KR20230031093A - 사람 엔테로바이러스, 엔테로바이러스 71 또는 이들을 동시에 검출할 수 있는 엔테로바이러스 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사람 엔테로바이러스(Human enterovirus, HEV), 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71, EV 71) 또는 이들을 동시에 검출할 수 있는 엔테로바이러스 검출 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 다양한 타입의 사람 엔테로바이러스(HEV)를 검출하고, 동시에 엔테로바이러스 71(EV 71)을 구별하여 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 제공하고, 이를 포함하는 조성물 또는 키트를 사용하여 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)을 동시에 다중 검출할 수 있는 방법을 제공하며, 이는 단일 검출 방법과 유사한 수준의 민감도 및 재현성을 나타낸다.
Description
본 발명은 사람 엔테로바이러스, 엔테로바이러스 71 또는 이들을 동시에 검출할 수 있는 엔테로바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
엔테로바이러스는 피코르나비리대 과(Picornaviridae family) 엔테로바이러스 속(Enterovirus genus)에 속하며 24-30nm 크기를 가지는 매우 작은 정이십면체의 피막이 없는 바이러스이다. 유전체로 단일가닥의 RNA를 가지기 때문에 RNA바이러스로 분류된다. 엔테로바이러스의 경우, 바이러스의 유전체를 둘러싸고 있는 단백질 껍질인 캡시드(capsid)는 12개의 펜타머(pentamer)로 구성되어 있으며, 각각의 펜타머는 VP1, VP2, VP3, VP4의 네 가지 폴리펩티드(polypeptide)로 이루어진 5개의 프로토머(protomer)로 구성되어 있다.
인간과 동물에게서 질환을 일으키는 엔테로바이러스는 폴리오바이러스(poliovirus)와 비폴리오 엔테로바이러스(non-polioenterovirus)로 크게 구분되며, 비폴리오 엔테로바이러스는 다시 콕사키바이러스 A, 콕사키바이러스 B, 에코바이러스, 및 기타 엔테로바이러스로 구분된다. 엔테로바이러스의 종류는 매우 다양하여 혈청형에 따라 약 116여종이 분류되어 있다(도 1).
상세하게, 콕사키바이러스 A에는 혈청형(serotype)에 따라 A1형부터 A22형까지와 A24형으로 나뉘어져 총 23종이 있으며, 콕사키바이러스 B에는 B1형부터 B6형까지로 나뉘어져 총 6종이 있다. 또 에코바이러스는 28개의 혈청형으로 구분된다. 근래에는 바이러스의 성상과 분류 사이에 일치하지 않는 경우가 자주 발생하여 이를 개선하기 위해 새로 분리된 엔테로바이러스를 에코바이러스나 콕사키바이러스로 분류하지 않고 새로운 번호를 부여하여 분류하고 있는데, 이를 본 명세서에서는 "기타 엔테로바이러스"로 지칭하였다. 이를 "신종 엔테로바이러스(new enterovirus)"라고 부르기도 한다.
기타 엔테로바이러스의 예로 엔테로바이러스 70, 엔테로바이러스 71, 엔테로바이러스 72, 엔테로바이러스 73 등을 들 수 있다.
엔테로바이러스 70은 급성출혈성 결막염의 원인 바이러스로 1969년에 아프리카의 가나에서 크게 유행한 바 있는데, 이 무렵 미국에서 아폴로 11호의 달 착륙이 있었기 때문에 이 바이러스에 의한 감염증을 아폴로 눈병이라 부르기도 했었다. 이후 이 엔테로바이러스 70은 전 세계로 전파되었으며 우리나라에서는 1971년에 대 유행한 바 있다.
엔테로바이러스 71은 수막염 이외에 흔히 수족구병(hand-foot and mouth disease)이나 포진성 구협염을 일으키며, 드물게는 뇌나 폐에 심각한 합병증을 일으켜 사망에 이르게 하기도 한다. 이 엔테로바이러스 71은 1997년에서 1998년에 걸쳐 대만에서 크게 유행한 적이 있으며 국내에서도 2000년에 유행한 바가 있다.
엔테로바이러스 72는 A형 간염 바이러스(hepatitis A)로 알려져 있으며, 이제는 더 이상 엔테로바이러스로 분류하지 않고 새로운 속인 헤파토바이러스(Hepatovirus)로 따로 분류한다.
엔테로바이러스 73은 최근에 보고된 형으로 무균성 수막염 환자에서 검출되었으며, 국내에서 스웨덴으로 입양된 아이에게서 검출이 보고된 바 있다. 따라서 국내에서도 유행하고 있을 것으로 추정된다.
엔테로바이러스는 유·소아 층에 주로 침범하며 특히 위생상태가 나쁜 환경에서 흔히 전파되는 전염성 병원체로서 주로 분변-경구 및 호흡기 경로로 전파되며 전 세계적으로 널리 분포되어 있어 인체감염은 계속적으로 보고되고 있다.
폴리오바이러스를 비롯한 엔테로바이러스는 인체 내에 들어오면 구인두 (oropharynx)와 소장 점막세포에서 일차적으로 증식하며 혈류를 타고 체내의 여러 기관으로 바이러스가 퍼지게 되어 그에 수반되는 임상 증상 또는 질환을 초래하며, 바이러스는 주로 분변과 호흡기 분비물로 배출이 된다.
엔테로바이러스에 따른 임상증상은 하기와 같다:
폴리오바이러스에서 소아마비, 무균성 뇌막염 및 발열증;
콕사키바이러스 A(CA)에서 포진성 구협염(Type 2~6, 8, 10), 급성 임파선 또는 인두염(Type 10), 무균성 뇌막염(Type 2, 4, 7, 9, 10), 소아마비(Type 7, 9), 홍역(Type 4, 6, 9, 16), 수족구질환(Type 5, 10, 16), 소아성 폐렴(Type 9, 16), 감기(Type 21, 24), 간염(Type 4, 9), 유아성 설사(Type 18, 20~22, 24) 및 급성출혈성 결막염(Type 24);
콕사키바이러스 B(CB)에서 흉막염(Type 1~5), 무균성 뇌막염(Type 1~6), 소아마비, 심막염, 심근염(Type 1~5), 호흡기질환과 폐렴(Type 4~5), 발진(Type 5), 간염(Type 5), 만성피로증;
에코바이러스에서 무균성 뇌막염(Type 12, 24, 26, 29, 32~34제외), 소아마비(Type 4, 6, 9, 11, 30), 뇌염, 기능장애 또는 Guillain-Berre 증후군(Type 2, 6, 9, 19), 홍역(Type 2, 4, 6, 9, 11, 16, 18), 호흡기질환(Type 4, 9, 11, 20, 25) 및 기타 설사, 유행성류마티즘, 심막염, 심근염, 간장애; 및
기타 엔테로바이러스에서 폐렴과 기관지염(Type 68), 급성 출혈성 결막염(Type 70), 소아마비, 무균성 뇌막염 및 수족구질환(Type 71) 등이 있다.
엔테로바이러스로 수반되는 임상 증상 또는 질환을 일으키는 병원체는 엔테로바이러스 뿐만 아니라, 많고 다양한 병원체가 있기 때문에 정확한 엔테로바이러스의 치료를 하기 위해서는 엔테로바이러스의 감별진단이 반드시 필요하다.
현재 엔테로바이러스의 진단은 크게 세포배양과 중화시험에 의한 바이러스 분리동정 검사와 역전사 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 유전자 검사로 구분이 된다.
이러한 감염원의 유전체에 기반한 진단법인 PCR 진단은 PCR 주형인 유전체로부터 다수의 증폭 산물을 만들 수 있는 PCR의 고유한 특징으로 인하여 타 진단 방법에 비하여 매우 높은 진단 민감도를 제공해 줄 수 있다. 높은 민감도를 제공해 줄 수 있다는 점과 진단에 필요한 소요 시간이 타 방법에 비교하여 매우 짧다는 이유로 인하여 PCR을 이용한 진단 방법이 점차적으로 타 진단 방법을 대체해 가고 있다.
실시간(Real-time) 중합효소 연쇄반응(PCR)은 기존의 PCR과 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간으로 측정하는 원리를 갖는다.
형광 검출방법으로는 인터킬레이팅(interchelating) 방법, TaqManTM 프로브법 및 분자비콘(Molecular becon) 방법 등이 있다. 이들은 각각 다른 원리를 이용하여 형광의 증가를 검출하는 방법이다.
TaqManTM 프로브법은 표적 핵산 검출을 위하여 형광이 표지된 프로브를 이용하는데, 프로브의 5`말단에는 서로 다른 파장을 나타내는 FAM, VIC, TET, HEX 등의 형광 염료를 부착하며, 3`말단에는 TAMRA, Black hole quencher 등의 소광자를 부착한다.
5'말단을 형광 염료 및 3'말단을 소광자로 태깅된 올리고뉴클레오티드(TaqManTM 프로브)가 PCR 반응액에 첨가되고, 그 후 TaqManTM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화되지만, 프로브상의 소광자에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성으로 주형에 혼성화한 TaqManTM 프로브만 분해되어 형광 염료가 프로브에서 유리됨으로써 소광자에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다.
본 발명에서는 사람 엔테로바이러스, 엔테로바이러스 71 또는 이들을 동시에 검출할 수 있는 엔테로바이러스 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 통해, 민감도가 높은 엔테로바이러스의 검출 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다양한 타입의 사람 엔테로바이러스(Human enterovirus, HEV)를 검출하고, 동시에 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71, EV 71) 을 구별하여 특이적으로 검출할 수 있는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71의 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 사용하고, 실시간(real-time) 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71의 동시 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머;
서열번호 4내지 6의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머; 및
서열번호 7로 기재되는 프로브로 이루어진 사람 엔테로바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 8 내지 9의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머;
서열번호 10 의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머; 및
서열번호 11 내지 13으로 기재되는 프로브로 이루어진 엔테로바이러스 71 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 성분을 포함하는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71의 동시 검출용 조성물을 제공한다.
a) 서열번호 1 내지 6으로 기재되는 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트;
b) 서열번호 7로 기재되는 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프로브;
c) 서열번호 8 내지 10으로 기재되는 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프라이머 세트; 및
d) 서열번호 11 내지 13으로 기재되는 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프로브 세트.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71의 동시 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 사용하고, RT-PCR을 수행하는 단계를 포함하는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71의 동시 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71을 높은 민감도 및 특이도로 동시에 구분하여 검출할 수 있고, 이를 이용한 실시간 RT-PCR 수행 시 재현성 있는 결과를 얻을 수 있으므로, 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71의 검출 및 감별진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 엔테로바이러스(Enterovirus)의 분류를 나타낸 도이다.
도 2는 엔테로바이러스(Enterovirus)의 유전체 구조(genome structure)를 나타낸 도이다.
도 3은 사람 엔테로바이러스(HEV)의 5'NCR 서열 정렬 및 프로브 설계 부위를 나타낸 도이다.
도 4는 사람 엔테로바이러스(HEV) 프라이머 및 프로브 성능 확인 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 사람 엔테로바이러스(HEV)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 단일(singleplex) 반응액에서의 CA10에 대한 농도별 효율을 확인한 그래프이다.
