PT96458B - Utilizacao de transcritos de rna polimerase dependentes de dna como moleculas registadoras para amplificacao de sinal em ensaios de hibridazacao de acidos nucleicos - Google Patents

Utilizacao de transcritos de rna polimerase dependentes de dna como moleculas registadoras para amplificacao de sinal em ensaios de hibridazacao de acidos nucleicos Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 96.458
J<
J
REQUERENTE: CHIRON CORPORATION
EPÍGRAFE1 UTILIZAÇÃO DE TRANSCRITOS DE RNA POLIMERASE
DEPENDENTES DE DNA COMO MOLÉCULAS REGISTADORAS PARA AMPLIFICAÇAO DE SINAL EM ENSAIOS DE HIBRIDIZAÇAO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
INVENTORES: Michael S. Urdea, cientista norte-americano, residente em 100 Bunce Meadow Road, Alamo, Califórnia 94507, Estados Unidos da América
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4,° da Convenção de. Paris de 20 de Março de 1883, de Janeiro de 1990, nos Estados Unidos da América, sob o NS. 463.022
INPI MOO. Π3 R F 10732
Titular: CHIRON CORPORATION
Epigrafe: UTILIZAÇÃO DE TRANSCRITOS DE RNA POLIMERASE
DEPENDENTES DE DNA COMO MOLÉCULAS REGISTADORAS PARA
AMPLIFICAÇAO DE SINAL EM ENSAIOS DE HIBRIDIZAÇAO DE
ÁCIDOS NUCLEICOS í
MEMÓRIA DESCRITIVA
Campo do invento presente invento diz respeito à detecção e quantificação de biomoléculas através de ensaios de hibridização, e mais particularmente diz respeito a ensaios de hibridização nos quais são usadas moléculas registadoras para amplificação de
J sinal.
Antecedentes do invento
As hibridizações de ácidos nucleicos são agora vulgarmente utilisadas na investigação genética, na investigação biomédica e em diagnósticos clinicos para detectar e quantificar sequências de nucleótidos particulares que estão presentes em misturas heterogéneas de DNA, RNA, e/ou outros materiais. No ensaio básico de hibridização de ácidos nucleicos, um analisado
de ácido nucleico de cadeia simples ( tanto DNA como RNA ) é hibridizado, directa ou indirectamente, a uma sonda marcada de ácido nucleico, e os duplexes contendo marcação são quantificados. Foram usadas tanto sondas marcadas radioactivamente como marcadas não radioactivamente.
Ao ensaio básico falta sensibilidade. Quando o analisado está presente em pequeno número de cópias ou em concentração diluida, o sinal não consegue ser distinguido do ruido de fundo. Foram desenvolvidas variações do esquema básico, para facilitar a separação dos duplexes alvo de material estranho, e/ou para amplificar as sequências do analisado com o objectivo de facilitar a detecção, mas estas variações pecam por terem na sua generalidade procedimentos complexos e de longa duração, elevado ruido de fundo, baixa sensibilidade, e dificuldade na quantificação. Um objectivo primeiro do presente invento é fornecer um amplificador para usar nos ensaios de hibridização, que forneça um ganho em sinal altamente reproduzível, uma razão sinal/ruido altamente reproduzível, que é em si mesmo quantificável e reproduzível, e tem a capacidade de se combinar especificamente com um analisado presente em baixas concentrações e com uma metade registadora universal para formar um complexo estável.
A patente norte americana com o número 4.868.105, pertença da requerente, emitida em 19 de Setembro de 1989, a descrição da qual está aqui incorporada para referência, descreve uma fase de solução no ensaio sandwich de hibridização, no qual o analisado de ácido nucleico é hibridizado com uma sonda marcada e a uma sonda de captura. 0 complexo analisado-sonda é acoplado por hibridizaçâo a um suporte sólido. Isto permite que os oligonucleótidos do analisado sejam removidos da solução como um complexo de fase sólida, concentrando assim o analisado, facilitando a sua separação dos outros reagentes, e aumentando a sua subsequente detecção.
pedido PCT com o número 84/03520 e o pedido de patente europeu com o número 124221 descrevem um ensaio de hibridizaçâo de DNA no qual: (1) o analisado é hibridizado com uma sonda de DNA de cadeia simples que tem uma cauda que é complementar aos oligonucleótidos marcados da enzima, e (2) o )
resultante duplex com cauda é hibridizado com um oligonucleótido marcado da enzima. 0 sistema de marcação da Enzo Biochem BioBridge parece ser semelhante ao sistema descrito nestes dois pedidos de patentes. 0 sistema Bio-Bridge utilisa um desoxinucleótido transferase terminal para adicionar caudas 3'poly T não modificadas a uma sonda de DNA. A sonda cauda poly-T é hibridizada com uma sequência de DNA alvo e depois com um poly-A modificado na biotina.
O pedido de patente europeu com o número 204510 ) descreve um ensaio de hibridizaçâo de DNA em que o analisado de DNA entra em contacto com uma sonda que tem uma cauda, tal como a cauda poly dT, e uma cadeia amplificadora que tem uma sequência, por exemplo, uma sequência poli dA, que hibridiza com a cauda da sonda e é capaz de se ligar a uma multiplicidade de cadeias marcadas.
problema principal com estes ensaios de hibridizaçâo anteriores é que lhes falta especificidade e/ou sinal suficientes para serem úteis na detecção de niveis muito baixos de analisado.
Um outro pedido da requerente, o pedido de patente europeu com o número 88309697.6 ( publicação número 0317077), depositado em 17 de Outubro de 1988, a descrição do qual está aqui incorporada para referência, descreve ologonucleótidos lineares e ramificados que podem ser usados com amplificadores de sinal em ensaios de hibridizaçâo. Neste caso, o oligómero amplificador tem dois domínios - um primeiro domínio que é complementar à sequência alvo ( ou o analisado per se ou uma sonda linker ) e um segundo dominio, presente em unidades repetitivas, complementar a uma sequência registadora marcada. A multiplicação de sequências registadoras por sequências alvo fornece a amplificação do sinal.
Uma outra abordagem foi utilisar polimerases de ácidos nucleicos para amplificar as sequências alvo. Por exemplo, a tão falada polimerase chain reaction (PCR), utilisa ciclos repetidos de DNA primed, síntese de DNA polimerase directamente a partir de DNA para amplificar sequências de interesse ( Saiki, R.K., et al., Science (1986) 230:1350-1354). 0 alvo amplificado é depois detectado usando o protocolo de ensaio de hibridizaçâo básico.
As RNA polimerases têm sido também utilisadas para amplificar sequências alvo (Krupp, G., e Soll, D. FEBS Letters (1987) 212:271-275). Esta abordagem foi incorporada num formato de hibridizaçâo que envolve a produção de uma cópia de cadeia dupla da sequência alvo, inserção da sequência promotora da RNA polimerase, transcrição da cópia e detecção por ensaios de hibridizaçâo (Kwoh, D.Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1989) 86:1173-1177). Dado que a RNA polimerase directamente a
k partir de DNA produz até 103 cópias de RNA por cópia de modelo de DNA, são necessários poucos ciclos de amplificação. As RNA polimerases dependentes de DNA de bacteriófago ( por exemoplo, T3, T7, SP6) foram previamente empregues para a preparação in vitro de sequências de RNA especificas, a partir de modelos de oligonucleótidos clonados ou sintéticos e são bem compreendidos ( Melton, D.A., et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12:7035-7056); Chamberlin, M. e Ryan, T., (1982) no The Enzimes, Boyer, P.D., ed., 15:87-108; Martin, C.T., e Coleman, J.E., Biochemistry (1987) 26 :2690-2696). Estas polimerases têm promotores altamente específicos. São conhecidas 17 sequências de DNA de promotores T7 e foi deduzida uma sequência de consenso (Oakley, J.L., e Coleman, J.E., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A (1977) 74:4266-4270; Dunn, J.J., e Studier, F.W., J. Molec. Biol. (1983) 166:477-535). Sabe-se também que para reter a actividade polimerásica, apenas a região promotora deve ser em cadeia dupla (Milligan, J.F., et al., Nucle ic Ac ids Res. (1987) 15:8783-8799).
Finalmente a RNA polimerase, retirada directamente a partir de RNA, foi também usada para detectar sequências alvo (Lizardi, P.M., et al. , Bio/technology (1988) 6^:1197-1202; Lomeli, Η., et al.,Clin. Chem. (1989) 35:1826-1831). Neste sistema, uma sonda de RNA é preparada por acoplação de RNA complementar à sequência alvo com RNA (MDV-1) (patente norte americana com o número 4.786.600), que funciona como um modelo exclusivo para o bacteriófago Q-beta (Q). Primeiro, o alvo está imobilizado num substrato sólido, depois a sonda de RNA é hibridizada com o alvo e finalmente a sonda é eluida. A subsequente adição de Q-beta-polimerase à sonda gera múltiplas
cópias do RNA modelo/alvo. Num ensaio relacionado, o RNA de MDV-1 foi primeiro ligado à biotina, depois acoplado a um alvo avidinilado, e subsequentemente testados como descrito acima (Chu, B.C.F., et al., Nucleic Acids Res. (1986) 14;5591-5603).
O uso de Q-beta replicase em ensaios de hibridização tem quatro grandes desvantagens:
1) A Q-beta replicase é tipicamente contaminada com RNA de MDV-1. Consequentemente, este sistema tem um grande background ( fraca razão sinal/ruido ) quando a sequência reqistadora é a própria sequência MDV-1;
2) A sonda é RNA. O RNA é altamente sensivel à degradação pela actividade da RNase, a gual é ubiqua em preparações celulares em bruto, e pelas condições alcalinas requeridas para desnaturar as cadeias duplas dos alvos de DNA;
3) Devido à estrutura secundária do RNA do MDV-1, há uma ligação consideravelmente não especifica nos ensaios de hibridização, baixando de forma significativa a sensibilidade do ensaio e excluindo uma quantificação exacta; e,
4) A quantidade de sinal ( o RNA produto da Q-beta replicase) varia com o logaritmo do número de sondas originalmente ligadas ao alvo. Assim, este ensaio pode apenas detectar diferenças de ordem de magnitude entre as concentrações de analisado em várias amostras.
O invento aqui exposto tem várias vantagens em relação ao método da Q-beta-replicase. Primeiro, a sonda é DNA em vez de RNA. Segundo, o ensaio tem uma elevada razão sinal/ruido e uma muito elevada sensibilidade. Terceiro, dado que o sinal é amplificado em vez do alvo, o oligómero que é de facto medido, «SS2ES*-=--—tterá sempre a mesma sequência e tamanho, permitindo assim a standartização e optimização das condições de ensaio (adicionalmente, a maioria dos reagentes biológicos pode ser usada universalmente, aumentando assim a simplificação e standartização do ensaio). Finalmente, o alvo pode ser facilmente e exactamente quantificado.
Sumário do invento
Um aspecto do invento é uma construção j polidesoxinucleotidica ( sonda modelo ) para usar como um amplificador de sinal em ensaios de hibridizaçâo. A sonda modelo é constituida por três dominios como se descreve na Figura IA:
(i) um primeiro dominio (A) que é de cadeia simples e tem uma sequência nucleotidica (a') complementar à sequência alvo (a) (Figura 2A), compreendendo a sequência alvo um dominio, quer dentro da sequência do analisado, como dentro da sequência de oligonucleótido, que também contém uma sequência do dominio complementar à sequência do analisado;
(ii) um segundo dominio (B) que é de cadeia dupla e J capaz de funcionar como um promotor para a actividade da enzima
RNA polimerase dependente de DNA; e (iii) um terceiro dominio (C) que pode ser de cadeia simples ou dupla, e é adjacente ao segundo dominio, de tal forma que o terceiro dominio é capaz de funcionar como modelo (c') para a actividade do promotor do segundo dominio (Figura 2B).
Um segundo aspecto do invento é um método para amplificar o sinal biológico usado para detectar e quantificar um oligonucleótido, ou outro analisado biomolecular, num ensaio de
hibridizaçâo compreendendo as seguintes etapas:
(i) imobilização do analisado# directa ou indirectamente, num substrato sólido; e a hibridizaçâo do polidesoxinucleótido da sonda modelo descrito acima, directa ou indirectamente, com o analisado;
(ii) seguidamente, remoção da sonda modelo não hibridizada;
(iii) seguidamente, transcrição ( por via da actividade da RNA polimerase dependente de DNA) de múltiplas cópias de oligómeros de RNA (c) que são complementares à sequência modelo (c') do domínio C do amplificador; e (iv) finalmente, quantificação dos trancritos de RNA.
Breve descrição dos esquemas
A Figura IA é uma representação esquemática de uma sonda modelo monomérica. As letras grandes designam os domínios, e as letras pequenas designam as cadeias dentro do dominio. Uma primeira letra designa uma cadeia inferior (leitura de 3' para 5', da esquerda para a direita). A sequência a' é complementar à sequência alvo. 0 dominio B é o promotor para a RNA polimerase. A sequência c' é um modelo para a RNA polimerase. A sonda é sintetisada como uma cadeia simples. 0 AAAAAAA representa o linker poly-A adicionado para permitir a auto-hibridização.
A Figura ÍB é a sequência de DNA de uma configuração da sonda modelo amplificadora. 0 dominio promotor, B, consiste na sequência de consenso do promotor do bacteriófago T7 (5'TAATACGACTCACTATA-3') mais 15 resíduos 5' adicionais para a sequência promotora.
A Figura IC é uma representação esquemática de uma sonda modelo multimérica, na qual as regiões de dupla cadeia são auto-hibridizáveis.
A Figura 2A é uma representação esquemática de um sistema de ensaio de hibridizaçâo sandwich o qual incorpora a sonda modelo. 0 analisado é indirectamente imobilizado num substrato sólido por hibridizaçâo com a sonda de captura de analisado, e é indirectamente ligado à sonda modelo via sonda modelo linker. w representa a sequência de uma região do polinucleótido imobilizado que é complementar à região (w) da sonda de captura do analisado, y representa a sequência de uma região da sonda de captura do analisado que é complementar à região (y') do analisado.x' representa a sequência de uma região do analisado que é complementar à região (x) da sonda modelo linker. a representa a sequência da sonda modelo linker que é complementar a a', a sequência do domínio A da sonda modelo.
