CN118620992A - 一种n蛋白的单分子免疫测定方法、测定系统及应用 - Google Patents
一种n蛋白的单分子免疫测定方法、测定系统及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118620992A CN118620992A CN202410392329.0A CN202410392329A CN118620992A CN 118620992 A CN118620992 A CN 118620992A CN 202410392329 A CN202410392329 A CN 202410392329A CN 118620992 A CN118620992 A CN 118620992A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- antibody
- crispr
- cas12a
- biotinylated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims description 42
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 9
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims abstract description 56
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 18
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 13
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 13
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 13
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 13
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- -1 mgCl 2 Chemical compound 0.000 claims description 4
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 claims description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 2
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 abstract description 16
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 14
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 abstract description 12
- JCLFHZLOKITRCE-UHFFFAOYSA-N 4-pentoxyphenol Chemical compound CCCCCOC1=CC=C(O)C=C1 JCLFHZLOKITRCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 abstract description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 19
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 108091006197 SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Proteins 0.000 description 12
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101100285518 Drosophila melanogaster how gene Proteins 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004557 single molecule detection Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000009792 yinqiao Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请提供的N蛋白的单分子免疫测定方法、测定系统及其应用，捕获抗体捕获的N蛋白与第一抗体、生物素化第二抗体、链霉亲和素和生物素化引物结合，形成夹心免疫复合物；在phi29DNA聚合酶的作用下，生物素化引物以连接的环状挂锁为模板启动RCA反应，以生成长ssDNA链；长的ssDNA链可被CRISPR/Cas12a识别，并反式裂解为FAM‑ssDNA‑BHQ1探针以产生荧光信号，该方法对N蛋白的线性范围很宽，从3fg/mL到3×107fg/mL，检测限(LOD)为1fg/mL(15amol/L，即1μL样品中含有约9个分子)，其检测灵敏度比市面上的酶联免疫吸附试剂盒(LOD，5.7×104fg/mL)高出四个数量级。