도 5b는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 이중(duplex) 반응액에서의 CA10에 대한 농도별 효율을 확인한 그래프이다.
도 5c는 사람 엔테로바이러스(HEV)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 단일(singleplex) 반응액에서의 EV71-B5에 대한 농도별 효율을 확인한 그래프이다.
도 5d는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 이중(duplex) 반응액에서의 EV71-B5에 대한 농도별 효율을 확인한 그래프이다.
도 6은 양성 시료(Vircell-MBC019)를 이용한 Mastermix 별 검출 효율의 비교 결과를 나타낸 그래프이다.(빨강： Real-time RT-PCR Mastermix A, 파랑: Real-time RT-PCR Mastermix B, 검정: 내부 대조군(IC))
도 7은 확립된 사람 엔테로바이러스(HEV) Real-time RT-PCR 시스템의 합성된 양성표준인 in vitro transcribed RNA를 확인한 그래프이다.(빨간색: HEV, 파란색: IC)
도 8은 엔테로바이러스 71(EV 71) 국내 분리주의 VP1 서열 정렬 및 프로브 설계 부위를 나타낸 도이다.
도 9는 합성된 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트를 이용해 EV 71 양성 표준 RNA 시료에 대한 실시간 증폭곡선을 나타낸 그래프이다.
도 10a는 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-B5에 대한 농도별 이중(duplex) 효율을 확인한 그래프이다.(빨간색: EV 71 단일 반응액, 파란색: EV 71 및 IC 이중 반응액, 노란색: HEV 및 IC 이중 반응액).
도 10b는 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-C4a(2017)에 대한 농도별 이중(duplex) 효율을 확인한 그래프이다.(빨간색: EV 71 단일 반응액, 파란색: EV 71 및 IC 이중 반응액, 노란색: HEV 및 IC 이중 반응액).
도 10c는 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-C4a(2018)에 대한 농도별 이중(duplex) 효율을 확인한 그래프이다.(빨간색: EV 71 단일 반응액, 파란색: EV 71 및 IC 이중 반응액, 노란색: HEV 및 IC 이중 반응액).
도 10d는 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-C4a(2019)에 대한 농도별 이중(duplex) 효율을 확인한 그래프이다.(빨간색: EV 71 단일 반응액, 파란색: EV 71 및 IC 이중 반응액, 노란색: HEV 및 IC 이중 반응액).
도 11은 양성 시료(Vircell-MBC019)를 이용한 Mastermix 별 검출 효율의 비교 결과를 나타낸 그래프이다.(빨간색： Real-time RT-PCR Mastermix A, 파란색: Real-time RT-PCR Mastermix B)
도 12는 확립된 엔테로바이러스 71(EV 71) Real-time PCR 시스템의 합성된 양성표준인 in vitro transcribed RNA를 확인한 그래프이다.(빨간색: EV 71, 파란색: IC)
도 13은 합성된 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트를 이용해 각 양성 시료에 대한 실시간 증폭곡선을 나타낸 그래프이다.(빨간색: EV 71, 파란색 : HEV)
도 14a는 사람 엔테로바이러스(HEV), 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-B5에 대한 농도별 단일(singleplex) 효율을 확인한 그래프이다(빨간색: HEV, 파란색: EV 71, 검은색: IC).
도 14b는 사람 엔테로바이러스(HEV), 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-B5에 대한 농도별 다중(multiplex) 효율을 확인한 그래프이다(빨간색: HEV, 파란색: EV 71, 검은색: IC).
도 14c는 사람 엔테로바이러스(HEV), 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-C4a에 대한 농도별 단일(singleplex) 효율을 확인한 그래프이다(빨간색: HEV, 파란색: EV 71, 검은색: IC).
도 14d는 사람 엔테로바이러스(HEV), 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-C4a에 대한 농도별 다중(multiplex) 효율을 확인한 그래프이다(빨간색: HEV, 파란색: EV 71, 검은색: IC).
도 15a는 양성 시료(EV 71-B5 및 EV 71-C4a)를 이용한 Mastermix A의 단일(singleplex) 및 다중(Multiplex) 검출 효율의 비교 결과를 나타낸 그래프이다(빨간색： 다중 반응액, 파란색: HEV 단일 반응액, 노란색: EV 71 단일 반응액).
도 15b는 양성 시료(EV 71-B5 및 EV 71-C4a)를 이용한 Mastermix B의 단일(singleplex) 및 다중(Multiplex) 검출 효율의 비교 결과를 나타낸 그래프이다(빨간색： 다중 반응액, 파란색: HEV 단일 반응액, 노란색: EV 71 단일 반응액).
도 16은 확립된 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71) 다중(multiplex) Real-time RT-PCR 시스템의 합성된 양성표준인 in vitro transcribed RNA를 확인한 그래프이다.(빨간색: HEV, 파란색: EV 71, 보라색: IC)
도 17은 사람 엔테로바이러스(HEV)의 직선성 시험을 위해 Vircell-MBC019를 이용하여 표준 곡선(Standard curve)을 작성한 그래프이다.(단위: genome copies/㎕)
도 18은 사람 엔테로바이러스(HEV)의 직선성 시험을 위해 HEV 합성 RNA를 이용하여 표준 곡선(Standard curve)을 작성한 그래프이다.(단위: target copies/㎕)
도 19는 엔테로바이러스 71(EV 71)의 직선성 시험을 위해 Vircell-MBC019 를 이용하여 표준 곡선(Standard curve)을 작성한 그래프이다.(단위: genome copies/㎕)
도 20은 엔테로바이러스 71(EV 71)의 직선성 시험을 위해 합성 RNA를 이용하여 표준 곡선(Standard curve)을 작성한 그래프이다.(단위: target copies/㎕)
도 2는 엔테로바이러스(Enterovirus)의 유전체 구조(genome structure)를 나타낸 도이다.
도 3은 사람 엔테로바이러스(HEV)의 5'NCR 서열 정렬 및 프로브 설계 부위를 나타낸 도이다.
도 4는 사람 엔테로바이러스(HEV) 프라이머 및 프로브 성능 확인 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 사람 엔테로바이러스(HEV)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 단일(singleplex) 반응액에서의 CA10에 대한 농도별 효율을 확인한 그래프이다.
도 5b는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 이중(duplex) 반응액에서의 CA10에 대한 농도별 효율을 확인한 그래프이다.
도 5c는 사람 엔테로바이러스(HEV)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 단일(singleplex) 반응액에서의 EV71-B5에 대한 농도별 효율을 확인한 그래프이다.
도 5d는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 이중(duplex) 반응액에서의 EV71-B5에 대한 농도별 효율을 확인한 그래프이다.
도 6은 양성 시료(Vircell-MBC019)를 이용한 Mastermix 별 검출 효율의 비교 결과를 나타낸 그래프이다.(빨강： Real-time RT-PCR Mastermix A, 파랑: Real-time RT-PCR Mastermix B, 검정: 내부 대조군(IC))
도 7은 확립된 사람 엔테로바이러스(HEV) Real-time RT-PCR 시스템의 합성된 양성표준인 in vitro transcribed RNA를 확인한 그래프이다.(빨간색: HEV, 파란색: IC)
도 8은 엔테로바이러스 71(EV 71) 국내 분리주의 VP1 서열 정렬 및 프로브 설계 부위를 나타낸 도이다.
도 9는 합성된 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트를 이용해 EV 71 양성 표준 RNA 시료에 대한 실시간 증폭곡선을 나타낸 그래프이다.
도 10a는 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-B5에 대한 농도별 이중(duplex) 효율을 확인한 그래프이다.(빨간색: EV 71 단일 반응액, 파란색: EV 71 및 IC 이중 반응액, 노란색: HEV 및 IC 이중 반응액).
도 10b는 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-C4a(2017)에 대한 농도별 이중(duplex) 효율을 확인한 그래프이다.(빨간색: EV 71 단일 반응액, 파란색: EV 71 및 IC 이중 반응액, 노란색: HEV 및 IC 이중 반응액).
도 10c는 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-C4a(2018)에 대한 농도별 이중(duplex) 효율을 확인한 그래프이다.(빨간색: EV 71 단일 반응액, 파란색: EV 71 및 IC 이중 반응액, 노란색: HEV 및 IC 이중 반응액).
도 10d는 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-C4a(2019)에 대한 농도별 이중(duplex) 효율을 확인한 그래프이다.(빨간색: EV 71 단일 반응액, 파란색: EV 71 및 IC 이중 반응액, 노란색: HEV 및 IC 이중 반응액).
도 11은 양성 시료(Vircell-MBC019)를 이용한 Mastermix 별 검출 효율의 비교 결과를 나타낸 그래프이다.(빨간색： Real-time RT-PCR Mastermix A, 파란색: Real-time RT-PCR Mastermix B)
도 12는 확립된 엔테로바이러스 71(EV 71) Real-time PCR 시스템의 합성된 양성표준인 in vitro transcribed RNA를 확인한 그래프이다.(빨간색: EV 71, 파란색: IC)
도 13은 합성된 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트를 이용해 각 양성 시료에 대한 실시간 증폭곡선을 나타낸 그래프이다.(빨간색: EV 71, 파란색 : HEV)
도 14a는 사람 엔테로바이러스(HEV), 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-B5에 대한 농도별 단일(singleplex) 효율을 확인한 그래프이다(빨간색: HEV, 파란색: EV 71, 검은색: IC).
도 14b는 사람 엔테로바이러스(HEV), 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-B5에 대한 농도별 다중(multiplex) 효율을 확인한 그래프이다(빨간색: HEV, 파란색: EV 71, 검은색: IC).
도 14c는 사람 엔테로바이러스(HEV), 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-C4a에 대한 농도별 단일(singleplex) 효율을 확인한 그래프이다(빨간색: HEV, 파란색: EV 71, 검은색: IC).
도 14d는 사람 엔테로바이러스(HEV), 엔테로바이러스 71(EV 71) 및 내부 대조군(IC)의 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 EV 71-C4a에 대한 농도별 다중(multiplex) 효율을 확인한 그래프이다(빨간색: HEV, 파란색: EV 71, 검은색: IC).
도 15a는 양성 시료(EV 71-B5 및 EV 71-C4a)를 이용한 Mastermix A의 단일(singleplex) 및 다중(Multiplex) 검출 효율의 비교 결과를 나타낸 그래프이다(빨간색： 다중 반응액, 파란색: HEV 단일 반응액, 노란색: EV 71 단일 반응액).
도 15b는 양성 시료(EV 71-B5 및 EV 71-C4a)를 이용한 Mastermix B의 단일(singleplex) 및 다중(Multiplex) 검출 효율의 비교 결과를 나타낸 그래프이다(빨간색： 다중 반응액, 파란색: HEV 단일 반응액, 노란색: EV 71 단일 반응액).