A Figura 2B é uma representação esquemática do uso dos transcritos de RNA polimerase, como moléculas registadoras em
J ensaios de hibridizaçâo. Após a hibridizaçâo do analisado e da sonda modelo, é adicionada uma RNA polimerase e são produzidos múltiplos trancritos de RNA complementares às sequências modelo (c). Estas sequências têm dois subdominios: c^ que é complementar à sonda de captura imobilizada num substrato sólido; e C2 que é complementar a uma sonda marcada. Isto permite a imobilização indirecta do marcado e a quantificação fácil do sinal do ensaio de hibridizaçâo. designa a marcação incorporada a qual pode ser radioactiva, quimioluminescente, fluorescente ou enzimática.
A Figura 2C é a sequência de DNA de um transcrito do domínio C, bem como a sequência do transcrito da sonda de captura 4 (C]/T) e a sonda marcada (C2'). X representa o derivado N metil desoxicitidina, [(6-aminocaproil)-2-aminoetil]-5-metil-2 ’ desoxicitidina, usado para acoplar a sonda de captura à fase sólida.
A Figura 3A descreve a preparação da sonda modelo pil.
A Figura 3B descreve a preparação da sonda modelo ρΐΐχ,.
A Figura 3C descreve a preparação da sonda modelo pIIr.
A Figura 4 descreve os oligómeros do dominio A do
Exemplo 9 e as sequências de DNA de oligo N, oligo S e oligo H.
A Figura 5 descreve o protocolo para um ensaio de ácido nucleico, utilizando a sonda modelo T7 e utilizando também uma sonda amplificadora para aumentar mais a sensibilidade e amplificação do sinal.
A Figura 6 é um gráfico que mostra a sensibilidade relativa e amplificação de sinal de várias sondas modelo, em ensaios para a presença de HIV no soro humano.
Descrição detalhada do invento
Um sinal biológico é um indicio bioquimicamente transmitido da ocorrência de um evento ou presença de uma molécula especifica.
RNA polimerase dependente de DNA é uma enzima que facilita a polimerização de sequências de RNA especificas a partir de um DNA modelo complementar.
Um dominio é uma região particular de um polinucleótido caracterizado pela sua função.
Uma reacção imunológica é o reconhecimento especifico e ligação de um anticorpo ao seu epitopo correspondente.
Um polidesoxinucleótido é uma molécula de DNA polimérica. Um polinucleótido é uma molécula de DNA ou RNA polimérica.
Um promotor é o sitio num polidesoxinucleótido ao qual a enzima RNA polimerase se liga preparatoriamente para iniciar a transcrição.
A RNA polimerase dependente de RNA é uma enzima que facilita a polimerização de sequências de RNA especificas a partir de um modelo de RNA complementar.
A transcrição é um processo mediado por uma enzima, através do qual se forma RNA correspondendo a um modelo de polinucleótido complementar.
A cadeia superior da dupla cadeia da molécula de DNA é a cadeia em que a extremidade 5' está à esquerda, quando a sequência é lida da esquerda para a direita. A sequência desta cadeia apresenta-se sempre abaixo da sequência para a sua cadeia inferior complementar, a qual é lida da extremidade 3'- para a 5'-, da esquerda para a direita.
Modos de realização do invento
1. Sondas modelo
Num aspecto deste invento uma sonda de DNA (referido como sonda modelo), contendo três domínios funcionais, foi concebida com o objectivo de aumentar o sinal nos ensaios de hibridização.
primeiro dominio (A na Figura IA), tem uma sequência (a') usualmente de 10 a 40 nucleótidos em comprimento, preferencialmente de 15 a 30 nucleótidos, que é de cadeia simples e é concebida para hibridizar com uma sequência alvo complementar (a) . Com o objectivo de conseguir estabilidade na hibridização, este dominio terá normalmente um conteúdo de CG na ordem dos 40% a 60%. A sequência alvo pode subsistir dentro de toda a sequência do polinucleótido a ser ensaiado (referido como analisado) ou pode subsistir dentro de um linker oligonucleotidico que também tem homologia com o analisado. Numa configuração preferida, o analisado será imobilizado num substrato sólido para facilitar os subsequentes procedimentos de lavagem. Esta imobilização pode ser directa (por exemplo, preparações polinucleotidicas contendo o analisado podem ser ligados a um filtro de nitrocelulose) ou indirectamente (por exemplo, um linker pode ser imobilizado no filtro e o analisado subsequentemente hibridizado ao linker).
segundo dominio (Β), tem preferencialmente 10 a 40 pares de bases em comprimento, preferencialmente 20 a '35 nucleótidos, mais preferencialmente 30 a 35 nucleótidos, é de dupla cadeia e funciona como um promotor da RNA polimerase retirada directamente do DNA. Este promotor é usualmente derivado a partir da sequência do promotor de um bacteriófago, de preferência qualquer dos fagos T3, T7, ou SP6, mais preferencialmente a partir do bacteriófago T7. Esta classe de RNA polimerases é de promotor altamente especifico. O promotor T7 é provavelmente o mais bem caracterizado. São conhecidas sequências do DNA de 17 promotores de T7 e foi deduzida uma sequência de consenso: 5'-TAATACGACTCACTATA-3’ (Oakley e Coleman; Dunn e
Studier). As sequências 3' para o promotor na cadeia complementar ( o segmento c', no qual a extremidade 3' está adjacente à extremidade 5'do segmento b') serve como modelo para a transcrição, e a transcrição de variações de muitas sequências modelo pode ser adaptada. Apenas a própria região do promotor tem de ser de dupla cadeia (Milligan et al.).
Podem ser adicionadas sequências adicionais na extremidade 5'do promotor. Por exemplo, numa configuração preferida, a região B consiste na sequência de consenso do promotor T7 mais bases adicionais 5' à sequência de consenso, as quais são idênticas à sequência dos plasmideos pT7 ( disponíveis na US Biochemicals) até ao local de restrição PvuII (Figura IB). Estas sequências podem ou não ter um efeito na transcrição.
terceiro dominio (C) tem a direcção 3' para o segundo dominio, e a cadeia c' desse dominio serve como modelo para o promotor do dominio B. 0 dominio C pode ser tão pequeno como 30 nucleótidos em comprimento ou tão longo como 10 Kb. Numa configuração preferida, o dominio tem de 40 a 45 bases. Numa outra configuração preferida o dominio tem 3,4 Kb e é substancialmente semelhante ao DNA genómico do virus da Hepatite B. Este dominio pode ser de cadeia simples ou dupla, e a extremidade 3' da cadeia modelo c' (directamente adjacente ao promotor) é usualmente um residuo de citosina.
E necessária uma relação adequada 5'- 3' do promotor (dominio B) para o modelo (dominio C) para haver uma transcrição adequada do modelo, o promotor tem a direcção 5' para o modelo, e o modelo é lido na direcção 3'- 5'. Contudo, será apreciado pelos especialistas nestas técnicas que a orientação dos dominios B/C
para o dominio A não é critica. Assim, sondas modelo construídas como dominios A-B-C ou como B-C-A produzirão o mesmo transcrito e por isso podem ser construídas em qualquer uma das formas.
produto de transcrição do RNA (c) do dominio C funciona como molécula registadora quanto à presença e quantidade do analisado. Amplificações de sinal ocorrem porque cada modelo 1 4 produz 10 a 10 transcritos. A sequência deste dominio pode ser concebida com uma sequência aleatória, avaliada por análise computacional, para minimizar a possibilidade de reacções cruzadas com outras sondas no sistema, ou alternativamente, pode ser uma sequência conhecida gue foi especificamente escolhida.
Maiores amplificações podem ser conseguidas concebendo uma sonda modelo com dominios promotor/modelo (B/C) multiméricos (Figura IC). Estas unidades multiméricas podem ter tanto moléculas com um arranjo linear como ramificadas. Para mais detalhes referentes à tecnologia de produção e aplicação de tais multimeros em ensaios de hibridização, ver publicação EPA no 0317077.
Numa sonda modelo multimérica, o número total de unidades repetitivas B/C estará usualmente no intervalo de 2 a 200, mais usualmente de 5 a 20. As unidades B/C do multimero podem estar covalentemente ligadas/ dirigidas umas na direcção das outras, através de pontes fosfodiéster ou através de agentes ligantés inseridos, tais como pontes de ácidos núcleicos, de aminoácidos, de carbohidratos ou de poliol, ou através de outros agentes de cruzamento que sejam capazes de fazer ligações cruzadas entre as cadeias de ácidos nucleicos. 0(s) sitio(s) de ligação pode(m) ser nas extremidades da unidade (tanto na orientação normal 3'-5', como aleatoriamente) e/ou num ou mais nucleótidos internos na cadeia. Nos multimeros lineares, as unidades individuais estão ligadas extremidade a extremidade para formar um polimero linear. Nos multimeros ramificados três ou mais unidades de oligonucleótidos emanam a partir de um ponto de origem para formar uma estrutura ramificada. 0 ponto de origem pode ser outra unidade oligonucleotidica ou uma molécula multifuncional à qual podem estar ligadas covalentemente pelo menos três unidades. 0 multimero pode ser linear na sua totalidade, totalrnente ramificado, ou ser uma combinação de porções lineares e de porções ramificadas. Preferencialmente, haverá pelo menos dois pontos ramificação no multimero, mais preferencialmente pelo menos três. 0 multimero pode incluir um ou mais segmentos de sequências em dupla cadeia.
As sondas modelo podem ser preparadas através de clonagem, montagem enzimática, técnicas químicas de cruzamento, sintese quimica directa ou combinação destes. Quando preparados por clonagem, as sequências de ácidos nucleicos que codificam a totalidade da sonda ou fragmentos desta podem ser feitos em forma de cadeia simples ou dupla através do procedimento de clonagem convencional. Quando feito na forma de dupla cadeia, a sonda é desnaturada para fornecer cadeias simples. As sondas modelo podem também ser clonadas na forma cadeia simples, usando vectores de fagos de cadeia simples convencionais como ο M13.
dominio A é de cadeia simples, o domino B é de cadeia dupla, e o dominio C pode ser de cadeia simples ou dupla. Um dominio particular (por exemplo, o dominio B) pode subsequentemente ser feito em cadeia dupla, através da
I hibridização com a sua cadeia complementar clonada separadamente. Alternativamente, a totalidade da sonda modelo pode ser clonada como cadeia simples, auto-hibridização dos polinucleótidos (a' b' c' c b). Neste caso quatro a dez nucleótidos adicionais, preferencialmente 5-7 nucleótidos, são adicionados à sequência como um espaçador entre c e c' para permitir um contorno adequado da região da dupla cadeia quando é auto-hibridizada. 0 espaçador é usualmente o poly-A, mas pode ser modificado para minimizar a reactividade do cruzamento na hibridização entre as várias sondas no ensaio.
J
Se forem desejadas sondas multiméricas, os fragmentos são ligados enzimaticamente ou quimicamente para formar um multimero. Quando montadas enzimaticamente, as unidades individuais estão ligadas por uma ligase tal como a DNA ligase do T4. Quando preparadas por cruzamentos químicos, as unidades individuais podem ser sintetisadas com um ou mais ácidos nucleicos que sofreram uma derivação para terem grupos funcionais que fornecem locais de ligação ou sofreram derivação depois de o oligonucleótido ter sido sintetisado para fornecer tais locais.
J Um procedimento preferido para o cruzamento químico é incorporar bases de citosina n modificadas no nucleótido, como descrito na publicação EPA, pertença da requerente, No. 0225807.
Quando preparados directamente por sintese química, os oligonucleótidos que contêm ácidos núcleicos derivados, cujos grupos funcionais estão bloqueados, são feitos por técnicas convencionais de sintese de oligonucleótidos. Os grupos funcionais não estão bloqueados e as unidades oligonucleotidicas são sintetisadas fora do(s) local não bloqueado.
2.Ensaios de hibridização amplificados
Num outro aspecto, este invento utilisa sondas modelo em ensaios de hibridização. 0 analisado pode ser qualquer sequência de nucleótidos de interesse - ou DNA ou RNA. A sequência do analisado pode constituir a totalidade de uma molécula ou apenas uma porção da molécula. 0 analisado pode ser um polinucleótido homogéneo, presente a baixa concentração no preparado da amostra, ou pode ser uma espécie minoritária numa mistura heterogénea de polinucleótidos. 0 analisado pode também ser proveniente de uma variedade de fontes, por exemplo, fluidos ou tecidos biológicos, substâncias alimentares, materiais ambientais, etc., ou pode ser sintetisado in vitro.
analisado pode ser preparado para as análises de hibridização através de uma variedade de meios, por exemplo, proteinase K/SDS, sais caotrópicos, etc. Também, pode ser vantajoso diminuir a amplitude de tamanho do analisado por meios enzimáticos, físicos ou quimicos, por exemplo, enzimas de restrição, sonificação, degradação quimica ( por exemplo, iões metálicos), etc. Os fragmentos podem ser tão pequenos como 0,1 β Kb, tendo usualmente pelo menos 0.5 Kb e podem ser de 1 Kb ou maiores. Quando a sequência do analisado é comprida, por exemplo no genoma virai, podem ser usadas várias regiões diferentes do analisado como alvo de uma sonda de analisado.
A sequência de analisado é fornecida na forma de cadeia simples para análise. Quando a sequência se encontra naturalmente presente na forma de cadeia simples, usualmente não é requerida a desnaturação. Contudo, se a sequência está presente na forma de dupla cadeia, a sequência será desnaturada. A desnaturação pode
ser realizada por várias técnicas, tais como a alcalina, geralmente de hidróxido 0,05 M a 0,2 M, formamida, sais caotrópicos, calor, ou combinações destes.
Numa primeira etapa, o analisado pode ser imobilizado direetamente numa fase sólida ou por hibridizações sandwich nas quais o analisado é ligado a um oligonucleótido que é depois ligado a uma fase sólida. Uma abordagem particularmente útil é uma hibridização sandwich em fase de solução, pertencente à Publicação EPA No. 0225807.
No ensaio de hibridização sandwich, com uma etapa de captura, a sonda modelo é usada como se segue: Um analisado de ácido nucleico de cadeia simples é incubado em condições de hibridização com um excesso de duas sondas de ácido nucleico de cadeia simples, (1) uma sonda de captura do analisado, tendo uma primeira sequência de ligação complementar ao analisado e uma segunda sequência de ligação que é complementar a um oligonucleótido de cadeia simples, ligado a uma fase sólida, e (2) uma sonda modelo linker tendo uma primeira sequência de ligação que é complementar ao analisado, e uma segunda sequência de ligação que é complementar ao dominio A da sonda modelo.