该方法特异性高，能准确鉴定出SARS‑CoV‑2伪病毒，检测灵敏度高。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，特别涉及一种N蛋白的单分子免疫测定方法、测定系统及应用。
背景技术
核酸检测是一种广为接受的黄金标准程序，主要是因为它能够进行早期诊断，而且具有很高的特异性和灵敏度。它主要用于产前诊断、新生儿遗传病筛查试验、早期癌症诊断、病毒基因分型、和传染病检测。Broughton等人采用了一种基于CRISPR-Cas12的侧流检测法来检测呼吸道拭子RNA提取物中的SARS-CoV-2这使得实时RT-PCR分析法的替代品开发得更快、更直观，其阳性预测率为95％，阴性预测率为100％。Chandrasekaran等人开发了一种快速COVID-19检测方法，该方法结合了免提取样品裂解、多重等温RNA扩增、T7转录和Cas13介导的裂解等方法，灵敏度为40拷贝/μL。然而，核酸检测仍然是一个具有挑战性的过程，因为在样本处理过程中可能会发生交叉污染，而且需要高度规范的实验室环境、熟练的操作人员和精密的设备。这些因素限制了这种方法在某些应用中的使用。因此，有必要开发其他检测方法，以便进行准确而简便的诊断。
免疫测定是一类生物分析技术，用于根据抗原-抗体反应检测和量化生物样本中的目标分子。它们以通用性强、价格低廉而著称。尽管免疫测定的种类繁多，但其程序主要涉及抗原-抗体特异性反应以及通过与其他物质反应将其转化为输出信号。在免疫测定中，酶联免疫吸附测定(ELISA)具有通量高、操作简单等优点，是最常用的多重分析技术。虽然在技术的支持下，酶联免疫吸附法现在可以检测到皮克级的目标分子，但它仍然无法检测到低丰度的生物标记物。因此，人们开发了许多与ELISA结合使用的策略，如基于微流控芯片的ELISA、电化学ELISA、数字ELISA等。然而，这些技术尽管提高了检测灵敏度，但仍然依赖于复杂的设备。因此，临床诊断蛋白质生物标记物需要一种简单、高灵敏度的免疫测定方法。
发明内容
鉴于此，有必要针对当前临床诊断蛋白质生物标记物检测水平有待提高的技术问题提供一种简单、高灵敏度的N蛋白的单分子免疫测定方法、检测系统及应用。
为解决上述问题，本申请采用下述技术方案：
本申请目的之一，提供了一种N蛋白的单分子免疫测定方法，包括下述步骤：
捕获抗体捕获的N蛋白与第一抗体、生物素化第二抗体、链霉亲和素和生物素化引物结合，形成免疫复合物；可以理解，免疫复合物是后面连接核酸扩增的基础，形成免疫复合物后将核酸扩增连接到免疫复合物上；
在phi29 DNA聚合酶的作用下，生物素化引物以连接的环状挂锁为模板启动RCA反应，以生成长ssDNA链；
获得的所述长ssDNA序列被CRISPR/Cas12a识别，并反式裂解为FAM-ssDNA-BHQ1探针以产生荧光信号。
在其中一些实施例中，在捕获抗体捕获的N蛋白与第一抗体、生物素化第二抗体、链霉亲和素和生物素化引物结合，形成免疫复合物的步骤中，具体包括下述步骤：
在96孔板中加入捕获抗体并孵育过夜，再用PBST缓冲液清洗所述孔板后，加入BSA封闭处理；具体地，孵育为温度为4-37℃，25-37℃封闭的温度为25-37℃，时间为1-4小时；
再对所述孔板进行洗涤后，在混合物中加入不同浓度的N蛋白标准品或样品，并孵育后用PBST缓冲液清洗所述孔板；再依次加入第一抗体和生物素化第二抗体，并孵育后用PBST缓冲液清洗所述孔板；再加入链霉亲和素与生物素化引物结合后用PBST缓冲液清洗所述孔板。具体地，孵育的温度为25-37℃，孵育的时间为1-2小时，链霉亲和素与生物素化引物结合的时间为10-60分钟。
在其中一些实施例中，所述捕获抗体包括1:500的小鼠单克隆抗体，所述第一抗体包括1:5000的兔单克隆抗体，所述生物素化第二抗体包括1:2000的生物素化山羊抗兔抗体。
在其中一些实施例中，将所述T4连接产物、phi29 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、BSA、dNTPs和经DEPC处理的水的混合物扩增处理，得到RCA产物，所述phi29 DNA聚合酶反应缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4及DTT，其pH为7.5。具体地，扩增的温度为20-37℃，扩增时间为1-4小时。
在其中一些实施例中，所述T4连接产物通过下述方法制备得到：
