgttaag ttg 43
<210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 35
attcatttac gggccttttg gcccgtaaat gaatgtaaat gaa 43
<210> 36
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 36
acaatcaaaa gggccttttg gcccttttga ttgtttttga ttg 43
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 37
attcttactc gggccttttg gcccgagtaa gaatgagtaa gaa 43
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 38
attttctacc gggccttttg gcccggtaga aaatggtaga aaa 43
<210> 39
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 39
accaataata gggccttttg gccctattat tggttattat tgg 43
<210> 40
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 40
atccttttat gggccttttg gcccataaaa ggatataaaa gga 43
<210> 41
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 41
attattcact gggccttttg gcccagtgaa taatagtgaa taa 43
<210> 42
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 42
atcattactt gggccttttg gcccaagtaa tgataagtaa tga 43

Claims (76)

1.一种利用多重信号放大系统进行非疾病诊断目的的酶联免疫斑点法检测的方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）固相基质上固定包被抗体或者抗原；
（2）单独加入待检测细胞，作用一段时间，去除剩余待检测细胞，洗涤；或同时加入待检测细胞和细胞刺激物，作用一段时间，去除剩余待检测细胞和细胞刺激物，洗涤；
（3）加入抗体-DNA/RNA连接链或者加入抗原-DNA/RNA连接链，作用一定时间；
（4）加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；
（5）加入修饰物a修饰的DNA/RNA检测链，反应一定时间；
（6）加入可与修饰DNA/RNA检测链上的修饰物a特异性结合的结合物b连接的酶；
（7）加入酶的底物进行反应；
（8）定量分析固相基质上所形成的具有检测信号的免疫斑点的数量；
所述DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链为以下序列组合中的一组或多组：
第一组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T；
第二组:
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG，对应放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T;
第三组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC； 对应放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应检测链：修饰物-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T；
第四组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T；
第五组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T;
第六组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第七组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应检测链：修饰物-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T；
第八组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应检测链：修饰物-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T；
第九组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A- (TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A- (TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十一组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十二组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十三组：
DNA连接链：AAATTCCTCTACCACCTACATCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十四组：
DNA连接链：AAATTCCTCTACCACCTACATCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十五组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应一级放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应二级放大链：ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A；对应检测链：修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T;
第十六组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG，对应一级放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应二级放大链：ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A；对应检测链：修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T;
第十七组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC；对应一级放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应二级放大链：GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T;
第十八组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应一级放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应二级放大链：GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A；对应检测链：修饰物-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T
第十九组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应一级放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应二级放大链：GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A；对应检测链：修饰物-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T
第二十组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应二级放大链：TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A；对应检测链：修饰物-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T
第二十一组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应一级放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应二级放大链：TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A；对应检测链：修饰物-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T；
所述n的范围为5≤n≤200；
序列从左到右为序列的5’端到3’端。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，在固相基质上包被抗体或抗原后，加入封闭液进行封闭。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述待检测细胞包括人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒的任一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述细胞刺激物为任何与细胞作用后可使细胞分泌任何抗原或抗体的物质。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，抗体/抗原-DNA/RNA连接链中，每个抗体/抗原分子连接一个或多个连接中间体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗体或抗原与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DNA/RNA连接链与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述抗体/抗原-DNA/RNA连接链中，每个连接中间体连接1个或多个DNA/RNA连接链。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，用于连接抗体或抗原和DNA/RNA连接链的连接中间体中的两种官能团的比例为一比一或一比多。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述两种官能团不同时为相同的官能团。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，先连接一级DNA/RNA放大链，连接后再加入二级DNA/RNA放大链，再连接更多级别DNA/RNA放大链。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测信号连接于DNA/RNA检测链的5’端、3’端或者检测链中间的任何位置。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测信号包括底物显色、底物沉积显色形成斑点、荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