Numa configuração preferida, pode ser usado um conjunto de sondas de captura de analisado em que cada membro do conjunto tem uma primeira sequência de ligação diferente, complementar a um segmento diferente do analisado, enquanto todos os membros do conjunto têm a mesma segunda sequência de ligação. Similarmente, um conjunto de sondas modelo linker pode ser usado, tendo cada membro do conjunto uma primeira sequência de ligação diferente complementar a um segmento diferente do analisado, mas todos os membros do conjunto têm a mesma segunda sequência de ligação complementar ao dominio A da sonda modelo. Esta abordagem tem a vantagem de permitir a detecção simultânea de variantes estritamente relacionados de um analisado, por exemplo, o genoma virai de estirpes relacionadas.
Através da utilisação de sondas de captura de analisado e de sondas modelo linker, a matriz sólida e a sonda modelo podem ser usadas com reagentes universais e não é necessário fazer, para cada analisado, diferentes matrizes oligonucleotidicas imobilizadas e diferentes sondas modelo.
Usualmente, as condições de hibridização consistem num meio aquoso, particularmente um meio aquoso tamponado, o qual inclui vários aditivos. Estes aditivos incluem os polinucleótidos a serem hibridizados, sais (por exemplo, citrato de sódio 0,017 M a 0,17 M e cloreto de sódio 0,17 Ma 1,7 M), detergentes iónicos ou não iónicos (0,1 a 1%), e ácidos nucleicos transportadores. Solventes não aquosos tais como dimetilformamida, dimetilsulfóxido e formamida podem também ser utilisados. A mistura é incubada durante 15 a 75 minutos a 45°C a 70°C. 0 rigor da hibridização é regulado pela temperatura e concentração de sal e pode ser variado dependendo do tamanho e homologia das sequências a serem hibridizadas. Para a hibridização de sequências para ligar DNA, a forma empirica para calcular a temperatura óptima sob condições Standard (0,9 M NaCl) é:
T(°C)= 4(Nq+Nc) + 2(NA+NT) - 5°C, em que Nq, Nq, Na, e Νψ são as percentagens das bases de G, C, A, e T na sequência (J; Meinkoth et al., Anal. Biochem (1984) 138:267:84).
produto resultante é um complexo de ácido nucleico com três componentes das duas sondas hibridizadas com o analisado pelas suas primeiras sequências de ligação. As segundas sequências de ligação da sonda modelo linker e da sonda de captura do analisado permanecem como caudas de cadeia simples, visto que não são complementares ao analisado.
Este complexo é depois adicionado sob condições de hibridização a uma fase sólida tendo um oligonucleótido de cadeia simples ligado a ele, que é complementar à segunda sequência de ligação da sonda de captura do analisado. 0 produto resultante compreende o complexo ligado à fase sólida, através do duplex formado pelo oligonucleótido ligado à fase sólida e à segunda sequência de ligação da sonda de captura do analisado. A fase sólida com o complexo ligado é depois separada dos materiais não ligados e lavada para remover qualquer material residual não ligado.
A sonda modelo é depois adicionada ao complexo fase sólida-analisado-sonda, sob condições de hibridização, para permitir que a sonda modelo hibridize com as segundas sequências de ligação disponíveis da sonda modelo linker do complexo ( a sequência alvo da sonda modelo). 0 complexo resultante de fase sólida é depois separado de qualquer sonda modelo não ligada e lavado.
promotora condições múltiplas
De seguida, ( domínio apropriadas cópias de a RNA polimerase especifica para a região B ) da sonda modelo é adicionada sob para a transcrição, e são produzidas
RNA (c) do modelo do domínio C (c'). A quantidade de transcrito é proporcional à quantidade de analisado na preparação inicial.
As condições de transcrição consistem num meio aquoso, de preferência um meio aquoso tamponado, com sais apropriados, usualmente incluindo sal de magnésio, uma mistura de NTPs (rATP, rUTP, rGTP, rCTP), a enzima RNA polimerase e, usualmente, inclui vários agentes desnaturantes, transportadores proteicos, e inibidores de RNase. A incubação é usualmente de 15 a 90 minutos, usualmente de 60 minutos; e a uma·temperatura que é óptima para a enzima escolhida, usualmente de 35°C a 42°C, usualmente 37°C.
A sequência do dominio C é concebida para um esquema de detecção especifico e vários de tais esquemas podem ser empregues para quantificar os transcritos. Por exemplo, o produto de transcrição (c) do dominio C pode ser sub-dividido em dois subdominios - q e 03 (Figura 2B). 0 sub-dominio οχ é complementar a uma sonda de captura transcrita, a qual foi imobilizada num substrato sólido. 0 sub-dominio 03 é complementar a uma sonda amplificadora. Após a hibridizaçâo, a quantidade de marcação retida é linearmente proporcional à quantidade de analisado presente na amostra original . Numa variante desta abordagem, os transcritos são ensandwichados com as sondas linker, isto é, a sonda de captura transcrita está em solução em vez de imobilizada, e contém um segundo dominio que é complementar a um oligonucleótido imobilizado; e o sub-dominio 02 é complementar a uma sonda linker amplificadora que por sua vez é complementar a uma sonda amplificadora. Este arranjo em sandwich é semelhante ao uso de sondas modelo linker e de sondas de captura de analisado, para ensandwichar o analisado, como descrito acima.
Numa configuração alternativa, o transcrito do dominio C tem apenas o sub-dominio cj. 0 dominio C é transcrito na presença de ribonucleótidos trifosfatados marcados, e o transcrito marcado é subsequentemente ligado a um transcrito da sonda de captura imobilizado, através da sua complementariedade com o subdominio c^ e quantificado.
Ainda numa outra configuração, o transcrito do dominio C tem apenas um sub-dominio C2. 0 dominio C é transcrito na presença de ribonucleósidos trifosfatados biotinilados, e o transcrito é capturado em contas de avidina. 0 transcrito é depois hibridizado com uma sonda amplificadora, através da sua complementariedade com o subdominio C2, e quantificado.
Vários outros métodos de marcar e detectar o transcrito da sonda de amplificação são possíveis, incluindo o uso simultâneo de ribonucleótidos marcados e conjuntos avidina/biotina, e serão óbvios para os especialistas nestas técnicas.
Sondas de Captura, Linker e Amplificadoras
As primeiras sequências de ligação da sonda de captura do analisado e a sonda modelo linker são complementares à sequência do analisado. Similarmente, as primeiras sequências de ligação do transcrito da sonda de captura e da sonda linker amplificadora são complementares aos transcritos registadores. Cada primeira sequência de ligação tem pelo menos 12 nucleótidos (nt), usualmente pelo menos 25 nt, mais usualmente pelo menos 30 nt, e não mais do que cerca de 150, usualmente não mais de 75, e mais usualmente não mais do que cerca de 50 nt. Eles serão normalmente escolhidos para se ligar a diferentes sequências do analisado. As primeiras sequências de ligação podem ser seleccionadas com base numa variadade de considerações. Dependendo da natureza do analisado podemos estar interessados numa sequência de consenso, numa sequência associada aos polimorfismos, num fenótipo ou genótipo particular, numa estirpe particular, ou semelhantes.
As segundas sequências de ligação da sonda de captura do analisado e da sonda modelo linker são seleccionadas para serem complementares, respectivamente, ao oligonucleótido ligado à fase sólida, e a uma unidade oligonucleotidica da sonda modelo e, assim, não deve ser rodeada por sequências endógenas na amostra/analisado. A segunda sequência de ligação pode ser contígua à primeira sequência de ligação, ou estar afastada dela por uma sequência não complementar intermediária. As sondas podem incluir outras sequências não complementares se desejado. Estas sequências não complementares não devem camuflar as ligações das sequências de ligação ou provocar a ocorrência de ligações não especificas.
As sondas de captura e as sondas linker podem ser preparadas por processos convencionais de sintese de oligoncleótidos ou por clonagem.
Será apreciado que as sequências de ligação não precisam de ter uma complementariedade perfeita para fornecer homoduplexes. Em muitas situações, heteroduplexes serão suficientes, quando menos de 10% das bases estão desencontradas, ignorando loops de número cinco ou mais. Consequentemente, o termo complementariedade, como aqui usado, significa um grau de
em complementariedade suficiente para fornecer uma estrutura duplex estável e especifica.
A fase sólida que é utilisada no ensaio pode ser na forma de partículas ou pode ser a superfície de uma parede sólida de uma variedade de recipientes, por exemplo, tubos de centrífuga, colunas, placas de cúpulas de microtitulação, filtros, tubos, etc. Preferencialmente, as partículas empregues serão de um tamanho entre 0,4 a 200 micra, mais usualmente de 0,8 a 4,0 micra. As partículas podem ser de qualquer material conveniente, tal como latex, ou vidro. 0 oligonucleótido, que é complementar à segunda sequência de ligação da sonda de captura de analisado, pode ser preso de forma estável à superfície sólida através de grupos funcionais por intermédio de procedimentos conhecidos.
Será apreciado que podemos substituir a segunda sequência de ligação da sonda de captura e o oligonucleótido preso à fase sólida, com um par ligando-receptor apropriado, que formará uma ligação estável juntando a fase sólida à primeira sequência de ligação da sonda de captura. Exemplos de tais pares são a biotina/avidina, tiroxina/ tiroxina ligada à globulina, antigene/anticorpo, carbohidrato/lectina, e semelhantes.
As sondas de amplificação incluirão uma sequência complementar ao sub-dominio C2 dos transcritos da sonda modelo, ou a um sub-dominio da sonda linker amplificadora. A sonda amplificadora é capaz de hibridizar com uma ou mais marcações ou sondas marcadas que fornecem directamente ou indirectamente um sinal detectável. Os marcadores podem ser incorporados em residuos individuais da sequência complementar ou podem estar
fc presentes como um dominio terminal ou cauda terminal tendo uma multiplicidade de marcações. Vários meios para fornecer ligações marcadas à sequência têm sido descritos na literatura. Ver, por exemplo, Urdea et al.,Nucl. Acids Res (1988) 4937; Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1983) 80:4045; Renz e Kurz, Nucl. Acids Res. (1984) 12/3435; Ric hards on e Gumport, Nucl. Acids Res. (1983) 11:6167; Smith et al.,Nucl. Acids Res. (1985) 13:2399; Meinkoth e Wahl, Anal, Biochem. (1984) 138:267. Os marcadores podem ser ligados covalentemente ou não covalentemente às sequências complementares. Marcadores que podem ser empregues incluem radionuclideos, fluorescentes, quimioluminescentes, corantes, enzimas, substratos enzimáticos, cofactores de enzimas, inibidores de enzimas, sub-unidades de enzimas, iões metálicos, e semelhantes. Marcadores específicos ilustrativos incluem fluoresceina, rodamina, vermelho do Texas, ficoeritrina, umbeliferona, luminol, NADPH, galactosidase, peroxidase de rábano bastardo, etc. Ver Urdea et al., para comparação de métodos de marcação não radioisotópicos.
As sondas marcadas podem ser convenientemente preparadas por sintese quimica, tal como descrito no pedido de patente co-pendente, pertencente à requerente, com o No de série 945.76. Ao fornecer grupos terminais para terem uma funcionalidade conveniente, podem ser juntos vários marcadores através da sua funcionalidade. Assim podemos fornecer grupos funcionais carboxi, tiol, amina, hidrazina, ou outros aos quais se podem juntar vários marcadores sem afectar prejudicialmente a formação de duplexes com a sequência. Como já foi indicado, podemos ter uma molécula com uma multiplicidade de marcadores juntos na sequência complementar à sequência marcada. Alternativamente, podemos ter um ligando ligado à sequência marcada e usar um receptor marcado para se ligar ao ligando, para fornecer o complexo de analisado marcado.
A razão de sonda de captura de analisado e sonda modelo linker, para moles anteriores de analisado, será para cada, pelo menos, estequiométrica e, de preferência, em excesso. Esta razão é preferencialmente de pelo menos cerca de 1,5:1, e mais preferencialmente de 2:1. Estará normalmente no intervalo de 2:1 a 10000:1. As concentrações de cada uma das sondas estará -9 -6 geralmente entre 10 e 10 M, com as concentrações da amostra -21 -12 de ácido nucleico a variar de 10 a 10 M. As etapas do ensaio de hibridização durarão geralmente de 10 minutos a 2 horas, estando frequentemente completas ao fim de 1 hora. A hibridização pode ser realizada a uma temperatura levemente elevada, geralmente no intervalo de desde cerca 20°C a 80°C, mais usualmente de cerca de 35°C a 70°C, particularmente a 65°C. Condições adicionais para a reacção de hibridização estão descritas a seguir.
procedimento utilisado na separação das etapas do ensaio irá variar dependendo da natureza da fase sólida. Para particulas, a centrifugação e filtração permitirão a separação das particulas, desprezando o sobrenadante ou isolando o sobrenadante. No local onde as particulas foram ensaiadas, as particulas serão lavadas completamente, usualmente de uma a cinco vezes, com um meio apropriado tamponizado contendo detergente, por exemplo PBS com SDS. Quando os meios de separação são uma parede ou um suporte, o sobrenadante pode ser desprezado ou isolado e a parede lavada da mesma forma que indicado para as partículas.
Dependendo da natureza do marcador, várias técnicas podem ser utilisadas para detectar a presença do marcador. Para fluorescentes, estão disponíveis um grande número de fluorómetros diferentes. Com enzimas, pode ser fornecido tanto um produto quimioluminescente, fluorescente ou colorido e determinado fluorometricamente, espectofotometricamente ou visualmente. Os vários marcadores que foram utilisados em imunoensaios e as técnicas aplicadas nos imunoensaios podem ser utilizadas nestes ensaios.
Num ensaio de hibridizaçâo no qual o ácido núcleico do analisado está directamente ligado à fase sólida, tal como um ensaio dot blot, a sonda modelo é hibridizada directamente para o analisado ligado. Neste caso, o dominio A da sonda modelo é complementar à sequência do analisado.