先将生物素化引物和挂锁DNA在孵育并杂交处理，以获得杂交产物；然后，将所述杂交产物、Hi-T4 DNA连接酶、StickTogether DNA连接酶缓冲液和DEPC处理的水混合，再孵育后进行连接以生成所述T4连接产物，所述StickTogether DNA连接酶缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT及聚乙二醇，其pH为7.6。具体地，孵育的温度为25-37℃，孵育的时间为10-60分钟，杂交时间为1-4小时。
在其中一些实施例中，在获得的所述长ssDNA序列被CRISPR/Cas12a识别，并反式裂解为FAM-ssDNA-BHQ1探针以产生荧光信号的步骤中，具体包括下述步骤：
将所述长ssDNA序列加入CRISPR/Cas12a混合物并孵育处理。将裂解产物从孔板中转移到离心管中，使用荧光分光光度计获得480nm激发的荧光光谱。具体地，孵育的温度为25-37℃，孵育的时间为1-2小时。
在其中一些实施例中，荧光光谱的荧光强度与N蛋白浓度的对数之间存在线性关系，其检测限范围从3fg/mL到3×107fg/mL，当检测限为1fg/mL，1μL样品中约有9个分子。
本申请目的之二，还提供了一种N蛋白的单分子免疫测定系统，所述N蛋白的单分子免疫测定系统由所述的测定方法实现。
本申请目的之三，还提供了一种所述的N蛋白的单分子免疫测定系统在N蛋白检测中的应用。
本申请采用上述技术方案，其有益效果如下：
本申请提供的N蛋白的单分子免疫测定方法、测定系统及其应用，捕获抗体捕获的N蛋白与第一抗体、生物素化第二抗体、链霉亲和素和生物素化引物结合，形成夹心免疫复合物；在phi29 DNA聚合酶的作用下，生物素化引物以连接的环状挂锁为模板启动RCA反应，以生成长ssDNA链；长的ssDNA链可被CRISPR/Cas12a识别，并反式裂解为FAM-ssDNA-BHQ1探针以产生荧光信号，该方法对N蛋白的线性范围很宽，从3fg/mL到3×107fg/mL，检测限(LOD)为1fg/mL(15amol/L，即1μL样品中含有约9个分子)，其检测灵敏度比市面上的酶联免疫吸附试剂盒(LOD，5.7×104fg/mL)高出四个数量级。该方法特异性高，能准确鉴定出SARS-CoV-2伪病毒。总之，CRISPR/Cas12a介导的免疫测定可以通过单分子检测在mol/L水平上检测SARS-CoV-2N蛋白，显示了其作为基于蛋白质的超灵敏疾病诊断的强大工具的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的N蛋白的单分子免疫测定方法的制备原理图。
图2为本发明实施例提供的CRISPR/Cas12a系统的可行性验证示意图。
图3为本发明实施例提供的RCA和RCA-CRISPR/Cas12a系统的可行性验证示意图。
图4为本发明实施例提供的RCA和CRISPR/Cas12a反应条件的优化的示意图。
图5为本发明实施例提供的优化CRISPR/Cas12a介导的免疫测定的反应条件示意图。
图6为本发明实施例提供的CRISPR/Cas12a介导的检测N蛋白的免疫测定示意图。
图7为本发明实施例提供的假病毒样本的选择性调查和分析示意图。
具体实施方式
下面详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。
本申请提供的N蛋白的单分子免疫测定方法、测定系统及其应用，整合了ELISA和CRISPR/Cas12a的优势，开发了一种检测SARS-CoV-2N蛋白的单分子免疫测定，其原理如图1所示。
本申请提供的N蛋白的单分子免疫测定方法，捕获抗体捕获的N蛋白进一步与第一抗体、生物素化第二抗体、链霉亲和素和生物素化引物结合，形成免疫复合物。在phi29 DNA聚合酶的作用下，生物素引物以连接的环状挂锁为模板启动RCA反应，从而生成长ssDNA链。获得的长ssDNA序列被CRISPR/Cas12a识别，从而释放了附带FAM-ssDNA-BHQ1的反式切割活性。以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。
实施例
1.材料和方法
1.1.化学品和材料
本申请中使用的所有寡核苷酸(表S1)均由上海生工生物技术有限公司(中国上海)合成和纯化。Hi-T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶和Lba Cas12a(Cpf1)购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)(美国马萨诸塞州伊普斯维奇)。磷酸盐缓冲液(PBS)和牛血清白蛋白(BSA)购自北京索来宝科技有限公司(中国北京)。链霉亲和素和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水来自上海生工生物技术有限公司(中国上海)。DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)试剂盒购自中科瑞泰生物科技有限公司(中国北京)。SARS-CoV-2(2019-nCoV)N蛋白-His重组蛋白、SARS-CoV-2N蛋白抗体(小鼠MAb)、SARS-CoV-2(2019-nCoV)N蛋白抗体(兔MAb)和SARS-CoV-2(2019-nCoV)N蛋白检测ELISA试剂盒均购义翘神州科技股份有限公司(中国北京)。生物素标记的山羊抗兔IgG(H+L)购自碧云天生物科技(上海)有限公司。