도 16은 확립된 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71) 다중(multiplex) Real-time RT-PCR 시스템의 합성된 양성표준인 in vitro transcribed RNA를 확인한 그래프이다.(빨간색: HEV, 파란색: EV 71, 보라색: IC)
도 17은 사람 엔테로바이러스(HEV)의 직선성 시험을 위해 Vircell-MBC019를 이용하여 표준 곡선(Standard curve)을 작성한 그래프이다.(단위: genome copies/㎕)
도 18은 사람 엔테로바이러스(HEV)의 직선성 시험을 위해 HEV 합성 RNA를 이용하여 표준 곡선(Standard curve)을 작성한 그래프이다.(단위: target copies/㎕)
도 19는 엔테로바이러스 71(EV 71)의 직선성 시험을 위해 Vircell-MBC019 를 이용하여 표준 곡선(Standard curve)을 작성한 그래프이다.(단위: genome copies/㎕)
도 20은 엔테로바이러스 71(EV 71)의 직선성 시험을 위해 합성 RNA를 이용하여 표준 곡선(Standard curve)을 작성한 그래프이다.(단위: target copies/㎕)
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 기재되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 3의 정방향(forward) 프라이머 및 서열번호 4 내지 6의 역방향(reverse) 프라이머를 포함한다.
상기 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트는 5'NCR(non-coding region) 부위(UTR; Untranslated region 이라고도 함)를 표적 핵산으로 설계된 프라이머 세트이다.
또한, 본 발명은 서열번호 8 내지 10으로 기재되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 8의 정방향(forward) 프라이머 및 서열번호 9 및 10의 역방향(reverse) 프라이머를 포함한다.
상기 프라이머의 염기서열을 다양하게 구성한 것은, 다중 검출을 하면서도 높은 민감도와 재현성을 유지할 수 있도록 하기 위함이다. 또한, 상기 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프라이머 세트는 캡시드 단백질인 VP1(viral protein 1) 부위를 표적 핵산으로 설계된 프라이머 세트이다.
상기 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프라이머 세트는 표적 핵산에 상보적으로 결합 가능한 염기서열의 길이가 20 내지 26bp(base pair), 바람직하게 18 내지 30bp이고; G+C함량이 43~60%, 바람직하게 40~60%이고; 및 융해 온도(Tm, melting temperature)가 50~57℃, 바람직하게 50~65℃인 것을 특징으로 한다.
상기 염기서열 길이의 범위에서 주형 DNA와 특이적으로 결합(annealing)할 수 있다.
융해온도(Tm)는 이중 가닥의 DNA가 한 가닥으로 되는 온도변화에 있어 그 중간 값을 의미한다. 이 값은 DNA의 길이 및 염기 조성에 따라 다르게 나타나며, 이 값이 높을수록 강하게 결합되어 있는 것을 의미한다. 융해온도(Tm)을 기준으로 결합(annealing)온도를 정하고, 일반적으로 Tm - 5℃로 설정한다.
상기 융해온도(Tm) 범위에서 프라이머가 주형 DNA에 원하는 위치에 안정적으로 결합할 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.
이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다.
핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프로브를 제공한다.
상기 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프로브는 5'NCR(non-coding region) 부위를 표적 핵산으로 설계된 프로브이다.
또한, 본 발명은 서열번호 11 내지 13으로 기재되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프로브 세트를 제공한다.
또한, 상기 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프로브 세트는 VP1(viral protein 1) 부위를 표적 핵산으로 설계된 프로브 세트이다.
상기 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프로브 세트는 표적 핵산에 상보적으로 결합 가능한 염기서열의 길이가 14 내지 27bp, 바람직하게 15 내지 30bp이고; G+C함량이 43~64%, 바람직하게 40~60% 이고; 및 융해 온도(Tm, melting temperature)가 46~66℃, 바람직하게 68~70℃인 것을 특징으로 하는 프로브이다.
상기 본 발명에서, 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프로브와 달리, 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프로브의 염기서열을 다양하게 구성한 것은, 다중 검출을 하면서도 높은 특이도와 재현성을 유지할 수 있도록 하기 위함이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수 개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.
이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다.
핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프로브는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명은 상기 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프로브가 이의 5' 말단에 형광 염료(fluorescence dye)가 추가로 더 접합된, 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프로브가 이의 5' 말단에 형광 염료가 추가로 더 접합된, 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프로브 세트를 제공한다.
상기 형광 염료는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine isothiocyanat), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 형광 염료로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프로브가 이의 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합된, 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프로브가 이의 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합된, 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프로브 세트를 제공한다.
상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 사람 엔테로바이러스(HEV)를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 조성물을 제공한다.
상기 사람 엔테로바이러스 검출용 조성물은 최소 검출한계가 10-1 내지 101 copies/㎕인 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 엔테로바이러스 71(EV 71)을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 조성물을 제공한다.
상기 엔테로바이러스 71 검출용 조성물은 최소 검출한계가 100 copies/㎕인 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71을 동시에 검출하되, 엔테로바이러스 71을 구별하여 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71 동시 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71 동시 검출용 조성물은 최소 검출한계가 100 내지 101 copies/㎕인 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71 동시 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물들은 각각 내부 대조군(internal control, IC)을 더 포함할 수 있다.
상기 내부 대조군은 상기 조성물에 포함된 프라이머, 프로브, 효소 등이 정상적으로 작동하는 지 여부 및 최소 검출한계 등을 확인할 수 있는 역할을 한다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소 등을 포함할 수 있다.
역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다.
중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
뉴클레아제 활성을 갖는 적합한 DNA 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieu를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 사람 엔테로바이러스 검출용 조성물을 포함하는 사람 엔테로바이러스 검출용 키트를 제공한다.
상기 사람 엔테로바이러스 검출용 키트는 최소 검출한계가 100 내지 101 copies/㎕인 사람 엔테로바이러스 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 엔테로바이러스 71 검출용 조성물을 포함하는 엔테로바이러스 71 검출용 키트를 제공한다.
상기 엔테로바이러스 71 검출용 키트는 최소 검출한계가 100 내지 101 copies/㎕인 엔테로바이러스 71 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71을 동시에 검출하되, 엔테로바이러스 71을 구별하여 특이적으로 검출할 수 있는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71 동시 검출용 키트를 제공한다.
상기 동시 검출용 키트는 최소 검출한계가 100 내지 101 copies/㎕인 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71 동시 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트들은 각각 내부 대조군(internal control, IC)을 더 포함할 수 있다.
상기 내부 대조군은 상기 조성물에 포함된 프라이머, 프로브, 효소 등이 정상적으로 작동하는 지 여부, 최소 검출한계 등을 확인할 수 있는 역할을 한다.
상기 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71 동시 검출용 키트는 Coxsackievirus CA16, Coxsackievirus, Coxsackievirus B4, Coxsackievirus B2, Coxsackievirus B5, Coxsackievirus B3 및 엔테로바이러스 68, 엔테로바이러스 71으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스를 검출한다.
상기 키트들은 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
상기 키트들은 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
한편, 상기 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 상기 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71의 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용하여 실시간(Real-time) 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스 및 엔테로바이러스 71의 동시 검출 방법을 제공한다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 대변 또는 소변 중 어느 하나 이상의 것으로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 임상시료는 바람직하게는 대변, 직장도말, 뇌척수액, 혈액, 구인두도말, 비인두도말 및 비강세척액으로부터 얻은 검체일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실험예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실험예 1> 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 실시간 PCR system 개발
실험예 1-1. 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 프라이머 및 프로브 제작
사람 엔테로바이러스(Human-enterovirus, HEV)의 PCR 분석 기술에서 임상 시료로부터 엔테로바이러스 검출을 위한 표적유전자로는 5'NCR(Non-coding region) 부위와 엔테로바이러스의 혈청형을 결정하는 VP1(viral protein 1) 부위를 사용하였다.
5' NCR은 넓은 스펙트럼을 갖는 HEV 검출에 좋은 결과를 도출할 수 있으므로 타겟 유전자로 주로 많이 사용한다고 알려져 있으며, VP1은 엔테로바이러스의 혈청형을 결정하는 유전자로서 보통 유전자의 증폭 및 염기서열 분석을 통해 엔테로바이러스의 유전형을 동정하는데 사용한다.
본 발명에서 엔테로바이러스 속의 다양한 혈청형 중 HEV의 검출용 프라이머 및 프로브 범위를 인간에 감염 이력이 있는 혈청형으로 설정하였다(표 1).
| 종(Species) | 유형(Type) |
| 엔테로바이러스(Enterovirus) A | 콕사키바이러스(Coxsackievirus) A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A12, A14, A16, EV71 |
| 엔테로바이러스(Enterovirus) B | 콕사키바이러스(Coxsackievirus) A9, B1, B2, B3, B4, B5, B6, Echovirus 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, EV69 |
| 엔테로바이러스(Enterovirus) C | 콕사키바이러스(Coxsackievirus) A11, A13, A15, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A24 |
| 엔테로바이러스(Enterovirus) D | EV68, EV70 |
| 폴리오바이러스(Poliovirus) | 폴리오바이러스(Poliovirus) 1, 폴리오바이러스(Poliovirus) 2, 폴리오바이러스(Poliovirus) 3 |
검출 범위 내의 혈청형들에 대해서 미국 국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 서열을 수집하여 다중 정렬(multiple alignment)을 해본 결과, 5'NCR 부위에 HEV에 특이적인 프라이머 및 프로브를 설계하는 것이 용이할 것으로 예측되었으며, VP1 유전자는 혈청형 별로 서열 변이가 크므로 HEV에 대한 프라이머 및 프로브 설계에 대해 어렵다는 한계점이 있었다.
따라서 5'NCR 부위를 목표 유전자로 설정하고 프라이머 및 프로브 설계를 위한 염기서열 분석을 수행하였다.
HEV를 특이적으로 검출하기 위해서 NCBI에 등록된 혈청형들의 참조 서열(Reference sequence)을 선정한 뒤, 이들의 다중 정렬(multiple alignment) 결과의 공통 서열(consensus sequence)을 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 하여 데이터베이스(database)를 확장하였다.
5'NCR 부위의 공통 서열(consensus sequence)을 BLAST한 결과로 다중 정렬(multiple alignment)한 결과, 인간에게 감염 이력이 있는 혈청형들에 대해서 특이적 검출이 가능하며, 최적의 Tm값이 확보될 수 있는 부위를 확인하여 이 구간에 프로브를 설계하였다(도 3).
이때, 서열 정렬(sequence alignment)은 Geneious program(Biomatters)를 이용하였으며, 정렬 바(alignment bar)의 색상이 녹색일 경우 염기서열 간 100% 일치함을 나타낸다.
TaqMan 프로브(probe) 제작 시 일반적으로 고려해야 할 사항인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 길이, GC 함량(contents) 및 다이머(dimer)의 형성 여부에 대한 사항들을 확인하였으며, 5'말단에 G염기가 있는 것은 프로브(probe)의 형광 소광현상(fluorescence quenching)을 방지하기 위해 선정에서 제외하였다.
프라이머(Primer)의 융해온도(Tm, melting temperature)값은 55~60℃ 길이는 18~29mers, 프로브(probe)의 Tm 값은 68~70℃ 길이는 34mers 이하의 범위로 디자인하였으며(표 2), Primer Express Software for Real-time PCR(Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm 값을 확인하였다.