A sonda modelo pode também ser utilisada noutros ensaios tais como ensaios directos, indirectos e imunoensaios sandwich, e ensaios para receptores ligandos, como, por
J exemplo, receptores de superfícies celulares. Nestes casos, em vez de um marcador, o reagente que desempenha o papel de anticorpo marcador ou outro ligando que se liga ao analisado (antigene ou receptor ligando), tem preso um oligonucleótido que é complementar a a', a sequência do dominio A da sonda modelo. Por exemplo, num imunoensaio em sandwich para um analisado antigene, a amostra de analisado é incubada com a fase sólida à qual se liga um primeiro anticorpo para o antigene. A amostra não ligada é removida da fase sólida e um segundo anticorpo para o antigene, que é acoplado a um oligonucleótido complementar a a', reage com o complexo ligado para formar um complexo com três membros. A seguir à remoção do excesso do segundo anticorpo, a sonda modelo é depois hibridizada com o complexo, através do oligonucleótido ligado ao segundo antigene. 0 excesso de sonda modelo é removido e é adicionada RNA polimerase como descrito acima. Finalmente, o produto da transcrição é quantificado como descrito.
Numa configuração alternativa, a sonda modelo pode ser sintetisada sem o dominio A e acoplada directamente ao receptor ligando ou ao anticorpo, através dos meios de avidina/biotina, ou um par equivalente estavelmente ligado como descrito previamente. A sonda modelo pode também estar presa de forma covalente ao receptor ligando por meios de sintese química, descritos no pedido de patente co-pendente No. 945.876.
Kits para realizar a amplificação dos ensaios de hibridização de ácidos nucleicos, de acordo com o invento, compreenderão numa embalagem combinada os seguintes reagentes: a sonda modelo; a apropriada RNA polimerase retirada directamente
_) do DNA, uma sonda marcadora apropriada; uma fase sólida capaz de se ligar ao analisado, opcionalmente uma sonda de captura de analisado se o formato de ensaio fôr tal que o analisado se liga à fase sólida através de um oligonucleótido intermédio ou outro ligando; e opcionalmente uma sonda modelo linker se o formato do ensaio fôr tal é que a sonda modelo não é hibridizada directamente no analisado. Similarmente, estes kits podem também conter transcritos de sondas de captura , de sondas de amplificação e de sondas linker. Estes reagentes estarão tipicamente separados em recipientes no kit. 0 kit pode também incluir um reagente desnaturante para desnaturar o analisado, tampões de hibridização, soluções de lavagem, controlos positivos e negativos e instruções escritas para realização do ensaio.
EXEMPLOS
Exemplo 1
A. Sonda modelo T7. A sonda foi concebida como se mostra na Figura IA. A sequência a' do dominio A está ilustrada na Figura 1B e é complementar à região a da sonda modelo linker descrita na Figura 2A. A sequência do dominio do promotor, B, (ilustrada na Fig. 1B) contém a sequência de consenso do promotor T7, mais 15 bases 5' adicionais para o promotor, e indêntica à sequência do plasmídeo pT7 (disponível pela US Biochemicals) até ao local de restrição PvuII. Os 15 pares de bases adicionais podem ser estranhos; contudo, eles foram incorporados desde que as experiências iniciais realizadas com sondas modelo, que tinham sido clonadas no vector pT7, provaram ser bem sucedidas. Assim, mesmo os modelos de sonda feitos por sintese quimica têm retida esta porção de plasmídeo. 0 dominio C foi concebido como uma sequência aleatória. Foi avaliado por análise computacional, para minimizar a potencial reactividade de cruzamentos na hibridização com outras sondas do sistema.
B. Sonda modelo T3. A sonda está concebida como no
Exemplo IA, acima, com a excepção de que a sequência de consenso para a RNA polimerase retirada directamente a partir do DNA da sequência promotora do bacteriófago T3 (5'-TATTAACCCTCACTAAA-3') é substituída pela sequência de consenso do promotor T7 (5'TAATACGACTCACTATA-3') .
C. Sonda modelo SP6. A sonda está concebida como no Exemplo IA, acima, com a excepção de que a sequência de consenso para a RNA polimerase retirada directamente a partir do DNA da sequência promotora do bacteriófago SP6 ( 5'- ATTTAGGTGACACTATA 3') é substituída pela sequência de consenso do promotor T7 e os primeiros seis nucleótidos 5'do dominio C são 5'-GAAGGG-3', em vez de 5'-GGGAGA-3, como no caso do Exemplo IA.
J
Exemplo 2
Ensaio de hibridizaçâo para o DNA do gene pilin de
Neisseria gonorrhoeae usando o procedimento para o ensaio de placas de microtitulação e a RNA polimerase do T7.
A. Analisado de DNA Standard. Foi usada a estirpe 31707 de N. gonorrhoeae do Neisseria Reference Laboratory (Seattle, WA) . O DNA foi preparado a partir desta estirpe, bem como a partir de outras estirpes comensais não patogénicas de Neisseria, usadas como controlos, através da adição de uma solução de proteinase K/SDS, como descrito em Urdea et al., (Gene (1987) 61:253).
B. Ligação do oligonucleótido ao suporte sólido (Figura 2A). Foi empregue um ensaio usando o procedimento da placa de microtitulação. As placas de microtitulação foram preparadas da maneira que se segue. Foram preparados dois tipos de cúpulas de
placas de microtitulação: (1) as cúpulas N para trabalho das amostras e controlos negativos,e (2) as cúpulas S para captura do complexo sonda-analisado, a partir de amostras e controlos positivos.
As cúpulas N foram produzidas como se segue: 300 μΐ de tampão HM (SDS 0,1%, 4*SSC), DNA de esperma de salmão sonificado lmg/ml , poly A lmg/ml, BSA 10 mg/ml, foram adicionados a Imulon II Remov-a-wells (Dynatech Inc.). As faixas das cúpulas foram cobertas e deixadas ficar à temperatura ambiente durante 1 hora. O tampão HM foi removido por aspiração e as cúpulas foram lavadas 3 vezes com 400 μΐ de 1 x PBS. As faixas foram cobertas com um envólucro de plástico, e armazenadas a 4°C até serem usadas.
As cúpulas S foram preparadas a partir das faixas Imulon II da maneira que se segue. A cada cúpula, foram adicionados 200 μΐ de uma solução a 200 μς/πιΐ de polifenilalanil-lisina (Sigma Chemical Inc.) em água. As faixas cobertas foram deixadas à temperatura ambiente durante 30 minutos a 2 horas, e depois lavadas como descrito acima.
De seguida foi sintetisado um oligómero de 21 bases, 5'-XCACCACTTTCTCCAAAGAAG-3' , em que X representa o derivado de 5-metil citidina, N4- (6-aminocaproil-2-aminoetil) , de acordo com o método de Warner et al. (DNA (1984) 3:401), e purificado como descrito por Urdea et al., em cima. A base de citosina modificada N4, facilita a ligação quimica cruzada dos oligonucleótidos, como descrito na Publicação da EPA No. 0225807, pertencente à requerente, e Urdea, M.S., et al., Nucl. Acids Res.. (1988) 16: 4937-4956.
Uma amostra de 10 OD do oligonucleótido sintetisado em
μΐ de 1 χ PBS foi tratada com 140 μΐ de dimetilformamida contendo lOmg de bis etileno glicol (succinimidilsuccinato) (Pierce Chemical Inc.). A mistura foi levada ao vortex e incubada no escuro à temperatura ambiente. Após 15 minutos, a solução foi passada por uma coluna de Sephade^S^G-25 (PD-10 de Pharmacia), previamente equilibrada com 30 ml de 1 x PBS. O volume não preenchido da coluna foi diluido para um volume final de 35 ml com 1 x PBS. A cada cúpula foi adicionada uma aliquota de 50 μΐ de solução de oligonucleótido. Após terem sido cobertas com um envólucro de plástico, as cúpulas ficaram a incubar à temperatura ambiente no escuro, durante 30 minutos, e durante uma noite. As cúpulas foram lavadas com 1 x PBS, depois cobertas com tampão HM, lavadas e armazenadas como acima.
C. Sondas de captura de analisado (Figura 2A). Um conjunto de três oligómeros de cadeia simples, cada um tendo uma porção de 30 bases variadas de comprimento, complementar a uma sequência especifica do gene pilin e uma porção constante de 20 bases 5' de comprimento, complementar ao oligonucleótido ligado à _J fase sólida, foram sintetisados através dos procedimentos automáticos de fosforamidite descritos por Warner et al., acima citados, e purificados pelo método de Sanchez-Pescador e Urdea, citados acima. As sequências complementares ao gene pilin foram baseadas na sequência pilin de N. gonorroheae descrita por Bergstom, S., et al. (PNAS USA (1986) 83:3890-3894).
As porções 5' das sondas eram complementares a segmentos da sequência pilin e eram como se segue:
Designação da sonda Sequência 5'
GCP-XTl-4 GAT GTG GCG GGC GCG CGT TCA AAG GCT TCG
GCP-XT1-8 GAG GCT GTA GTT TCC GTT TAT ACA ATT TCT
GCP-XT1-12 GCC AAG CCA TTT TAC CAA GAC GCC TGT CGG
A porção 3' de cada sonda de captura de analisado foi construída para ser complementar à sequência de oligonucleótidos presa ao suporte sólido descrito abaixo.
D. Sondas modelo linker (Figura 2A) . Um conjunto de 12 oligómeros de cadeia simples, consistindo cada um numa porção variável de 30 bases de comprimento, complementares a uma sequência especifica do gene pilin e uma porção 3' constante de 20 bases de comprimento, complementar à sonda modelo (Figura 2A), foram sintetisados pelos procedimentos de Warner et al., acima citado e purificados de acordo com Sanchez-Pescador e Urdea, acima citados.
As porções 5' da sonda eram complementares a segmentos da sequência pilin e eram como se segue:
Designação da sonda Sequência 5'
GCP-LLA2C-1 ATA CTT ATG GGA AGT TTT TCC GAA ATG GGA
GCP-LLA2C-2 GCT CGA CTA CTA ACA CTA GCG ATA GCA GCC
GCP-LLA2C-3 AAA CCG CAA TCA GCG GGA AGG GCG GAT GGT
GCP-LLA2C-5 GGA AAA CCG GCT TCC AGT TTT TAG TCG GCA
GCP-LLA2C-6 GCT CAT AAT GGA CTT AAG GCC GTT TAC CGG
GCP-LLA2C-7 TTT GTT GTG AAG ACG GCC GCA CCG TAG GGG
GCP-LLA2C-9 ACT TCA ATT TTT GCC GCA GCA ATG GCG GTG
GCP-LLA2C-10 CGA AAG TTC GCC GCA TTT GTT ACT AAT GTT
GCP-LLA2C-11 GTT TTT TGA GAG GGA CAC CCG GTC CGC ACT
GCP-LLA2C-13 ATG CGC GTG GCT GCT GCT GTG GCA ACG GCT
GCP-LLA2C-14 GTT TCT GCC GTT TCT TTA GCT GTG GTT CGT
CGP-LLA2C-15 CGG CAG TTG GAC GGC GCT ATT CCG TAG ACT
A porção 3' de cada sonda modelo linker foi construída para ser complementar à sequência do dominio A da sonda modelo.
E. OligOmeros marcados (Figura 2B). Um oligómero de 18 bases, 5'-XGGTCCTAGCCTGACAGC-3', em que X está definido como acima, foi sintetisado como descrito, e combinado com fosfatase alcalina (FA) da seguinte maneira: FA do intestino de bezerro ( 3 mg em tampão; imunoensaios de qualidade, Boehringer-Mannheim), foi colocada num Centricon 30 Microconcentrator. Aproximadamente 2 ml de borato de sódio 0,1 M, pH 9,5, foram depois adicionados e o dispositivo foi regulado para 3500 rpm, até ser obtido um volume final de 40 μΐ. O oligonucleótido alquilamino foi depois activado com p - fenileno diisotiocianato (DITC; Pierce Chemicals) em 95:5 (v/v) de dimetilformamida: borato de sódio 0,1 M, pH 9,3, extraido com n-butanol, e combinado com a proteína. O produto final foi armazenado a 4°C. Ver Urdea et al. (Nuc. Acids Res. (1988) 16:4937).
F. Procedimento com as Placas de Microtitulação. Para análises em duplicado, foram colocados 20 μΐ de cada amostra em 2 cúpulas N, depois tratados com 25 μΐ de solução de proteinase K/SDS. As cúpulas foram cobertas com uma placa seladora de microtitulação Linbro-Titertek, agitadas cuidadosamente, e incubadas a 65°C durante 30 minutos em banho de água. 0 analisado de captura e a sonda modelo linker, que estavam colocados em NaOH 1 M, foram adicionados em 10 μΐ a cada cúpula. Após a selagem, as amostras foram incubadas por 10 a 30 minutos de 65°C a 72°C como acima. As soluçdes foram neutralizadas com 26 μΐ de ácido acético 0,38 M (ou ácido sulfónico 3-[N-morfolino] propano 0,76 M (MOPS), ácido livre), 12,3 x SSC, depois incubadas, cobertas, por 15-30 minutos adicionais, a 65°C. De cada cúpula N, 40 μΐ da amostra são transferidos para novas cúpulas S, contendo a sonda de captura no suporte sólido. As cúpulas foram seladas e postas a 65°C durante 1 hora. Cada cúpula foi depois lavada duas vezes por aspiração com SDS 0,1%, 0,1 x SSC. Ver Folberg et al.
(Molec. and cell. probes (1988) 2! 5 9) .
A sonda modelo foi subsequentemente hibridizada a um complexo, por incubação de 100 fmoles de sonda modelo em 40 μΐ de 4 x SSC com poly A 100 μg/ml, a 55°C por 1 hora, seguindo-se duas lavagens com 0,1 x SSC, 0,1% de SDS e duas lavagens com 0,1 x
SSC.
A transcrição do dominio C foi efectuada por incubação do complexo em 20 μΐ de uma solução contendo Tris HCl 40 mM (pH 8), MgCl2 20 mM, NaCL 10 mM, Espermidina 1 mM, ditiotreitol 10 mM, albumina de soro bovino 0,15 mg/ml, rATP, rCTP, rGTP, rUTP 1,25 mM cada, RNAsin 1600 unidades/ml, e RNA polimerase de T7 2000 unidades/ml. Esta mistura foi incubada a 37°C durante 1 hora. A transcrição foi terminada pela adição de 20 μΐ de solução contendo 8 X SSC, e 0,2% DE SDS, e a totalidade da mistura foi transferida para novas cúpulas contendo uma sonda de captura
imobilizada com as sequências C]/. A captura dos transcritos do domínio C (Figura 2B) foi efectuada por incubação a 55°C durante 1 hora, seguindo-se duas lavagens com 0,1 X SSC, 0,1% de SDS.