1.2.DNA杂交和连接
在进行连接反应前，先将10μL生物素化引物(5nM)和10μL挂锁DNA(200nM)在37℃孵育并杂交2小时，以获得杂交产物。然后，将4μL杂交产物、1μL Hi-T4 DNA连接酶(400U/μL)、10μL StickTogether DNA连接酶缓冲液(66mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、1mMDTT、7.5％聚乙二醇，pH 7.6)和5μL经DEPC处理的水混合，在25℃孵育30分钟，进行连接，生成连接产物。
1.3.RNA反应
RCA反应在30μL的体积中进行，其中包含20μL T4连接产物、1μL phi29DNA聚合酶(10U/μL)、3μL phi29 DNA聚合酶反应缓冲液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT，pH 7.5)、1μL BSA(20mg/mL)、2μL dNTPs(10mM)和3μL经DEPC处理的水。反应混合物在30℃下扩增2小时，得到RCA产物。
使用CRISPR/Cas12a系统对RCA产物进行验证。反应体系包括20μL RCA溶液、5μLCas12a(1μM)、0.5μL crRNA(10μM)、0.4μL DNA探针(10μM)和经DEPC处理水稀释的一小时低成本多用途高效系统(HOLMES)缓冲液1。总体积为100μL。在37℃下反应1小时后，使用日立F-7100荧光分光光度计(日立，日本东京)记录480nm激发的荧光光谱。
1.4.基于CRISPR/Cas12a介导的免疫测定对SARS-CoV-2N蛋白进行单分子检测
首先在96孔板中加入100μL捕获抗体(小鼠单克隆抗体，1:500)，在4℃孵育过夜。用PBST缓冲液(PBS，含0.05％吐温20，pH 7.4)清洗孔板三次后，加入300μL 5％(w/v)BSA，37℃封闭2小时。再经过一轮洗涤后，在混合物中加入不同浓度的N蛋白标准品或样品，37℃孵育一小时。依次加入100μL检测抗体(兔单克隆抗体，1:5000)和二抗(生物素化山羊抗兔抗体，1:2000)，37℃孵育1小时。每个孵育步骤结束后，需要进行三次洗涤以去除未结合的成分。然后，加入100μL 20nM的链霉亲和素，与生物素化的二抗结合30分钟。用PBST洗三次，向混合物中加入50μL的T4连接产物，然后在37℃孵育30分钟。T4连接产物含有2.5μL Hi-T4DNA连接酶(400U/μL)、10μL杂交产物、25μL StickTogether DNA连接酶缓冲液和12.5μLDEPC处理水，连接产物为室温孵育30分钟后得到的。用PBST冲洗三次后，取50μL RCA反应混合物，包括2μL phi29 DNA聚合酶(10U/μL)、5μL phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、1.5μL BSA(20mg/mL)、2μL dNTP(10mM)和39.5μL DEPC处理水，在96孔板中于30℃孵育2小时。最后，加入100μL CRISPR/Cas12a混合物并在37℃孵育一小时。将裂解产物从孔中转移到离心管中，使用日立F-7100荧光分光光度计(日立公司，日本东京)获得480nm激发的荧光光谱。
1.5.选择性分析和假病毒样本检测
本实施例使用几种干扰蛋白对SARS-CoV-2N蛋白检测进行了选择性分析，包括SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、白细胞介素-6蛋白(IL-6)和牛血清白蛋白(BSA)。干扰蛋白的浓度是SARS-CoV-2N蛋白的10倍。
将pSARS-CoV-2ORF1ab质粒(10μg)、S质粒(10μg)和StruΔS质粒(10μg)转染至293T细胞(5×106)，生成伪SARS-CoV-2阳性样本。阴性对照组是将以删去N基因的StruΔS为模板构建的变异StruΔS质粒(10μg)、pSARS-CoV-2ORF1ab(10μg)和S(10μg)转染到293T细胞(5×106)中，生成假SARS-CoV-2(ΔN)。转染24小时后收获假病毒，用裂解缓冲液裂解5分钟。随后使用本申请提出的CRISPR/Cas12a介导的免疫测定法和商用SARS-CoV-2N蛋白ELISA试剂盒对样本进行分析比较。
2.结果和讨论
2.1.RCA和CRISPR/Cas12a的可行性评估