가능한 다양한 표적을 검출하기 위하여 3가지의 서로 다른 정방향 프라이머 및 3가지의 서로 다른 역방향 프라이머를 제작하였다(표 2).
| 표적 유전자 | 프라이머 및 프로브 | 서열(5' to 3') | 서열 번호 | 생성물 크기 |
| 5'NCR | F-primer 1 | ACA TGG TGY GAA GAG TCK ATT GAG CT | 1 | 68 bp |
| F-primer 2 | AAG GTG YGA AGA GCC TAY TGA GCT | 2 | ||
| F-primer 3 | ACA TGG TGY GAA GAG TCT ACT GWG CT | 3 | ||
| R-primer 1 | CTC CGC AGT TRG GAT TAG CC | 4 | ||
| R-primer 2 | TGC TCC RTG GTT RGG ATT AGC C | 5 | ||
| R-primer 3 | CTC CGC GGT TAR GAT TAG CC | 6 | ||
| Probe | TCC GGC CCC TGA AT - MGB | 7 |
실험예 1-2. 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 실시간 RT-PCR 조건 최적화
실험예 1-2-1. 제작된 프라이머 및 프로브의 성능확인
실시간(Real-time) RT-PCR 반응액은 10 pmol/㎕로 희석한 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머(primer) 각 1 ㎕ 로 총 2 ㎕ 와 2 pmol/㎕로 희석한 TaqMan 프로브(probe) 1 ㎕, 2X RT-PCR MasterMix 10 ㎕(AppliedBiosystems), 25X RT enzyme buffer 0.8 ㎕에 주형(template) RNA 5 ㎕ 및 TE buffer 1.2 ㎕를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞췄다.
이때 사용한 주형(template) RNA는 엔테로바이러스(Enterovirus) 양성시료(CA10 및 EV 71-B5)에서 추출한 핵산이다.
PCR 조건은 50℃에서 30분간 역 전사(Reverse transcription) 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq 중합효소(polymerase)를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
사용한 실시간(Real-time) PCR 장비는 AppliedBiosystems 7500 Fast Real-time PCR system (Life technologies, USA)이다.
HEV 검출용 프라이머 및 프로브의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 합성하였으며, 내부 대조군(internal control, IC)인 Human GAPDH는 코젠바이오텍사의 프라이머, 프로브를 사용하였다. 이 때 다중(multiplex) 방법을 구성하기 위한 TaqMan 프로브(probe)의 형광 염료는 HEV에 FAM 및 IC에 JOE를 사용하였다.
합성된 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트를 이용해 각 양성 시료에 대한 실시간 증폭곡선을 확인한 결과 엔테로바이러스 양성시료 모두에서 정상적인 증폭 플롯(amplification plot)을 나타내며 타겟인viral RNA가 검출되었다 (도 4).
실험예 1-2-2. 제작된 프라이머 및 프로브의 농도조건 확립
HEV의 프라이머 및 프로브 세트(set)의 단일(singleplex) 반응액과 HEV 프라이머 및 프로브 세트(set) 및 IC가 혼합된 이중(duplex) 반응액 간에 증폭 플롯의 효율을 Ct(threshold cycle) 값과 플롯(plot) 형태(shape)를 통해서 비교하였다.
최적화된 프라이머 및 프로브 농도 조건은 하기와 같다(표 3).
각 농도에 따라 검출 성능이 달라질 수 있기 때문에, 100~250nM의 범위 내에서 간섭효과가 제일 적고, 검출 성능이 좋은 최적의 농도 조건을 선정하였다.
단일(singleplex) 반응액과 이중(duplex) 반응액에서의 각 표적(Target) 핵산 검출 Ct(threshold cycle) 값에 큰 차이가 없으며(표 4), 플롯(plot) 형태(shape)에도 유의미한 차이점이 없었다(도 5a~5d).
CA10을 단계 희석하여 Ct 값을 분석한 결과, 하기 표 4에 기재된 것처럼 단일 반응액에서 [27.5, 31.2, 34.5, 37.1 및 검출 안됨] 및 이중 반응액에서 [27.6, 30.4, 33.5, 36.7 및 검출 안됨]으로 Ct 값의 차이가 거의 없었고, 이는 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트가 표 3에 기재된 농도 조건에서 단일 반응액과 이중 반응액의 검출 성능이 유사하다는 것을 의미한다(도 5a 및 5b). 즉, 서로 다른 2가지의 표적 RNA를 2가지의 형광 염료를 사용했을 때, 위 조건에서 간섭 효과가 최소화되고 동시에 2가지 표적 RNA를 구별하여 검출할 수 있다.
EV 71-B5를 단계 희석하여 Ct 값을 분석한 결과는 하기 표 4에 기재된 바와 같고, 그 의미는 상기 CA10의 경우와 같다(도 5c 및 5d).
| 표적 | 검출 채널 | 프라이머 및 프로브 | 최종 농도(nM) |
| 사람 엔테로바이러스(HEV) | FAM | Forward primer 1 | 250 |
| Forward primer 2 | 250 | ||
| Forward primer 3 | 250 | ||
| Reverse primer 1 | 250 | ||
| Reverse primer 2 | 250 | ||
| Reverse primer 3 | 250 | ||
| Probe | 200 | ||
| 내부 대조군(IC) | JOE | Forward primer | 150 |
| Reverse primer | 150 | ||
| Probe | 100 |
| 주형 희석(Template Dilution) |
CA10 | EV 71-B5 | ||
| singleplex | duplex | singleplex | duplex | |
| 희석(Dilution) 1 | 27.5 | 27.6 | 27.8 | 27.7 |
| 희석(Dilution) 2 | 31.2 | 30.4 | 31.2 | 30.6 |
| 희석(Dilution) 3 | 34.5 | 33.5 | 34.4 | 33.7 |
| 희석(Dilution) 4 | 37.1 | 36.7 | 37.7 | 37.7 |
| 희석(Dilution) 5 | 검출 안됨 | 검출 안됨 | 검출 안됨 | 검출 안됨 |
실험예 1-2-3. 실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix 선정
최적의 성능을 확보할 수 있는 실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix를 선정하기 위해서 동일한 프라이머 및 프로브 혼합 조건을 이용해 두 가지의 MasterMix 간의 성능 비교 테스트를 수행하였다.
실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix A 반응액은 표 3의 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 혼합액 4 ㎕, ２X RT-PCR MasterMix 10 ㎕ (AppliedBiosystems), 25X RT enzyme buffer 0.8 ㎕와 단계적으로 희석한 주형(template) RNA 5 ㎕ 및 TE buffer 0.2 ㎕를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞췄다.
실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix B 반응액은 표 3의 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 혼합액 2 ㎕, 1.2X Rox dye 1 ㎕, 4X Real-time MasterMix 5 ㎕ (PowerAmpTM OneStep RT-PCR kit, Kogenebiotech)와 단계적으로 희석한 주형(template) RNA 5 ㎕ 및 TE buffer 7 ㎕를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞췄다.
PCR 조건은 50℃에서 30분간 역 전사(Reverse transcription) 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq 중합효소(polymerase)를 활성화시킨 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
사용한 실시간(Real-time) RT-PCR 장비는 AppliedBiosystems 7500 Fast Real-time PCR system (Life technologies, USA)이다.
EV 71(Vircell-MBC019) 시료를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서는 B 반응액 사용 시 [25.6, 32.5 및 36.5]로 상대적으로 빠른 Ct 값이 확인 되었으며(표 6), 증폭 플롯의 β값에서도 이와 같은 차이를 확인하였다(도 6).
따라서, EV 71(Vircell-MBC019) 시료에서 동등 또는 그 이상의 검출 효율을 나타낸 실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix B 시약을 본 발명의 주 성분으로 최종 결정하였다(표 5).
| 시약 종류 | 사용량(㎕) |
| HEV 프라이머 및 프로브 mix (최종농도 : F primer 1~3 각 250nM, R primer 1~3 각 250nM, Probe 200nM) |
1 |
| IC 프라이머 및 프로브 mix (최종농도 : F primer 150nM, R primer 150nM, Probe 100nM) | 1 |
| 1.2X ROX dye (기준 형광) | 1 |
| 4X Real-time PCR MasterMix | 5 |
| TE buffer | 7 |
| Total | 15 |
| Ev 71 주형(template) 희석(dilution) |
Ct 값 평균(mean) | |
| Mastermix A | Mastermix B | |
| 희석(dilution) 1 | 26.8 | 25.6 |
| 희석(dilution) 2 | 33.4 | 32.5 |
| 희석(dilution) 3 | 36.4 | 36.5 |
실험예 1-3. 양성표준물질 제작
확립된 HEV 실시간(Real-time) PCR 시스템의 양성표준시료를 2종(HEV 유전자 염기서열을 반영한 핵산과 내부대조군인 사람 유전자의 염기서열을 반영한 핵산)을 제작하였으며, 사용 목적은 최소 검출 한계 등 분석적 성능 시험에 표준물질로 사용하고, 키트 제작 시 프라이머와 프로브 염기서열 및 효소 등의 시약 구성물들이 정상적으로 작동하는지 여부를 확인하는 양성 대조군으로써 활용하였다.
양성표준시료의 성상은 각 프라이머의 증폭 서열을 포함한 합성 RNA이며, 이의 제조는 물질제조 프로세스에 따라 RNA 합성(in vitro transcription)을 하여 제조하였다.
본 키트의 프라이머로 증폭시켜 생성된 각 표적의 PCR 생성물(product)을 RNA 합성에 주형으로 활용하였다.
합성된 양성표준(in vitro transcribed RNA)을 실시간(Real-time) RT-PCR로 증폭 플롯을 확인하였다(도 7).
HEV의 합성된 양성표준물질(in vitro transcribed RNA)이 붉은색 그래프이고, 내부 대조군의 양성표준물질(in vitro transcribed RNA)이 파란색 그래프로 이중(duplex) 검출을 확인하였고, 확립된 HEV 실시간(Real-time) PCR 시스템이 정상적으로 작동하고 있음을 나타낸다.
<실험예 2> 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 실시간 PCR system 개발
실험예 2-1. 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 프라이머 및 프로브 제작
엔테로바이러스 71(Enterovirus 71, EV 71)의 PCR 분석 기술에서 임상 시료로부터 엔테로바이러스 71 검출에는 VP1 부위를 사용하였다.
VP1 gene은 엔테로바이러스의 혈청형을 결정하는 유전자로서 보통 유전자의 증폭 및 염기서열분석을 통해 엔테로바이러스의 유전형을 동정하는데 사용한다고 알려져 있다.
따라서 다른 엔테로바이러스와 구별하여 특이적으로 EV 71만을 검출하기 위해서 VP1 부위를 목표 유전자로 설정하고 프라이머 및 프로브 설계를 위한 염기서열 분석을 수행하였다.
EV 71를 특이적으로 검출하기 위해서 NCBI에 등록된 참조 서열(Reference sequence)을 선정한 뒤, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 활용하여 데이터베이스(database)를 확장하였다.
VP1 부위를 BLAST한 결과로 다중 정렬(multiple alignment)을 진행하였으며, EV 71의 VP1 유전자 서열은 매우 많고 서열 변이가 컸으므로, 우선적으로 국내 분리주에 대해서 프라이머 및 프로브 설계를 하였다(도 8).
이때, 서열 정렬(sequence alignment)은 Geneious program(Biomatters)을 이용하였으며 정렬 바(alignment bar)의 색상이 녹색일 경우 염기서열 간 100% 일치함을 나타낸다.
TaqMan 프로브(probe) 제작 시 일반적으로 고려해야 할 사항으로 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 길이, GC 함량(contents) 및 다이머(dimer)의 형성 여부를 확인하였으며 5'말단에 G염기가 있는 것은 현광 소광현상(fluorescence quenching)을 방지하기 위해 프로브(probe) 선정에서 제외하였다.
프라이머(Primer)의 융해온도(Tm, melting temperature)값은 55~60℃, 길이는 18~29 mers, 프로브(probe)의 Tm은 68~70℃, 길이는 34 mers 이하의 범위로 디자인하였으며(표 7), Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다.
여러 유전형의 엔테로바이러스 71을 민감도 있게 검출할 수 있도록 서로 다른 3가지의 프로브를 제작하였다(표 7).
| 표적 유전자 (Target gene) | 프라이머 및 프로브 | 서열(Sequence)(5' to 3') | 서열 번호 | 생성물 크기 (Product size) |
| VP1 | F-primer 1 | AAA TGG TTA TGC YAA CTG GGA | 8 | 90 bp |
| F-primer 2 | AAA CGG ATA TGC AAA YTG GGA | 9 | ||
| R-primer | GCA TCA AAR CGC ATR TAG GTG | 10 | ||
| Probe 1 | TAG AYA TAA CAG GTT ACG CRC AAA TGC - BHQ | 11 | ||
| Probe 2 | AGA CAT AAC TGG TTA TGC GCA AAT GCG - BHQ | 12 | ||
| Probe 3 | AGA CAT AAC CGG TCA TGC GCA GAT GC - BHQ | 13 |
실험예 2-2. 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 실시간 RT-PCR 조건 최적화
실험예 2-2-1. 제작된 프라이머 및 프로브의 성능확인
실시간(Real-time) RT-PCR 반응액은 10 pmol/㎕로 희석한 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머(primer) 각 1 ㎕로 총 2 ㎕ 와 2 pmol/㎕로 희석한 TaqMan 프로브(probe) 1 ㎕, 2X RT-PCR MasterMix 10 ㎕(AppliedBiosystems), 25X RT enzyme buffer 0.8 ㎕에 주형(template) RNA 5 ㎕ 및 TE buffer 1.2 ㎕ 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞췄다.
이때 사용한 주형(template) RNA는 EV 71 (Enterovirus 71) 양성 표준 RNA (Vircell-MBC019)이다.
PCR 조건은 50℃에서 30분간 역 전사(Reverse transcription) 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq 중합효소(polymerase)를 활성화시킨 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
사용한 실시간(Real-time) PCR 장비는 AppliedBiosystems 7500 Fast Real-time PCR system(Life technologies, USA)이다.
엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 프라이머 및 프로브의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 합성하였으며, 내부 대조군(internal control, IC)인 Human GAPDH는 코젠바이오텍사의 프라이머, 프로브를 사용하였다. 이 때 다중(multiplex)을 구성하기 위한 TaqMan 프로브(probe)의 형광 염료는 EV 71에 FAM 및 IC에 JOE를 사용하였다.
합성된 프라이머(primer) 및 TaqMan 프로브(probe) 세트를 이용해 EV 71 양성 표준 RNA 에 대한 실시간 증폭 플롯을 확인한 결과, 양성 검체 시료가 아닌 순수 바이러스 핵산인 경우 사람 유전자 타겟인 내부 대조군의 증폭은 없이 EV 71 타겟 유전자의 증폭 플롯(빨간색 그래프)만 정상적으로 나타났다(도 9).
실험예 2-2-2. 제작된 프라이머 및 프로브의 농도조건 확립
EV 71의 프라이머 및 프로브 세트(set)의 단일(singleplex) 반응액과 EV 71 프라이머 및 프로브 세트(set)와 IC가 혼합된 이중(duplex) 반응액 간에 증폭 플롯의 효율을 Ct(threshold cycle) 값과 플롯(plot) 형태(shape)를 통해서 비교하였다.
최적화된 프라이머 및 프로브 농도 조건 및 유전자 증폭반응 제한 여부 확인 시험 데이터는 표 8 및 9와 같으며 단일(singleplex) 반응액과 이중(duplex) 반응액에서의 각 표적(Target) DNA 검출 Ct(threshold cycle) 값에 큰 차이가 없으며 플롯(plot) 형태(shape)에도 유의미한 차이점이 없었다(도 10a~10d).
최적화된 프라이머 및 프로브 농도 조건은 하기와 같다(표 8).
각 농도에 따라 검출 성능이 달라질 수 있기 때문에, 50~500nM의 범위 내에서 간섭효과가 제일 적고, 검출 성능이 좋은 최적의 농도 조건을 선정하였다.
단일(singleplex) 반응액과 이중(duplex) 반응액에서의 각 표적(Target) DNA 검출 Ct(threshold cycle) 값에 큰 차이가 없으며(표 9), 플롯(plot) 형태(shape)에도 유의미한 차이점이 없었다(도 10a~10d).
EV 71-B5을 단계 희석하여 Ct 값을 분석한 결과, 하기 표 9의 No. 1에 기재된 것처럼 단일 반응액(EV 71)에서 [23.6, 26.7 및 29.8] 및 이중 반응액(EV 71 + IC)에서 [23.5, 26.8 및 29.2]으로 Ct 값의 차이가 거의 없고, 이중 반응액(HEV + IC)에서 [23.3, 26.9 및 29.8]으로 마찬가지로 Ct 값의 차이가 거의 없었다. 이는 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 프라이머 및 프로브 세트가 표 8에 기재된 농도 조건에서 단일 반응액과 이중 반응액의 검출 성능이 유사하다는 것을 의미한다. 즉 서로 다른 2가지의 표적 RNA를 2가지의 형광 염료를 사용했을 때, 위 조건에서 간섭 효과가 최소화되고 동시에 2가지 표적 RNA를 구별하여 검출할 수 있다
EV 71-C4a(2017, 2018, 2019)를 단계 희석하여 Ct 값을 분석한 결과는 하기 표 9에 기재된 바와 같고, 그 내용은 상기 EV 71-B5의 경우와 같다.
또한 앞서 개발한 사람 엔테로바이러스(HEV)의 실시간(Real-time) RT-PCR 시스템(system)과 표적(Target) DNA 검출 Ct 값 및 플롯(plot) 형태(shape)의 비교 결과에서도 유의미한 차이점이 없었다(표 9 및 도 10a~10d).
| 표적 | 검출 채널 | 프라이머 및 프로브 | 최종 농도(nM) |
| 엔테로바이러스 71 (EV 71) | FAM | Forward primer 1 | 500 |
| Forward primer 2 | 500 | ||
| Reverse primer | 500 | ||
| Probe 1 | 250 | ||
| Probe 2 | 250 | ||
| Probe 3 | 250 | ||
| 내부 대조군 (IC) | JOE | Forward primer | 150 |
| Reverse primer | 150 | ||
| Probe | 100 |
| No. | 혈청형 | 프라이머 및 프로브 반응액 | 주형(Template) 희석(dilution) | ||
| 희석(dilution) 1 | 희석(dilution) 2 | 희석(dilution) 3 | |||
| 1 | EV 71-B5 | EV 71 | 23.6 | 26.7 | 29.8 |
| EV 71 + IC | 23.5 | 26.8 | 29.2 | ||
| HEV + IC | 23.3 | 26.9 | 29.8 | ||
| 2 | EV 71-C4a (2017) |
EV 71 | 34.3 | 38.5 | not detect |
| EV 71 + IC | 34.5 | 38.7 | not detect | ||
| HEV + IC | 33.7 | 38.4 | not detect | ||
| 3 | EV 71-C4a (2018) |
EV 71 | 32.8 | 36.0 | 38.4 |
| EV 71 + IC | 32.0 | 36.2 | 38.0 | ||
| HEV + IC | 32.4 | 36.0 | 38.2 | ||
| 4 | EV 71-C4a (2019) |
EV 71 | 30.4 | 34.1 | 37.3 |
| EV 71 + IC | 29.9 | 33.6 | 36.4 | ||
| HEV + IC | 30.4 | 34.0 | 37.5 | ||
실험예 2-2-3. 실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix 선정
최적의 성능을 확보할 수 있는 실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix를 선정하기 위해서 동일한 프라이머 및 프로브 혼합 조건을 이용해 두 가지의 MasterMix 간의 성능 비교 테스트를 수행하였다.
실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix A 반응액은 표 8의 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 혼합액 4 ㎕, ２X RT-PCR MasterMix 10 ㎕ (AppliedBiosystems), 25X RT enzyme buffer 0.8 ㎕와 단계적으로 희석한 주형(template) RNA 5 ㎕ 및 TE buffer 0.2 ㎕를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞췄다.
실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix B 반응액은 표 8의 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 혼합액 2 ㎕, 1.2X Rox dye 1 ㎕, 4X Real-time MasterMix 5 ㎕ (PowerAmpTM OneStep RT-PCR Kit, Kogenebiotech)와 단계적으로 희석한 주형(template) RNA 5 ㎕ 및 TE buffer 7 ㎕를 를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞췄다.
PCR 조건은 50℃에서 30분간 역 전사(Reverse transcription) 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq 중합효소(polymerase)를 활성화시킨 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
사용한 실시간(Real-time) RT-PCR 장비는 AppliedBiosystems 7500 Fast Real-time PCR system(Life technologies, USA)이다.
EV 71(Vircell-MBC019) 시료를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서는 B 반응액 사용 시 상대적으로 빠른 Ct 값이 확인 되었으며, 증폭 플롯의 ΔRn값에서 차이가 나타남을 확인하였다(도 11).
따라서, EV 71(Vircell-MBC019) 시료에서 동등 또는 그 이상의 검출 효율을 나타낸 실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix B 시약을 본 발명의 주 성분으로 최종 결정하였다(표 10).
| 시약 종류 | 사용량 (㎕) |
| EV 71 프라이머 및 프로브 mix (최종농도 : F primer 1, 2 각 500nM, R primer 500nM, Probe 1~3 각 250nM) |
1 |
| IC 프라이머 및 프로브 mix (최종농도 : F primer 150nM, R primer 150nM, Probe 100nM) | 1 |
| 1.2X ROX dye (기준 형광) | 1 |
| 4X Real-time PCR MasterMix | 5 |
| TE buffer | 7 |
| Total | 15 |
| EV 71 주형(template) 희석(dilution) |
Ct 값 평균 | |
| Mastermix A | Mastermix B | |
| 희석(Dilution) 1 | 26.8 | 26.3 |
| 희석(Dilution) 2 | 33.7 | 33.1 |
| 희석(Dilution) 3 | 39.5 | 37.1 |
실험예 2-3. 양성표준물질 제작
확립된 EV 71 실시간(Real-time) RT-PCR 시스템의 양성표준시료를 제작하였으며 사용 목적은 최소 검출 한계 등 분석적 성능 시험에 표준물질로 사용하고, 키트 제작 시 프라이머와 프로브 염기서열 및 효소 등의 시약 구성물들이 정상적으로 작동하는지 여부를 확인하는 양성 대조군으로써 활용하였다.
양성표준시료의 성상은 각 프라이머의 증폭 서열을 포함한 합성 RNA이며 이의 제조는 물질제조 프로세스에 따라 RNA 합성(in vitro transcription)을 하여 제조하였다.
본 키트의 프라이머로 증폭시켜 생성된 각 표적의 PCR 생성물(product)을 RNA 합성에 주형으로 활용하였다.
합성된 양성표준(in vitro transcribed RNA)을 실시간(Real-time) RT-PCR로 증폭 플롯을 확인하였다(도 12).
EV 71의 합성된 양성표준물질(in vitro transcribed RNA)이 붉은색 그래프이고, 내부 대조군의 양성표준물질(in vitro transcribed RNA)이 파란색 그래프로 이중(duplex) 검출을 확인하였고, 확립된 EV 71 실시간(Real-time) PCR 시스템이 정상적으로 작동하고 있음을 나타낸다.
<실험예3> 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71) 동시 검출용 다중 실시간 RT-PCR system 개발
실험예 3-1. 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71) 동시 검출용 다중 실시간 RT-PCR 조건 최적화
실험예 3-1-1. 제작된 프라이머 및 프로브 세트의 성능 확인
실시간(Real-time) RT-PCR 반응액은 10 pmol/㎕로 희석한 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머(primer) 각 1 ㎕로 총 2 ㎕ 와 2 pmol/㎕로 희석한 TaqMan 프로브(probe) 1 ㎕, 2X RT-PCR MasterMix 10 ㎕ (AppliedBiosystems), 25X RT enzyme buffer 0.8 ㎕에 주형(template) RNA 5 ㎕ 및 TE buffer 1.2 ㎕를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞췄다.
이때 사용한 주형(template) RNA는 엔테로바이러스(Enterovirus) 양성시료 EV 71-B5, EV 71-C4a 및 EV 71(Vircell-MBC019)시료이다. 엔테로바이러스(Enterovirus) 양성시료(CA10)는 HEV에서만 검출됨에 따라 HEV, EV 71에 모두 검출될 수 있는 시료인 상기 3가지 시료를 사용하였다.
PCR 조건은 50℃에서 30분간 역 전사(Reverse transcription) 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq 중합효소(polymerase)를 활성화시킨 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
사용한 실시간(Real-time) RT-PCR 장비는 AppliedBiosystems 7500 Fast 실시간(Real-time) PCR system (Life technologies, USA)이다.
앞서 개발한 HEV, EV 71 및 IC 동시 검출용 프라이머 및 프로브의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 합성하였으며, 이 때 다중(multiplex)을 구성하기 위한 TaqMan 프로브(probe)의 형광 염료는 HEV에 JOE, EV 71에 FAM 및 IC에 Cy5를 사용하였다.
합성된 프라이머(primer) 및 TaqMan 프로브(probe) 세트를 이용해 각 양성 시료인 EV 71 및 HEV에 대한 실시간 증폭 플롯을 확인한 결과, 각각 검출 타겟 핵산에서만 정상적인 증폭 플롯을 나타냈다(도 13).
실험예 3-1-2. 제작된 프라이머 및 프로브 세트의 농도 조건 확립
앞서 개발한 HEV 및 EV 71의 각 프라이머 및 프로브 세트(set)의 단일 반응액, 상기 두 가지의 프라이머 및 프로브 세트(set)의 이중(duplex) 반응액 및 IC가 추가로 혼합된 다중(multiplex) 반응액 간에 증폭 플롯의 효율을 Ct(threshold cycle) 값과 플롯(plot) 형태(shape)를 통해서 비교하였다.
최적화된 프라이머 및 프로브 농도 조건은 하기와 같다(표 12).
각 농도에 따라 검출 성능이 달라질 수 있기 때문에, 50~500nM의 범위 내에서 간섭효과가 제일 적고, 검출 성능이 좋은 최적의 농도 조건을 선정하였다.
이중(duplex) 반응액과 다중(multiplex) 반응액에서의 각 표적 RNA 검출 Ct(threshold cycle) 값에 큰 차이가 없으며(표 13), 플롯(plot) 형태(shape)에도 유의미한 차이점이 없었다(도 14a~14d).
EV 71-B5을 단계 희석하여 Ct 값을 분석한 결과, 하기 표 13에 기재된 것처럼 이중 반응액 중 EV 71 시스템에서 [20.8, 24.9 및 28.1] 및 다중 반응액 중 EV 71 시스템에서 [20.3, 24.5 및 28.1]로 Ct 값의 차이가 거의 없고, HEV 시스템에서도 마찬가지의 결과를 보인다. 이는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71) 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트가 표 12에 기재된 농도 조건에서 이중 반응액과 다중 반응액의 검출 성능이 유사하다는 것을 의미한다. 즉 서로 다른 3가지의 표적 RNA를 3가지의 형광 염료를 사용했을 때, 위 조건에서 간섭 효과가 최소화되고 동시에 3가지 표적 RNA를 구별하여 검출할 수 있다.
EV 71-C4a를 단계 희석하여 Ct 값을 분석한 결과는 하기 표 13에 기재된 것처럼 이중 반응액 중 EV 71 시스템에서 [31.2, 36.3 및 검출안됨] 및 다중 반응액 중 EV 71 시스템에서 [30.4, 32.9 및 검출안됨]으로 나왔고, 오히려 다중 반응액이 이중 반응액에서 보다 더 빠른 Ct 값을 나타내어 다중 반응액의 검출 성능이 더 좋았다. 한편, HEV 시스템에서는 반대의 결과를 보이지만, 다중 반응액에서 이중 반응액과의 Ct 값 차이가 크지 않아 여전히 좋은 성능을 나타낸다는 점을 확인하였다.
| 표적 | 검출 채널 | 프라이머 및 프로브 | 최종 농도 (nM) |
| 엔테로바이러스 71 (EV 71) | FAM | Forward primer 1 | 500 |
| Forward primer 2 | 500 | ||
| Reverse primer | 500 | ||
| Probe 1 | 250 | ||
| Probe 2 | 250 | ||
| Probe 3 | 250 | ||
| 사람 엔테로바이러스 (HEV) | JOE | Forward primer 1 | 250 |
| Forward primer 2 | 250 | ||
| Forward primer 3 | 250 | ||
| Reverse primer 1 | 250 | ||
| Reverse primer 2 | 250 | ||
| Reverse primer 3 | 250 | ||
| Probe | 200 | ||
| 내부 대조군 (IC) | Cy5 | Forward primer | 150 |
| Reverse primer | 150 | ||
| Probe | 100 |
| 주형(Template) 희석(dilution) |
EV 71-B5 | EV 71-C4a | ||||||
| 이중(duplex) | 다중(Multiplex) | 이중(duplex) | 다중(Multiplex) | |||||
| EV 71 | HEV | EV 71 | HEV | EV 71 | HEV | EV 71 | HEV | |
| 희석(dilution) 1 | 20.8 | 20.1 | 20.3 | 21.2 | 31.2 | 30.9 | 30.4 | 31.4 |
| 희석(dilution) 2 | 24.9 | 24.2 | 24.5 | 25.2 | 36.3 | 34.7 | 32.9 | 34.6 |
| 희석(dilution) 3 | 28.1 | 28.3 | 28.1 | 28.8 | 검출 안됨 | 검출 안됨 | 35.1 | 37.4 |
실험예 3-1-3. 실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix 선정
최적의 성능을 확보할 수 있는 실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix를 선정하기 위해서 동일한 프라이머 및 프로브 혼합 조건을 이용해 두 가지의 MasterMix 간의 성능 비교 테스트를 수행하였다.
실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix A 반응액은 표 3의 각 농도로 혼합한 HEV의 프라이머 및 프로브 혼합액 1 ㎕, 표 8의 각 농도로 혼합한 EV 71의 프라이머 및 프로브 혼합액 1 ㎕, 표3과 8의 IC의 프라이머 및 프로브 혼합액 1 ㎕, ２X RT-PCR MasterMix 10 ㎕ (AppliedBiosystems), 25X RT enzyme buffer 0.8 ㎕와 단계적으로 희석한 RNA 시료 5 ㎕ 및 TE buffer 1.2 ㎕를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞췄다.
실시간(Real-time) RT-PCR MasterMix B 반응액은 표 3의 각 농도로 혼합한 HEV의 프라이머 및 프로브 혼합액 1 ㎕, 표 8의 각 농도로 혼합한 EV 71의 프라이머 및 프로브 혼합액 1 ㎕, 표 3 및 8의 IC의 프라이머 및 프로브 혼합액 1 ㎕, 1.2X Rox dye 1 ㎕, 4X Real-time MasterMix 5 ㎕ (PowerAmpTM OneStep RT-PCR Kit, Kogenebiotech)와 단계적으로 희석한 RNA 시료 5 ㎕ 및 TE buffer 6 ㎕를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞췄다.
PCR 조건은 50℃에서 30분간 역 전사(Reverse transcription) 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq 중합효소(polymerase)를 활성화시킨 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
사용한 실시간(Real-time) PCR 장비는 AppliedBiosystems 7500 Fast 실시간(Real-time) PCR system (Life technologies, USA)이다.
EV 71-B5 양성 시료를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서는 Mastermix A 사용 시 EV 71의 Ct값이 26.6(이중) 및 29.5(다중)로 나타났고, Mastermix B 사용 시에는 EV 71의 Ct값이 25.9(이중) 및 26.7(다중)으로 나타나 이중 및 다중 간 EV 71의 Ct값의 차이가 Mastermix B에서 작았다. 또한, Mastermix A 사용 시 HEV의 Ct값이 26.3(이중) 및 28.5(다중)로 나타났고, Mastermix B 사용 시에는 HEV의 Ct값이 26.4(이중) 및 25.4(다중)으로 나타나 이중 및 다중 간 HEV의 Ct값의 차이가 Mastermix B에서 작았다(표 15).
한편, EV 71-C4a 양성 시료를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서도 상기와 같이 EV 71 및 HEV의 Ct값의 차이가 Mastermix B에서 작았다(표 15).
따라서 양성 시료에서 이중 및 다중 반응액 간에 유사한 검출효율을 나타낸 Real-time RT-PCR MasterMix B 시약을 본 발명의 주 성분으로 최종 결정하였다(표 14).
| 시약 종류 | 사용량 (㎕) |
| EV 71 프라이머 및 프로브 mix (최종농도 : F primer 1, 2 각 500nM, R primer 500nM, Probe 1~3 각 250nM) |
1 |
| HEV 프라이머 및 프로브 mix(최종농도 : F primer 1~3 각 250nM, R primer 1~3 각 250nM, Probe 200nM) | 1 |
| IC 프라이머 및 프로브 mix (최종농도 : F primer 150nM, R primer 150nM, Probe 100nM) | 1 |
| 1.2X ROX dye | 1 |
| 4X Real-time PCR MasterMix | 5 |
| TE buffer | 6 |
| Total | 15 |
| 시료 | EV 71-B5 | EV 71-C4a | ||||||
| 검출시스템 | 이중(duplex) | 다중(Multiplex) | 이중(duplex) | 다중(Multiplex) | ||||
| EV 71 | HEV | EV 71 | HEV | EV 71 | HEV | EV 71 | HEV | |
| Mastermix A | 26.6 | 26.3 | 29.5 | 28.5 | 35.6 | 33.5 | 38.7 | 36.9 |
| Mastermix B | 25.9 | 26.4 | 26.7 | 25.4 | 35.1 | 34.5 | 35.0 | 34.3 |
실험예 3-2. 양성표준물질 제작
확립된 사람 엔테로바이러스(Human-enterovirus) 및 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71) 실시간(Real-time) RT-PCR 시스템의 양성표준시료를 제작하였으며 사용 목적은 최소 검출한계 등 분석적 성능 시험에 표준물질로 사용하고, 키트 제작 시 프라이머와 프로브 염기서열 및 효소 등의 시약 구성물들이 정상적으로 작동하는지 여부를 확인하는 양성 대조군으로써 활용하였다.
양성표준시료의 성상은 각 프라이머의 증폭 서열을 포함한 합성 RNA이며 이의 제조는 물질제조 프로세스에 따라 RNA 합성(in vitro transcription)을 하여 제조하였다.
본 키트의 프라이머로 증폭시켜 생성된 각 표적(target)의 PCR 생성물(product)을 RNA 합성에 주형으로 활용하였다.
합성된 양성표준(in vitro transcribed RNA)을 실시간(Real-time) RT-PCR로 증폭 플롯을 확인하였다(도 16).
실험예 3-3. 성능 평가
실험예 3-3-1. 분석적 특이도 (Analytical specificity)
개발한 HEV 및 EV 71 다중(multiplex) 실시간(Real-time) RT-PCR 시스템의 특이성을 교차반응 시험을 통해 평가하였다.
다양한 혈청형의 엔테로바이러스, 유사한 증상의 원인이 될 수 있는 다른 병인체 및 human genomic RNA를 포함한 핵산을 이용하여 실시간(Real-time) RT-PCR을 수행한 후 각각의 시료에 대한 검출 결과를 분석하였다.
시험에 사용한 물질은 국가병원체자원은행(National Culture Collection for pathogens, NCCP), 한국생물자원센터(Korean Collection for Type cultures, KCTC) 및 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분양 받거나 Vircell S.L(Santafe, Spain)에서 핵산을 구입하였다.
교차반응 시험 결과 HEV 시스템에서는 모든 HEV 시료가 EV 71 시스템에서는 EV 71만이 형광 채널에서 검출 반응이 일어났고, 다른 종의 핵산에서는 상기 2가지 시스템을 통한 검출반응이 일어나지 않았다(표 16).
또한 내부대조군(IC)은 Human genomic RNA가 포함된 시료에서 증폭반응을 일으키고 검사 샘플 품질(quality) 평가를 위해 확인되었으며 본 발명 시약의 특이성을 입증하였다.
| 분류 | Organism | Strain no. | HEV | EV 71 |
| 코로나바이러스 | Human coronavirus NL63 | 질병관리청 제공 | - | - |
| Human coronavirus 229E | - | - | ||
| Human coronavirus OC43 | - | - | ||
| Human coronavirus NL63 | NCCP 43214 | - | - | |
| SARS-CoV-2 | NCCP 43326 | - | - | |
| 엔테로바이러스 | Coxsackievirus CA16 | NCCP 41207 | + | - |
| Coxsackievirus | NCCP 43221 | + | - | |
| Coxsackievirus B4 | NCCP 41203 | + | - | |
| Coxsackievirus B4 | NCCP 41204 | + | - | |
| Coxsackievirus B2 | NCCP 41206 | + | - | |
| Coxsackievirus B2 | NCCP 41201 | + | - | |
| Coxsackievirus B5 | NCCP 41205 | + | - | |
| Coxsackievirus B3 | NCCP 41202 | + | - | |
| Enterovirus 68 | MBC125 | + | - | |
| Enterovirus 71 | MBC019 | + | + | |
| 인플루엔자바이러스 | Influenza virus A (H1N1) | MBC028 | - | - |
| Influenza virus A (H3) | MBC029 | - | - | |
| Influenza virus B | MBC030 | - | - | |
| 호흡기 감염 및 유사 증상 병인체 | Dengue virus 1 | ATCC VR-3228SD | - | - |
| Dengue virus 2 | ATCC VR-3229SD | - | - | |
| Dengue virus 3 | ATCC VR-3230SD | - | - | |
| Dengue virus 4 | ATCC VR-3231SD | - | - | |
| Sapovirus | 추출 RNA | - | - | |
| Enteric Adenovirus 41 | MBC114 | - | - | |
| Respiratory syncytial virus A | MBC041 | - | - | |
| Respiratory syncytial virus B | MBC083 | - | - | |
| Mumps virus | MBC040 | - | - | |
| Rubella virus | MBC113 | - | - | |
| Measles virus | MBC046 | - | - | |
| Adenovirus | MBC001 | - | - | |
| Rotavirus | 추출 RNA | - | - | |
| Norovirus | MBC111 | - | - | |
| Astrovirus | 추출 RNA | - | - | |
| Herpes Simplex virus 1 | NCCP 43109 | - | - | |
| Herpes Simplex virus 2 | NCCP 43108 | - | - | |
| Parainfluenza virus 1 | MBC037 | - | - | |
| Parainfluenza virus 2 | MBC038 | - | - | |
| Parainfluenza virus 3 | MBC039 | - | - | |
| Human parechovirus 1 | NCCP | - | - | |
| Human parechovirus 2 | NCCP | - | - | |
| Human parechovirus 3 | NCCP | - | - | |
| Varicella-zoter virus | NCCP | - | - | |
| Bordetella pertussis | ATCC 10380 | - | - | |
| Haemophilus influenzae | MBC020 | - | - | |
| Legionella birminghamensis | KCTC12007 | - | - | |
| Legionella israeiensis | KCTC 12008 | - | - | |
| Legionella pneumophila | KCTC 12009 | - | - | |
| Legionella busanensis | KCTC 12084 | - | - | |
| Mycoplasma pneumoniae | ATCC 15531 | - | - | |
| Streptococcus pneuomiae | NCCP14774 | - | - | |
| Mycobacterium avium | ATCC 25291 | - | - | |
| Mycobacterium abscessus | ATCC 19977 | - | - | |
| Mycobacterium chelonae | ATCC 35749 | - | - | |
| Peudomonas aeruginosa | ATCC10145 | - | - | |
| Staphylococcus aureus | ATCC 13565 | - | - | |
| Listeria monocytogenes | ATCC 19115 | - | - | |
| Listeria welshimeri | ATCC 35897 | - | - | |
| Campylobacter jejuni | ATCC 33250 | - | - | |
| Escherichia coli O157:H7 | ATCC43894 | - | - | |
| Salmonella typhimurium | ATCC 14028 | - | - | |
| Salmonella typhi | ATCC 19214 | - | - | |
| Bacillus cereus | NCCP 10084 | - | - | |
| Shigella flexneri | ATCC 12022 | - | - | |
| Shigella sonnei | KCTC 22530 | - | - | |
| Listeria innocua | KCTC 3586 | - | - | |
| Clostridium perfringens | ATCC 12916 | - | - | |
| 다른 종 | Human RNA | - | - | - |
실험예 3-3-2. 직선성 확인 (Linearity)
시험법에 있어서 직선성이란 검체 중에 함유되어 있는 분석대상물질(target analyte)의 양에 정비례하는 결과를 제공할 수 있는 능력을 말하며 시험 기준은 최소 5단계 이상의 농도로 희석한 시험물질을 이용하며 표준곡선(standard curve)을 작성하여 R2값을 측정하였다.
HEV 및 EV 71의 직선성은 양성표준(in vitro transcribed RNA)를 이용해 측정하였다.
각 시료를 TE buffer를 이용해 10배씩 순차적으로 희석한 뒤, 주형(template) RNA로 사용하여 PCR을 수행하였다.
측정 Ct 값과 농도를 이용해 표준곡선(standard curve)을 작성한 결과, 모두 R2값이 0.98이상이었고, 기울기(slope)로부터 계산된 PCR 효율도 100%에 근접한 것으로 나타났다(표 17 및 18)(도 17 내지 20).
표적 핵산의 농도에 따라, 편차가 작고 일정한 Ct 값을 검출할 수 있는 시스템의 직선성과 효율성을 확인하였다.
[계산식] PCR Efficiency = 10(-1/slope)-1
| 농도 (copies/㎕) | 시료 별 Ct 값 평균 | |
| Vircell-MBC019 | in vitro transcribed RNA | |
| 1.0 x 106 | - | 20.2 |
| 1.0 x 105 | - | 23.4 |
| 1.0 x 104 | 23.9 | 26.7 |
| 1.0 x 103 | 27.1 | 29.7 |
| 1.0 x 102 | 30.1 | 32.7 |
| 1.0 x 101 | 33.0 | 36.2 |
| 1.0 x 100 | 36.3 | 38.6 |
| R2 | 0.981 | 0.999 |
| PCR Efficiency | 93.537 % | 109.018 % |
| 농도 (copies/㎕) | 시료 별 Ct 값 평균 | |
| Vircell-MBC019 | in vitro transcribed RNA | |
| 1.0 x 106 | - | 20.7 |
| 1.0 x 105 | - | 23.9 |
| 1.0 x 104 | 24.8 | 27.4 |
| 1.0 x 103 | 28.5 | 30.3 |
| 1.0 x 102 | 31.1 | 33.5 |
| 1.0 x 101 | 35.5 | 36.1 |
| 1.0 x 100 | 검출 안됨 | 38.8 |
| R2 | 0.999 | 0.994 |
| PCR Efficiency | 111.288 % | 112.482 % |
<실시예 1> 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71) 동시 검출용 다중 실시간 RT-PCR system을 이용한 임상 시료 검출
RNA 형태로 제공받은 임상 시료를 이용해 개발된 HEV 및 EV 71의 동시 검출용 다중(multiplex) 시약의 성능을 확인하는 시험을 수행하였다.
성능 확인 시험은 제공 받은 45건의 시료를 이용하여 기존 검사법(표 19 및 20)과 본 발명의 개발한 키트와의 Ct 값을 비교하였다(표 21).
45건의 RNA 시료 중 본 발명의 시약에서 HEV 시스템으로 검출된 것은 45건으로, 이 중 EV 71 시스템으로 검출된 것은 5건으로 확인되었으며, 기존 검사법으로는 33건만 확인되었다(표 21).
또한 기존 검사법에서 검출된 임상 시료들의 Ct 값은 본 발명의 시약보다 Ct 값이 높음을 확인하였다(표 21).
따라서 본 발명의 시약은 기존 검사법에서 검출하지 못하는 12건의 엔테로바이러스 타입을 추가로 검출할 수 있고, Ct 값이 낮아 다양한 유형의 엔테로바이러스를 종류가 다양한 검체로부터 높은 민감도로 검출을 할 수 있어 검출 효율이 우수하다는 것을 확인하였다.
| 표적 유전자 (Target gene) | 프라이머 및 프로브 | 서열 (5' to 3') | 생성물 크기 (Product size) |
| 5' NCR | F-primer | GCG ATT GTC ACC ATW AGC AGY CA | 145 bp |
| R-primer 1 | GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C | ||
| Probe | FAM-CCG ACT ACT TTG GGW GTC CGT GT-BHQ1 |
| 단계(Step) | 온도(Temperature) | 시간(Time) | Cycle |
| 역 전사(Reverse complement) | 50 ℃ | 30 min | 1 |
| 95 ℃ | 10 min | 1 | |
| 변성(Denaturation) | 95 ℃ | 15 sec | 40 |
| 접합(Annealing) | 50 ℃ | 45 sec (scan) | |
| 연장(Extension) | 72 ℃ | 5 sec |
| No. | 본 발명 시약 (Human enterovirus / Enterovirus 71) (Ct 값) |
기존 진단 시약 (Enterovirus singleplex) (Ct 값) |
엔테로바이러스 타입 | 검체 종류 |
| 1 | 33.4 | 36.8 | E9 | 비인두도말 |
| 2 | 33.2 | 38.0 | E9 | 비인두도말 |
| 3 | 29.6 | 34.6 | E9 | 비인두도말 |
| 4 | 35.2 | - | E30 | 뇌척수액 |
| 5 | 36.5 | - | E30 | 뇌척수액 |
| 6 | 34.6 | - | E30 | 뇌척수액 |
| 7 | 29.4 | 33.9 | CA6 | 비인두도말 |
| 8 | 32.4 | 36.2 | CA6 | 대변 |
| 9 | 31.0 | 34.8 | CA6 | 대변 |
| 10 | 30.2 | 33.9 | E21 | 대변 |
| 11 | 34.3 | - | CA10 | 비인두도말 |
| 12 | 34.6 | 36.9 | CA16 | 비인두도말 |
| 13 | 30.6 | 33.7 | CA4 | 비인두도말 |
| 14 | 26.9 | 33.4 | CA4 | 비인두도말 |
| 15 | 26.9 | 30.5 | CA4 | 비인두도말 |
| 16 | 33.3 | - | HRV-B | 비인두도말 |
| 17 | 35.3 | - | CB4 | 비인두도말 |
| 18 | 37.7 | - | CA8 | 비인두도말 |
| 19 | 35.0 | 36.9 | CA8 | 비인두도말 |
| 20 | 31.1 | 34.9 | E6 | 대변 |
| 21 | 37.7 | - | E6 | 뇌척수액 |
| 22 | 33.3 | 35.4 | E16 | 대변 |
| 23 | 33.9 | 36.9 | E18 | 대변 |
| 24 | 32.1 | 37.0 | E18 | 대변 |
| 25 | 26.3 | 30.1 | E18 | 대변 |
| 26 | 37.1 | - | E5 | 뇌척수액 |
| 27 | 23.8 | 26.2 | CA2 | 뇌척수액 |
| 28 | 29.3 | 29.8 | CB2 | 대변 |
| 29 | 34.1 | - | CB2 | 대변 |
| 30 | 31.6 | 32.2 | CB5 | 대변 |
| 31 | 38.5 | - | E25 | 대변 |
| 32 | 26.7 | 27.7 | E11 | 대변 |
| 33 | 26.6 | 28.1 | CA10 | 대변 |
| 34 | 19.0 | 23.6 | CB5-E | 뇌척수액 |
| 35 | 19.2 | 22.6 | CB5-C | 대변 |
| 36 | 21.4 / 20.0 | 24.8 | EV71-B5 | 대변 |
| 37 | 30.7 / 29.6 | 34.1 | EV71-C1 | 비인두도말 |
| 38 | 29.2 | 32.0 | CA5 | 대변 |
| 39 | 31.7 | 32.7 | CA5 | 대변 |
| 40 | 28.8 | 32.7 | CA5 | 대변 |
| 41 | 32.0 | 34.0 | CA5 | 대변 |
| 42 | 37.9 | - | HRV-A | 비인두도말 |
| 43 | 33.6 / 32.5 | 36.1 | EV71-C4a | 비인두도말 |
| 44 | 34.2 / 34.3 | 35.2 | EV71-C4a | 비인두도말 |
| 45 | 32.5 / 31.7 | 34.1 | EV71-C4a | 비인두도말 |
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'NCR F-primer 2
<400> 2
aaggtgygaa gagcctaytg agct 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'NCR F-primer 3
<400> 3
acatggtgyg aagagtctac tgwgct 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'NCR R-primer 1
<400> 4
ctccgcagtt rggattagcc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'NCR R-primer 2
<400> 5
tgctccrtgg ttrggattag cc 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'NCR R-primer 3
<400> 6
ctccgcggtt argattagcc 20
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'NCR probe
<400> 7
tccggcccct gaat 14
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP1 F-primer 1
<400> 8
aaatggttat gcyaactggg a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP1 F-primer 2
<400> 9
aaacggatat gcaaaytggg a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP1 R-primer
<400> 10
gcatcaaarc gcatrtaggt g 21
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP1 probe 1
<400> 11
tagayataac aggttacgcr caaatgc 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP1 probe 2
<400> 12
agacataact ggttatgcgc aaatgcg 27
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP1 probe 3
<400> 13
agacataacc ggtcatgcgc agatgc 26
Claims (24)
- 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 및
서열번호 4내지 6의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머;로 이루어진 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 프라이머 세트. - 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 조성물은 서열번호 7로 기재되는 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 조성물은 내부 대조군(internal control, IC)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 조성물. - 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 검출용 키트.
- 서열번호 8 내지 9의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 및
서열번호 10의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머;로 이루어진 것을 특징으로 하는 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 프라이머 세트. - 제6항의 프라이머 세트를 포함하는 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 조성물은 서열번호 11 내지 13으로 기재되는 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 조성물은 내부 대조군(internal control,IC)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 조성물. - 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로바이러스 71(EV 71) 검출용 키트.
- 하기의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 조성물:
a) 서열번호 1 내지 6으로 기재되는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트.
b) 서열번호 7로 기재되는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프로브.
c) 서열번호 8 내지 10으로 기재되는 것을 특징으로 하는 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프라이머. 세트
d) 서열번호 11 내지 13으로 기재되는 것을 특징으로 하는 엔테로바이러스 71을 검출할 수 있는 프로브. - 제11항에 있어서,
상기 성분 a)의 사람 엔테로바이러스(HEV)를 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 1내지 3의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4내지 6의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머를 포함하고, 5'NCR(non-coding region) 부위를 표적 핵산으로 설계되고, 표적 핵산에 상보적으로 결합 가능한 18 내지 29개의 염기서열을 포함하고, 및 융해 온도(Tm, melting temperature)는 55~60℃인 것을 특징으로 하고;
상기 성분 b)의 사람 엔테로바이러스(HEV)를 검출할 수 있는 프로브는 5'NCR(non-coding region) 부위를 표적 핵산으로 설계되고, 표적 핵산에 상보적으로 결합 가능한 34개 이하의 염기서열을 포함하고, 및 융해 온도(Tm, melting temperature)는 68~70℃인 것을 특징으로 하고;
상기 성분 c)의 엔테로바이러스 71(EV 71)을 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 8의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9및 10의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머를 포함하고, 캡시드 단백질인 VP1(viral protein 1) 부위를 표적 핵산으로 설계되고, 표적 핵산에 상보적으로 결합 가능한 18 내지 29개의 염기서열을 포함하고, 및 융해 온도(Tm, melting temperature)는 55~60℃인 것을 특징으로 하고; 및
상기 성분 d)의 엔테로바이러스 71(EV 71)을 검출할 수 있는 프로브는 캡시드 단백질인 VP1(viral protein 1) 부위를 표적 핵산으로 설계되고, 표적 핵산에 상보적으로 결합 가능한 34개 이하의 염기서열을 포함하고, 및 융해 온도(Tm, melting temperature)는 68~70℃인 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 조성물. - 제12항에 있어서,
상기 조성물은 내부 대조군(IC)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 프로브 세트 b) 및 d)가 이의 5' 말단에 형광 염료 및 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 조성물. - 제14항에 있어서,
상기 형광 염료가 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 조성물. - 제14항에 있어서,
상기 소광자가 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 조성물의 최소 검출한계는 100 내지 101 copies/㎕인 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 조성물은 역전사 중합효소, DNA 중합효소, 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 사람 엔테로바이러스(HEV)는 Coxsackievirus CA16, Coxsackievirus, Coxsackievirus B4, Coxsackievirus B2, Coxsackievirus B5, Coxsackievirus B3 Enterovirus 68 및 Enterovirus 71로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)은 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 조성물. - 제11항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출용 키트.
- 제11항의 조성물을 사용하고, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출 방법.
- 제22항에 있어서,
상기 방법은 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)를 동시에 검출하되, 각각의 특이적인 프로브에 태깅된 서로 다른 형광 염료에 의해 엔테로바이러스 71(EV 71)을 구별하여 특이적으로 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출 방법. - 제20항에 있어서,
상기 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 대변, 소변, 직장도말, 구인두도말, 비인두도말 및 비강세척액으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 사람 엔테로바이러스(HEV) 및 엔테로바이러스 71(EV 71)의 동시 검출 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210113532A KR102508610B1 (ko) | 2021-08-26 | 2021-08-26 | 사람 엔테로바이러스, 엔테로바이러스 71 또는 이들을 동시에 검출할 수 있는 엔테로바이러스 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210113532A KR102508610B1 (ko) | 2021-08-26 | 2021-08-26 | 사람 엔테로바이러스, 엔테로바이러스 71 또는 이들을 동시에 검출할 수 있는 엔테로바이러스 검출 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230031093A true KR20230031093A (ko) | 2023-03-07 |
| KR102508610B1 KR102508610B1 (ko) | 2023-03-10 |
Family
ID=85513377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210113532A KR102508610B1 (ko) | 2021-08-26 | 2021-08-26 | 사람 엔테로바이러스, 엔테로바이러스 71 또는 이들을 동시에 검출할 수 있는 엔테로바이러스 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102508610B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101087490B1 (ko) * | 2008-09-19 | 2011-11-28 | (주)바이오니아 | 엔테로바이러스 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 엔테로바이러스 검출방법 |
-
2021
- 2021-08-26 KR KR1020210113532A patent/KR102508610B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101087490B1 (ko) * | 2008-09-19 | 2011-11-28 | (주)바이오니아 | 엔테로바이러스 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 엔테로바이러스 검출방법 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102508610B1 (ko) | 2023-03-10 |
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