Os transcritos do dominio C foram depois marcados por adição de 50 fmol da sonda com enzima marcada (cg') em 40 μΐ de 4 x SSC, poly A 100gg/ml, durante 15 minutos a 55°C. Finalmente, o complexo foi lavado duas vezes com 0,1 x SSC, SDS 0,1%, seguindo-se por duas lavagens com 0,1 x SSC.
Para detecção da FA, foi empregue uma reacção baseada no dioxetano com enzima acoplada (Schapp et al. Tet. Lett. (1987)
28:1159-1162) e a patente norte americana No. 4.857.652), disponível no Lumigen Inc.. 0 procedimento para a detecção foi como se segue. Para a etapa de marcação, 40 μΐ de tampão HM com a sonda de FA foram adicionados a cada cúpula, e as cúpulas foram incubadas a 55°C durante 15 minutos. O sobrenadante foi removido e as cúpulas foram lavadas duas vezes com 380 μΐ de 0,1 x SSC e
0,1% de SDS . As cúpulas foram depois lavadas duas vezes com 380 μΐ de 0,1 x SSC, para remover qualquer SDS restante. Foram adicionados a cada cúpula 20 μΐ de reagente dioxetano em tampão -4
CTAB a 3,3*10 M. As cúpulas foram levemente inclinadas para que o reagente caisse suavemente para o fundo e levemente agitadas para distribuir o reagente mesmo até ao fundo. As cúpulas foram cobertas com a placa seladora de microtitulação e incubadas num forno a 37°C durante uma hora. As cúpulas foram depois lidas com um luminómetro.
Resultados
Os testes foram realizados em células bacterianas de N.
gonorrhoeae (estirpe 31707), bem como em controlos de Neisseria não patogénica, de acordo com o protocolo do Exemplo 2, descrito acima. Os resultados estão apresentados como uma razão sinalruido (S/R), representando o valor da amostra contra o valor do controlo. 0 número de células foi determinado pela viabilidade celular. Para comparação, os testes foram também realizados nas mesmas amostras, utilizando um multimero de amplificação do tipo combinado com 5 locais de ramificação, como descrito no pedido de patente norte americana co-pendente com o No. de série 109.282.
No de células
Ensaio de transcrição T7
Ensaios multiméricos
Trial 1 Trial 2 Trial 1 Trial 2
8,3 x 105 186,76+25,39 139,93+44,87 90,94+48,69 82,75+16,55
8,3 x 104 18,35+3,60 8,35+4,20 9,94+8,71 14,56+0,47
8,3 x 103 2,43+0,37 1,55+0,37 2,58+1,40 2,55+0,42
Exemplo 3
Ensaios de hibridização usando a RNA polimerase T3 ensaio de hibridização é empregue utilisando o mesmo protocolo que no Exemplo 2, acima citado, com a excepção de que o dominio B da sonda modelo contém as sequências para o promotor da RNA polimerase T3, em vez do promotor T7. A sequência do promotor T3 foi previamente descrita por Brown, J.E., et al. (Nucleic Acids Res. (1986) 14:3521-3526). A sequência do promotor T3 é 5'TAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GA -3' e substitui a sequência do promotor T7 5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA -3'.
“S—r
Exemplo 4
Ensaio de Hibridizaçâo usando a RNA Polimerase SP6 ensaio de hibridizaçâo é empregue utilisando o mesmo protocolo que no Exemplo 2, acima citado, com a excepção de que o dominio B da sonda modelo contém a sequência para o promotor da RNA polimerase SP6, em vez do promotor T7. A sequência do promotor SP6 foi previamente descrita por Brown et al., acima citado. A sequência do promotor SP6 é 5'- ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAG GG-3' e substitui a sequência do promotor T7 5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3'.
Exemplo 5
Ensaio de Hibridizaçâo para o DNA do Vírus da Hepatite B (HBV) usando o Procedimento de Ensaio com Placas de
Microtitulação e a RNA Polimerase do T7
Extratos de DNA de amostras de soro ou plasma de pacientes potencialmente infectados com o virus da Hepatite B (HBV) são preparados como descrito no de pedido de patente co-pendente com o No. 109282, e são usados como analisados como descrito no Exemplo 2.
Um conjunto de sondas modelo linker de cadeia simples, cada uma tendo uma porção variável com 30 bases de comprimento, complementar a uma sequência especifica da região constante ds do genoma do HBV, e uma porção 3' constante de 20 bases de comprimento, complementar à sonda modelo usada no Exemplo 2, é sintetisada pelos procedimentos descritos no Exemplo «SESfetó
2. As sequências destas sondas estão apresentadas no Quadro 1, a seguir.
Quadro 1
Sondas Modelo linker para HBV
Designação da sonda :HBV.LLA2C.70 :HBV.LLA2C.69 :HBV.LLA2C.68 :HBV.LLA2C.67 jHBV.LLA2C.66 :HBV.LLA2C.65 jHBV.LLA2C.59
Sequência
TGA CTG [CG]CG ATT GGT [GA]GA GGC AGG [AC]GG AGG TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC CTT G[AT][CT] GGG [GA]TT GAA GTC CCA ATC
TGG ATT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
GTT GCG TCA GCA AAC ACT TGG CA [CG] AGA
CC[AT] TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TAA GTT GGC GAG AAA GT[GA] AAA GCC TG[TC]
TT[AC] TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
GCA GCA AA[GA] CCC AAA AGA CCC ACA
A[TG][TA] C[TG][TC] TTA GGC ATA GGA CCC
GTG TC
ATG TAT ACC CA [GA] AGA CA [AG] AAG AAA ATT
GGT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TAG AGG ACA AAC GGG CAA CAT ACC TTG [AG]TA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
JHBV.LLA2C.58 GAT TTA GAG GCA TAG CAG CAG GAT GAA GAG GAA
GGC ATA GGA CCC GTG TC
JHBV.LLA2C.57 GAT AAA ACG CCG CAG ACA CAT CCA GCG ATA
TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
JHBV.LLA2C.56 GGA CAA [AG]TT GGA GGA CA[GA] GAG GTT GGT
GAG TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HBV.LLA2C.55 TTG TTA GAG GTT GGG GAC TGG GAA TTT TGG CCA
GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HBV.LLA2C.54 CCA CCA CGA GTC TAG ACT CTG [CT]GG TAT
TGT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HBV.LLA2C.53 GAT TCT TGT CAA CAA GAA AAA CCC CGC CTG TTA
GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HBV.LLA2C.52 CAC GAG [CA]AG GGG TCC TAG GAA TCC TGA
TGT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HBV.LLA2C.51 CAG GGT TTA CTG TTC C[TG]G AAC TGG AGC
CAC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
Um conjunto de sondas de captura de analisado de cadeia simples, tendo cada uma uma porção variável de 30 bases de comprimento, complementar a uma sequência especifica da região constante ds do genoma do HBV e uma porção 3' constante de 20 bases de comprimento, complementar ao oligonucleótido ligado à placa de microtitulação, como descrito no Exemplo 2 é sintetisado como no Exemplo 2. A sequência destas sondas está apresentada no Quadro 2, a seguir.
Quadro 2
Sondas de captura de analisado para o HBV
Designação da sonda Sequência
:HBV.XT1.64 CTT CTT GGC CCC CAA TAC CAC ATC ATC CAT ATA
CTT TGG AGA AAG TGG TG
íHBV.XTl.63 GAA AGC CAA ACA GTG GGG GAA AGC CCT ACG
CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG
íHBV.XTl.62 íHBV.XTI.61 :HBV.XT1.6O
CAC TGA ACA AAT GGC ACT AGT AAA CTG AGC
CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG
GAG AAA CGG [AG]CT GAG GCC C[AC]C TCC CAT
AGG CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG [GC]CG AAA GCC CAG GA[CT] GAT GGG ATG GGA
ATA CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG
Todos os outros métodos e reagentes são os mesmos que no Exemplo 2.
Exemplo 6
Ensaio de Hibridização para TEM-1 Beta-lactamase de DNA em N.
gonorrhoeae usando o Procedimento do Ensaio de Placas de
Microtitulação e a RNA Polimerase T7
Análises moleculares revelaram que a resistência à penicilina, observada em N. gonorrhoeae, é, na sua maior parte devida à presença do gene Tem-1 beta-lactamase num plasmideo não conjugativo de 3-7 M. daltons. (Este plasmideo é homólogo aos que se encontram em H. ducreyi, H. parainfluenza e ocasionalmente em H. influenza). Um ensaio de hibridização é pois desenvolvido para detectar DNA TEM-1 em N. gonorrhoeae (ou nas outras bactérias atrás mencionadas que transportem plasmideos homólogos) com o propósito de determinar a resistência à penicilina.
plasmideo de 7,3 Kb de N. gonorrhoeae que transporta o gene TEM-1 foi obtido, e um segmento contendo 80% do gene TEM-1 foi sequenciado como descrito na Publicação EPA pertencente à
>
requerente, com o No. 0317077. As sondas de captura do analisado e as sondas modelo linker são sintetisadas e purificadas como descrito no Exemplo 2, acima referido. As porções 5' das sondas modelo linker são complementares às sequências da região codificadora do gene; enquanto que as porções 5' das sondas de captura de analisado são complementares a sequências adjacentes do plasmídeo. Alternativamente, são também preparadas sondas nas quais as porções 5' de ambos os conjuntos são dirigidas para o gene TEM-1.
Em todos os outros aspectos, o procedimento no ensaio de hibridização e os reagentes, são semelhantes aos descritos no Exemplo 2.
Este ensaio para o TEM-1 ê um instrumento clinico poderoso que permitirá ao pessoal médico identificar infecções resistentes à penicilina, e optimizar o regime de tratamento, através da escolha de uma terapia de antibóticos apropriada.
Exemplo 7
Ensaio de Hibridização de DNA de Chlamydia trachomatis Utilisando o Procedimento do Ensaio de Placas de Microtitulação e Polimerase do T7
As sondas de modelo linker e de captura de analisado são preparadas usando a mesma estratégia que foi descrita no Exemplo 2 e concebidas para hibridizar com o plasmídeo pCHL2 de Chlamydia, descrito por Palmer e Falkow (Plasmid (1986) 16;5262). Cada sonda do conjunto é de 50 mer nas quais os primeiros 30 residuos 5' são complementares às sequências do pCHL2, e os residuos 3' restantes são as sequências do modelo linker e da captura de analisado especificas no sistema, descritas no Exemplo 2. As sequências pCHL2, usadas para conceber estas sondas estão descritas na Publicação EPA, pertença da requerente, com o
No. 0317077.
Em todos os outros aspectos o ensaio de hibridizaçâo e os reagentes são os mesmos que estão descritos no Exemplo 2.
Exemplo 8
Ensaio de Hibridizaçâo para o Determinante tet M em N.
gonorrhoeae
Descobriu-se que as estirpes de N. gonorrhoeae resistentes a elevados niveis de tetraciclina, exibidindo uma concentração minima inibitória num valor abaixo de 16 g/ml, adquiriam o determinante M tet num plasmídeo conjugativo de 24,5 Md (Cannon, J.G., et al., Annual Review of Microbiology (1984) 38:111; Morse, S.A., et al., Antimicrob. Agents Chemother. (1986) 30:664) . Foi assim desenvolvido um ensaio de hibridizaçâo para detectar DNA tet M em N. gonorrhoeae ( ou nas outras bactérias atrás mencionadas transportando plasmídeos homólogos) com o propósito de determinar a resitência à tetraciclina.
Dez μΐ de suspensão de células de N. gonorrhoeae resistêntes à tetraciclina (TRNG), tanto em caldo de CG como em leite magro, são misturadas com 12,5 μΐ de uma solução de lise ( proteinase K 2mg/ml em Tris-HCl 10 mM, NaCL 150 mM, EDTA 10 mM,
»
SDS 1%, pH 8,0) numa cúpula Immulon II limpa (Dynatech), e incubadas a 65°C durante 20 minutos.
As sondas de captura da analisado e as sondas modelo linker são sintetisadas e purificadas como descrito no Exemplo 2, acima citado, com a excepção de serem concebidas para hibridizar o gene estrutural tet Μ. A sequência das sondas está baseada na sequência do gene tet M do transposâo shuttle conjugativo de estreptococo Tn 1545, descrito por Martin, P., et al., Nucl. Acids Res. (1986) 14:7047.
Em todos os outros aspectos, o procedimento do ensaio
J de hibridização e reagentes são os mesmos que descritos no Exemplo 2.
Exemplo 9
Comparação de Sondas Modelo com vários Números de Pares de Bases entre o domínio A e B em Ensaios para a Presença do DNA do vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) em Plasma Humano
Várias sondas modelo foram preparadas, cada uma tendo o mesmo dominio funcional, A, B, e C, mas com diferente número de pares de bases separando o dominio A e o promotor T7.
A estratégia geral foi preparar DNA contendo o promotor da polimerase T7, ligado de forma operacional à extremidade 5' do genoma virai da hepatite B (HBV)- cerca de 3,4 Kb de comprimento. Assim, o genoma do HBV actua como dominio C e funciona como modelo para a subsequente transcrição, enquanto que o resultante RNA especifico de HBV funciona como um transcrito registador. Este fragmento de DNA foi clonado no plasmídeo pGEM3Z (comercialmente disponível na Promega, Inc.- ver Figura 3A). De seguida, um oligómero parcialmente de cadeia simples, correspondendo ao dominio A das sondas modelo, e uma pequena região espaçadora de cadeia dupla (18 nucleótidos) com uma extremidade de coesão foi também preparada (Figura 4). 0 oligómero foi depois ligado ao promotor/ fragmento de DNA de HBV (dominio B/C), que foram isolados a partir do plasmideo, por digestão por endonuclease de restrição e subsequente purificação. 0 tamanho do fragmento varia dependendo das endonucleases de restrição utilisadas para linearizar o plasmideo (Fgura 3A-C).
J
A. Sonda modelo pil
1. Promotor T7 (dominio B) e HBV (dominio C)
Um segmento de DNA compreendendo a sequência de consenso T7, orientada com a direção 5' para linearizar o DNA genómico de HBV, foi inserido no local ECORI de pGEM3Z (pGEM3ZHBV) . Após a clonagem, o plasmideo foi isolado e relinearizado por digestão com Nde I (Figura 3A).