RCA反应的触发和Cas12a的激活是决定RCA-CRISPR介导免疫测定可行性的两个关键因素。因此，本申请首先合成了能被crRNA间隔区识别的单链DNA(ssDNA)序列，以确认CRISPR/Cas12a的反式切割活性。然后，在CRISPR/Cas12a系统中加入不同浓度的ssDNA，测量FAM-ssDNA-BHQ1的荧光强度。结果表明，荧光强度与目标ssDNA浓度呈正相关，范围从10-11到10-7mol/L，这表明CRISPR/Cas12a系统可以识别目标序列，并有效地切割附近的FAM-ssDNA-BHQ1。
请参阅图2，为本实施例提供的CRISPR/Cas12a系统的可行性验证。其中，(A)为CRISPR/Cas12a系统中FAM-ssDNA-BHQ1对不同浓度ssDNA的荧光光谱和(B)为荧光强度。
随后，设计并合成了引物和挂锁探针序列，以检验它是否能触发RCA。引物用于与挂锁探针杂交，并在Hi-T4 DNA连接酶的帮助下将挂锁探针的5'端和3'端连接成环状结构。然后，在phi29 DNA聚合酶的作用下，RCA在环状挂锁模板介导的引物3'端开始延伸。
首先用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)评估了RCA反应的可行性(图2A)。泳道1和泳道2中的条带分别代表单链引物和挂锁。在Hi-T4 DNA连接酶的作用下，引物和挂锁的杂交产物产生了特征性的环状DNA模板的特征带(泳道3)，由于立体阻碍的增强，环状DNA模板带的移动速度比线性挂锁慢。加入phi29 DNA聚合酶和dNTP后，在泳道4中观察到一条明亮且移动速度较慢的条带，表明引物激活了挂锁探针的模板环化，并通过RCA反应转化为长DNA扩增产物。加入Cas12a/crRNA后，含有大量被crRNA识别的重复序列的RCA产物被切割成不同大小的片段(泳道5)。这些结果证实了RCA和RCA辅助CRISPR/Cas12a系统的可行性。
请参阅图3为本实施例提供的RCA和RCA-CRISPR/Cas12a系统的可行性验证示意图。其中：(A)为RCA的12％PAGE分析(M：DNA标记；泳道1：1μM引物；泳道2：1μM挂锁；泳道3：T4连接产物；泳道4：RCA产物；泳道5：RCA-CRISPR/Cas12a产物)。(B)为CRISPR/Cas12a系统中报告基因对不同引物浓度的RCA产物的荧光光谱。(C)为荧光强度。(D)
RCA-CRISPR/Cas12a(黑点)与单个CRISPR/Cas12a系统(红点)的灵敏度比较。
由图3发现RCA-CRISPR/Cas12a系统的灵敏度比单个CRISPR/Cas12a系统高三个数量级。
2.2.优化RCA和CRISPR/Cas12a
需要说明的是：在开发RCA-CRISPR介导的免疫测定之前，对几个关键因素进行了优化，以获得最佳的分析性能。生物素引物是启动RCA反应的触发器，其结构与信噪比密切相关。因此，本申请首先设计了五条与挂锁探针互补长度不同的引物链，以测试在何种条件下可以触发RCA反应。
请参阅图4表示为RCA和CRISPR/Cas12a反应条件的优化。其中：(A)不同杂交碱基数量的引物-挂锁-RCA产物引发的荧光强度变化。(B)不同浓度的T4 DNA连接酶引发的RCA产物的荧光强度变化。(C)不同RCA延长时间下报告基因荧光强度的变化。(D)crRNA与Cas12a的不同比例下报告基因的荧光强度变化。
结果表明，所有引物都能与挂锁探针杂交并启动RCA反应，而互补碱基长度为24bp的引物产生的荧光强度最高(图4中A)。因此，本实施例选择了互补长度为24bp的引物进行进一步实验。在优化T4连接酶的用量和phi29聚合酶的延长时间时发现，当T4连接酶的用量增加到400U时，荧光强度并没有明显增加(图4中B)。因此，为了确保每次实验中挂锁连接效率最大化，按照产品说明中的建议，在接下来的实验中选择了400U的T4连接酶。我们还评估了RCA的扩增时间。如图4中C所示，RCA在2小时内的反应速度最快。为了确定CRISPR/Cas12a反式切割的最佳crRNA与Cas12a的比例，测量了不同crRNA与Cas12a比例的CRISPR/Cas12a系统中DNA报告探针的荧光强度。如图4中D所示，当crRNA与Cas12a的比例为1:1时，荧光强度最高。因此，后续实验选择了1:1的crRNA与Cas12a的比例。
进一步地，在最佳条件下，本实施例固定了Cas12a、crRNA和DNA报告探针的浓度，并将引物浓度从0至2×10-11mol/L。
如图4中B和图4中C所示，FAM-ssDNA-BHQ1在λem＝520nm处的荧光强度随着引物浓度的增加而增加。与单个ssDNA引发的CRISPR/Cas12a反应相比，RCA-CRISPR/Cas12a反应切断FAM-ssDNA-BHQ1的灵敏度提高了3个数量级(图4中D)，这表明RCA-CRISPR/Cas12a反应的效率很高。
2.3.CRISPR/Cas12a介导的单分子检测N蛋白的免疫分析法
为了实现对N蛋白的单分子检测，进一步开发了一种CRISPR/Cas12a介导的免疫测定方法，该方法结合了ELISA、RCA和CRISPR/Cas12a。