16.一种利用多重信号放大系统进行酶联免疫斑点法检测的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括可以与包被抗体或包被抗原结合的固相基质、可以与固相基质结合的包被抗体或包被抗原、经过刺激或未经任何刺激可以分泌特定物质的细胞、抗体/抗原-DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、连有修饰物a的DNA/RNA检测链、连有结合物b的酶、可被酶催化显色的底物，其中，多重信号放大系统包括抗体/抗原-DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、连有修饰物a的DNA/RNA检测链、连有结合物b的酶、可被酶催化显色的底物，用于将细胞分泌物质的待检测信号放大后进行检测，
所述DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链为以下序列组合中的一组或多组：
第一组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T；
第二组:
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG，对应放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T;
第三组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC； 对应放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应检测链：修饰物-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T；
第四组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T；
第五组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T;
第六组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第七组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应检测链：修饰物-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T；
第八组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应检测链：修饰物-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T；
第九组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A- (TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A- (TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十一组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十二组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十三组：
DNA连接链：AAATTCCTCTACCACCTACATCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十四组：
DNA连接链：AAATTCCTCTACCACCTACATCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十五组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应一级放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应二级放大链：ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A；对应检测链：修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T;
第十六组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG，对应一级放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应二级放大链：ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A；对应检测链：修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T;
第十七组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC；对应一级放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应二级放大链：GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T;
第十八组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应一级放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应二级放大链：GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A；对应检测链：修饰物-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T
第十九组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应一级放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应二级放大链：GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A；对应检测链：修饰物-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T
第二十组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应二级放大链：TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A；对应检测链：修饰物-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T
第二十一组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应一级放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应二级放大链：TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A；对应检测链：修饰物-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T；
所述n的范围为5≤n≤200；
序列从左到右为序列的5’端到3’端。
17.根据权利要求16所述的检测系统，其特征在于，包被抗体或包被抗原、细胞分泌的特定物质、抗体/抗原-DNA/RNA连接链三者可以形成双抗体夹心或者双抗原夹心的结构。
18.根据权利要求16所述的检测系统，其特征在于，所述固相基质为多孔板、PVDF膜、醛基化的固相基质。
19.根据权利要求16所述的检测系统，其特征在于，所述包被抗体或抗原选自可与相应抗原或抗体结合并可被包被于固相基质的抗体或抗原。
20.根据权利要求16所述的检测系统，其特征在于，抗体或抗原可通过化学键、吸附作用包被于固相基质。
21.根据权利要求16所述的检测系统，其特征在于，所述细胞包括人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒的任一种或多种。
22.根据权利要求16所述的检测系统，其特征在于，经过刺激的细胞为经过细胞刺激物刺激的细胞，所述细胞刺激物为与细胞作用后可使细胞分泌任何抗原或抗体的物质。
23.根据权利要求16所述的检测系统，其特征在于，所述待检测信号可以连接于DNA/RNA检测链的5’端、3’端或者检测链中间的任何位置。
24.一种多重信号放大系统，其特征在于，所述多重信号放大系统包括可以显色的底物、连有结合物b的酶、连有修饰物a的DNA/RNA检测链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、抗体或抗原分子、连接DNA/RNA连接链与抗体或抗原的连接中间体，其中，DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链可互补配对后连接，或者，DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接，其中，各链之间的碱基可互补配对相互连接，修饰物a可与结合物b特异性结合，
所述DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链为以下序列组合中的一组或多组：
第一组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T；
第二组:
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG，对应放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T;
第三组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC； 对应放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应检测链：修饰物-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T；
第四组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T；
第五组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T;
第六组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第七组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应检测链：修饰物-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T；
第八组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应检测链：修饰物-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T；
第九组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A- (TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A- (TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十一组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十二组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十三组：
DNA连接链：AAATTCCTCTACCACCTACATCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十四组：
DNA连接链：AAATTCCTCTACCACCTACATCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十五组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应一级放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应二级放大链：ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A；对应检测链：修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T;