2. 0 oligómero
Um oligómero de cadeia dupla parcial foi sintetisado, o qual compreende o dominio A e um pequeno dominio de dupla cadeia terminando numa extremidade coesiva complementar à extermidade coesiva criada pela digestão com Nde I. Este oligómero é designado por oligo N. 0 oligo N compreende as duas cadeias de DNA. A sequência da cadeia X é 5'- GGT CGA CTA ATC GGT AGC-3'. A sequência da cadeia Y é 3'- TCC GTA TCC TGG GCA CAG CCA GCT GAT
TAG CCA TCG AT-5'. As cadeias X e Y foram hibridizadas criando um dominio A de cadeia simples na extremidade 3' da cadeia uma extremidade AT coesiva na extremidade 5' da cadeia Y.
Y e
3. Ligação oligo N e o pGEM3Z-HBV linearizado por Nde I foram ligados, criando um oligonucleótido com oligo N em ambas as extremidades da molécula (Figura 3A). A molécula foi cortado com HinD III, criando dessa forma a sonda modelo designada por pil (Figura 3A). A distância entre o promotor T7 e o dominio A é de 200 pares de bases.
B. Sondas modelo ρΐΐτ,
A sonda modelo ρΐΐχ, foi sintetisada como descrito em A, acima, com a excepçâo de que o pGEM3Z-HBV foi linearizado com Seal, criando desse modo uma região espaçadora maior entre o promotor T7 do dominio B e o dominio A (Figura 3B). Neste caso, o oligómero é designado por oligo S e consiste em cadeias X e Y' . O oligo S difere do oligo N dado que não tem extremidade coesiva. A cadeia X é a mesma que a cadeia X no oligo N, mas à cadeia Y' falta o 5'-TA. As cadeias X e Y' foram hibridizadas criando um dominio A de cadeia simples na extremidade 3'da cadeia Y' e uma extremidade não coesiva na extremidade 5' da cadeia Y'.O plasmídeo linearizado e o oligo S foram ligados na extremidade nâo coesiva. A distância entre o promotor T7 e o domino A é de 900 pares de bases.
C. Sonda Modelo pllp
A sonda modelo pIIr foi sintetisada como descrito em A,
-Μ— acima, com a excepção de que o pGEM3Z-HBV foi linearizado com HinD III (Figura 3C). 0 oligómero é designado por oligo H e consiste em cadeias X e Y''. 0 oligo H difere do oligo N dado que a extremidade coesiva é complementar à extremidade coesiva gerada pela digestão com Hind III. A cadeia X é a mesma que a cadeia X no oligo N, mas a cadeia Y'’ tem a sequência 3'- TCC GTA TCC TGG
GCA CAG CCA GCT GAT TAG CCA TCG TCGA-5'. As cadeias X e Y'' foram hibridizadas criando um dominio A de cadeia simples na extremidade 3' da cadeia Y'’ e a extremidade coesiva TCGA na extremidade 5' da cadeia Y'’. 0 oligo H e o pGEM3Z linearizado com Hind III foram ligados, criando um oligonucleótido com oligo H em ambas as extremidades da molécula (Figura 3C). A molécula foi cortada com Nde I em vez de Hind III, criando assim a sonda modelo designada por pIIR. Esta sonda difere da pll e da ρΐΐχ, dado que a sequência dos dominios é B-C-A. A distância entre o promotor T7 e o dominio A é de 3200 pares de bases.
D. Sondas linker e de captura especificas para o
HIV.
ensaio descrito a seguir ( ver Figura 5) é semelhante ao ensaio descrito no Exemplo 2 acima. Dado que o HIV é o analisado, foi necessário criar sondas de captura de analisado e sondas modelo linker, com sub-dominios homólogos ao genoma do HIV. A sequência destas novas sondas modelo linker são fornecidas a seguir. A porção 5' de cada sonda é complementar a uma porção do genoma do HIV, enquanto que as porções 3' são complementares a uma sequência do oligonucleótido de captura imobilizado ( no caso das sondas de captura) ou ao dominio A da
sonda modelo T7 ( no caso das sondas modelo linker)
Quadro 3
Sondas de captura de analisado
Designação da sonda Sequência
:HIV.96.1.XT1 TTC TAC TAC TTT [TC]AC CCA TGC [AG]TT TAA
AGC TTC TTT GGA GAA AGT GGTG
:HIV.96.2.XT1 TTC TAT TAC TTT [TC]AC CCA TGC [AG]TT CAA
AGC TTC TTT GGA GAA AGT GGT G
•.HIV. 97 .XT1 TGC TTG ATG TCC CCC CAC TGT GTT TAG ι CAT
CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG
:HIV.97.2.XT1 TGC CTG GTG TCC TCC AAC TAT GTT CAG ' CAT
CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG
:HIV.53.XT1 AGG TGA TAT GGC [CT]TG ATG TA[CT] CAT TTG
CCC CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG
:HIV.54.XT1 :HIV.55.XT1 :HIV.68.1.XT1
•.HIV.68.2.XT1 :HIV.99.XT1 zHIV.100.XTl iHIV.lOl.XTl
CAT GGG TAT [TC]AC TTC TGG GCT [GA]AA [AG]GC CTT CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG TTG [TC]GG GGT GGC [TC]CC [TC]TC TGA TAA
TGC TGA CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG
AAT TTT T[GA]A AAT TTT [TC]CC TTC CTT TTC
CAT CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG
AAC TCT T[GA]A AAT TTT [TC]CC TTC CTT TTC
CAT CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG
TTA CTG GTA CAG T[TC]T CAA TAG G[AG]C TAA
T[GT]G CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG
TAA C[TC][TC] TTG GGC CAT CCA T[TC]C CTG
GCT TTC TTC TTT GGA GAA AGT GGT G
CTT TTA TTT TTT CTT CTG TCA ATG GCC ATC
TTC TTT GGA GAA AGT GGT G :HIV.1O2.XT1
AAA TAC TGG AGT ATT GTA TGG ATT [CT]TC
AGC TTC TTT GGA GAA AGT GGT G
Quadro 4
Sondas modelo linker
Designação da sonda
Sequência :HIV.51.LLA2C :HIV.52.LLA2C :HIV.56.LLA2C :HIV.57.LLA2C zHIV.58.1.LLA2C :HIV.58.2.LLA2C :HIV.59.1.LLA2C :HIV.59.2.LLA2C :HIV.60.LLA2C :HIV.62.LLA2C
TCC [CG]CC GCT TAA TAC [TC]GA CGC TCT CGC
ACC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TTA [TA]AT AAT GAT [CT]TA AGT TCT TCT GAT
CCT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
ACT TCC [CT]CT TGG TTC TCT CAT [CT]TG [GA]CC TGG TTA GGC ATA GGA CCC GT GTC TTC [CT]TG AAG GGT ACT AGT[AG]GT TCC TGC
TAT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
GAT AGG TGG ATT A[CT] [TG] TGT CAT CCA T[GC]C TAT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC GAT AGG TGG GTT G[TC][TG] TGT CAT CCA T[GC]C TAT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC ATT ATC CA [TC] CTT TTA TA [GA] ATT TCT CCT
ACT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
ATT ATC CA[TC] CTT TTA TA[GA] ATG TCT CCC
ACT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
CTA TAC AT [TC] CTT ACT ATT TTA TTT AAT
CCC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TT[CT] GCA TTT TGG ACC A[AG][CG] AAG GTT
TCT GTC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
CTC CCT G[AG]C ATG CTG TCA TCA TTT CTT :HIV.63.LLA2C íHIV.64.1.LLA2C iHIV. 64.2.LLA2C iHIV.65.LLA2C iHIV. 98 .LLA2C
CTA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC :HIV.66 .LLA2C iHIV.67.LLA2C :HIV.70.LLA2C iHIV. 71.LLA2C
TTC A[TG]T TGG TGT CCT TCC TT[TC] CCA CAT
TTC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TTC A[TG]T TGG TGT CCT TCC CT[TC] CCA CAT
CTC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
GCC A[GA]A T[CT]T TCC CTA AAA AAT TAG CCT
GTC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC [AG]TC CCA [TG]TC TGC AGC TTC CTC ATT GAT [GA]GT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
ATC ATT TTT GGT TTC CAT [CT]TT C[CT]T GGC
AAA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TGT C[TC]T ACT TTG ATA AAA CCT CCA ATT
CCC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TCT CCA [TC]TT [AG]GT [AG]CT GTC TTT TTT
CTT TAT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
GTA CTG ATA TC [TC] A[AC]T CCC TGG TGT [CT]TC ATT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
iHIV.72.LLA2C GGT GAT CCT TTC CAT CCC TGT GG[ACT] AGC
ACA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
íHIV.73.LLA2C TAA GAT TTT TGT CAT GCT AC[TA] [TC]TG GAA
TAT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
iHIV.69.LLA2C AGA [TC]CC TAC ATA CAA ATC ATC CAT GTA
TTG TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
iHIV.74.LLA2C TAT TTT TG[TC] TCT ATG [CT]TG [CT]CC TAT
TTC TAA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
iHIV.75.LLA2C ATG [TC]TT TTT [GA]TC TGG TGT GGT AA[GA]
TCC CCA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
iHIV.76.LLA2C
ATA [AG]CC CAT CCA AAG [GA]AA TGG [AG]GG :HIV.77.LLA2C
TTC TTT TTA GGC ATA GGA CCC GTG GTC
TA[CT] TAA GTC TTT TGA TGG GTC ATA ATA [TC]AC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HIV.78.1.LLA2C TGT ATA TTT CAG ATT TTT AAA TGG [CT]TC TC TTG
TTA GGC ATA GGA CCC GTG
íHIV.78.2.LLA2C TGT TTT CAG ATT TTT ATA TTG [CT]TC TTG
GTA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HIV.79.LLA2C G[TC]T AA[TC] TGT TT[TC] ACA TCA TTA GTG
TGG GCA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
íHIV. 80 .LLA2C GGA [GA]T[CT] TTT CCC CAT AT[TC] ACT ATG
CTT TCT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HIV.81.LLA2C :HIV.82.LLA2C :HIV.83.LLA2C
CCC CAT CTA CAT AGA A[GAC]G TTT CTG C[TA]C CTA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC TGC TTG TAA [CT]TC AGT [TC]TT CTG ATT TGT
TGT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
ATC TGG TTG TGC TTG AAT [GA]AT [TC]CC [TC]AA TGC ATT AGG CAT AGG ACC CGT GTC
:HIV. 84. LLA2C ATC TAC TTT TTA TTG TTC ATT TCC TCC AAT [TC]CC
GGC ATA GGA CCC GTG TC
íHIV.85.LLA2C TAG CCA TTG CTC TCC AAT T[AG][CT] TGT GAT
ATT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HIV.86.LLA2C GAC ATT TAT CAC AGC T[GA]G CTA CTA TTT
:HIV.87.LLA2C
C[TC]T TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TAT [AG]TA [TG]CC ACT GGC TAC ATG [AG]AC :HIV.88.LLA2C
TGC TAC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TTT TAC TGG CCA TCT TCC TGC TAA TTT TAT
TAG GCA TAG GAC CCG TGT C
íHIV. 89 .LLA2C
TAC TCC TTG ACT TTG GGG [AG]TT GTA GGG
AAT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TCT [TC]TC CCC TGC ACT GTA [CT]CC CCC AAT :HIV. 90 .LLA2C
CCC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HIV.91.LLA2C TAG TTT GTA TGT CTG TTG CTA T[TC]A TG[TC]
CTA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HIV.92.LLA2C TTT GAA TTT TTG T[AG]A TTT G[TC]T TTT GTA
íHIV.93.LLA2C :HIV.94.LLA2C [AGjTT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TCC AGA G[GTA]A G[CT]T TTG CTG GTC CTT
TCC AAA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
TAT T[AG]T C[TC]T GTA TTA CTA CTG CCC CTT
CAC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HIV.95.1.LLA2C TT[GA] CTT TTC TTC TTG GCA CTA CTT TTA
T[GA]T TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HIV.95.2.LLA2C TT[GA] CTT TTC TTC TTG GTA CTA CCT TTA
T[GA]T TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
:HIV.103.LLA2C
TTT TCT TTT AAA ATT GTG [AG]AT GAA [TC]AC
TGC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC
D. Comparação das Sondas Modelo pll em Ensaios de Hibridização do HIV em Plasma Humano
Amostras de plasma humano normal com várias quantidades da sequência alvo sintética de HIV foram preparadas como descrito no Exemplo 2. 10 μΐ do plasma foram adicionados a 12,5 μΐ de tampão de extração (Tris 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, SDS 1%, DNA de esperma de salmão sonifiçado 40μ9/πι1, e proteinase K 2mg/ml), e incubadas em cúpulas de placas de microtitulação, a 65°C durante 30 minutos. As cúpulas foram primeiro preparadas ί
através da ligação de um oligonucleótido de cadeia simples com uma sequência definida ao substrato sólido, como descrito na Exemplo 2. 5 μΐ de NaOH 1 N com 12,5 fmoles de cúpulas de sondas de captura de HIV e sondas linker (descritas acima) foram adicionados e a mistura foi novamente incubada a 65°C durante 30 minutos. De seguida foram adicionados 13 μΐ de MOPS-SSC ( ácido 3-[ N- morfolino] propanosulfónico 0,77 M, NaCl 1,845 M, citrato de sódio 0,185 M) e a mistura foi novamente a incubar a 65°C durante duas horas.
As cúpulas foram depois lavadas duas vezes com um tampão de lavagem A (0,1 x SSC, SDS 0,1%). A seguir às lavagens foram adicionados 30 fmoles de sonda modelo T7 em 40 μΐ de mistura hyb de cavalo ( 50 % de soro de cavalo, NaCl 0,6 M, citrato de sódio 0,06 M SDS 1%) e a mistura foi incubada a 55°C durante uma hora. (A mistura de hibridizaçâo de cavalo foi preparada da maneira que se segue: para dez ml - 504 μΐ de água (tratada com dietil pirocarbonato, DEPC), 336 μΐ de SDS 10%, 60 μΐ de Tris-HCl 1 M (pH 8), 100 μΐ de proteinase K 25 mg/ml, 6 ml de soro de cavalo, incubado a 65°C durante duas horas, adicionando-se lml de água (tratada com DEPC) e 2ml de 20 x SSC).
As cúpulas foram depois lavadas duas vezes com tampão de lavagem A e duas vezes com tampão de lavagem B (0,1 x SSC). De seguida são adicionados 40 μΐ de mistura de transcrição ( TrisHCl 40 mM pH 8, MgCl2 20 mM, 80 unidades de polimerase T7 (New England Biolabs), DTT 10 mM, BSA 0,15 mg/ml, ATP, GTP, UTP,e CTP cada a 1,25 mM, RNAsin 1600 unidades/ml) e a mistura foi incubada num forno a 37°C durante 1,5 horas.