请参阅图5表示为优化CRISPR/Cas12a介导的免疫测定的反应条件。其中：(A)为捕获抗体浓度。(B)为生物素引物的间隔碱基个数。(C)为链霉亲和素浓度。(D)为生物素-引物浓度。(E)为挂锁浓度。
本实施例首先研究了捕获抗体的浓度，荧光信号表明1:500是饱和浓度(图5中A)。考虑到链霉亲和素和生物素化引物之间的距离过近可能会产生立体阻碍，从而影响phi29DNA聚合酶的DNA扩增，我们在生物素和引物之间插入了不同数量的碱基。如图5中B所示，生物素-15A-引物组的荧光强度最高。
随后，进一步研究了链霉亲和素与生物素化二抗和生物素化引物之间结合的浓度；发现20nM是最佳浓度(图5中C)。在确定了所需的链霉亲和素用量后，我们选择了三种不同浓度的生物素化引物来优化其用量。结果表明，当生物素化引物的浓度达到0.5nM时，信噪比达到峰值(图5中D)。最后，我们研究了不同浓度的挂锁探针对荧光强度的影响。结果表明，荧光强度随着挂锁探针浓度的增加而增加，并在20nM时达到最高信号(图5中E)。
在最佳条件下，本实施例使用一系列浓度的SARS-CoV-2N蛋白测试了CRISPR/Cas12a介导免疫测定的检测灵敏度。
请参阅图6，表示为CRISPR/Cas12a介导的检测N蛋白的免疫测定示意图。其中：(A)为CRISPR/Cas12a介导的酶联免疫吸附试验中报告基因对不同浓度N蛋白的荧光光谱。(B)和(C)都显示了520nm波长处的荧光强度与N蛋白浓度对数之间的线性关系。(B)中使用的N蛋白浓度范围为3fg/mL至1×106fg/mL，(C)中使用的N蛋白浓度范围为1×106fg/mL至3×107fg/mL。(D)吸收强度与N蛋白浓度之间的线性关系，从1×105fg/mL到6×106fg/mL，这是通过商用SARS-CoV-2N蛋白ELISA试剂盒获得的。
如图6中A所示，λem＝520nm处的荧光强度随着N蛋白浓度的增加而增加。在3fg/mL至3×107fg/mL范围内，所开发的免疫测定与N蛋白浓度对数呈良好的线性关系，检测限为1fg/mL(15amol/L，1μL样品中约有9个分子)(图6中B和C)。为了进行比较，我们还测试了商用酶联免疫吸附试剂盒的检测灵敏度，计算得出的检测限为5.7×104fg/mL(图6中D)。因此，CRISPR/Cas12a介导的免疫测定的检测灵敏度比商业ELISA试剂盒高出四个数量级。
2.4.基于既定方法的选择性分析和假病毒检测
为了研究该方法的选择性，选择了SARA-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、白细胞介素-6蛋白(IL-6)和BSA进行分析。
请参阅图7表示为假病毒样本的选择性调查和分析示意图。其中，(A)为SARS-CoV-2N蛋白的选择性调查。N蛋白的浓度为5ng/mL，其他蛋白的浓度均为50ng/mL。使用(B)SARS-CoV-2N蛋白酶联免疫吸附试剂盒和(C)本实施例提出的CRISPR/Cas12a介导的免疫测定法检测SARS-CoV-2伪病毒样本。阳性样本为假SARS-CoV-2，是通过转染pSARS-CoV-2ORF1ab、S和StruΔS制备的。阴性样本是pseudo-SARS-CoV-2(ΔN)，它是通过转染pSARS-CoV-2ORF1ab、S和一个变异的StruΔS质粒制备的，该质粒是以删除了N基因的StruΔS为模板构建的。发现1至3号为阴性样本，4至8号为阳性样本。所有样品均稀释100,000倍。LOD的计算公式如下LOD＝空白+3×标准偏差。
结果表明，SARS-CoV-2N蛋白的荧光强度明显，而其他干扰蛋白的荧光强度与空白组相似。尽管干扰蛋白的浓度是N蛋白的10倍，但仍能观察到这一现象。这一结果表明我们提出的方法具有很高的选择性(图7中A)。
为了评估本实施例提出的方法检测真实样本中N蛋白的能力，进一步构建了SARS-CoV-2伪病毒。通过转染pSARS-CoV-2ORF1ab、S和StruΔS来构建假SARS-CoV-2，从而产生阳性样本。伪-SARS-CoV-2(ΔN)的阴性对照是通过转染pSARS-CoV-2ORF1ab、S和变异的StruΔS质粒产生的。对这两种样本分别使用我们提出的方法和商业试剂盒进行了测试比较。如图7中B和C所示，本实施例提供的方法能够以100,000倍的稀释倍数检测到五组阳性伪病毒，而商业试剂盒则无法检测到相同的伪病毒。此外，稀释100,000倍的阴性和阳性样本也仅能用本申请提出的方法准确区分。这些结果进一步表明了CRISPR/Cas12a介导的免疫测定的高灵敏度和准确性。
本申请提供的N蛋白的单分子免疫测定方法构建了一种新的免疫诊断方法，将免疫结合、RCA、CRISPR精确识别和Cas12a的高效切割结合在一起，实现了amol/L水平上对SARS-CoV-2N蛋白的单分子检测。检测限低至1fg/mL(15amol/L，即1μL样品中含有约9个分子)。检测灵敏度比市面上的酶联免疫吸附试剂盒(5.7×104fg/mL)高出四个数量级。根据实验的研究结果，该方法被证明能准确检测出SARS-CoV-2伪病毒，表明它具有实际应用的潜力。