第十六组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG，对应一级放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应二级放大链：ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A；对应检测链：修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T;
第十七组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC；对应一级放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应二级放大链：GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T;
第十八组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应一级放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应二级放大链：GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A；对应检测链：修饰物-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T
第十九组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应一级放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应二级放大链：GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A；对应检测链：修饰物-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T
第二十组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应二级放大链：TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A；对应检测链：修饰物-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T
第二十一组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应一级放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应二级放大链：TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A；对应检测链：修饰物-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T；
所述n的范围为5≤n≤200；
序列从左到右为序列的5’端到3’端。
25.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，一个抗体或抗原的连接中间体可以连接一条或多条DNA/RNA连接链。
26.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链直接互补配对连接为DNA/RNA检测链的碱基可直接与DNA/RNA连接链的碱基互补配对。
27.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，同时DNA/RNA放大链的部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
28.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述DNA/RNA放大链再与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者DNA/RNA放大链部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
29.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一级DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，一级DNA/RNA放大链与一条或多条二级DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级DNA/RNA放大链与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
30.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
31.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，多条放大链为两条及以上放大链。
32.根据权利要求30所述的多重信号放大系统，其特征在于，多级放大为两级及以上放大。
33.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，DNA/RNA连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA检测链通过碱基互补配对连接。
34.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，DNA/RNA检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA连接链通过碱基互补配对连接。
35.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，连接中间体两端或中间任意位置双功能化，一官能团连接抗体或抗原上对应的官能团，另一官能团连接DNA/RNA连接链上对应的官能团，连接中间体的双官能团中两种官能团的比例为一比一或一比多。
36.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，抗体、抗原、DNA或RNA上用于与连接中间体反应或连接的官能团包括氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
37.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述连接中间体上的双官能团中的一种官能团与抗原或抗体上的包括氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
38.根据权利要求37所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述连接中间体上的双官能团中的另一种官能团可以与DNA/RNA上的包括氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
39.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，与连接中间体相连的抗体或抗原分子，一个抗体或抗原分子可连接一个或同时连接多个连接中间体。
40.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，与连接中间体相连的DNA/RNA连接链，一个连接中间体可连接一个或同时连接多个DNA/RNA连接链。
41.根据权利要求24所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述修饰物a可以连接于DNA/RNA检测链的5’端、3’端或者检测链中间的任何位置。
42.根据权利要求24-41任一项所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述多重信号放大系统可应用于免疫酶联斑点法的检测中。
43.一种多重信号放大系统，其特征在于，所述的信号放大系统采用DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、DNA/RNA检测链，其中，所述的DNA/RNA放大链可为一条或多条，
所述DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链为以下序列组合中的一组或多组：
第一组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T；
第二组:
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG，对应放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T;
第三组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC； 对应放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应检测链：修饰物-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T；
第四组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T；
第五组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T;
第六组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第七组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应检测链：修饰物-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T；
第八组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应检测链：修饰物-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T；
第九组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A- (TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACA，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A- (TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十一组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十二组：
RNA连接链：AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十三组：
DNA连接链：AAATTCCTCTACCACCTACATCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T；
第十四组：
DNA连接链：AAATTCCTCTACCACCTACATCAC，对应一级放大链：GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A；对应二级放大链：TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应检测链：修饰物-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
第十五组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTT，对应一级放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应二级放大链：ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A；对应检测链：修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T;
第十六组：
连接链：TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG，对应一级放大链：CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A；对应二级放大链：ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A；对应检测链：修饰物-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T;
第十七组：
连接链：AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC；对应一级放大链：GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A；对应二级放大链：GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A；对应检测链：修饰物-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T;
第十八组：
连接链：GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG ；对应一级放大链： CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A；对应二级放大链：GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A；对应检测链：修饰物-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T
第十九组：
连接链：GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT； 对应一级放大链：ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A；对应二级放大链：GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A；对应检测链：修饰物-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T
第二十组：
连接链：CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC；对应放大链：GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A；对应二级放大链：TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A；对应检测链：修饰物-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T
第二十一组：
连接链：AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC；对应一级放大链：GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A；对应二级放大链：TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A；对应检测链：修饰物-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T；
所述n的范围为5≤n≤200；
序列从左到右为序列的5’端到3’端。
44.根据权利要求43所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述的DNA/RNA放大链可为一级放大或多级放大。
45.根据权利要求43所述的多重信号放大系统，其特征在于，当DNA/RNA放大链为一条或多条时，DNA/RNA放大链部分片段与DNA/RNA连接链碱基互补配对，同时DNA/RNA放大链的部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
46.根据权利要求43所述的多重信号放大系统，其特征在于，当DNA/RNA放大链为多条时，一条DNA/RNA放大链部分片段与DNA/RNA检测链碱基互补配对，同时与其他多条DNA/RNA放大链部分片段互补配对。
47.根据权利要求43所述的多重信号放大系统，其特征在于，当DNA/RNA放大链为多条时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述DNA/RNA放大链再与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者DNA/RNA放大链部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
48.根据权利要求43所述的多重信号放大系统，其特征在于，当DNA/RNA放大链为多级放大时，DNA/RNA连接链与一级DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，一级DNA/RNA放大链与一条或多条二级DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级DNA/RNA放大链与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
49.根据权利要求43所述的多重信号放大系统，其特征在于，DNA/RNA连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA检测链通过碱基互补配对连接。
50.根据权利要求43所述的多重信号放大系统，其特征在于，DNA/RNA检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA连接链通过碱基互补配对连接。
51.根据权利要求43所述的多重信号放大系统，其特征在于，二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
52.根据权利要求51所述的多重信号放大系统，其特征在于，多条放大链为两条及以上放大链。
53.根据权利要求51所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述多级放大为两级及以上放大。
54.如权利要求24-53任一项所述的多重信号放大系统的制备方法，其特征在于，包括抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备、DNA/RNA放大链的制备。
55.根据权利要求54所述的制备方法，其特征在于，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备为抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链相连，其中，所述连接中间体具有双官能团，一官能团与抗体或抗原相连，另一官能团与DNA/RNA连接链相连。
56.根据权利要求54所述的制备方法，其特征在于，抗体或抗原或者DNA/RNA连接链上的用于与连接中间体连接的官能团包括腙基、氨基、羧基、羟基、巯基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
57.根据权利要求54所述的制备方法，其特征在于，所述连接中间体的双官能团中一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羧基反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羟基的反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羧基结合，另一官能团可与羟基结合；或者一个官能团可与羧基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羟基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接。
58.根据权利要求54所述的制备方法，其特征在于，抗体或抗原上的氨基与连接中间体上的一个官能团反应连接，而DNA/RNA连接链上的巯基与连接中间体上的另一个官能团反应连接。
59.根据权利要求54所述的制备方法，其特征在于，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备包括下述步骤：
（1）将抗原或抗体、连接中间体，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-连接中间体；
（2）将抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-DNA/RNA连接链。
60.根据权利要求59所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，抗体或抗原、连接中间体的摩尔比为1:0.05-1:1000。
61.根据权利要求60所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，抗体或抗原、连接中间体的摩尔比为1:0.1-1:100。
62.根据权利要求59所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反应温度为1-25℃。
63.根据权利要求62所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反应温度为2-8℃。
64.根据权利要求59所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，抗原或抗体-连接中间体可通过脱盐离心柱或者超滤或者透析进行纯化。
65.根据权利要求59所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链的摩尔比为1:0.05-1:1000。
66.根据权利要求65所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链的摩尔比为1:0.1-1:100。
67.根据权利要求59所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，反应温度为1-25℃。
68.根据权利要求67所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，反应温度为2-8℃。
69.根据权利要求59所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的抗原或抗体-DNA/RNA连接链可采用超滤离心纯化或透析纯化。
70.根据权利要求59所述的制备方法，其特征在于，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链连接成功的验证方法，包括使用质谱进行验证。
71.根据权利要求70所述的制备方法，其特征在于，所述质谱选自基质辅助激光解吸飞行时间质谱、电喷雾离子化质谱的任一种或其组合。
72.根据权利要求54所述的制备方法，其特征在于，所述DNA/RNA放大链的制备方法包括下述步骤：
（1）将聚合酶和相应的引物、发卡结构、底物按一定比例混合并反应一定时间；
（2）反应完成后，灭活聚合酶，制得DNA/RNA放大链反应产物；
（3）所得DNA/RNA放大链直接使用或进行纯化后使用。
73.根据权利要求72所述的制备方法，其特征在于，所述DNA/RNA放大链合成后不纯化直接使用。
74.根据权利要求72所述的制备方法，其特征在于，所述DNA/RNA放大链合成后纯化时所采用的纯化方法包括切胶回收、高效液相色谱法，凝胶渗透色谱法、离子交换色谱法、超滤离心、透析、沉淀法、结晶法中的一种或多种。
75.如权利要求24-53任一项所述的多重信号放大系统或权利要求54-74任一项所述的制备方法制备得到的多重信号放大系统在非疾病诊断目的的酶联免疫斑点法检测中的应用。
76.如权利要求16-23任一项所述的检测系统在用于非疾病诊断目的的酶联免疫斑点法检测中的应用。
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