Novas cúpulas foram novamente preparadas através da
ligação de um oligonucleótido de cadeia simples com uma sequência definida ao substrato sólido ( descrito no Exemplo 2). A nova cúpula foram adicionados 12,5 μΐ de tampão de extração (proteinase K 2mg/ml), 5μ1 de soro humano tratado com proteinase K e SDS, 15 μΐ de 20 x SSC, 5 μΐ de SDS 10% contendo 12,5 fmoles de transcritos de sondas de captura e linker amplificadoras, e 12,5 μΐ da mistura da primeira cúpula, a qual contém os transcritos de RNA recentemente formados. Esta mistura foi incubada a 65°C durante 2 horas.
De notar que, em contraste com o protocolo do Exemplo 2, os transcritos das sondas de captura e linker amplificadoras, são usados para ensandwichar o trancrito de RNA (Figura 5). Estas sondas servem por um lado como pontes entre o transcrito e o nucleótido imobilizado, e ainda entre o transcrito e a sonda amplificadora ( a ser adicionada).
As cúpulas são depois lavadas duas vezes com tampão de lavagem A. Foram adicionados a cada cúpula 40 μΐ de mistura de hibridização de cavalo contendo 100 fmoles de uma combinação tipo sonda amplificadora ( como no Exemplo 2), e incubadas a 55°C durante 15 minutos. As cúpulas foram depois lavadas duas vezes com tampão de lavagem A. Foram adicionados a cada cúpula 40 μΐ de mistura de hibridização de cavalo contendo 100 fmoles de sonda da fosfatase alcalina, e incubadas a 55°C durante 15 minutos. ( a mistura de hibridização de cavalo é pré-tratada para remover actividade de RNAase residual, de acordo com a preparação do protocolo descrito atrás, com a excepção de que, após a incubação a 65°C, a solução é arrefecida e são adicionados 60 μΐ de fluoreto de fenil-metil sulfonil 100 mM (PMSF) para inactivar a proteinase K, e a mistura vai novamente a incubar a 37°C durante hora.
As amostras foram ensaiadas por detecção de fosfatase alcalina como descrito no Exemplo 2, acima. As cúpulas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem A, duas vezes com tampão de lavagem B. Foram adicionados 20 μΐ do reagente dioxetano e incubadas a 37°C durante 30 minutos e as cúpulas foram depois lidas num luminómetro.
E. Resultados
J
Foram preparados padrões das várias quantidades de DNA de HIV clonado adicionado a amostras de soro humanas e foram ensaiados como descrito acima. Cada padrão foi ensaiado usando uma das três sondas modelo pil T7 descritas acima. A sensibilidade e amplificação estão ilustradas na Figura 6. Como um controlo Standard, um padrão de DNA de HIV foi ensaiado usando apenas a sonda de ensaio tipo amplificadora de sinal descrita na publicação de Patente Europeia No. 0317077. O uso da sonda modelo T7 fornece aproximadamente um aumento de 30 vezes na £ sensibilidade e aproximadamente um aumento de 50 vezes na amplificação relativamente à polimerase não Standard.
Exemplo 10
Ensaio de Hibridização para o DNA do Vírus da Hepatite C (HCV)
Usando o Procedimento de Ensaio com Placas de
Microtitulação e a RNA Polimerase T7
Os ensaios para a presença de DNA e RNA específicos do
HCV são realizados como descrito no Exemplo 9. Conjuntos de sondas modelo linker e de captura de analisado são preparados como descrito no Exemplo 2 e concebidas para hibridizar com porções do genoma do HCV. Estas sondas estão descritas nas vulgarmente conhecidas PCT US90/02853, publicada a 18 de Maio de 1990. Cada sonda do conjunto tem 50 mer, na qual os 30 primeiros résiduos na extremidade 5' são complementares a sequências do HCV, e os restantes résiduos são o sistema de sequências especificas de captura de analisado e de modelo linker, descritas no Exemplo 2.
Da mesma maneira podem ser analisados outras estirpes de bactérias patogénicas, de virus e parasitas e outros genes que conferem resistência a antibióticos. Será apreciado que o ensaio do invento pode ser adaptado para conduzir múltiplos ensaios para diferentes analisados simultaneamente. Numa das formas, através da mudança de marcador e da sequência da sonda amplificadora para um novo analisado ( bem como as sequências especificas do analisado nas sondas de captura de analisado e de modelo linker), é possivei detectar dois diferentes analisados na mesma amostra na mesma fase sólida. Alternativamente, pela sintese de oligonucleótidos diferentes, ligados ao suporte sólido (Exemplo 2B, acima ) para cada analisado, e ligando cada sequência de oligonucleótido de ligação a diferentes posições numa faixa da membrana, é possivei realizar vários tipos de ensaios diferentes simultaneamente com o mesmo marcador.
Modificações dos métodos acima descritos para realizar o invento, que são óbvias para os especialistas em quimica de ácidos nucleicos, e ensaios clínicos e bioquímicos e áreas
Γ relacionadas são entendidas como estando dentro do espirito das reivindicações que se seguem.

Claims (127)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1- Uma construção polidesoxinucleotidica para utilização como um amplificador de sinal, em ensaios de hibridizaçâo, caracterizada pelo facto de compreender três dominios:
    (a) um primeiro dominio (A) que é de cadeia simples e possui uma sequência nucleotidica complementar a uma sequência alvo?
    (b) um segundo dominio (B) que é de cadeia dupla e capaz de funcionar como um promotor para a actividade da RNA polimerase dependente do DNA; e (c) um terceiro dominio (C) que é quer de cadeia simples ou dupla e adjacente ao segundo dominio referido, de tal forma que o referido terceiro dominio é capaz de funcionar como um modelo para a actividade do promotor do referido segundo dominio.
  2. 2- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto da referida actividade da RNA polimerase dependente do DNA ser derivada a partir do bacteriófago T7.
  3. 3- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto da referida actividade da RNA polimerase dependente do DNA, ser proveniente do bacteriófago T3.
  4. 4- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto da referida actividade da RNA polimerase dependente do DNA ser proveniente do bacteriófago SP6.
  5. 5- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o referido primeiro dominio A ter, pelo menos 10, e não mais do que 40 nucleótidos de comprimento.
  6. 6- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o _J primeiro dominio A ter, pelo menos 15, e não mais do que 30 nucleótidos de comprimento.
  7. 7- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizada pelo facto de o referido segundo dominio B ter, pelo menos 12, e não mais do que 40 nucleótidos em comprimento.
  8. 8- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizada pelo facto de o referido segundo dominio B ter, pelo menos 17, e não mais do que 30 nucleótidos em comprimento.
  9. 9- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizada pelo facto de o referido terceiro dominio C ter, pelo menos 30, e não mais do que 10.000 nucleótidos em comprimento.
  10. 10- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizada pelo facto de o referido terceiro dominio C ter, pelo menos 40, e não mais do que 80 nucleótidos em comprimento.
  11. 11- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizada pelo facto de o referido terceiro dominio C ter , pelo menos, 2 Kb e não mais do que 10 Kb em comprimento.
  12. 12- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizada pelo facto de o referido terceiro dominio C ter, pelo menos, 3 Kb e não mais do que 4 Kb em comprimento.
  13. 13- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizada pelo facto de o referido terceiro dominio C ser constituído, substancialmente, por todo o genoma do virus da Hepatite B.
  14. 14- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizada pelo facto de a sequência para o referido segundo dominio B compreender a sequência:
    5' -TAA TAC GAC TCA CTA TA-3'
    3' -ATT ATG CTG AGT GAT AT-5'
  15. 15- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizada pelo facto de a sequência nucleotidica do referido segundo dominio B ser:
    5' -CTG GCT TAT CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TA-3'
    3' -GAC CGA ATA GCT TTA ATT ATG CTG AGT GAT AT-5'
  16. 16- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o residuo 5' da cadeia superior da sequência nucleotidica, para o referido terceiro dominio C, ser adjacente ao referido segundo dominio B, e ser um residuo de guanosina.
  17. 17- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência para o referido terceiro dominio C ser:
    5' -GGG AGA TGT GGT TGT CGT ACT TAG CGA AAT ACT GTC CGA GTC G-3'
    3' -CCC TCT ACA CCA ACA GCA TGA ATC GCT TTA TGA CAG GCT CAG C-5'
  18. 18- As construções polidesoxinucleotidicas, conforme reivindicado na reivindicação 17, caracterizada pelo facto da extremidade 3' da cadeia superior da sequência nucleotidica de DNA, do referido segundo dominio B, ser ligada à extremidade 5' da cadeia superior da referida sequência nucleotidica do dominio
    J C.
  19. 19- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto do transcrito do referido terceiro dominio C ter dois sub-dominios:
    (a) um primeiro sub-dominio, cy, que é capaz de hibridizar para um linker de captura de oligonucleótido, sendo este linker de captura capaz de hibridizar para um polinucleótido imobilizado num substrato sólido; e (b) um segundo sub-dominio, C2, que é capaz de se ligar a um oligonucleótido linker amplificador, sendo este linker amplificador capaz de se ligar a uma sonda quantificáve1.
  20. 20- Uma construção polidesoxinucleotidica, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto de os primeiro e segundo domínios, B e C, estarem presentes em múltiplas unidades de repetição.
  21. 21- Um método de amplificação de um sinal biológico, usado para detectar e quantificar um oligonucleótido para análise, num ensaio de hibridizaçâo, caracterizado pelo facto de compreender:
    (i) a imobilização do analizado referido, directa ou indirectamente num substrato sólido; e hibridização da construção polidesoxinucleotidica da reivindicação 1, directa ou indirectamente no analizado;
    (ii) remoção de construções polidesoxinucleotidicas não hibridizadas;
    (iii) transcrição de múltiplas cópias de oligómeros de RNA que são complementares da sequência modelo, c', no referido terceiro dominio, C, da referida construção polidesoxinucleotidica através da actividade da RNA polimerase dependente do DNA; e (iv) detecção da quantidade de transcritos de RNA formados na fase (iii).
  22. 22- Um ensaio de hibridização de ácidos nucleicos, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o referido segundo dominio, B, ser proveniente da RNA polimerase dependente do DNA do bacteriófago T7.
  23. 23- Um ensaio de hibridazaçâo de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o segundo dominio, B, ser derivado da RNA polimerase dependente do DNA do bacteriófago T3.
  24. 24- Um ensaio de hibridazaçâo de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o referido segundo dominio, B, ser derivado da RNA polimerase dependente do DNA do bacteriófago SP6.
  25. 25- Um ensaio de hibridazaçâo de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto da referida construção polidesoxinucleotidica ser direetamente hibridizada para um analizado de cadeia simples.
  26. 26- Um ensaio de hibridazação de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de a referida construção polidesoxinucleotidica ser hibridizada para um oligonucleótido linker , possuindo o referido linker um dominio que é capaz de formar híbridos estáveis com o analizado.
  27. 27- Um ensaio de hibridazação de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de:
    (a) um terceiro dominio, C, da referida construção polidesoxinucleotidica ser transcrito na presença de trifosfatos ribonucleotidicos marcados;
    (b) os transcritos do referido terceiro dominio possuírem um primeiro sub-dominio, σχ, complementares a uma sonda de captura oligonucleotidica que se encontra imobilizada num substrato sólido; e (c) os referidos transcritos são imobilizados e quantificados.
  28. 28- Um ensaio de hibridazação de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de:
    (a) um terceiro dominio, C, da referida contruçâo polidesoxinucleotidica ser transcrito na presença de trifosfatos ribonucleotidicos biotinilizados;
    (b) o referido transcrito do referido terceiro dominio possuir um primeiro sub-dominio, 02, que é complementar de uma sonda oligonucleotidica marcada; e (c) os referidos transcritos são imobilizados sobre um substrato sólido avidinilatado; e (d) os referidos transcritos são quantificados.
  29. 29- Um ensaio de hibridazação de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de:
    (a) um terceiro dominio, C, da referida construção polidesoxinucleotidica ser transcrito na presença de, ambos os trifosfatos ribonucleotidicos biotinilizados e marcados;
    (b) os referidos transcritos são imobilizados sobre um substrato sólido avidinilatado; e (c) os referidos transcritos são quantificados.
  30. 30- Um ensaio de hibridazaçâo de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de:
    (a) a transcrição do referido terceiro dominio, C, da referida construção polidesoxinucleotidica, possuir dois subdominios :
    (i) um primeiro sub-dominio, σχ, que é complementar de uma sonda polinucleotidica de captura, sendo a referida sonda imobilizada num substrato sólido; e (ii) um segundo sub-dominio, C2, que é complementar a uma sonda oligonucleotidica marcada;
    (b) o referido transcrito é hibridizado para a referida sonda de captura;
    (c) a referida sonda marcada é hibridizada para os referidos transcritos; e, (d) os referidos transcritos são quantificados.
  31. 31 - Um ensaio de hibridazaçâo de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de:
    (a) o transcrito do referido terceiro dominio, C, da referida construção polidesoxinucleotidica ter dois sub-dominios:
    (i) um primeiro sub-dominio, οχ, que é complementar de uma sonda de captura do transcrito, sendo a mesma capaz de hibridizar para um oligonucleótido que foi imobilizado num substrato sólido; e (ii) um segundo sub-dominio, C2, que é complementar de uma sonda linker, sendo a mesma capaz de hibridizar para um oligonucleótido marcador;
    (b) o referido transcrito é hibridizado para a referida sonda de captura do transcrito e para a referida sonda linker, para formar um transcrito em sandwich;
    (c) o referido transcrito em sandwich é hibridizada para um oligonucleótido imobilizado num substrato sólido;
    (d) a referida sandwich imobilizada é hibridizada para um oligonucleótido marcador; e (e) os referidos transcritos são quantificados.