CRISPR/Cas12a介导的免疫测定可被证明是开发新型蛋白质生物标记物检测生物传感器的多功能工具。这种改良技术可为开发基于蛋白质的CRISPR诊断技术开辟道路，从而满足生物研究和临床诊断的关键要求。
可以理解，以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上仅为本申请的较佳实施例而已，仅具体描述了本申请的技术原理，这些描述只是为了解释本申请的原理，不能以任何方式解释为对本申请保护范围的限制。基于此处解释，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进，及本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本申请的其他具体实施方式，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种N蛋白的单分子免疫测定方法，其特征在于，包括下述步骤：
捕获抗体捕获的N蛋白与第一抗体、生物素化第二抗体、链霉亲和素和生物素化引物结合，形成免疫复合物；
在phi29 DNA聚合酶的作用下，生物素化引物以连接的环状挂锁为模板启动RCA反应，以生成长ssDNA链；
获得的所述长ssDNA序列被CRISPR/Cas12a识别，并反式裂解为FAM-ssDNA-BHQ1探针以产生荧光信号。
2.如权利要求1所述的N蛋白的单分子免疫测定方法，其特征在于，在捕获抗体捕获的N蛋白与第一抗体、生物素化第二抗体、链霉亲和素和生物素化引物结合，形成免疫复合物的步骤中，具体包括下述步骤：
在96孔板中加入捕获抗体并孵育过夜，再用PBST缓冲液清洗所述孔板后，加入BSA后封闭；再对所述孔板进行洗涤后，在混合物中加入不同浓度的N蛋白标准品或样品，并孵育后用PBST缓冲液清洗所述孔板；再依次加入第一抗体和生物素化第二抗体，并孵育后用PBST缓冲液清洗所述孔板；再加入链霉亲和素与生物素化引物结合后用PBST缓冲液清洗所述孔板，所述孵育为温度为4-37℃，25-37℃封闭的温度为25-37℃，时间为1-4小时。
3.如权利要求2所述的N蛋白的单分子免疫测定方法，其特征在于，所述捕获抗体包括1:500的小鼠单克隆抗体，所述第一抗体包括1:5000的兔单克隆抗体，所述生物素化第二抗体包括1:2000的生物素化山羊抗兔抗体。
4.如权利要求1所述的N蛋白的单分子免疫测定方法，其特征在于，将所述T4连接产物、phi29 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、BSA、dNTPs和经DEPC处理的水的混合物扩增处理，得到RCA产物，所述phi29 DNA聚合酶反应缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4及DTT，其pH为7.5，所述扩增的温度为20-37℃，扩增时间为1-4小时。
5.如权利要求4所述的N蛋白的单分子免疫测定方法，其特征在于，所述T4连接产物通过下述方法制备得到：
先将生物素化引物和挂锁DNA孵育并杂交处理，以获得杂交产物；然后，将所述杂交产物、Hi-T4 DNA连接酶、StickTogether DNA连接酶缓冲液和DEPC处理的水混合，再孵育后进行连接以生成所述T4连接产物，所述StickTogether DNA连接酶缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT及聚乙二醇，其pH为7.6，孵育的温度为25-37℃，孵育的时间为10-60分钟，杂交时间为1-4小时。
6.如权利要求1所述的N蛋白的单分子免疫测定方法，其特征在于，在获得的所述长ssDNA序列被CRISPR/Cas12a识别，并反式裂解为FAM-ssDNA-BHQ1探针以产生荧光信号的步骤中，具体包括下述步骤：
将所述长ssDNA序列加入CRISPR/Cas12a混合物并孵育处理，将裂解产物从孔板中转移到离心管中，使用荧光分光光度计获得480nm激发的荧光光谱，所述孵育的温度为25-37℃，孵育的时间为1-2小时。
7.如权利要求6所述的N蛋白的单分子免疫测定方法，其特征在于，荧光光谱的荧光强度与N蛋白浓度的对数之间存在线性关系，其检测限范围从3fg/mL到3×107fg/mL，当检测限为1fg/mL，1μL样品中约有9个分子。
8.一种N蛋白的单分子免疫测定系统，其特征在于，所述N蛋白的单分子免疫测定系统由权利要求1至7任一项所述的测定方法实现。