  32. 32- Um ensaio de hibridização de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de:
    (a) o transcrito do referido terceiro dominio, C, da referida construção polidesoxinucleotidica possuir dois subdominios:
    (i) um primeiro sub-dominio, οχ, que é complementar de uma sonda de captura do transcrito, sendo a mesma capaz de hibridizar para um oligonucleótido que tenha sido imobilizado num substrato sólido; e (ii) um segundo sub-dominio, C2, que é complementar de uma sonda linker amplificadora, sendo a sonda linker capaz de hibridizar para uma sonda amplificadora;
    (b) o referido transcrito é hibridizado para a referida sonda de captura do transcrito e para a referida sonda linker amplificadora, para formar um transcrito em sandwich;
    (c) o referido transcrito em sandwich de transcrito é hibridizado para um oligonucleótido imobilizado num substrato sólido;
    (d) a referida sandwich imobilizada é hibridizada para uma sonda amplificadora;
    (e) a referida sonda amplificadora é hibridizada para um oligonucleótido marcador; e (f) os referidos transcritos são quantificados.
  33. 33- Um ensaio de hibridização de ácido nucleico, conforme _) reivindicado na reivindicação 32, caracterizado pelo facto de o transcrito de RNA ser transcrito a partir do DNA do Virus da
    Hepatite B.
  34. 34- Um ensaio de hibridização de ácido nucleico, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de os referidos segundo e terceiro domínios, B e C, da referida construção polidesoxinucleotidica , estarem presentes em múltiplas unidades de repeticçâo.
  35. 35- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 21, usado para detectar a presença de N. gonorrhoeae, numa amostra biológica, caracterizado pelo facto de o analizado compreender um segmento de DNA ou de RNA de N. gonorrhoeae.
  36. 36- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 21, usado para detectar a presença do virus da Hepatite Β , numa amostra biológica, caracterizado pelo facto de o analizado compreender um segmento DNA ou RNA do virus da Hepatite B .
  37. 37- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 21, usado para detectar a presença de bactérias contendo o gene betalactamase TEM-1, numa amostra biológica, caracterizado pelo facto de o analizado compreender um segmento de DNA ou de RNA do gene da beta-lactamase TEM-1.
  38. 38- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 21, usado para detectar a presença de Chlamydia, numa amostra biológica, caracterizado pelo facto de o analizado compreender um segmento de DNA ou de RNA de Chlamydia.
  39. 39- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 21, usado para detectar a presença de bactérias contendo o determinante M tet, numa amostra biológica, . caracterizado pelo facto de o analizado compreender um segmento de DNA ou de RNA do determinante M tet.
  40. 40- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 21, usado para detectar a presença de HIV, numa amostra biológica, caracterizado pelo facto de o analizado compreender um segmento de DNA ou RNA de HIV.
  41. 41- Método, conforme reivindicado na reivindicação 21, usado para detectar a presença de HCV, numa amostra biológica, caracterizado pelo facto de o referido analizado compreender um segmento de DNA ou RNA de HCV.
  42. 42- Um método de amplificação do sinal biológico usado para detectar e quantificar um receptor ligando, num ensaio de hibridizaçâo, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes etapes:
    (a) imobilização do referido receptor ligando directa ou indirectamente numa fase sólida;
    (b) ligação, ao receptor ligando , de um ligando especifico para o referido receptor, sendo o referido ligando acoplado a um oligonucleótido complementar do primeiro dominio da construção da reivindicação 1.
    (c) remoção do ligando não hibridizado;
    (d) transcrição de múltiplas cópias dos oligõmeros de RNA que são complementares da sequência modelo , c', do terceiro dominio, C, da referida construção polidesoxinucleotidica, através da actividade da RNA polimerase dependente do DNA; e (e) quantificar os transcritos de RNA.
  43. 43- Um ensaio de hibridazação, conforme reivindicado na reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o receptor ligando ser um antigénio, e sendo o ligando um anticorpo que reage imunologicamente com o antigénio.
  44. 44- Uma sonda linker modelo, especifica para um analizado de DNA ou RNA, substancialmente similar a um DNA genómico do HBV.
  45. 45- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TGA CTG [CG]CG ATT GGT [GA]GA GGC AGG [AC]GG AGG TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  46. 46- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: CTT G[AT] [CT] GGG [GA]TT GAA GTC CCA ATC TGG ATT TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  47. 47- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GTT GCG TCA GCA AAC ACT TGG CA [CG] AGA CC[AT] TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  48. 48- Uma sonda linker” modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TAA GTT GGC GAG AAA GT(GA) AAA GCC TG[TC] TT[AC] TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  49. 49- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto possuir a sequência de DNA: GCA GCA AA(GA) CCC AAA AGA CCC ACA A[TG] [TA] C(TG)(TC) TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  50. 50- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: ATG TAT ACC CA (GA) AGA CA [AG] AAG AAA ATT GGT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  51. 51- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TAG AGG ACA AAC GGG CAA CAT ACC TTG [AG]TA TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  52. 52- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GAT GAG GCA TAG CAG CAG GAT GAA GAG GAA TTA GGC ATA GGA
    CCC GTG TC.
  53. 53- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GAT AAA ACG CCG CAG ACA CAT CCA GCG ATA TTA GGC ATA GGA
    CCC GTG TC.
  54. 54- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GGA CAA [AG]TT GGA GGA CA [GA] GAG GTT GGT GAG TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  55. 55- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TTG GAG GTT GGG GAC TGC GAA TTT TGG CCA TTA GGC ATA GGA
    CCC GTG TC.
  56. 56- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: CCA CCA CGA GTC TAG ACT CTG [CT]GG TAT TGT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  57. 57- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GAT TCT TGT CAA CAA GAA AAA CCC CGC CTG TTA GGC ATA GGA
    CCC GTG TC.
    )
  58. 58- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: CAC GAG [CA]AG GGG TCC TAG GAA TCC TGA TGT TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  59. 59- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 44, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: CAG GGT TTA CTG TTC C[TG]G AAC TGG AGC CAC TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  60. 60- Uma sonda de captura para análise, especifica para um analizado de DNA ou de RNA substancialmente similar ao DNA
    J genómico do HBV.
  61. 61- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 60, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: CTT GGC CCC CAA TAC CAC ATC ATC CAT ATA CTT CTT
    TGG AGA AAG TGG TG.
  62. 62- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 60, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GAA AGC CAA ACA GTG GGG GAA AGC CCT ACG CTT CTT
    TGG AGA AAG TGG TG.
  63. 63- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 60, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA; CAC TGA ACA AAT GGC ACT AGT AAA CTG AGC CTT CTT
    TGG AGA AAG TGG TG.
  64. 64- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 60, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA; GAG AAA CGG [AG]CT GAG GCC C[AC]C TCC CAT - AGG
    CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG.
  65. 65- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado £ na reivindicação 60, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA; [GC]CG AAA GCC CAG GA[CT] GAT GGG ATG GGA ATA CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG.
  66. 66- Uma sonda de captura para análise, especifica para um analizado de DNA ou RNA substancialmente similar ao RNA genómico de HIV.
  67. 67- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA; TTC TAC TAC TTT [TC]AC CCA TGC [AG]TT TAA AGC
    TTC TTT GGA GAA AGT GGTG.
    J
  68. 68- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA; TTC TAT TAC TTT [TC]AC CCA TGC [AG]TT CAA AGC
    TTC TTT GGA GAA AGT GGT G.
  69. 69- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TGC TTG ATG TCC CCC CAC TGT GTT TAG CAT CTT CTT
    TGG AGA AAG TGG TG.
  70. 70- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TGC CTG GTG TCC TCC AAC TAT GTT CAG CAT CTT CTT
    TGG AGA AAG TGG TG.
  71. 71- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: AGG TGA TAT GGC [CT]TG ATG TA[CT] CAT TTG CCC
    CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG.
  72. 72- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: CAT GGG TAT [TC]AC TTC TGG GCT [GA]AA [AG]GC CTT CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG.
  73. 73- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TTG [TC]GG GGT GGC [TCJCC [TC]TC TGA TAA TGC TGA CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG.
  74. 74- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: AAT TTT T[GA]A AAT TTT [TC]CC TTC CTT TTC CAT
    CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG.
  75. 75- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: AAC TCT T[GA]A AAT TTT [TC]CC TTC CTT TTC CAT
    CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG.
  76. 76- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TTA CTG GTA CAG T[TC]T CAA TAG G[AG]C TAA T[GT]G CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG.
  77. 77- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TAA C[TC][TC] TTG GGC CAT CCA T[TC]C CTG GCT
    TTC TTC TTT GGA GAA AGT GGT G.
  78. 78- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: CTT TTA TTT TTT CTT CTG TCA ATG GCC ATC TTC TTT
    GGA GAA AGT GGT G.
  79. 79- Uma sonda de captura para análise, conforme reivindicado na reivindicação 66, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: AAA TAC TGG AGT ATT GTA TGG ATT [CT]TC AGC TTC
    TTT GGA GAA AGT GGT G.
  80. 80- Uma sonda linker modelo, especifica para um analizado de DNA ou de RNA substancialmente similar ao RNA genómico do HIV.
  81. 81- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TCC [CG]CC GCT TAA TAC [TC]GA CGC TCT CGC ACC TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  82. 82- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TTA [TA]AT AAT GAT [CT]TA AGT TCT TCT GAT CCT TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  83. 83- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: ACT TCC [CT]CT TGG TTC TCT CAT [CT]TG [GA]CC TGG TTA GGC
    ATA GGA CCC GT GTC.
  84. 84- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TTC [CT]TG AAG GGT ACT AGT [AG]GT TCC TGC TAT TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  85. 85- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GAT AGG TGG ATT A[CT][TG] TGT CAT CCA T[GC]C TAT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  86. 86- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GAT AGG TGG GTT G[TC][TG] TGT CAT CCA T[GC]C TAT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  87. 87- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: ATT ATC CA [TC] CTT TTA TA [GA] ATT TCT CCT ACT TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  88. 88- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: ATT ATC CA [TC] CTT TTA TA [GA] ATG TCT CCC ACT TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  89. 89- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: CTA TAC AT [TC] CTT ACT ATT TTA TTT AAT CCC TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  90. 90- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TT[CT] GCA TTT TGG ACC A[AG][CG] AAG GTT TCT GTC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  91. 91- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: CTC CCT G[AG]C ATG CTG TCA TCA TTT CTT CTA TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  92. 92- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TTC A[TG]T TGG TGT CCT TCC TT[TC] CCA CAT TTC TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  93. 93- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TTC A[TG]T TGG TGT CCT TCC CT[TC] CCA CAT CTC TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  94. 94- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GCC A [GA] A T[CT]T TCC CTA AAA AAT TAG CCT GTC TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  95. 95- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: [AG]TC CCA [TG]TC TGC AGC TTC CTC ATT GAT [GA]GT TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  96. 96- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: ATC ATT TTT GGT TTC CAT [CT]TT C[CT]T GGC AAA TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  97. 97- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizado pelo facto de possuir a sequência de DNA: TGT C[TC]T ACT TTG ATA AAA CCT CCA ATT CCC TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  98. 98- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TCT CCA [TC]TT [AG]GT [AG]CT GTC TTT TTT CTT TAT TTA GGC
    OS58»mí—-ÍγATA GGA CCC GTG TC.
  99. 99- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GTA CTG ATA TC[TC] A[AC]T CCC TGG TGT [CT]TC ATT TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  100. 100- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GGT GAT CCT TTC CAT CCC TGT GG[ACT] AGC ACA TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  101. 101- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TAA GAT TTT TGT CAT GCT AC [TA] [TC]TG GAA TAT TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  102. 102- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: AGA [TC]CC TAC ATA CAA ATC ATC CAT GTA TTG TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  103. 103- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TAT TTT TG[TC] TCT ATG [CT]TG [CT]CC TAT TTC TAA TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  104. 104- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: ATG [TC]TT TTT [GA]TC TGG TGT GGT AA[GA] TCC CCA TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  105. 105- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: ATA [AC]CC CAT CCA AAG [GA]AA TGG [AG]GG TTC TTT TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG GTC.
  106. 106- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TA[CT] TAA GTC TTT TGA TGG GTG ATA ATA [TC]AC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  107. 107- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TGT TTT CAG ATT TTT AAA TGG [CT]TC TTG ATA TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  108. 108- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TGT TTT CAG ATT TTT ATA TTG [CT]TC TTG GTA TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  109. 109- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: G[TC]T AA[TC] TGT TT[TC] ACA TCA TTA GTG TGG GCA TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  110. 110- Uma sonda linker” modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GGA [GA]T[CTj TTT CCC CAT AT(TC) ACT ATG CTT TCT TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  111. 111- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: CCC CAT CTA CAT AGA A[GAC]G TTT CTG C[TA]C CTA TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  112. 112- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TGC TTG TAA [CT]TC AGT (TC)TT CTG ATT TGT TGT TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  113. 113- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: ATC TGG TTG TGC TTG AAT [GA]AT [TC]CC [TC]AA TGC ATT AGG CAT AGG ACC CGT GTC.
  114. 114- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: ATC TAC TTG TTC ATT TCC TCC AAT [TC]CC TTT TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  115. 115- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TAG CCA TTG CTC TCC AAT T[AG][CT] TGT GAT ATT TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  116. 116- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: GAC ATT TAT CAC AGC T[GA]G CTA CTA TTT C[TC]T TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
  117. 117- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TAT [AG]TA [TG]CC ACT GGC TAC ATG [AG]AC TGC TAC TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  118. 118- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TTT TAC TGG CCA TCT TCC TGC TAA TTT TAT TAG GCA TAG GAC
    CCG TGT C.
  119. 119- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TAC TCC TTG ACT TTG GGG (AG)TT GTA GGG AAT TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  120. 120- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TCT [TC]TC CCC TGC ACT GTA [CT]CC CCC AAT CCC TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  121. 121- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TAG TTT GTA TGT CTG TTG CTA T[TC]A TG[TC] CTA TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  122. 122- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TTT GAA TTT TTG T[AG]A TTT G[TC]T TTT GTA [AG]TT TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  123. 123- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TCC AGA G[GTA]A G[CT]T TTG CTG GTC CTT TCC AAA TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  124. 124- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TAT T[AG]T C[TC]T GTA TTA CTA CTG CCC CTT CAC TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  125. 125- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TT [GA] CTT TTC TTC TTG GCA CTA CTT TTA T[GA]T TTA GGC
    ATA GGA CCC GTG TC.
  126. 126- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TT[GA] CTT TTC TTC TTG GTA CTA CCT TTA T[GA]T TTA GGC ATA
    GGA CCC GTG TC.
  127. 127- Uma sonda linker modelo, conforme reivindicado na reivindicação 80, caracterizada pelo facto de possuir a sequência de DNA: TTT TCT TTT AAA ATT GTG [AG]AT GAA [TC]AC TGC TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC.
    Lisboa, 10 de Janeiro de 1991
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