9.一种如权利要求8所述的N蛋白的单分子免疫测定系统在N蛋白检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410392329.0A CN118620992A (zh) | 2024-04-02 | 2024-04-02 | 一种n蛋白的单分子免疫测定方法、测定系统及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410392329.0A CN118620992A (zh) | 2024-04-02 | 2024-04-02 | 一种n蛋白的单分子免疫测定方法、测定系统及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118620992A true CN118620992A (zh) | 2024-09-10 |
Family
ID=92596651
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410392329.0A Pending CN118620992A (zh) | 2024-04-02 | 2024-04-02 | 一种n蛋白的单分子免疫测定方法、测定系统及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118620992A (zh) |
-
2024
- 2024-04-02 CN CN202410392329.0A patent/CN118620992A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1255861B1 (en) | Methods and kits for proximity probing | |
| CN114107019A (zh) | 一种同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片、检测方法及用途 | |
| EP2189539B2 (en) | Conjugate complexes for analyte detection | |
| WO2002048403B1 (en) | Multiplexed protein expression and activity assay | |
| CN117969854A (zh) | 一种用于检测细胞因子蛋白浓度的试剂盒及其应用 | |
| CN113702641A (zh) | 一锅式核酸-抗体共检测方法及应用 | |
| WO2021191450A1 (en) | Controls for proximity detection assays | |
| CN111187863A (zh) | 一种双酶法恒温扩增检测covid-19的试剂盒和检测方法 | |
| CN118620992A (zh) | 一种n蛋白的单分子免疫测定方法、测定系统及应用 | |
| US20220162589A1 (en) | Analyte Detection Method Employing Concatemers | |
| US20230159983A1 (en) | Method for detecting analytes of varying abundance | |
| CN113528611A (zh) | 一种蛋白检测试剂盒及检测方法 | |
| CN101429547A (zh) | 肺炎球菌的抗原及配体管式pcr检测试剂盒及其制备和应用 | |
| US20230088664A1 (en) | Method of Detecting Analytes in a Sample | |
| CN113564158B (zh) | 一种DNA引物、包括该引物的CRISPR/Cas12a系统及试剂盒 | |
| CN113567684B (zh) | 基于核酸适配体探针的IFNg识别方法及检测IFNg的试剂盒 | |
| CN113945720B (zh) | 基于核酸适配体探针的pdgf-bb识别方法及检测pdgf-bb的试剂盒 | |
| KR20230044218A (ko) | 핵산 및 분석물의 동시 검출을 위한 다중분석물 검정 | |
| CN117965700A (zh) | 一种单核苷酸变异的即时检测方法 | |
| He et al. | On-Bead DNA Synthesis Triggered by Allosteric Probe for Sensitive Detection of Protein Biomarker | |
| SE2251386A1 (en) | In vitro detection method and device | |
| CN117467747A (zh) | 一种生物标志物检测方法 | |
| Bijak et al. | Methods of detecting biological materials | |
| CN116144649A (zh) | 一种基于自驱动杂交链式反应检测生物分子的序列组合、试剂盒及其应用 | |
| CN101503738A (zh) | Hiv病毒抗原及配体管式pcr检测试剂盒及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |