JPWO2001096401A1 - 蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体の作製方法 - Google Patents
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Abstract
蛍光タンパク質を融合し、かつ抗原結合活性のあるｓｃＦｖ抗体の作製方法を提供する。ｓｃＦｖ抗体を表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製し、これより特定の抗原を認識する抗体を発現しているクローンを選択する。そして、当該クローンより、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を取得し、これを発現ベクターに導入する。発現ベクターには予め蛍光タンパク質をコードする遺伝子が組込まれており、宿主内で発現させることにより、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体が産生される。
Description
技術分野
本発明は、蛍光を発することができる抗体の作製方法に関する。詳しくは、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体の作製方法に関する。
背景技術
抗体のライブラリーの作製方法としてファージディスプレイ法が利用されている。ファージディスプレイ法は、Ｓｍｉｔｈにより１９８５年（Ｓｍｉｔｈ ＧＰ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５ ２２８：４０７５ １３１５−７）に考案されたもので、Ｍ１３ファージのような一本鎖環状ＤＮＡを持つ線状のバクテリオファージが用いられる。ファージ粒子はＤＮＡの周囲を取り囲んでファージ粒子の大部分を構成するｃｐ８というタンパク質と、ファージが大腸菌に感染する時に機能する５個のｃｐ３と呼ばれるタンパク質などからなっている。このｃｐ３もしくはｃｐ８と融合した形でポリペプチドをコードするように遺伝子を構築し、ファージ粒子表面にそのタンパクを発現させるシステムがファージディスプレイシステムである。他の物質との結合活性を持つタンパク質を表面に保持したファージ粒子は、そのリガンドとの結合活性を利用して濃縮することができる。こうして目的とする結合活性を有するファージ粒子を濃縮する方法は、パニング法と呼ばれている。濃縮されたファージ粒子には、必要な結合活性を持つタンパク質をコードするＤＮＡがパッケージングされている。このように繊維状ファージの利用によって、結合活性に基づくスクリーニングと、ＤＮＡのクローニングとをきわめて効率的に行うことができるシステムが実現した（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ，Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ＤＪ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９０ ３４８：６３０ １５５２−４．）。
ファージディスプレイ系が抗体に応用され、ＶＨドメインのみ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ型抗体がｃｐ３又はｃｐ８と融合された形で発現された。抗原と結合するファージ抗体は同時に抗体をコードする遺伝子を含む。即ち、ファージディスプレイシステムでは、特定の抗原に結合可能な抗体分子と、その抗体分子をコードする遺伝子も同時に得られる点に大きな利点がある。しかし、ファージディスプレイ系を用いて作製された初期の抗体ライブラリーから単離された抗体は、抗原結合力の低いものが多かった。結合力を高める試みの一つとして、人為的に遺伝子に変異を与える方法が提案された。Ｗｉｎｔｅｒらは１９９４年、単離した全てのＶＨ、ＶＬ遺伝子と、ＪＨ、ＪＬ遺伝子の間にランダムな配列を挿入する半人工的配列を持つ抗体ライブラリーを作製することにより、親和性に優れた抗体の取得を可能とする抗体ライブラリーを得た（Ｎｉｓｓｉｍ Ａ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３ ６９２−８，１９９４）。Ｄｅ Ｋｒｕｉｆらも１９９５年基本的に同じ原理に基づいて抗体ライブラリーを作製している（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ Ｊ，Ｂｏｅｌ Ｅ，Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ Ｔ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：１ ９７−１０５，１９９５）。Ｖａｕｇｈａｎらは、１９９６年ライブラリーの大きさを拡大することで充分な大きさの抗体レパートリーを確保しようとしている（Ｖａｕｇｈａｎ ＴＪ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３ ３０９−１４，１９９６）。また、本発明者らは、生体内における抗体産生過程をできるだけ再現することにより、より多様なレパートリーを有し、かつ機能的なコンフォーメーションを保持した抗体分子を高い割合で含む抗体ライブラリーの提供方法を提案した（特願平１２−０５０５４３）。
上記のように、ファージディスプレイシステムによれば、抗体分子だけでなく、その抗体分子をコードする遺伝子も同時に得られる。この遺伝子の両端はユニークな制限酵素部位に設計できるため、ファージＤＮＡを単離し、制限酵素処理を行い、続いて、適当な発現ベクターに組み込むといった簡単な操作により、当該遺伝子の発現形態をファージディスプレイ型から別の形態へと変換することができる（Ｉｔｏ，Ｗ．，ａｎｄ Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｙ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０６６８−２０６７５，１９９３）。
一方、蛍光を発することができるタンパク質ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られ、ＧＦＰによる様々なタンパク質の標識化が試みられている。ＧＦＰは、特定波長の光の照射により蛍光を発することができるタンパク質分子であり、ＧＦＰにより標識化されたタンパク質分子の検出には特別の試薬等を必要としない。したがって、迅速かつ容易に検出ができることはもちろんのこと、生細胞内等においても直接検出することができるといった利点があり、今後の応用が期待されている。なお、ＧＦＰと同様に蛍光を発するタンパク質として、ＲＦＰ（ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＣＦＰ（ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）や、これらの変異体が開発されている（Ｃｒａｍｅｒｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３１５−３１９，１９９６；Ｙａｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：８２１２−８２１６，１９９８；Ｌｙｂａｒｇｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，３１：１４７−１５２，１９９８）。
抗体分子についてもＧＦＰ等による標識化が検討されているが、以下の課題が存在することが指摘されている。
抗体分子の中のＳ−Ｓ結合には、ドメイン内の分子内Ｓ−Ｓ結合と、Ｈ鎖とＬ鎖の間、あるいはＨ鎖とＨ鎖の間の分子間Ｓ−Ｓ結合の２種類が存在する。バクテリアの細胞質内で発現させた抗体は、抗体の産生に組替え遺伝子技術を応用した当初は、抗原結合活性をあまり示さなかった。というのは、細胞質内の条件では、ポリペプチドの正しいｆｏｌｄｉｎｇが起きないうえ、Ｓ−Ｓ結合が正しく形成されないからである（Ｂｏｓｓ ＭＡ，Ｋｅｎｔｅｎ ＪＨ，Ｗｏｏｄ ＣＲ，Ｅｍｔａｇｅ ＪＳ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３７９１−８０６，１９８４．）。これに対して、翻訳されたポリペプチドが膜を通過しペリプラズムへ分泌されるように、ｐｅｌＢ配列やｏｍｐＡ配列をポリペプチドのＮ末端側に導入するという試みが行われたが、Ｆａｂフラグメント，ｓｃＦｖフラグメントのいずれも抗原との結合が正しく行われるものは得られなかった（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４１，１９８８；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｐ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｒ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３，１９８８）。ＧＦＰと融合することによって蛍光を発する抗体を創り出すには、抗体が抗原結合活性を得るために必要な条件とＧＦＰが蛍光を発するために必要な条件という相反する両方の条件を満たさなければならない。ＧＦＰは、バクテリア内で翻訳された直後の状態では蛍光を発することができない。別の因子は必要としないが、分子内で多段階の化学反応が起きることにより発光中心が形成されることで蛍光を発することができる状態となる（Ｒｅｉｄ，Ｂ．，ａｎｄ Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：６７８６−６７９１，１９９７）。
一方、最近になって、イントラボディー技術の発展により、抗原結合能を有するｓｃＦｖ抗体を動物細胞の細胞質内でうまく発現させることができるようになってきた。
発明の開示
このような状況において、本発明者らは、ｓｃＦｖ抗体に注目し、ｓｃＦｖ抗体を蛍光タンパク質分子により標識化することを試みた。その結果、ファージディスプレイシステムを組み合わせて用いた系により、蛍光タンパク質により標識化されたｓｃＦｖ抗体を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。本発明の構成は以下の通りである。
〔１〕以下の工程を含む、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体の作製方法。
１）ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製する工程、
２）前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを抗原でスクリーニングすることにより、該抗原に結合可能なｓｃＦｖ抗体を発現しているファージクローンを選択する工程、
３）工程２）で選択したファージクローンより、ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子を取得する工程、
４）工程３）で取得した遺伝子を組込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能な発現ベクターに、該遺伝子を組込む工程、及び
５）工程４）で得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、前記融合タンパク質を発現させる工程。
〔２〕 前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、重鎖可変領域と機能的なコンフォーメーションを再構成するように選択された軽鎖可変領域を少なくとも一部分含んで成る、ことを特徴とする〔１〕に記載のｓｃＦｖ抗体の作製方法。
〔３〕 前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを構成する各ファージクローン表面のｓｃＦｖ抗体は、ＶＨ領域、ＶＬ領域、リンカー及びＣＬ領域を有する、ことを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載のｓｃＦｖ抗体の作製方法。
〔４〕 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ，及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載のｓｃＦｖ抗体の作製方法。
〔５〕 〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載の方法により作製される、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体。
〔６〕 ＶＨ領域、ＶＬ領域、及びリンカーにより構成されるＦｖ領域、ＣＬ領域、並びに該ＦＶ領域に該ＣＬ領域を介して連結される蛍光タンパク質を有してなる、ことを特徴とする蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体。
〔７〕 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする〔６〕に記載のｓｃＦｖ抗体。
〔８〕 〔５〕乃至〔７〕のいずれかに記載のｓｃＦｖ抗体を用いた免疫学的測定方法。
〔９〕 〔１〕に記載の工程１）〜４）により取得される、ｓｃＦｖ抗体遺伝子、及び蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有する組換えベクター。
〔１０〕 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子はＶＨ遺伝子、リンカー配列、ＶＬ遺伝子、及びＣＬ遺伝子からなる、ことを特徴とする〔９〕に記載の組換えベクター。
〔１１〕 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする〔９〕又は〔１０〕のいずれかに記載の組換えベクター。
〔１２〕 以下の構造を有する組み換えベクター。
〔１３〕 ５’側より順に、開始コドン、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を導入する部位、及び蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクター。
〔１４〕 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子は、ＶＨ遺伝子、リンカー配列、ＶＬ遺伝子、及びＣＬ遺伝子からなる、ことを特徴とする〔１３〕に記載の発現ベクター。
〔１５〕 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子を導入する部位と前記蛍光タンパク質をコードする塩基配列との間にＨｉｓ−ｔａｇ、ｍｙｃ−ｔａｇ、又はＨＡ−ｔａｇをコードする塩基配列を有する、ことを特徴とする〔１３〕又は〔１４〕に記載の発現ベクター。
〔１６〕 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする〔１３〕乃至〔１５〕のいずれかに記載の発現ベクター。
〔１７〕 ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリー、及び
ｓｃＦｖ抗体遺伝子を組み込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクター、を含む、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体作製用キット。
〔１８〕 前記ｓｃＦｖ抗体はＶＨ領域、ＶＬ領域、リンカー、及びＣＬ領域から構成される、ことを特徴とする〔１７〕に記載のキット。
〔１９〕 ｓｃＦｖ抗体遺伝子を有するファージクローン又はファージミドクローンから構成されるｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリー、及び
ｓｃＦｖ抗体遺伝子を組み込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクター、を含む、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体作製用キット。
〔２０〕 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子はＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、リンカー配列、及びＣＬ遺伝子から構成される、ことを特徴とする〔１９〕に記載のキット。
〔２１〕 前記ベクターは〔１３〕乃至〔１６〕のいずれかに記載される発現ベクターである、ことを特徴とする〔１７〕乃至〔２０〕のいずれかに記載のキット。
発明を実施するための最良の形態
本発明である、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体の作製方法は、以下の工程を含むものである。
１）ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製する工程、
２）前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを抗原でスクリーニングすることにより、該抗原に結合可能なｓｃＦｖ抗体を発現しているファージクローンを選択する工程、
３）工程２）で選択したファージクローンより、ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子を取得する工程、
４）工程３）で取得した遺伝子を組込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能な発現ベクターに、該遺伝子を組込む工程、及び
５）工程４）で得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、前記融合タンパク質を発現させる工程。
本発明において、「ｓｃＦｖ抗体」とは、Ｆｖ領域、即ち、重鎖可変領域（ＶＨ領域）及び軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含み、これらがリンカーにより架橋されて構成される抗体である。本明細書においては、ＶＨ領域、ＶＬ領域、及びリンカーに加えて、軽鎖定常領域（ＣＬ領域）を含むものもｓｃＦｖ抗体に含まれるものとする。ＣＬ領域を付加することは、本発明の蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体のコンフォーメーションの安定化の目的で行われる。
また、「ｓｃＦｖ抗体遺伝子」とは、ＶＨ領域をコードする遺伝子（ＶＨ遺伝子）、ＶＬ領域をコードする遺伝子（ＶＬ遺伝子）、及びリンカー配列から構成される。本発明においては、これらに加えてＣＬ領域をコードする遺伝子（ＣＬ遺伝子）を含むものもｓｃＦｖ抗体遺伝子に含まれるものとする。
ＶＨ領域とＶＬ領域とを架橋するリンカーには、汎用的なものを用いることができ、例えば、グリシン−セリンからなるペプチドリンカーが用いられる。
本発明において、「ライブラリー」とは、多様な同種の構成要素からなる集合体を意味する。よって、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーとは、多様なｓｃＦｖ抗体を含有する集合体である。本発明においては、各ｓｃＦｖ抗体はファージ表面に発現されている。換言すれば、表面にｓｃＦｖ抗体を発現しているファージクローンの集合によりｓｃＦｖ抗体ライブラリーが形成される。
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が機能的なコンフォーメーションを再構成するように（もしくは、再構成しているものが大多数を占めるように）作製できれば有効なものとなる。本発明者らは、特願平１２−０５０５４３において、重鎖可変領域と機能的なコンフォーメーションを形成する軽鎖可変領域を選択してライブラリー作製に用いることを提案している。特願平１２−０５０５４３に提案された方法はｓｃＦｖ抗体ライブラリーにも適用することが可能である。また、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、生体内の多様性を包含するのに十分なクローン数を有することが好ましい。これにより、後述の工程２）において、多種多様な抗原に対して、当該抗原と結合可能なｓｃＦｖ抗体を表面に発現するクローンを選択することが可能となる。また、クローン数は、１×１０１１以上であることが好ましい。このようなクローン数を有するｓｃＦｖ抗体ライブラリーの調製方法については、後述の実施例において説明する。
本発明におけるｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンの集合により構成されるが、かかるｓｃＦｖ抗体ライブラリーはｓｃＦｖ抗体遺伝子を保有するファージミドクローンの集合（以下、「ｓｃＦｖ抗体ファージミドライブラリー」という）より調製することができる。なお、本発明において、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を保有するクローンの集合から構成されるライブラリーをｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーと呼ぶ。したがって、ｓｃＦｖ抗体ファージミドライブラリーはｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーでもある。また、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を保有するファージミドにより形質転換された大腸菌の集合もｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーを構成する。
ｓｃＦｖ抗体ファージミドライブラリーを作製するためのファージミドベクターとしては、市販のものを利用することができる（例えば、ファルマシア製 ｐＴＺ１９Ｒ）。ファージミドには、ｃｐ３やｃｐ８等のファージの構成タンパク質をコードする遺伝子に、発現させたい外来タンパク質をコードする遺伝子、即ち、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を連結する。
ｓｃＦｖ抗体遺伝子は、上述のようにＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、及びリンカー配列、又はこれらにＣＬ遺伝子を加えたものから構成されるが、ＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、及びＣＬ遺伝子は、任意の抗体産生細胞より得ることができる。抗体産生細胞としては、例えば、末梢血リンパ球や脾臓細胞等を挙げることができる。それぞれの遺伝子の単離には、公知のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法を利用することができる。得られた各領域の遺伝子とリンカー配列とを連結することによりｓｃＦｖ抗体遺伝子が構成される。
ｓｃＦｖ抗体ファージミドライブラリーからのｓｃＦｖ抗体ライブラリーの調製方法は次のように行うことができる。まず、ｓｃＦｖ抗体ファージミドライブラリーを構成する各クローンを宿主にトランスフェクションさせる。次に、この宿主にヘルパーファージを重感染させる。例えば、ファージミドベクターｐＴＺ１９Ｒは、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７の重感染によってファージ粒子として回収することができる。このとき利用されるファージミドのｃｐ３タンパク質が外来タンパク質すなわちｓｃＦｖ抗体と融合されていれば、完成するファージの表面にはｓｃＦｖ抗体が提示されることとなる。
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーの作製方法は上述のものに限られるわけではなく、例えば、後述の実施例のように、まず、ＶＨ遺伝子、ＣＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、及びＣＬ遺伝子とから構成されるＦａｂ型抗体遺伝子を保有するクローンにより構成されるライブラリー（以下「Ｆａｂ抗体遺伝子ライブラリー」という）を作成し、各クローンにおけるＦａｂ抗体遺伝子をｓｃＦｖ抗体遺伝子に変換することによりｓｃＦｖ抗体を保有するクローンの集合（ｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリー）を得て、これから上述の方法によりｓｃＦｖ抗体ライブラリーを作製することができる。
本発明の工程２）では、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを特定の抗原でスクリーニングし、当該抗原に結合可能なｓｃＦｖ抗体を発現しているファージクローンが選択される。
抗原は、目的に応じて種々のものが用いられる。また、抗原を用いたスクリーニングは以下に示すパニング法により行うことができる。まず、目的とする抗原にｓｃＦｖ抗体ライブラリーを接触させ、この抗原に結合するクローンを回収する。回収したクローンを増幅し、再び目的の抗原と接触させて、結合するクローンを回収する工程を繰り返す。ファージの増幅は、ファージを大腸菌に感染させ、回収することによって行われる。この工程を繰り返すことによって、目的とする反応性を持つｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンが濃縮される。抗原との結合性に基づくスクリーニングは、一般にクローンの回収率が上昇するまで行われる。ここで回収率とは、抗原に対して添加したファージクローンの数に対する、抗原への結合性を有するものとして回収されたファージクローンの数の割合である。回収率がその前のスクリーニングに比較して明らかに上昇するとき、目的とする反応性を持つｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンが濃縮されつつあることを意味する。
工程３）においては、工程２）により選択したファージクローンより、ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子（ｓｃＦｖ抗体遺伝子）が取得される。即ち、ファージクローンより、ＶＨ領域、ＶＬ領域、及びリンカーをコードする遺伝子が切り出される。ｓｃＦｖ抗体としてＣＬ領域を含有するものを用いる場合には、ＶＨ領域、ＶＬ領域、及びリンカーに加えて、ＣＬ領域をコードする遺伝子が切り出される。このとき、Ｈｉｓ，ＭｙｃなどのＴａｇを含有するものを用いてもよい。
具体的なｓｃＦｖ抗体遺伝子の切り出し方法としては、ファージＤＮＡのｓｃＦｖ抗体遺伝子導入部位、即ち、ｓｃＦｖ抗体遺伝子の両端の制限酵素サイトを特異的に切断する制限酵素を用いる。このような切り出しを行うため、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを構成する各ファージクローンにおけるｓｃＦｖ遺伝子導入部位を当該制限酵素に対応したユニークな制限酵素サイトにより形成しておく。
工程３）の後に、工程３）で取得したｓｃＦｖ抗体遺伝子の一端又は両端の配列を、該遺伝子のコードするアミノ酸配列が変化しない条件下で異なる塩基配列に変換する工程（工程３−１））を行うことができる。この工程により、ｓｃＦｖ抗体遺伝子のコードするアミノ酸配列を変化させることなく、その一端又は両端に所望の制限酵素サイトを形成することができる。これにより、工程３）で切り出されたｓｃＦｖ抗体遺伝子の一端又は両端の塩基配列を、次の工程４）において用いられる発現ベクターの導入部位を形成する制限酵素サイトに対応させることができる。このような工程を行うことにより、発現ベクターの設計の自由度が高くなる。もちろん、予めｓｃＦｖ抗体遺伝子の両端の制限酵素サイトと発現ベクターの導入部位とが対応するように、ｓｃＦｖ抗体遺伝子及び発現ベクターを設計することができ、この場合には工程３−１）は不要である。工程３−１）は、適当な合成プライマーを用いたＰＣＲにより行うことができる。この場合、工程３）と同時に工程３−１）を行うことができる。即ち、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を切り出す際に、ｓｃＦｖ抗体遺伝子の一端又は両端の配列を変換する２つのプライマーを用いてＰＣＲを行い、制限酵素サイトの変換されたｓｃＦｖ抗体遺伝子を切り出し、かつ増幅する。
また、ｓｃＦｖ抗体遺伝子の末端に適当なリンカーを付加することにより、所望の制限酵素サイトを形成してもよい。
工程４）では、工程３）、又は工程３）及び工程３−１）で取得したｓｃＦｖ抗体遺伝子を発現ベクターに組み込むことが行われる。
発現ベクターはｓｃＦｖ抗体遺伝子を組み込むことによりｓｃＦｖ抗体遺伝子発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なものを用いる。このような発現ベクターとしては、５’側より順に、開始コドン、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を導入する部位、及び蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有するものが用いられる。また、ｓｃＦＶ抗体遺伝子を導入する部位と蛍光タンパク質をコードする塩基配列の間にＨｉｓ−ｔａｇ、ｍｙｃ−ｔａｇ、又はＨＡ−ｔａｇなどをコードする塩基配列（以下、「タグ配列」という）を有する発現ベクターを用いることができる。かかるベクターを用いることにより、ｓｃＦｖ領域と蛍光タンパク質との間に、タグ配列によりコードされる分子が介在される。これにより、タグ分子の特定物質との親和性を利用してｓｃＦｖ抗体を精製することが可能となる。また、タグ配列を入れる位置はこれに限られるものではなく、ｓｃＦｖ抗体遺伝子導入部位の５’上流域、又は蛍光タンパク質をコードする配列の下流域に入れておくこともできる。但し、タグ配列にコードされる分子とｓｃＦｖ抗体とが融合したものとして発現される位置に入れる必要がある。
上記特性を備える発現ベクターは、市販の発現ベクターを周知の遺伝子操作技術を用いて改良することにより作製することができる。なお、形質転換させる宿主に応じて、細菌発現用ベクター、動物細胞発現用ベクターを用いる。大腸菌を宿主とした場合の本発明における発現ベクターとして、例えば、ｐ６×Ｈｉｓ−ＧＦＰ（クロンテック製）ベクターの開始コドンとＨｉｓ−Ｔａｇ配列の間にＡｓｃＩサイトを付加したものを用いることができる。
この発現ベクターにおいては、ＡｓｃＩサイトにｓｃＦｖ抗体遺伝子が導入される。このベクターを用いた場合に、後述の工程５）で得られる発現産物では、標識ペプチドであるヒスチジンタグが融合したｓｃＦｖ抗体が発現される。ヒスチジンタグは金属イオンとの結合活性を持つタグであって、例えばニッケルカラムに捕捉することができるため、ｓｃＦｖ抗体の精製に利用できる。
同様の目的で、ヒスチジンタグの代わりに、ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ等を用いることもできる。その場合には、ヒスチジンタグの場合と同様に、これらのタグをコードする塩基配列を組込んだ発現ベクターを用いる。また、ｓｃＦｖ抗体遺伝子に予めＨｉｓ−ｔａｇ等をコードする塩基配列を融合しておき、これを発現ベクターに導入することもできる。この場合には、発現ベクターとしてＨｉｓ−ｔａｇ等をコードする塩基配列を有するものを使用する必要はない。
蛍光タンパク質の種類は特に限定されず、公知のものを任意に選択して用いることができる。例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰを用いることができ、また、これらの変異体を用いることもできる。変異体としては、例えば、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＢＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＹＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られている。これらのタンパク質は特定の波長の光を照射することにより照射光と異なる波長の光を発光することができ、目的、条件等に応じて任意に選択して用いることができる。また、これらの蛍光タンパク質は単独で用いられることはもちろんのこと、複数種を任意に選択し、組み合わせて用いることもできる。
上記工程１）〜４）により取得される、ｓｃＦｖ抗体遺伝子、及び蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有する組換えベクターは本発明に含まれる。また、工程３）の後に上記工程３−１）をさらに行うことにより取得される組換えベクターも本発明に含まれる。この場合においても、上述のようにｓｃＦｖ抗体遺伝子としてＣＬ遺伝子を含む場合も含まれるものとする。
具体的な組換えベクターとして、次の構成のものを挙げることができる。
本発明における工程５）では、工程４）で得られたｓｃＦｖ抗体遺伝子を有する組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体が発現される。
上記の工程により作製される蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体は、免疫染色等の免疫学的測定方法に利用できる。本発明のｓｃＦｖ抗体では、蛍光タンパク質が融合しているため、それ自体で蛍光を発することができる。すなわち、従来の抗体を用いたＥＬＩＳＡ法等においては、標識化された２次抗体を必要とするが、本発明のｓｃＦｖ抗体においてはそれ自体標識化されているため、２次抗体等を必要とせず、測定工程の簡略化が図れる。また、蛍光を発するために特別の基質を必要としないため、例えば、細胞内で発現させ、これを取り出すことなく直接測定することができる。したがって、特定の抗原の細胞内ないし生体内における発現、分布を直接測定することができる。
ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリーと、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を組込むことにより当該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクターとを含ませることにより、ｓｃＦｖ抗体作製用キットを構成することができる。ｓｃＦｖ抗体ライブラリー、蛍光タンパク質、発現ベクターとしては、それぞれ上述のものを任意に選択して用いることができる。また、ｓｃＦｖ抗体としては、ＶＨ領域、ＶＬ領域、リンカー、及びＣＬ領域から構成されるものも含まれる。
また、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を有するファージクローン又はファージミドクローンから構成されるｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーと、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を組み込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクターとを含ませることにより、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体作製用キットを構成することができる。この場合において、ｓｃＦｖ抗体遺伝子はＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、リンカー配列、及びＣＬ遺伝子から構成されるものも含まれる。ｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーは、公知のファージ又はファージミドを用い、公知の遺伝子操作技術によりｓｃＦｖ抗体遺伝子を導入することにより作製される。また、蛍光タンパク質、発現ベクターとしては、それぞれ上述のものを任意に選択して用いることができる。
［実施例］
本実施例では、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製するために、まず、ＶＨ領域、ＣＨ領域、ＶＬ領域、及びＣＬ領域とから構成されるＦａｂ型抗体遺伝子を含有するクローンの集合からなるＦａｂ抗体遺伝子ライブラリーを作製した。そして、Ｆａｂ抗体遺伝子ライブラリーをｓｃＦｖ型抗体遺伝子を含有するクローンの集合からなるｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーに変換し、これよりｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製した。なお、本実施例では、ｓｃＦｖ型抗体として、ＶＨ領域、リンカー、及びＶＬ領域（ｓｃＦｖ）にＣＬ領域が付加した抗体（以下、「ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体」という）を用いた。ＣＬ領域を付加した理由は、細胞質内で発現させた場合に安定性の促進が期待されるからである。なお、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーの調製方法はこれに限定されるものではない。
１．Ｆａｂ抗体遺伝子ライブラリー作製用ファージミドベクターの作製
１−１ Ｆａｂ抗体遺伝子ライブラリーを作製するためのベクターの作製
図１に概念的に示すように、ｐＴＺ１９Ｒファージミドベクター（ファルマシア）にＭ１３ファージのｐｅｌＢ（シグナル配列）、Ｈｉｓ６タグ配列、Ｍ１３ファージのｃｐ３タンパク質（Δｃｐ３（１９８ａａ−４０６ａａ）Ｎ端欠失キャプシドタンパク質３）配列、ｐｒｏｔｅｉｎＡタンパク質配列を適当な制限酵素部位で組み込みベクターｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄを作製した（Ｉｂａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９４：３５−４６，１９９７．参照）。軽鎖λ５，λ６遺伝子に存在するＢｓｔＰＩでその遺伝子が切断されることを避けるためにｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄはＸｈｏＩ部位が設けられている。ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの塩基配列を図２に、制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を図３〜５に示した。
このベクターの所定の位置に重鎖と軽鎖の遺伝子を挿入することにより、実際の抗体タンパク質発現ベクターが完成することとなる。完成したベクターによって発現される抗体の形状はＦａｂ型であり、重鎖軽鎖はＮ末の可変領域に続いて定常領域ＣＨ１，ＣＬをそれぞれ有している。定常領域同士の−ＳＳ−結合によって、重鎖と軽鎖は結合されることになる。軽鎖定常領域ＣＬ遺伝子は前述のｃｐ３遺伝子と結合されており、結果として発現タンパク質はＦａｂ−ｃｐ３の形状となる。
具体的には、以下のような操作を行った。
用いたプライマー：
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ Ｈ鎖部分の作製
１）ｐＡＡＬＦａｂを鋳型にして５２７−５９９を用いたＰＣＲ，５４７−５９０を用いたＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した。
２）５４４−５４５，５４６−５４７，５４８−５４９にてＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した
３）１）２）を混合し５２７，５９０によるＰＣＲを行い、これをｐＡＡＬＦａｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ ｓｉｔｅにクローニングした
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ Ｌ鎖部分
４）５４２−５６２，５６１−６１３を用いたＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した
５）５３８−５３９，５４２−５４３にてＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した
６）４）５）を混合し５３８，５６２によるＰＣＲを行い、これをｐＡＡＬＦａｂのＳａｃＩ−ＮｈｅＩ ｓｉｔｅにクローニングした
ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ
６）ＶＨｓｔｕｆｆｅｒ部分の作製
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８ＴをＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩにて消化、ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを作用させて平滑末端に変えた後ｓｅｌｆ ｌｉｇａｔｉｏｎさせてＶＨ部分のｓｔｕｆｆｅｒを作製した。
７）ＶＨｓｔｕｆｆｅｒ部分の作製
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを鋳型にして５２７−６００にてＰＣＲ。６）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ ｓｉｔｅにクローニングした。
８）これをＫｐｎＩにて消化、ｓｅｌｆ ｌｉｇａｔｉｏｎさせてＶＬ部分のｓｔｕｆｆｅｒを作製
９）ＳｆｉＩ，ＮｃｏＩ，ＳｐｅＩ ｓｉｔｅの導入
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを鋳型にして５２７−６６３にてＰＣＲ。１）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ ｓｉｔｅにクローニングした。
１０）ＡｓｃＩ ｓｉｔｅの導入
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを鋳型にして５２７−ＬＣＰ３ＡＳＣにてＰＣＲし、それをＳａｃＩ完全消化、ＳａｌＩ部分消化した２）にクローニングした。
１１）ｇａｍｍａＣＨ１部分をヒト遺伝子に変換
ヒトｇａｍｍａＣＨ１部分にはＢｓｔＰＩ ｓｉｔｅが存在するためこれをなくす設計でクローニングを行った。扁桃ｃＤＮＡを鋳型にしてｈＣＨ１Ｂｓｔ−ｈＣＨ１ｍｉｄＳ，ｈＣＨ１ｍｉｄＡＳ−ｈＣＨ１Ｈ６にてＰＣＲしたのち、これを混合してｈＣＨ１Ｂｓｔ−ｈＣＨ１６ＳｍａにてＰＣＲし、そのＤＮＡ断片を３）のＢｓｔＰＩ−Ｓｍａ ｓｉｔｅにクローニングした
１２）Ｘｈｏ ｓｉｔｅの導入
１１）を鋳型に７０２−６６３にてＰＣＲを行い、これを１１）のＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ ｓｉｔｅにクローニングした。
１−２ 重鎖可変領域（ＶＨ）を一時的にクローニングするためのベクターの作製
公知の手法（Ｉｂａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９４：３５−４６，１９９７．参照）に従って、まずｐＡＡＬＦａｂベクター（図１の１））を作製した。ｐＡＡＬＦａｂベクターのＸｂａＩからＥｃｏＲＩの間を欠落させ、新たに制限酵素切断部位Ｋｐｎ Ｉ，Ｓｆｉ Ｉ，Ｎｃｏ Ｉ，Ｓｐｅ Ｉを付加して、ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを経て、ＶＨ（重鎖可変領域）をクローニング可能としたベクターｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ（図１の３））を作製し、重鎖可変領域を一時的にクローニングするためのベクターとした。ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの塩基配列を図６に、制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を図７〜８に示した。
具体的には
ｐｒｉｍｅｒ６１０とｐｒｉｍｅｒ６１１をアニールさせ、それをｐＦＣＡＨ３−Ｅ８ＴのＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ ｓｉｔｅにクローニングしてｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎの作製を行なった。さらに、ｐｒｉｍｅｒ５２７とｐｒｉｍｅｒ６１９にてＰＣＲを行い、これをさらにＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ ｓｉｔｅにクローニングし、ＳｆｉＩ，ＮｃｏＩ ｓｉｔｅの導入を行った。
２．イムノグロブリン軽鎖ライブラリーの作製
２−１ ＰＣＲを用いたイムノグロブリン軽鎖遺伝子の単離
骨髄細胞（検体Ｎｏ．５９）４×１０７ｃｅｌｌｓ、および臍帯血と末梢血のリンパ球から、市販のキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて、２．６μｇのｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡは、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによって作製した。プライマーには、オリゴｄＴを用いた。得られたｃＤＮＡを鋳型にして、軽鎖遺伝子の取得用５‘プライマー（κ１〜κ６、λ１〜λ６）と３’プライマー（ｈＣＫＡＳＣプライマーまたはｈＣＬＡＳＣプライマー）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して１０μＬのＴＥバッファーに懸濁した。用いたプライマーの塩基配列とＰＣＲの条件は以下のとおりである。軽鎖遺伝子取得用プライマーの塩基配列中、下線部はＳｆｉＩサイト、ＡｓｃＩサイトを示す。
５’−プライマーκ１〜κ６
５’−プライマーλ１〜λ６
ＰＣＲの条件
ｃＤＮＡ ２μＬ
１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付） １０μＬ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（２．０ｍＭ） １０μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４μＬ
５’側プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ） １μＬ
３’側プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ） １μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ７１μＬ
ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡２．５Ｕ／μＬ）１μＬ
９４℃ １分、５５℃ ２分、７４℃ １分を３５サイクル
２−２ ライブラリー作製に適した軽鎖を選択して軽鎖遺伝子ライブラリーを作製する方法
２−２−１ 軽鎖遺伝子のファージミドへの組込み
１で得たＰＣＲ産物を以下の条件で制限酵素処理した。
ＰＣＲ産物 １０μＬ
１０×ＮＥＢ４（ＡｓｃＩに添付） ５μＬ
１０×ＢＳＡ（ＳｆｉＩに添付） ５μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ２８μＬ
ＡｓｃＩ（ＮＥＢ社 １０Ｕ／μＬ） １μＬ
ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社 ２０Ｕ／μＬ） １μＬ
３７℃で１時間、５０℃で１時間反応後、そのうち１０μＬ分をアガロース電気泳動し、６００ｂｐ付近のバンドを切り出して、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製した。ＰＣＲ産物と同様に制限酵素処理したｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ（図１の４））をジーンクリーンＩＩキットで精製し、制限酵素処理したＰＣＲ産物と以下の条件で１６℃で４時間〜一晩反応させることによりライゲーションした。
制限酵素処理したｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ２μＬ
制限酵素処理したＰＣＲ産物 １μＬ
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ
（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅに添付）
１０ｍＭ ＡＴＰ １．５μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ８μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造１０Ｕ／μＬ）１μＬ
２−２−２ ファージミドの大腸菌への導入
得られたｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡを用いて以下のように大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。即ち、ｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡを一旦エタノール沈殿し、１／５ＴＥ（ＴＥを滅菌済ＭｉｌｌｉＱで５倍希釈したもの）３μＬに溶解した。そのうち、１．５μＬをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）２０μＬに懸濁し、以下の条件でエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーター
ＢＲＬ社 Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｃａｔ．ｓｅｒｉｅｓ １６００）
設定条件；ｖｏｌｔａｇｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ４ｋΩ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ３３０μＦ
ＤＣ ｖｏｌｔｓ ＬｏｗΩ
ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｅ Ｆａｓｔ
２−２−３ ファージミドで形質転換した大腸菌からのＦａｂ−ｃｐ３型抗体培地中への分泌
形質転換した上記の大腸菌を形質転換用培地（ＳＯＢ）２ｍＬに植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ａｍｐプレート）にまき、残りは、１％グルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有２×ＴＹ培地で培養し、グリセリンストックした。寒天培地は３０℃でｉｎｃｕｂａｔｅし、生えてきたコロニーを楊枝でつついて分離し、それぞれプラスミドを調製し、軽鎖遺伝子の塩基配列を調べた。
ＳＯＢ培地：９５０ｍＬの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後２５０ｍＭのＫＣｌ溶液１０ｍＬを加え、５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調製した。精製水を加えて１０００ｍＬに調整した後、オートクレーブで２０分間滅菌し、使用直前に滅菌した２ＭのＭｇＣｌ２を５ｍＬ加えた。
ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ ２０ｇ
ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ
ＮａＣｌ ０．５ｇ
２×ＹＴ培地：９００ｍＬの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後５Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．０に調製し、精製水を加えて１０００ｍＬとした。オートクレーブで２０分間滅菌して使用した。
ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １６ｇ
ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ
ＮａＣｌ ５ｇ
その他の試薬は以下から購入した。
メーカー 品名
シグマ アンピシリンナトリウム
和光純薬 フェノール
シグマ ＢＳＡ
ＤＩＦＣＯ ２×ＹＴ培地
和光純薬 カナマイシン硫酸塩
ナカライテスク ポリエチレングリコール６０００
ナカライテスク Ｔｗｅｅｎ２０
片山化学 ＮａＣｌ
和光純薬 ＩＰＴＧ
和光純薬 スキムミルク
和光純薬 アジ化ナトリウム
和光純薬 トリエチルアミン
和光純薬 過酸化水素
和光純薬 ＯＰＤ錠
和光純薬 エタノール
κ１、κ２、κ３、κ４、κ５、およびκ６、並びにλ１、λ２、λ３ａ、λ３ｂ、λ４、λ５、λ６、λ７、λ８、λ９、およびλ１０の全てについて以上の操作を行い、目的のクローンが得られているかどうか確認した。続いてκ１、κ２などの各グループのクローンをｉｎ ｖｉｖｏでの使用頻度に近い比率になるように混合した。これら軽鎖の各グループは、それぞれ実際の生体内でどのような割合で発現しているのかが既に知られている。ＰＣＲ法で増幅してベクターに組み込んだこれらの遺伝子クローンを、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用頻度に近い比率になるように混合しＶＬライブラリーとした。ＶＬライブラリーにおける各ｆａｍｉｌｙの構成比率を以下に示す。
＊Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＡＤ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９４）１３，３２４５−６０．
＊＊発表時記載なし。
＊＊＊プライマーＶＫ６−２で作製したｃＤＮＡとプライマーＶＫ６−３で作製したｃＤＮＡを等量混合。
＊Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＡＤ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９４）１３，３２４５−６０．
＊２ 発表時記載なし。
＊３ プライマーＶＬ２で作製したｃＤＮＡ５％とプライマーＶＬ２−２で作製したｃＤＮＡ１０％を混合。
＊４ プライマーＶＬ３ａ−２で作製したｃＤＮＡ１７％とプライマーＶＬ３ｂで作製したｃＤＮＡ１５％を混合。
＊５ プライマーＶＬ４ａで作製したｃＤＮＡ０．５％とプライマーＶＬ４ｂで作製したｃＤＮＡ０．５％とプライマーＶＬ４ｃで作製したｃＤＮＡ０．５％を混合。
＊６ プライマーＶＬ５ａｂｄｅで作製したｃＤＮＡ０．５％とプライマーＶＬ５ｃで作製したｃＤＮＡ０．５％を混合。
次に、ＶＬライブラリーから無作為に選んだ約１０００個の軽鎖遺伝子の塩基配列を確認した。すなわち、蛍光プライマーｈｕＣＨ１Ｊ（５’−ＡＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＣＣＣＧＧ−３’／配列番号：４５）を用い、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって塩基配列を決定した。得られた塩基配列を比較して重複するクローンを除いた。更にデータベースと照合し、ｄｅｌｅｔｉｏｎが無いと確認されたクローンについて、予め発現することがわかっている重鎖遺伝子のクローンの一つＶＨ３−４と組み合わせて、発現実験を行った。操作は以下のとおりである。ＶＨ３−４のアミノ酸配列を配列番号：１に示した。
まずＶＨ３−４をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、重鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。一方、ｄｅｌｅｔｉｏｎが無いと確認された軽鎖遺伝子クローンについてもＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、軽鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンＩＩキットで精製し、ＶＨ３−４の重鎖遺伝子とライゲーションすることにより、組み合わせた。得られたｌｉｇａｔｅｄＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。生えてきたコロニーを試験管にいれた培地にうえ、ＩＰＴＧで発現を誘導することにより、Ｆａｂ−ｃｐ３型の抗体分子を培養上清中に発現させた。２０時間程度の培養により、ヘルパーファージの感染無しでもＦａｂ−ｃｐ３型の抗体分子が培養上清に発現される。この培養上清を用いて以下のようなＥＬＩＳＡを行った。
２−２−４ ＥＬＩＳＡ法による重鎖と軽鎖の正しい発現と会合の検定
１）抗体結合９６ｗｅｌｌマイクロタイタープレートの作製
抗κ抗体（ＭＢＬ ｃｏｄｅ Ｎｏ．１６１）を０．０１Ｍナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ ＮａＮ３で１．２５μｇ／ｍＬで希釈し、１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加した。４℃で一晩静置することにより、ウェルに抗κ抗体を吸着させた。反応液を捨て、５％ ＢＳＡ ｉｎ ０．０１Ｍナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ ＮａＮ３を２００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し、３７℃で２時間静置することにより、非特異的な吸着を防ぐためのブロッキングを行った。
次に、非特異的活性吸収済の抗λ抗体（ＭＢＬ ｃｏｄｅ Ｎｏ．１５９）を０．０１Ｍナトリウムリン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ ＮａＮ３で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し氷室で一晩静置した。反応液を捨て、５％ ＢＳＡ ｉｎ ０．０１Ｍナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ ＮａＮ３を２００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で２時間静置し、非特異的な結合を防ぐためのブロッキングを行った。
２）１次反応
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｏｒｏｌとして）ヒトＦａｂ（１０μｇ／ｍＬ）を、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＰＢＳ／０．１％ＮａＮ３をそれぞれ１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加した。ＩＰＴＧでＦａｂ−ｃｐ３型の抗体分子の発現を誘導した培養上清の原液を１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で１時間反応させた。
３）２次反応
１次反応を終了したマイクロタイタープレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄した。次いでＰＢＳ／０．１％ＮａＮ３で希釈した抗Ｆｄ抗体（１μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で１時間反応させた。
４）３次反応
２次反応を終了したマイクロタイタープレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄した。次いでＰＢＳ／０．１％ＮａＮ３で希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（４０００倍希釈）を１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で１時間反応させた。
５）発色反応および吸光度測定
３次反応を終了したマイクロタイタープレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄した。次いで発色基質溶液（ＳＩＧＭＡ １０４ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔａｂｌｅｔｓ １粒あたり５ｍＬの５０ｍＭジエタノールアミンＰＨ９．８に溶解したもの）を１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加した。室温で反応させ、４０５ｎｍの吸光度が０．５以上になったと思われる時点で、停止液を添加し、プレートリーダー（タイターテック マルチスキャンＭＣＣ）で吸光度測定した。
このＥＬＩＳＡで陽性（吸光度０．５以上）となったクローンは、Ｆａｂ−ｃｐ３型の抗体分子の発現と会合がうまく行われているとし、κ鎖遺伝子、λ鎖遺伝子それぞれ反応性の高いものから１００個ずつ選択した。両者を混合してＦａｂ−ｃｐ３型の抗体分子の発現と会合がうまく行われているクローンのみを集めたライブラリーＫＬ２００とした。
３．軽鎖遺伝子ライブラリーと重鎖遺伝子ライブラリーの組み合わせライブラリー（Ｆａｂ抗体遺伝子ライブラリー）の作製
３−１−１ ＰＣＲを用いたイムノグロブリン重鎖遺伝子の単離
２−１と同様の手順を用いて臍帯血、骨髄液、および末梢血のリンパ球、並びに扁桃腺からｈｕｍａｎ μ ｐｒｉｍｅｒ（以下に示すプライマーの６３４）あるいはｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒを用いてｃＤＮＡを調製し、このｃＤＮＡを鋳型にして、以下に示すヒト抗体重鎖遺伝子の取得用５’プライマー（ＶＨ１〜ＶＨ７）と３’プライマー（ｈｕｍａｎ ＪＨプライマー４種を等量混合したもの、以下に示すプライマーの６９７〜７００）、または、ｈｕｍａｎ μプライマー（以下に示すプライマーの６３４）を用いて、ＰＣＲを行った。表中、下線をつけた部分はＳｆｉＩサイトを示す。ｈＶＨ２ａはｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ＶＨ２ ｆａｍｉｌｙに対応していないため、新たにＶＨ２ａ−２を設計した。またｈＶＨ４ａではＶＨ４ファミリー全体に対応していないため、新たにｈＶＨ４ａ−２を設計した。ＶＨ５ａもｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ＶＨ５ ｓｕｂｆａｍｉｌｙに対応していなかったため新たにＶＨ５ａ−２を設計した。またＶＨ７に対応するｐｒｉｍｅｒとしてｈＶＨ７を設計した。これらについても遺伝子増幅を行い、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄに組み込み、どのような遺伝子がとれたのかを塩基配列決定した。ｈＶＨ５ａ−２についてはｈＶＨ１ａと配列が酷似しているため、ｈＶＨ１ａで増幅させたものと同様の遺伝子産物が得られることが予想されるためこれについては使用しなかった。ＰＣＲ産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して１０μＬのＴＥバッファーに懸濁した。
各ＶＨ ｆａｍｉｌｙの増幅に使用したｐｒｉｍｅｒ
Ｈｕｍａｎ ＶＨ ｐｒｉｍｅｒ ＳｆｉＩ ｓｉｔｅを下線で示す
Ｈｕｍａｎ ＪＨ ｐｒｉｍｅｒ ＢｓｔＰＩ，ＸｈｏＩ ｓｉｔｅを下線で示す
ｃＤＮＡ ２μＬ
１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付） １０μＬ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（２．０ｍＭ） １０μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４μＬ
５’側プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ） １μＬ
３’側プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ） １μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ７１μＬ
ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡２．５Ｕ／μＬ）１μＬ
ＰＣＲ条件：９４℃ １分、５５℃ ２分、７４℃ １分を３５サイクル
３−１−２ 重鎖遺伝子ライブラリーの作製
３−１−１で得たＰＣＲ産物を以下の条件で制限酵素処理した。
ＰＣＲ産物 １０μＬ
１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造） ５μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ３３μＬ
ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造１５Ｕ／μＬ） １μＬ
ＸｈｏＩ（宝酒造１２Ｕ／μＬ） １μＬ
３７℃で２時間反応後、そのうち１０μＬ分をアガロース電気泳動し、４００ｂｐ付近のバンドを切り出して、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製した。ＰＣＲ産物と同様に制限酵素処理したｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ（図１の３））をジーンクリーンＩＩキットで精製し、制限酵素処理したＰＣＲ産物と以下の条件で１６℃で４時間〜一晩反応させることによりライゲーションした。
制限酵素処理したｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ ２μＬ
制限酵素処理したＰＣＲ産物 １μＬ
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ
（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅに添付）
１０ｍＭ ＡＴＰ １．５μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ８μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造１０Ｕ／μＬ）１μＬ
３−１−３ ファージミドの大腸菌への導入
得られたＤＮＡを大腸菌ＤＨ１２Ｓに形質転換した。具体的にはＤＮＡを一旦エタノール沈殿し、１／５ＴＥ（ＴＥを滅菌済ＭｉｌｌｉＱで５倍希釈したもの）３μＬに溶解する。そのうち、１．５μＬをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）２０μＬに懸濁し、エレクトロポレーション法により形質転換を行った。
エレクトロポレーター
ＢＲＬ社Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｃａｔ．ｓｅｒｉｅｓ １６００）
設定条件；ｖｏｌｔａｇｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ４ｋΩ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ３３０μＦ
ＤＣｖｏｌｔｓ ＬｏｗΩ
ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｅ Ｆａｓｔ
形質転換用培地（ＳＯＢ）２ｍＬに上記操作の終了した形質転換大腸菌を植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ａｍｐプレート）にまき、残りは、１％グルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有２×ＹＴ培地で培養し、グリセリンストックした。寒天培地は３０℃でインキュベートし、生えてきたコロニーを楊枝でつついて分離し、それぞれプラスミドを調製し、重鎖遺伝子の塩基配列を調べた。ＶＨ１〜ＶＨ７の全てについてこれらのことを行い、目的のクローンが得られているかどうか確認した。これらの各グループ（ファミリー）のクローンをｉｎ ｖｉｖｏでの使用頻度に近い比率になるように混合してＶＨライブラリーとした。ＶＨライブラリーにおける各ファミリーの構成比率を以下に示す。
＊Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＡＤ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９４）１３，３２４５−６０．
＊＊実際にはＶＨ１とＶＨ５は同一のプライマーで増幅されるため、分離して集計できない。
＊＊＊ＶＨ４プライマーで作製したｃＤＮＡとＶＨ４−２プライマーで作製したｃＤＮＡを混合してこの割合とした。
３−２ 組み合わせ遺伝子ライブラリーの作製
ＶＨライブラリー２００μｇを下記条件でＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、重鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。
ＶＨライブラリー２００μｇ １００μＬ
１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造） ４０μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ２０５μＬ
ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造４０Ｕ／μＬ） ３０μＬ
ＸｈｏＩ（宝酒造５０Ｕ／μＬ） ２５μＬ
ｄｅｌｅｔｉｏｎが無いと確認された軽鎖遺伝子クローンＫＬ２００、およびＶＬライブラリーの挿入されたベクターｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄについても下記条件でＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、軽鎖遺伝子を含む断片を、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。
ＫＬ２００またはＶＬライブラリー
を挿入したｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ １００μｇ １００μＬ
１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造） ４０μＬ
滅菌済Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ２３０μＬ
ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造４０Ｕ／μＬ） １５μＬ
ＸｈｏＩ（宝酒造５０Ｕ／μＬ） １５μＬ
次に、ＶＨ遺伝子ライブラリー断片と軽鎖遺伝子の挿入されたｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄベクターを、次の条件下、１６℃で一晩反応させてライゲーションした。
制限酵素処理した
ＶＨライブラリー断片 １０μｇ ５０μＬ
制限酵素処理したＫＬ２００または
ＶＬライブラリーの断片
を含むｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ４０μｇ ５０μＬ
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ
（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅに添付） １００μＬ
１０ｍＭ ＡＴＰ １００μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ６７０μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造１０Ｕ／μＬ）３０μＬ
反応の終了したＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。具体的にはＤＮＡを一旦エタノール沈殿し、１／５ＴＥ（ＴＥを滅菌済ＭｉｌｌｉＱで５倍希釈したもの）３０μＬに溶解した。これをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）５００μＬに懸濁し、エレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーター
ＢＲＬ社Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｃａｔ．ｓｅｒｉｅｓ １６００）
設定条件；ｖｏｌｔａｇｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ４ｋΩ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ３３０μＦ
ＤＣ ｖｏｌｔｓ ＬｏｗΩ
ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｅ Ｆａｓｔ
形質転換用培地（ＳＯＢ）１２ｍＬに上記操作の終了した大腸菌を植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ａｍｐプレート）にまき、残りは、１％グルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有２×ＹＴ培地５００ｍＬで培養し、グリセリンストックした。寒天培地は３０℃でインキュベートし、生えてきたコロニーの数から得られたクローンの数を推定した。それぞれ４．５×１０１０クローンが得られた。
扁桃ｍＲＮＡよりｒａｎｄａｍ ｈｅｘａｍｅｒにて合成したｃＤＮＡをもとに得た各ＶＨ ｆａｍｉｌｙをｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄベクターにクローニングし、ＫＬ２００と組み合わせたライブラリーをＡＩＭＳ１とした。（１．２８×１０１０の独立したクローン）
サイ帯血、骨髄液、末梢血、扁桃ｍＲＮＡよりｈｕｍａｎ ｍ ｐｒｉｍｅｒにて合成したｃＤＮＡをもとに得た各ＶＨ ｆａｍｉｌｙをｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄベクターにクローニングし、ＫＬ２００と組み合わせた遺伝子ライブラリーをＡＩＭＳ２とした．（３．２０×１０１０の独立したクローン）
サイ帯血、骨髄液、末梢血、扁桃ｍＲＮＡよりｈｕｍａｎ μ ｐｒｉｍｅｒにて合成したｃＤＮＡをもとに得た各ＶＨ ｆａｍｉｌｙをＶＬ ｌｉｂｒａｒｙと組み合わせたライブラリーをＡＩＭＳ３とした。（４．５０×１０１０の独立したクローン）
更に（ＡＩＭＳ１＋ＡＩＭＳ２）：ＡＩＭＳ３＝１：１で混合し、１×１０１１の独立したクローンからなるライブラリーとした（ＡＩＭＳ４と呼ぶ）。
４．ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子ライブラリーの調製
４−１−１ ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄの作製
ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ３μｇ（３μＬ）（図１の４）を参照）をＢｓｔＰＩ（３Ｕ／μＬ）３μＬ、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ＤＷ３９μＬと混合し、３７℃で２時間、制限酵素処理を行った。処理後、エタノール沈殿して得られた沈殿を１０μＬのＴＥバッファーに溶解した。これに、ＳａｃＩ（１０Ｕ／μＬ）１μＬ、１０×Ｌ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ＤＷ３４μＬを混合して３７℃で２時間、制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動して、４．７ｋｂ断片を回収した。回収物をエタノール沈殿して１０μＬとした（ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ断片）。
一方、プライマーｌｉｎＦ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）５μＬとプライマーｌｉｎＲ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）５μＬを混合し、９４℃で５分加熱した後、８０℃５分、７０℃５分、室温放置３０分によりアニールさせた。このうち、２μＬと上記で得られたｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ断片１μＬ、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ、ＤＷ９．５μＬ、Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ １μＬを混合し、１６℃で１６時間反応させた。反応後、エタノール沈殿して３μＬに濃縮し、そのうち１．５μＬを用いて、大腸菌ＤＨ１２Ｓコンピテントセル２０μＬをエレクトロポレーションにより形質転換した。得られたクローンのプラスミドを抽出し、塩基配列を確認して、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄと名づけた。図９にｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄの構造を模式的に示した。また、図１０〜図１２にｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示した。
４−１−２ ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄへのＡＩＭＳ−４Ｌ鎖の組込み
ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄ２０μｇ（２０μＬ）を、１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ ３０μＬ、１０×ＢＳＡ ３０μＬ、ＮｃｏＩ（１０Ｕ／μＬ）１０μＬ、ＡｓｃＩ（１０Ｕ／μＬ）１０μＬ）と混合して３７℃で２時間、制限酵素処理を行った。アガロースゲル電気泳動により、４．５ｋｂ断片を回収し、エタノール沈殿して１０μＬとした（ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄ ＮｃｏＩ−ＡｓｃＩ断片、５μｇ得られた）。一方、ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミド（ＡＩＭＳ−４ライブラリーを構成するプラスミド）２０μｇ（２０μＬ）を、１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ ３０μｌ、１０×ＢＳＡ ３０μＬ、ＮｃｏＩ（１０Ｕ／μＬ）１０μＬ、ＡｓｃＩ（１０Ｕ／μＬ）１０μＬ）と混合して３７℃で２時間反応させた。アガロースゲル電気泳動して、６８０ｂｐ断片を回収し、エタノール沈殿して１０μＬとした（ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミドＮｃｏＩ−ＡｓｃＩ断片、１μｇ得られた）。
ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄ ＮｃｏＩ−ＡｓｃＩ断片２．５μｇ（５μＬ）、ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミドＮｃｏＩ−ＡｓｃＩ断片１μｇ（１０μＬ）、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、ＤＷ７２μＬ、Ｔ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ ３μＬを混合し、１６℃で１６時間反応させた。エタノール沈殿して３μＬに濃縮し、そのうち１．５μＬを用いて、大腸菌ＤＨ１２Ｓコンピテントセル０．２ｍＬをエレクトロポレーションにより形質転換した。エレクトロポレーション後のＤＨ１２ＳをＳＯＣ培地に植え、３７℃で１時間培養した後、ＴＹＧＡ培地２Ｌで３０℃一晩培養した。一部を寒天培地にまいてクローンの総数を見積もったところ、２．１×１０８であった。一晩培養した大腸菌からプラスミドを抽出したところ、２ｍｇ得られた。これをＡＩＭＳ−４ ＶＬライブラリープラスミドとした。
４−１−３ ＡＩＭＳ−４ ＶＬライブラリープラスミドへのＡＩＭＳ−４ Ｈ鎖の組込みと形質転換
４−１−２で得られたＡＩＭＳ−４ ＶＬライブラリープラスミド５００μｇ（２００μＬ）をＨｉｎｄＩＩＩ（５０Ｕ／μＬ）２０μＬ、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ ４０μＬ、ＤＷ ２４０μＬと混合し３７℃で２時間、制限酵素処理した後、ＢＡＰ Ｃ７５（０．４Ｕ／μＬ）を１０μＬ添加し、３７℃で２時間、５０℃で１５分反応させた。フェノール処理後、エタノール沈殿して、２０μＬ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解した。これに、ＸｈｏＩ（５０Ｕ／μＬ）２０μＬ、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ ４０μＬ、ＤＷ ３２０μＬを混合し、３７℃で２時間制限酵素処理した。これをアガロースゲル電気泳動して、４．５ｋｂ断片を回収し、エタノール沈殿して４０μＬとした（ＡＩＭＳ−４ ＶＬ ライブラリープラスミドＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＢＡＰ断片、２２０μｇ得られた）。
一方、ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミド６００μｇ（６００μＬ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ（５０Ｕ／μＬ）２０μＬ、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ ８０μＬ、ＤＷ １００μＬと混合し３７℃で２時間切断した。フェノール処理後、エタノール沈殿して、５０μＬ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解した。これに、ＸｈｏＩ（５０Ｕ／μＬ）２０μＬ、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ ４０μＬ、ＤＷ ２９０μＬを混合し、３７℃で２時間制限酵素処理した。その後、ＢＡＰ Ｃ７５（０．４Ｕ／μＬ）を１０μＬ添加し、３７℃で２時間、５０℃で１５分反応させた。アガロースゲル電気泳動して、０．５ｋｂ断片を回収し、エタノール沈殿して４０μＬとした（ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミドＸｈｏＩ ＢＡＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＢＡＰ断片、４１μｇ得られた）。
上記方法により調製したＡＩＭＳ−４ ＶＬライブラリープラスミドＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＢＡＰ断片５０μｇ（９．１μＬ）、ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミドＸｈｏＩ ＢＡＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＢＡＰ断片４１μｇ（４０μＬ）、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ３０μＬ、ＤＷ １９５．９μＬ、及びＴ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ ２５μＬを混合し、１６℃で１６時間反応させた。これをアガロースゲル電気泳動して、４．５ｋｂ断片を回収し、エタノール沈殿して１／１０ＴＥ ｂｕｆｆｅｒで３６μＬとした（３５μｇ得られた）。これに、１０×ｋｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、１０ｍＭ ＡＴＰ ５μＬ、Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（１０Ｕ／μＬ）４μＬを添加し、３７℃で１時間反応させた。さらに、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １０００μＬ、ＤＷ ８７５０μＬ、Ｔ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ ２００μＬを混合し、１６℃で１６時間反応させ、セルフライゲーションを行った。１−ブタノールで濃縮後、エタノール沈殿して１／１０ＴＥで２００μＬとし、これを用いて大腸菌ＤＨ１２Ｓコンピテントセル５ｍＬをエレクトロポレーションにより形質転換した。エレクトロポレーション後のＤＨ１２Ｓを５０ｍＬのＳＯＣ培地に植え、３７℃で３０分培養した後、ＴＹＧＡ培地２Ｌで３０℃一晩培養した。一部を寒天培地にまいてクローンの総数を見積もったところ、１．１×１０１１であった。このようにして得られたクローンの集合からなるライブラリーをＡＩＭＳ−５とした。図１３のａ）に、ＡＩＭＳ−５抗体遺伝子ライブラリーを構成するクローンの基本的な構造を示す。
４−２ ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子ライブラリー（ＡＩＭＳ−５）からｓｃＦｖ−ＣＬ抗体ファージライブラリーの作製
１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地３００ｍＬを入れた５リットルのフラスコ１６本にＡＩＭＳ−５懸濁液を２．５ｍＬを加え、３７℃で振とう培養し１時間おきに波長６００ｎｍにおける吸光度を測定しながら、吸光度が１．０になるまで増殖させた。培養液にヘルパーファージ液（Ｍ１３ＫＯ７）をフラスコ当たり１２ｍＬ加えてヘルパーファージを感染させ、３７℃で２時間培養し、ヘルパーファージ感染済みＤＨ１２Ｓとした。
５リットルのフラスコ２４本に２×ＹＴ培地６００ｍＬと１００μｇ／ｍＬのアンピシリン０．６ｍＬ、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン０．８ｍＬ、ヘルパーファージ感染済みＤＨ１２Ｓ２００ｍＬを加えて３７℃で２０時間振とう培養した。
菌体は４℃で８０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を集めた。上清に２０％のポリエチレングリコール／２．５Ｍ ＮａＣｌ ４Ｌを加えて約２０分間静かに攪拌した後、４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心、沈殿を１ＬのＰＢＳで溶かし、２０％のポリエチレングリコール／２．５Ｍ ＮａＣｌ ２００ｍＬを加えて約２０分間静かに攪拌した後、４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心した。上清を捨ててさらに４℃で８０００ｒｐｍ、３分間遠心して沈殿を回収した。沈殿は０．０５％ ＮａＮ３を加えたＰＢＳで溶解し、４℃で１０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を回収した後、４℃で８０００ｒｐｍ、３分間さらに遠心して上清を回収した。
回収したファージ溶液の力価は以下のようにチェックした。すなわち、ファージ溶液をＰＢＳで１０６、１０７、１０８希釈し、その１０μＬをＤＨ１２Ｓ ９９０μＬに感染させ、３７℃で１時間培養した。これをＬＢＧＡプレートに１００μＬ播いて３０℃で１８時間培養した。コロニーの数をカウントすることにより希釈前の原液の力価を算出した。ファージ溶液原液を２％スキムミルク及び０．０５％ ＮａＮ３を含むＰＢＳに２×１０１４／ｍＬになるよう懸濁した。５．ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体ライブラリーから特定の抗原に特異的に結合するファージの選択
本実施例では、モデル抗原としてＣ．ｅｌｅｇａｎｓの細胞内で発現していると考えられるｃＤＮＡである「ＣＣ０４６」の大腸菌での発現産物を用いた。具体的には、ＣＣ０４６のＮ末端の９６アミノ酸に相当する部分（ＣＣ０４６抗原）を用いた。ＣＣ０４６抗原に特異的に結合するファージの選択（スクリーニング）は、以下に示すパニング法によって行った。
５−１ スクリーニング用試験管の作製
ＣＣ０４６抗原をＰＢＳで２０μｇ／ｍＬに調製し、試験管３本（Ｎｕｎｃ社製Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に３ｍＬずつ添加して４℃で１８時間インキュベートして、試験管内表面へ抗原を吸着させた。吸着後、抗原溶液を捨て、２％スキムミルク含有ＰＢＳ溶液３ｍＬずつを加えて２５℃で１時間反応させ、ファージ抗体が非特異的に試験管に結合することを防ぐためにブロッキングを行った。
５−２ スクリーニング操作
作製した抗原吸着済試験管に４で得たＡＩＭＳ−５ライブラリーを２％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳになるよう溶解して１×１０１４ＣＦＵ／９ｍＬに調製し、この液を試験管３本に３ｍＬずつ添加して２５℃で２時間反応させた後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳで４回、ＰＢＳで４回、および滅菌した超純水（ＭｉｌｌｉＱにて作製）で１回洗浄した。
続いて抗原結合試験管に結合したファージを以下のように回収した。すなわち、０．１Ｍトリエチルアミン（ｐＨ１２．３）を試験管１本当たり３ｍＬ添加し、ローテーターを用いて室温で２０分間反応させ乖離させた後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）１．１ｍＬを加えて中和し、この液を回収した。
５−３ 回収したファージの増幅
回収した液は（ファージの大腸菌への感染）（ヘルパーファージの感染）（ファージの回収）の処理を行い、含まれているファージを精製・増幅した。
１）ファージの大腸菌への感染
大腸菌（ＤＨ１２Ｓ）を２×ＹＴ培地５０ｍＬで培養し、波長６００ｎｍの吸光度が０．５になるよう増殖させ、上記で乖離させたファージ液を加えて３７℃で１時間振とう培養した。
２）ヘルパーファージの感染
１）の培養液６２．３ｍＬをとり、２×ＹＴ培地４２５ｍＬ、４０％ グルコース１２．５ｍＬ、および１００μｇ／ｍＬアンピシリン０．５ｍＬを加えて３７℃で波長６００ｎｍにおける吸光度が０．５になるまで培養した後、４℃、５０００ｒｐｍで１０分間遠心して菌体を沈殿させ、回収して１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン０．３ｍＬを加えた２×ＹＴ培地３００ｍＬに懸濁した。これに３×１０１０ｃｆｕ／ｍＬのヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を１／１００量加え、３７℃で１時間振とう培養した。
培養液を予め３７℃に暖めた培地（２×ＹＴ培地に１００μｇ／ｍＬアンピシリンと７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた液）９００ｍＬに加えて３７℃で一晩培養した。
３）ファージの回収
２）の培養液を４℃で７０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、その上清に２．５Ｍの塩化ナトリウムを加えた２０％のポリエチレングリコールを１／５量加えて室温で２０分間静置した後、４℃で８０００ｒｐｍ、１５分間遠心して沈殿を回収し、培養液の１／１０量の滅菌ＰＢＳを加えて溶解し、再度２．５Ｍの塩化ナトリウムを加えた２０％のポリエチレングリコールを１／５量加えて４℃で１００００ｒｐｍ、２０分間遠心して上清を捨て、さらにスピンダウンして４℃で１００００ｒｐｍ、２分間遠心した。これに０．０５％のＮａＮ３を加えたＰＢＳを培養液の１／１００量加えて沈殿を溶解し、ファージを回収した。
５−４ 増幅したファージによる再スクリーニング
増幅したファージを用いて５−２と同様に抗原結合試験管を用いてスクリーニングを繰り返した。スクリーニングでの洗浄は、非特異に吸着したファージを乖離し、結合力の高いファージを選択する上で重要なステップであることから、２回目以降のスクリーニングにおける洗浄条件は以下のようにした。
２回目；ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で６回、ＰＢＳで６回、滅菌した超純水で１回
３回目；ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で１３回、ＰＢＳで１３回、滅菌した超純水で１回
５−５ スクリーニングによって得られた抗体の抗原結合活性（アフィニティー）の測定
本発明者らは、以上のスクリーニングにより得られたファージを大腸菌に感染させ、その後ヘルパーファージを重感染させることなく長時間培養することにより、大腸菌外にｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体が分泌されてくることを発見した。
そこで、ファージによってコードされるｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の抗原結合活性を、ファージ表面に発現されている抗体ではなく、ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を用いて行った。具体的な方法は以下のとおりである。
５−５−１ ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の発現誘導
まず、以上のスクリーニングにより得られたファージを大腸菌ＤＨ１２Ｓに感染させた。次に、ファージの感染した大腸菌を、ＹＴＧＡ培地（１％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有２×ＹＴ培地）を含む寒天培地にまき、生えてきたコロニーの中から数十個を選択し、１％グルコースと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地３ｍＬにそれぞれのクローンを植え終夜培養した。０．１％グルコースと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地１０ｍＬに終夜培養した培養液を１００μＬを入れ、対数増殖期に達したら、１ＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を１０μＬ加えてさらに３０℃で２１時間培養した後、培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブにとり、４℃で１００００ｒ．ｐ．ｍ．５分間遠心してその培養上清をとり、０．１％となるようアジ化ナトリウムを添加して検体とした。
５−５−２ ＥＬＩＳＡ法による抗原結合活性（アフィニティー）の測定
まず、ＥＬＩＳＡ用のプレートを以下のように調製した。ＣＣ０４６抗原１０μｇ／ｍＬを９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに１００μＬ添加して４℃で１８時間結合させたのち、５％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（ブロッキング液）を各ウェルに２００μＬ添加して３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、ＰＢＳで１回洗浄してアフィニティーの測定に用いた。
このようにして得られたプレートの各ウェルに、５−５−１で得られた検体を１００μＬずつ加え、２５℃１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで４回洗浄し、５００倍希釈のウサギ抗ｃｐ３抗体（ＭＢＬ製）を１００μＬ加えて２５℃で１時間反応させた。各ウェルをＰＢＳで４回洗浄した後、１０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭＢＬ製）を１００μＬ加えて、２５℃で１時間反応させた。再度ＰＢＳで４回洗浄し、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液１００μＬを加えて暫時反応させた後、１．５Ｎ リン酸１００μＬを加えて反応を停止し、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果２５クローン中２１クローンに活性が確認された。
これら２１クローンについてＤＮＡ塩基配列を決定したところ、７種類のクローンであることがわかった。ＤＮＡ塩基配列の解析は、ＤＮＡシークエンサー（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用いた公知の方法（ジデオキシ法）により行った。
５−５−３ 免疫蛍光染色法による各クローンの抗原結合活性の比較
５−５−２で得られた７種類のクローンについて抗原結合活性を免疫蛍光染色法により比較した。免疫染色の材料にはＣ．ｅｌｅｇａｎｓの初期胚を用いた。
まず、周知の方法を用いてＣ．ｅｌｅｇａｎｓを飼育し、受精卵を得た。受精卵が初期胚にまで成長した後に、スライドグラス上にとり、−２０℃に冷却したエタノール中にスライドグラスごと１０分間浸した。次に、−２０℃に冷却したアセトンに１０分間浸した。室温に放置し、アセトンが揮発したらＰＢＳに５分間浸した。次いで、５％スキムミルク含有ＰＢＳに１時間浸してブロッキングした。
次に、５−５−２で陽性（活性が認められた）であったサンプル（ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体溶液）の培養上清を５％ スキムミルク含有ＰＢＳで２倍に希釈し、２５μＬを上記で準備したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの結合したスライドグラス上の初期胚に添加し、室温で２時間反応させた。
反応後、抗体液をスライドグラスから除き、洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ）中に室温で１０分間浸して洗浄を行った。洗浄液を取り替えてもう２度同じ操作を繰り返した。
次にウサギ抗ｃｐ３抗体（ｃｐ３タンパク質をウサギに免疫することによって作製）を５％スキムミルク含有ＰＢＳで２００倍希釈したもの２５μＬをスライドグラス上の初期胚に添加し、室温で２時間反応させた。反応が終了したら抗体液をスライドグラスから除き、洗浄液中に室温で１０分間浸して洗浄を行った。洗浄液を取り替えてもう２度同じ操作を繰り返した。
続いて、Ｃｙ３標識抗ウサギＩｇＧ抗体を５％スキムミルク含有ＰＢＳで８００倍希釈したもの２５μＬをスライドグラス上に滴下し、４℃で１晩反応させた。
反応が終了したら、抗体液をスライドグラスから除き、洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ）中に室温で１０分間浸して洗浄を行った。洗浄液を取り替えてもう１度同じ操作を繰り返した。
続いて、５０ｍＬの洗浄液に１ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰＩを１μＬ添加し、この中にスライドグラスを室温で１０分間浸した。
液を吸い取った後、封入剤をのせ、カバーグラスをかけて顕微鏡観察した。
５−５−４ ウエスタンブロットによる各クローンの抗原結合活性の比較
以下に示す周知の方法により５−５−２で得られた各クローンの抗原結合活性を比較した。
ＣＣ０４６精製抗原を１レーンあたり１００ｎｇまたは１０ｎｇ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをメンブレンに転写した。
メンブレンをブロッキングした後、５−５−２で得られた各クローンの培養上清を４倍希釈（５％スキムミルク共存下）にしてメンブレンにのせ、反応させた。
室温で１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗った。洗浄済みのメンブレンに抗ｃｐ３抗体（５００倍希釈、５％スキムミルク共存下）を添加し、室温で１時間反応させた。反応後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗った。
洗浄済みメンブレンにＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（×１０００、ＭＢＬ ｃｏｄｅ Ｎｏ．４５８）を添加し、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗った。
化学発光試薬（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ；Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ，ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）にメンブレンを浸し、ラップに包んで、フィルムに露光した。フィルムを現像して結果を評価した。
以上の結果及び５−５−３の結果より、最も抗原結合活性の高いクローンを選択し（クローンＣＣ０４６Ｎ２と呼ぶ）、以降の実験に用いた。
６．ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体からＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体への変換
６−１ ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体発現用ベクターの作製
図１３のｂ）下段に示されるように、ｐ６×Ｈｉｓ−ＧＦＰベクター（クロンテック製）の開始コドンとＨｉｓ−ｔａｇ配列の間に、ＡｓｃＩサイトを付加して発現用ベクターｐＡｓｃＨＧＦＰを作製した。
このベクターのＡｓｃＩサイトにｓｃＦｖ−ＣＬ遺伝子を挿入することにより、実際の抗体タンパク質発現用のベクターが完成する（図１３のｃ））。このベクターより発現される抗体はｓｃＦｖ−ＣＬ型であり、ＧＦＰはＨｉｓ−ｔａｇを介してＣＬ領域に連結することとなる。
ＡｓｃＩサイトを付加する具体的な操作は以下のように行った。ｐ６×Ｈｉｓ−ＧＦＰ ベクター（０．１ｍｇ／ｍＬ）０．５μＬ，１０×ＬＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒＩＩ １０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ １６μＬ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０μＬ，プライマーＧＦＰＡｓｃＦ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ，プライマーＧＦＰＡｓｃＲ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ，ＬＡ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）１μＬ，滅菌水６０．５μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で５分保温した。９４℃ １分，５５℃ １分，７２℃ ４分を３０サイクル繰り返し、さらに７２℃，７分インキュベートした。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、フェノール処理、エタノール沈殿して１０μＬに濃縮した。これに、１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，滅菌水７５μＬ，ＡｓｃＩ（１０Ｕ／Ｌ）５μＬを加え、３７℃で３時間保温した。１／５量をアガロースゲル電気泳動して目的の断片を回収し、エタノール沈殿して濃縮し、３０μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解した。これをライゲーション反応に供さず、周知の方法によりセルフライゲーションを起こさせ、環状のプラスミドベクターとすることもできる。
上記と同様の方法により、ＲＦＰ（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を発現させるベクターｐＡｓｃＨＲＦＰを作製することができる。また、これを用いて以下の操作を行えば、ＲＦＰ融合型のｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を発現させることができる。
６−２ クローンＣＣ０４６Ｎ２よりｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子の増幅
クローンＣＣ０４６Ｎ２を用いてＰＣＲ法を行い、ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子を増幅した。この際、ＡｓｃＩサイトを含む２つのプライマーを合成し、これらを用いることにより、ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子部分にコードされるアミノ酸配列を変化させない条件においてＶＨ遺伝子のＮ末端のＳｆｉＩサイトをＡｓｃＩサイトに変換した。図１３のｂ）上段に増幅されたｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子を模式的に示した。
ＰＣＲ法に用いたプライマーを以下に示す。なお、小文字部分がＡｓｃＩ部位である。
ＰＣＲ法の具体的な方法を以下に示す。
クローンＣＣ０４６Ｎ２ ０．５μＬ，１０×ｂｕｆｆｅｒ＃１ １０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ １０μＬ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４μＬ，プライマーＡｓｃ３Ｆ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ，プライマーＡｓｃＲ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ，ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）１μＬ，滅菌水７２．５μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で１分保温した。９４℃ １分，５５℃ １分，７２℃ １分を２５サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、フェノール処理、エタノール沈殿して１０μＬに濃縮した。
得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動で確認後フェノール処理後、エタノール沈殿して１０μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。
６−３ 発現ベクターへのｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子の導入
６−２で得られたＰＣＲ産物を以下の条件で制限酵素処理した。
ＰＣＲ産物１０μＬ
３７℃で３時間反応後、１／２量をアガロースゲル電気泳動して目的の断片を回収し、エタノール沈殿して濃縮し、３０μＬのＴＥに溶解した。
他方、同様に発現用ベクターｐＡｓｃＨＧＦＰ（図１３のｂ）下段）を制限酵素処理し、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。
次に上記処理をしたＰＣＲ産物と発現用ベクターを、１６℃、４時間〜一晩、以下の条件下で反応させることによりライゲーションした。
制限酵素処理したｐＡｓｃＨＧＦＰ ２μＬ
制限酵素処理したＰＣＲ産物 １μＬ
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ
（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅに添付）
１０ｍＭ ＡＴＰ １．５μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ８μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造１０Ｕ／μＬ）１μＬ
以上の操作の結果得られたベクター（ｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミド）をＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体作製に用いた。ｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミドのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図１４に示した。
７．大腸菌内でのＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の産生
７−１ ｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミドの大腸菌への導入
ｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミドを用いて、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。具体的にはｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミドを１／１０量をＴＥ３μＬに溶解し、これをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ製）２０μＬに懸濁し、エレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーター
ＢＲＬ社Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｃａｔ．ｓｅｒｉｅｓ １６００）
設定条件；ｖｏｌｔａｇｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ４ｋΩ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ３３０μＦ
ＤＣ ｖｏｌｔｓ ＬｏｗΩ
ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｅ Ｆａｓｔ
形質転換用培地（ＳＯＢ）２ｍＬに上記操作の終了した大腸菌を植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、ＴＹＧＡ寒天培地上で培養した。形賀転換体２４クローンについて大腸菌からプラスミドＤＮＡを周知の方法を用いて調製し、制限酵素ＰｖｕＩＩによって切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。その結果（正しい向きの場合は０．３，１．７，４．３ｋｂの長さの断片が得られる）により、挿入されたｓｃＦｖ−ＣＬ遺伝子の向きが正しいクローンを選択した。
８．ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の精製及び解析
８−１ ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の発現誘導及び精製
まず、７−１によって得られたｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミドをもつ大腸菌を１リットルの１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有２×ＹＴ培地に懸濁し、３０℃で培養した。大腸菌の濃度を波長６００ｎｍの吸光度により測定し、ｌｏｇ ｐｈａｓｅになったところで、１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、３０℃でさらに２１時間培養した。次に、培養液を遠心分離して菌体を回収し、菌体に３０ｍＬの５０ｍＭ Ｎａ−リン酸緩衝液／３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８を加え、超音波処理により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、その上清３０ｍＬを平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（ゲル容量２．８ｍＬ）にアプライした。５０ｍＭ リン酸ナトリウム／３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８、２５０ｍＬでカラムを洗浄した後、１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１２０，１５０，２００，２５０ｍＭ イミダゾール１ｍＬで溶出した。各溶出フラクションに波長３６６ｎｍの光を照射し、蛍光を発するフラクション（３０−９０ｍＭ）を選択した。選択したフラクションのタンパク濃度を測定した結果、約２００μｇのタンパク質が得られていた。この精製タンパク質溶液を用いて以下の解析を行った。
８−２ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製タンパク質の解析
８−１で得られた精製タンパク質溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。なお、比較例として、精製前の菌体破砕液（粗抽出液）を用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１５に示した。図１５において、レーン２が精製タンパク質溶液を流したレーンである。また、レーンＭ及びレーン１には、分子量マーカー及び比較例である精製前の菌体破砕液を泳動した。
図１５に示されるように、粗抽出物では夾雑しているタンパク質のため判別できないが、精製タンパク質溶液では濃縮され、予測される位置（矢印で示される位置）にバンドが明らかに検出できた。
８−３ 精製タンパク質のＥＬＩＳＡ法による抗原結合活性（アフィニティー）の測定
８−１で得られた精製タンパク質（ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体）の抗原（ＣＣ０４６）に対する結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。具体的な方法及び条件を以下に示す。
まず、ＥＬＩＳＡ用のプレートを以下のように調製した。抗原２０μｇ／ｍＬを９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに１００μＬ添加して４℃で１８時間結合させたのち、５％ＢＳＡ（ブロッキング液）を各ウェルに２００μＬ添加して３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、ＰＢＳで１回洗浄してアフィニティーの測定に用いた。
このようにして得られたプレートの各ウェルに、８−１で得られた精製タンパク質溶液を倍数希釈したものを１００μＬずつ加え、３７℃１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで４回洗浄し、５０００倍希釈のウサギ抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ社製）１００μＬ加えて３７℃で１時間反応させた。各ウェルをＰＢＳで４回洗浄した後、１００００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭＢＬ製）を１００μＬ加えて、３７℃で１時間反応させた。各ウェルをＰＢＳで４回洗浄した後、発色基質溶液（ＯＰＤ）を１００μＬ加え、前に述べたようにプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、５−５−３におけるｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体と同等の抗原活性が認められた。
８−４ 精製タンパク質溶液を用いた免疫蛍光染色
次に、８−１で得た精製タンパク質溶液に、抗原ＣＣ０４６に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体分子が存在することを証明するために、様々なステージにおけるＣ．ｅｌｅｇａｎｓの胚細胞について免疫蛍光染色を行った。
まず、８−１で得た精製タンパク質溶液（ｓｃＦｖ−ＣＬ−ＧＦＰ）を５％ スキムミルク含有ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、２５μＬを前に述べた要領で準備したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの結合したスライドグラス上に添加し、４℃で１晩反応させた。
次に抗体液をスライドグラスから除き、洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ）中に室温で１０分間浸し、洗浄液を取り替えてもう１度同じ操作を繰り返した。
５０ｍＬの洗浄液に１ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰＩを１μＬ添加し、この中にスライドグラスを室温で１０分間浸した。
液を吸い取ったのち、封入剤をのせ、カバーグラスをかけて顕微鏡観察した。
このようにして調製したサンプルの染色像の観察には、フィルターセットＮｏ．１０（励起フィルターＢＰ４５０−４９０、ダイクロイックミラーＦＴ５１０、バリアフィルターＢＰ５１５−５６５）（Ｚｅｉｓｓ社製）を用いた。尚、ＤＡＰＩによるＤＮＡ染色を同時に行った。
初期胚を観察した結果を図１６のａに示す。矢印Ａ示した部分（中心体部分）にＧＦＰによる蛍光が観察される。即ち、はっきりと抗原ＣＣ０４６を認識する分子の存在が確認される。よって、精製タンパク質溶液中に、ＣＣ０４６を特異的に認識し、かつ蛍光を発するＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の存在が確認された。また、ＣＣ０４６は中心体に局在することがわかる。尚、矢印ｄで示した部分にはＤＡＰＩによる蛍光が観察される。
また、図１６のｂは、５−５で得られたクローンより取得したｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を用いて同様の免疫蛍光染色を行った結果である。この場合には２次抗体として上述のようにウサギ抗ｃｐ３抗体を、３次抗体としてＣｙａｎｉｎ３標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。矢印Ｂで示した部分に蛍光が観察される。尚、矢印Ｄで示した部分にはＤＡＰＩによる蛍光が観察される。
図１６のａとの比較より、ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体よりもＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を用いた方が感度及び解像度の点から優れていることがわかった。尚、ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を用いた場合の染色像の観測には、フィルターセットＮｏ．１５（励起フィルターＢＰ４５６／１２、ダイクロイックミラーＦＴ５８０、バリアフィルターＬＰ５９０）（Ｚｅｉｓｓ社製）を用いた。また、ＧＦＰ融合型の場合と同様にＤＡＰＩによるＤＮＡ染色を同時に行った。
本実施例の方法では、５．の「ＳｃＦｖ−ＣＬ抗体ライブラリーから特定の抗原に特異的に結合するファージの選択」を約２週間で行うことができた。また、６．の「ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体からＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体への変換」から７．の「大腸菌内でのＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の産生」までを約１週間で行うことができた。したがって、最終形態のＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を単離するのに１ヶ月を要しないこととなる。このように、本発明の方法によれば極めて短期間で蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ型の抗体を取得することが可能である。なお、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ型の抗体作製に要する期間は、実験環境によってさらに短縮することができるものである。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想定できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
産業上の利用の可能性
本発明により、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ型の抗体の新規な作製方法が提供される。本発明の作製方法によれば、極めて短期間で所望の抗体を得ることができる。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーとして、生体内の多様性を包含するのに十分なクローン数を有するものを用いることにより、多種多様な抗体を認識可能な抗体が得られる。
また、本発明で得られる蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ型抗体は、特定波長の光の照射によりそれ自体で蛍光を発するため、検出に２次抗体、３次抗体等を必要としない。したがって、本発明で得られる抗体を免疫学的測定方法に利用した場合には、操作工程の簡略化、及び測定時間の短縮化が図れる。また、一般的な酵素免疫測定法では検出（測定）に特別の試薬（基質）を必要とするが、本発明で得られる抗体では特定波長の光の照射のみで検出が可能となるため、生細胞内ないし生体内において直接検出することができる。
また、異なる抗原に対して、異なる蛍光タンパク質を融合した抗体を作製し、これらを同時に用いて免疫染色することにより、同時に多色染色することが可能である。
さらに、イントラボディー技術と組み合わせることにより、生細胞内ないし生体内において特定の機能に関与する抗原分子をリアルタイムに測定することが可能となる。
以上のように、本発明により得られる蛍光タンパクと融合したｓｃＦｖ型抗体は、免疫染色の分野において用途の広い検出試薬に利用できるといえる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の実施例において、可変領域ライブラリーの作製に用いた各種のベクターの構造を模式的に示す図である。
１）ｐＡＡＬＦａｂ：Ｄ１．３ｍｕｔａｔｉｏｎ用ベクター。
２）ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ：Ｅ８発現用ベクター。ｐＡＡＬＦａｂをもとに、制限酵素サイトを改変した。新たにＰｓｔＩ、ＸｂａＩ、およびＫｐｎＩサイトを付加し、ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩサイトの位置を変更した。
３）ｐＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ：重鎖可変領域遺伝子クローニング用ベクター。ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔをもとに、制限酵素サイトを改変した。ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ間を欠落させ、新たにＫｐｎＩ、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩおよびＳｐｅＩサイトを付加した。重鎖可変領域遺伝子をＳｆｉＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニング可能。
４）ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ：重鎖可変領域遺伝子クローニング用ベクター。ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ、およびｐＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄをもとにＤＮＡ配列を改変した。マウスγＣＨ１をヒトγＣＨ１で置きかえた。新たに、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩ、およびＡｓｃＩサイトを付加した。軽鎖可変領域をＳｆｉＩ−ＡｓｃＩサイトにクローニング可能。
図２は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの塩基配列を示す図である。
図３は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（１）。
図４は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（２）。
図５は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（３）。
図６は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの塩基配列を示す図である。
図７は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（１）。
図８は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（２）。
図９は、ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子ライブラリーの調製に用いたベクターｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄの構造を模式的に示した図。
図１０は、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す図（１）。
図１１は、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す図（２）。
図１２は、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す図（３）。
図１３は、本発明の実施例における操作手順を示した図。ａ）に示すのは、ＡＩＭＳ−５ライブラリーを構成するクローンにおけるｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の遺伝子の模式図。ｂ）に示すのは、ＰＣＲによってｓｃＦｖ−ＣＬ抗体のコードされた領域のＤＮＡを増幅し、ＰＣＲ産物をｐＡｓｃＨＧＦＰベクターに組み込むことを表す模式図。ｂ）の上段にＰＣＲ産物（増幅されたｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子）、同下段にｐＡｓｃＨＧＦＰベクターが表される。ｃ）に示すのは、ｂ）の操作により得られる、ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体発現用ベクターである。
図１４は、ｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列。メチオニンを含む３アミノ酸のあとに、ＶＨドメイン−リンカー−Ｖλドメイン−Ｃλドメイン−Ｈｉｓ−ｔａｇ−ＧＦＰという順に並んでいる構造となっている。Ｖドメインの番号およびＣＤＲの位置については、Ｋａｂａｔの決め方に従った。Ｖλドメインの１０番目のアミノ酸は欠失している。
図１５は、大腸菌で発現させたＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した結果（ゲル）を示す図である。レーンＭは分子量マーカーを、レーン１は粗抽出液を、レーン２は精製タンパク質をそれぞれ流した結果である。染色は、クーマシーブリリアントブルーで行った。矢印は、ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の位置を示す。
図１６は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの初期胚を、ＣＣ０４６に特異的な２種類の形態のｓｃＦｖ−ＣＬ抗体で染色した図。ａ）はＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ−ＧＦＰで直接染色した図（矢印Ａで示した部分にＧＦＰの蛍光が観察される。また、矢印ｄで示した部分にはＤＡＰＩによる蛍光が観察される）。ｂ）は、ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を反応させた後、２次抗体（ウサギ抗ｃｐ３抗体）と３次抗体（Ｃｙａｎｉｎ３標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体）を反応させて検出した図（矢印Ｂで示した部分にＣｙａｎｉｎ３の蛍光が観察される。また、矢印Ｄで示した部分にはＤＡＰＩによる蛍光が観察される。）。
本発明は、蛍光を発することができる抗体の作製方法に関する。詳しくは、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体の作製方法に関する。
背景技術
抗体のライブラリーの作製方法としてファージディスプレイ法が利用されている。ファージディスプレイ法は、Ｓｍｉｔｈにより１９８５年（Ｓｍｉｔｈ ＧＰ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５ ２２８：４０７５ １３１５−７）に考案されたもので、Ｍ１３ファージのような一本鎖環状ＤＮＡを持つ線状のバクテリオファージが用いられる。ファージ粒子はＤＮＡの周囲を取り囲んでファージ粒子の大部分を構成するｃｐ８というタンパク質と、ファージが大腸菌に感染する時に機能する５個のｃｐ３と呼ばれるタンパク質などからなっている。このｃｐ３もしくはｃｐ８と融合した形でポリペプチドをコードするように遺伝子を構築し、ファージ粒子表面にそのタンパクを発現させるシステムがファージディスプレイシステムである。他の物質との結合活性を持つタンパク質を表面に保持したファージ粒子は、そのリガンドとの結合活性を利用して濃縮することができる。こうして目的とする結合活性を有するファージ粒子を濃縮する方法は、パニング法と呼ばれている。濃縮されたファージ粒子には、必要な結合活性を持つタンパク質をコードするＤＮＡがパッケージングされている。このように繊維状ファージの利用によって、結合活性に基づくスクリーニングと、ＤＮＡのクローニングとをきわめて効率的に行うことができるシステムが実現した（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ，Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ＤＪ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９０ ３４８：６３０ １５５２−４．）。
ファージディスプレイ系が抗体に応用され、ＶＨドメインのみ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ型抗体がｃｐ３又はｃｐ８と融合された形で発現された。抗原と結合するファージ抗体は同時に抗体をコードする遺伝子を含む。即ち、ファージディスプレイシステムでは、特定の抗原に結合可能な抗体分子と、その抗体分子をコードする遺伝子も同時に得られる点に大きな利点がある。しかし、ファージディスプレイ系を用いて作製された初期の抗体ライブラリーから単離された抗体は、抗原結合力の低いものが多かった。結合力を高める試みの一つとして、人為的に遺伝子に変異を与える方法が提案された。Ｗｉｎｔｅｒらは１９９４年、単離した全てのＶＨ、ＶＬ遺伝子と、ＪＨ、ＪＬ遺伝子の間にランダムな配列を挿入する半人工的配列を持つ抗体ライブラリーを作製することにより、親和性に優れた抗体の取得を可能とする抗体ライブラリーを得た（Ｎｉｓｓｉｍ Ａ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３ ６９２−８，１９９４）。Ｄｅ Ｋｒｕｉｆらも１９９５年基本的に同じ原理に基づいて抗体ライブラリーを作製している（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ Ｊ，Ｂｏｅｌ Ｅ，Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ Ｔ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：１ ９７−１０５，１９９５）。Ｖａｕｇｈａｎらは、１９９６年ライブラリーの大きさを拡大することで充分な大きさの抗体レパートリーを確保しようとしている（Ｖａｕｇｈａｎ ＴＪ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３ ３０９−１４，１９９６）。また、本発明者らは、生体内における抗体産生過程をできるだけ再現することにより、より多様なレパートリーを有し、かつ機能的なコンフォーメーションを保持した抗体分子を高い割合で含む抗体ライブラリーの提供方法を提案した（特願平１２−０５０５４３）。
上記のように、ファージディスプレイシステムによれば、抗体分子だけでなく、その抗体分子をコードする遺伝子も同時に得られる。この遺伝子の両端はユニークな制限酵素部位に設計できるため、ファージＤＮＡを単離し、制限酵素処理を行い、続いて、適当な発現ベクターに組み込むといった簡単な操作により、当該遺伝子の発現形態をファージディスプレイ型から別の形態へと変換することができる（Ｉｔｏ，Ｗ．，ａｎｄ Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｙ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０６６８−２０６７５，１９９３）。
一方、蛍光を発することができるタンパク質ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られ、ＧＦＰによる様々なタンパク質の標識化が試みられている。ＧＦＰは、特定波長の光の照射により蛍光を発することができるタンパク質分子であり、ＧＦＰにより標識化されたタンパク質分子の検出には特別の試薬等を必要としない。したがって、迅速かつ容易に検出ができることはもちろんのこと、生細胞内等においても直接検出することができるといった利点があり、今後の応用が期待されている。なお、ＧＦＰと同様に蛍光を発するタンパク質として、ＲＦＰ（ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＣＦＰ（ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）や、これらの変異体が開発されている（Ｃｒａｍｅｒｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３１５−３１９，１９９６；Ｙａｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：８２１２−８２１６，１９９８；Ｌｙｂａｒｇｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，３１：１４７−１５２，１９９８）。
抗体分子についてもＧＦＰ等による標識化が検討されているが、以下の課題が存在することが指摘されている。
抗体分子の中のＳ−Ｓ結合には、ドメイン内の分子内Ｓ−Ｓ結合と、Ｈ鎖とＬ鎖の間、あるいはＨ鎖とＨ鎖の間の分子間Ｓ−Ｓ結合の２種類が存在する。バクテリアの細胞質内で発現させた抗体は、抗体の産生に組替え遺伝子技術を応用した当初は、抗原結合活性をあまり示さなかった。というのは、細胞質内の条件では、ポリペプチドの正しいｆｏｌｄｉｎｇが起きないうえ、Ｓ−Ｓ結合が正しく形成されないからである（Ｂｏｓｓ ＭＡ，Ｋｅｎｔｅｎ ＪＨ，Ｗｏｏｄ ＣＲ，Ｅｍｔａｇｅ ＪＳ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３７９１−８０６，１９８４．）。これに対して、翻訳されたポリペプチドが膜を通過しペリプラズムへ分泌されるように、ｐｅｌＢ配列やｏｍｐＡ配列をポリペプチドのＮ末端側に導入するという試みが行われたが、Ｆａｂフラグメント，ｓｃＦｖフラグメントのいずれも抗原との結合が正しく行われるものは得られなかった（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４１，１９８８；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｐ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｒ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３，１９８８）。ＧＦＰと融合することによって蛍光を発する抗体を創り出すには、抗体が抗原結合活性を得るために必要な条件とＧＦＰが蛍光を発するために必要な条件という相反する両方の条件を満たさなければならない。ＧＦＰは、バクテリア内で翻訳された直後の状態では蛍光を発することができない。別の因子は必要としないが、分子内で多段階の化学反応が起きることにより発光中心が形成されることで蛍光を発することができる状態となる（Ｒｅｉｄ，Ｂ．，ａｎｄ Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：６７８６−６７９１，１９９７）。
一方、最近になって、イントラボディー技術の発展により、抗原結合能を有するｓｃＦｖ抗体を動物細胞の細胞質内でうまく発現させることができるようになってきた。
発明の開示
このような状況において、本発明者らは、ｓｃＦｖ抗体に注目し、ｓｃＦｖ抗体を蛍光タンパク質分子により標識化することを試みた。その結果、ファージディスプレイシステムを組み合わせて用いた系により、蛍光タンパク質により標識化されたｓｃＦｖ抗体を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。本発明の構成は以下の通りである。
〔１〕以下の工程を含む、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体の作製方法。
１）ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製する工程、
２）前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを抗原でスクリーニングすることにより、該抗原に結合可能なｓｃＦｖ抗体を発現しているファージクローンを選択する工程、
３）工程２）で選択したファージクローンより、ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子を取得する工程、
４）工程３）で取得した遺伝子を組込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能な発現ベクターに、該遺伝子を組込む工程、及び
５）工程４）で得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、前記融合タンパク質を発現させる工程。
〔２〕 前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、重鎖可変領域と機能的なコンフォーメーションを再構成するように選択された軽鎖可変領域を少なくとも一部分含んで成る、ことを特徴とする〔１〕に記載のｓｃＦｖ抗体の作製方法。
〔３〕 前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを構成する各ファージクローン表面のｓｃＦｖ抗体は、ＶＨ領域、ＶＬ領域、リンカー及びＣＬ領域を有する、ことを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載のｓｃＦｖ抗体の作製方法。
〔４〕 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ，及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載のｓｃＦｖ抗体の作製方法。
〔５〕 〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載の方法により作製される、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体。
〔６〕 ＶＨ領域、ＶＬ領域、及びリンカーにより構成されるＦｖ領域、ＣＬ領域、並びに該ＦＶ領域に該ＣＬ領域を介して連結される蛍光タンパク質を有してなる、ことを特徴とする蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体。
〔７〕 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする〔６〕に記載のｓｃＦｖ抗体。
〔８〕 〔５〕乃至〔７〕のいずれかに記載のｓｃＦｖ抗体を用いた免疫学的測定方法。
〔９〕 〔１〕に記載の工程１）〜４）により取得される、ｓｃＦｖ抗体遺伝子、及び蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有する組換えベクター。
〔１０〕 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子はＶＨ遺伝子、リンカー配列、ＶＬ遺伝子、及びＣＬ遺伝子からなる、ことを特徴とする〔９〕に記載の組換えベクター。
〔１１〕 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする〔９〕又は〔１０〕のいずれかに記載の組換えベクター。
〔１２〕 以下の構造を有する組み換えベクター。
〔１４〕 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子は、ＶＨ遺伝子、リンカー配列、ＶＬ遺伝子、及びＣＬ遺伝子からなる、ことを特徴とする〔１３〕に記載の発現ベクター。
〔１５〕 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子を導入する部位と前記蛍光タンパク質をコードする塩基配列との間にＨｉｓ−ｔａｇ、ｍｙｃ−ｔａｇ、又はＨＡ−ｔａｇをコードする塩基配列を有する、ことを特徴とする〔１３〕又は〔１４〕に記載の発現ベクター。
〔１６〕 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする〔１３〕乃至〔１５〕のいずれかに記載の発現ベクター。
〔１７〕 ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリー、及び
ｓｃＦｖ抗体遺伝子を組み込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクター、を含む、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体作製用キット。
〔１８〕 前記ｓｃＦｖ抗体はＶＨ領域、ＶＬ領域、リンカー、及びＣＬ領域から構成される、ことを特徴とする〔１７〕に記載のキット。
〔１９〕 ｓｃＦｖ抗体遺伝子を有するファージクローン又はファージミドクローンから構成されるｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリー、及び
ｓｃＦｖ抗体遺伝子を組み込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクター、を含む、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体作製用キット。
〔２０〕 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子はＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、リンカー配列、及びＣＬ遺伝子から構成される、ことを特徴とする〔１９〕に記載のキット。
〔２１〕 前記ベクターは〔１３〕乃至〔１６〕のいずれかに記載される発現ベクターである、ことを特徴とする〔１７〕乃至〔２０〕のいずれかに記載のキット。
発明を実施するための最良の形態
本発明である、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体の作製方法は、以下の工程を含むものである。
１）ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製する工程、
２）前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを抗原でスクリーニングすることにより、該抗原に結合可能なｓｃＦｖ抗体を発現しているファージクローンを選択する工程、
３）工程２）で選択したファージクローンより、ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子を取得する工程、
４）工程３）で取得した遺伝子を組込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能な発現ベクターに、該遺伝子を組込む工程、及び
５）工程４）で得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、前記融合タンパク質を発現させる工程。
本発明において、「ｓｃＦｖ抗体」とは、Ｆｖ領域、即ち、重鎖可変領域（ＶＨ領域）及び軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含み、これらがリンカーにより架橋されて構成される抗体である。本明細書においては、ＶＨ領域、ＶＬ領域、及びリンカーに加えて、軽鎖定常領域（ＣＬ領域）を含むものもｓｃＦｖ抗体に含まれるものとする。ＣＬ領域を付加することは、本発明の蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体のコンフォーメーションの安定化の目的で行われる。
また、「ｓｃＦｖ抗体遺伝子」とは、ＶＨ領域をコードする遺伝子（ＶＨ遺伝子）、ＶＬ領域をコードする遺伝子（ＶＬ遺伝子）、及びリンカー配列から構成される。本発明においては、これらに加えてＣＬ領域をコードする遺伝子（ＣＬ遺伝子）を含むものもｓｃＦｖ抗体遺伝子に含まれるものとする。
ＶＨ領域とＶＬ領域とを架橋するリンカーには、汎用的なものを用いることができ、例えば、グリシン−セリンからなるペプチドリンカーが用いられる。
本発明において、「ライブラリー」とは、多様な同種の構成要素からなる集合体を意味する。よって、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーとは、多様なｓｃＦｖ抗体を含有する集合体である。本発明においては、各ｓｃＦｖ抗体はファージ表面に発現されている。換言すれば、表面にｓｃＦｖ抗体を発現しているファージクローンの集合によりｓｃＦｖ抗体ライブラリーが形成される。
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が機能的なコンフォーメーションを再構成するように（もしくは、再構成しているものが大多数を占めるように）作製できれば有効なものとなる。本発明者らは、特願平１２−０５０５４３において、重鎖可変領域と機能的なコンフォーメーションを形成する軽鎖可変領域を選択してライブラリー作製に用いることを提案している。特願平１２−０５０５４３に提案された方法はｓｃＦｖ抗体ライブラリーにも適用することが可能である。また、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、生体内の多様性を包含するのに十分なクローン数を有することが好ましい。これにより、後述の工程２）において、多種多様な抗原に対して、当該抗原と結合可能なｓｃＦｖ抗体を表面に発現するクローンを選択することが可能となる。また、クローン数は、１×１０１１以上であることが好ましい。このようなクローン数を有するｓｃＦｖ抗体ライブラリーの調製方法については、後述の実施例において説明する。
本発明におけるｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンの集合により構成されるが、かかるｓｃＦｖ抗体ライブラリーはｓｃＦｖ抗体遺伝子を保有するファージミドクローンの集合（以下、「ｓｃＦｖ抗体ファージミドライブラリー」という）より調製することができる。なお、本発明において、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を保有するクローンの集合から構成されるライブラリーをｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーと呼ぶ。したがって、ｓｃＦｖ抗体ファージミドライブラリーはｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーでもある。また、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を保有するファージミドにより形質転換された大腸菌の集合もｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーを構成する。
ｓｃＦｖ抗体ファージミドライブラリーを作製するためのファージミドベクターとしては、市販のものを利用することができる（例えば、ファルマシア製 ｐＴＺ１９Ｒ）。ファージミドには、ｃｐ３やｃｐ８等のファージの構成タンパク質をコードする遺伝子に、発現させたい外来タンパク質をコードする遺伝子、即ち、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を連結する。
ｓｃＦｖ抗体遺伝子は、上述のようにＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、及びリンカー配列、又はこれらにＣＬ遺伝子を加えたものから構成されるが、ＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、及びＣＬ遺伝子は、任意の抗体産生細胞より得ることができる。抗体産生細胞としては、例えば、末梢血リンパ球や脾臓細胞等を挙げることができる。それぞれの遺伝子の単離には、公知のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法を利用することができる。得られた各領域の遺伝子とリンカー配列とを連結することによりｓｃＦｖ抗体遺伝子が構成される。
ｓｃＦｖ抗体ファージミドライブラリーからのｓｃＦｖ抗体ライブラリーの調製方法は次のように行うことができる。まず、ｓｃＦｖ抗体ファージミドライブラリーを構成する各クローンを宿主にトランスフェクションさせる。次に、この宿主にヘルパーファージを重感染させる。例えば、ファージミドベクターｐＴＺ１９Ｒは、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７の重感染によってファージ粒子として回収することができる。このとき利用されるファージミドのｃｐ３タンパク質が外来タンパク質すなわちｓｃＦｖ抗体と融合されていれば、完成するファージの表面にはｓｃＦｖ抗体が提示されることとなる。
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーの作製方法は上述のものに限られるわけではなく、例えば、後述の実施例のように、まず、ＶＨ遺伝子、ＣＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、及びＣＬ遺伝子とから構成されるＦａｂ型抗体遺伝子を保有するクローンにより構成されるライブラリー（以下「Ｆａｂ抗体遺伝子ライブラリー」という）を作成し、各クローンにおけるＦａｂ抗体遺伝子をｓｃＦｖ抗体遺伝子に変換することによりｓｃＦｖ抗体を保有するクローンの集合（ｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリー）を得て、これから上述の方法によりｓｃＦｖ抗体ライブラリーを作製することができる。
本発明の工程２）では、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを特定の抗原でスクリーニングし、当該抗原に結合可能なｓｃＦｖ抗体を発現しているファージクローンが選択される。
抗原は、目的に応じて種々のものが用いられる。また、抗原を用いたスクリーニングは以下に示すパニング法により行うことができる。まず、目的とする抗原にｓｃＦｖ抗体ライブラリーを接触させ、この抗原に結合するクローンを回収する。回収したクローンを増幅し、再び目的の抗原と接触させて、結合するクローンを回収する工程を繰り返す。ファージの増幅は、ファージを大腸菌に感染させ、回収することによって行われる。この工程を繰り返すことによって、目的とする反応性を持つｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンが濃縮される。抗原との結合性に基づくスクリーニングは、一般にクローンの回収率が上昇するまで行われる。ここで回収率とは、抗原に対して添加したファージクローンの数に対する、抗原への結合性を有するものとして回収されたファージクローンの数の割合である。回収率がその前のスクリーニングに比較して明らかに上昇するとき、目的とする反応性を持つｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンが濃縮されつつあることを意味する。
工程３）においては、工程２）により選択したファージクローンより、ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子（ｓｃＦｖ抗体遺伝子）が取得される。即ち、ファージクローンより、ＶＨ領域、ＶＬ領域、及びリンカーをコードする遺伝子が切り出される。ｓｃＦｖ抗体としてＣＬ領域を含有するものを用いる場合には、ＶＨ領域、ＶＬ領域、及びリンカーに加えて、ＣＬ領域をコードする遺伝子が切り出される。このとき、Ｈｉｓ，ＭｙｃなどのＴａｇを含有するものを用いてもよい。
具体的なｓｃＦｖ抗体遺伝子の切り出し方法としては、ファージＤＮＡのｓｃＦｖ抗体遺伝子導入部位、即ち、ｓｃＦｖ抗体遺伝子の両端の制限酵素サイトを特異的に切断する制限酵素を用いる。このような切り出しを行うため、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを構成する各ファージクローンにおけるｓｃＦｖ遺伝子導入部位を当該制限酵素に対応したユニークな制限酵素サイトにより形成しておく。
工程３）の後に、工程３）で取得したｓｃＦｖ抗体遺伝子の一端又は両端の配列を、該遺伝子のコードするアミノ酸配列が変化しない条件下で異なる塩基配列に変換する工程（工程３−１））を行うことができる。この工程により、ｓｃＦｖ抗体遺伝子のコードするアミノ酸配列を変化させることなく、その一端又は両端に所望の制限酵素サイトを形成することができる。これにより、工程３）で切り出されたｓｃＦｖ抗体遺伝子の一端又は両端の塩基配列を、次の工程４）において用いられる発現ベクターの導入部位を形成する制限酵素サイトに対応させることができる。このような工程を行うことにより、発現ベクターの設計の自由度が高くなる。もちろん、予めｓｃＦｖ抗体遺伝子の両端の制限酵素サイトと発現ベクターの導入部位とが対応するように、ｓｃＦｖ抗体遺伝子及び発現ベクターを設計することができ、この場合には工程３−１）は不要である。工程３−１）は、適当な合成プライマーを用いたＰＣＲにより行うことができる。この場合、工程３）と同時に工程３−１）を行うことができる。即ち、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を切り出す際に、ｓｃＦｖ抗体遺伝子の一端又は両端の配列を変換する２つのプライマーを用いてＰＣＲを行い、制限酵素サイトの変換されたｓｃＦｖ抗体遺伝子を切り出し、かつ増幅する。
また、ｓｃＦｖ抗体遺伝子の末端に適当なリンカーを付加することにより、所望の制限酵素サイトを形成してもよい。
工程４）では、工程３）、又は工程３）及び工程３−１）で取得したｓｃＦｖ抗体遺伝子を発現ベクターに組み込むことが行われる。
発現ベクターはｓｃＦｖ抗体遺伝子を組み込むことによりｓｃＦｖ抗体遺伝子発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なものを用いる。このような発現ベクターとしては、５’側より順に、開始コドン、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を導入する部位、及び蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有するものが用いられる。また、ｓｃＦＶ抗体遺伝子を導入する部位と蛍光タンパク質をコードする塩基配列の間にＨｉｓ−ｔａｇ、ｍｙｃ−ｔａｇ、又はＨＡ−ｔａｇなどをコードする塩基配列（以下、「タグ配列」という）を有する発現ベクターを用いることができる。かかるベクターを用いることにより、ｓｃＦｖ領域と蛍光タンパク質との間に、タグ配列によりコードされる分子が介在される。これにより、タグ分子の特定物質との親和性を利用してｓｃＦｖ抗体を精製することが可能となる。また、タグ配列を入れる位置はこれに限られるものではなく、ｓｃＦｖ抗体遺伝子導入部位の５’上流域、又は蛍光タンパク質をコードする配列の下流域に入れておくこともできる。但し、タグ配列にコードされる分子とｓｃＦｖ抗体とが融合したものとして発現される位置に入れる必要がある。
上記特性を備える発現ベクターは、市販の発現ベクターを周知の遺伝子操作技術を用いて改良することにより作製することができる。なお、形質転換させる宿主に応じて、細菌発現用ベクター、動物細胞発現用ベクターを用いる。大腸菌を宿主とした場合の本発明における発現ベクターとして、例えば、ｐ６×Ｈｉｓ−ＧＦＰ（クロンテック製）ベクターの開始コドンとＨｉｓ−Ｔａｇ配列の間にＡｓｃＩサイトを付加したものを用いることができる。
この発現ベクターにおいては、ＡｓｃＩサイトにｓｃＦｖ抗体遺伝子が導入される。このベクターを用いた場合に、後述の工程５）で得られる発現産物では、標識ペプチドであるヒスチジンタグが融合したｓｃＦｖ抗体が発現される。ヒスチジンタグは金属イオンとの結合活性を持つタグであって、例えばニッケルカラムに捕捉することができるため、ｓｃＦｖ抗体の精製に利用できる。
同様の目的で、ヒスチジンタグの代わりに、ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ等を用いることもできる。その場合には、ヒスチジンタグの場合と同様に、これらのタグをコードする塩基配列を組込んだ発現ベクターを用いる。また、ｓｃＦｖ抗体遺伝子に予めＨｉｓ−ｔａｇ等をコードする塩基配列を融合しておき、これを発現ベクターに導入することもできる。この場合には、発現ベクターとしてＨｉｓ−ｔａｇ等をコードする塩基配列を有するものを使用する必要はない。
蛍光タンパク質の種類は特に限定されず、公知のものを任意に選択して用いることができる。例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰを用いることができ、また、これらの変異体を用いることもできる。変異体としては、例えば、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＢＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＹＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られている。これらのタンパク質は特定の波長の光を照射することにより照射光と異なる波長の光を発光することができ、目的、条件等に応じて任意に選択して用いることができる。また、これらの蛍光タンパク質は単独で用いられることはもちろんのこと、複数種を任意に選択し、組み合わせて用いることもできる。
上記工程１）〜４）により取得される、ｓｃＦｖ抗体遺伝子、及び蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有する組換えベクターは本発明に含まれる。また、工程３）の後に上記工程３−１）をさらに行うことにより取得される組換えベクターも本発明に含まれる。この場合においても、上述のようにｓｃＦｖ抗体遺伝子としてＣＬ遺伝子を含む場合も含まれるものとする。
具体的な組換えベクターとして、次の構成のものを挙げることができる。
上記の工程により作製される蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体は、免疫染色等の免疫学的測定方法に利用できる。本発明のｓｃＦｖ抗体では、蛍光タンパク質が融合しているため、それ自体で蛍光を発することができる。すなわち、従来の抗体を用いたＥＬＩＳＡ法等においては、標識化された２次抗体を必要とするが、本発明のｓｃＦｖ抗体においてはそれ自体標識化されているため、２次抗体等を必要とせず、測定工程の簡略化が図れる。また、蛍光を発するために特別の基質を必要としないため、例えば、細胞内で発現させ、これを取り出すことなく直接測定することができる。したがって、特定の抗原の細胞内ないし生体内における発現、分布を直接測定することができる。
ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリーと、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を組込むことにより当該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクターとを含ませることにより、ｓｃＦｖ抗体作製用キットを構成することができる。ｓｃＦｖ抗体ライブラリー、蛍光タンパク質、発現ベクターとしては、それぞれ上述のものを任意に選択して用いることができる。また、ｓｃＦｖ抗体としては、ＶＨ領域、ＶＬ領域、リンカー、及びＣＬ領域から構成されるものも含まれる。
また、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を有するファージクローン又はファージミドクローンから構成されるｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーと、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を組み込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクターとを含ませることにより、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体作製用キットを構成することができる。この場合において、ｓｃＦｖ抗体遺伝子はＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、リンカー配列、及びＣＬ遺伝子から構成されるものも含まれる。ｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーは、公知のファージ又はファージミドを用い、公知の遺伝子操作技術によりｓｃＦｖ抗体遺伝子を導入することにより作製される。また、蛍光タンパク質、発現ベクターとしては、それぞれ上述のものを任意に選択して用いることができる。
［実施例］
本実施例では、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製するために、まず、ＶＨ領域、ＣＨ領域、ＶＬ領域、及びＣＬ領域とから構成されるＦａｂ型抗体遺伝子を含有するクローンの集合からなるＦａｂ抗体遺伝子ライブラリーを作製した。そして、Ｆａｂ抗体遺伝子ライブラリーをｓｃＦｖ型抗体遺伝子を含有するクローンの集合からなるｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリーに変換し、これよりｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製した。なお、本実施例では、ｓｃＦｖ型抗体として、ＶＨ領域、リンカー、及びＶＬ領域（ｓｃＦｖ）にＣＬ領域が付加した抗体（以下、「ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体」という）を用いた。ＣＬ領域を付加した理由は、細胞質内で発現させた場合に安定性の促進が期待されるからである。なお、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーの調製方法はこれに限定されるものではない。
１．Ｆａｂ抗体遺伝子ライブラリー作製用ファージミドベクターの作製
１−１ Ｆａｂ抗体遺伝子ライブラリーを作製するためのベクターの作製
図１に概念的に示すように、ｐＴＺ１９Ｒファージミドベクター（ファルマシア）にＭ１３ファージのｐｅｌＢ（シグナル配列）、Ｈｉｓ６タグ配列、Ｍ１３ファージのｃｐ３タンパク質（Δｃｐ３（１９８ａａ−４０６ａａ）Ｎ端欠失キャプシドタンパク質３）配列、ｐｒｏｔｅｉｎＡタンパク質配列を適当な制限酵素部位で組み込みベクターｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄを作製した（Ｉｂａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９４：３５−４６，１９９７．参照）。軽鎖λ５，λ６遺伝子に存在するＢｓｔＰＩでその遺伝子が切断されることを避けるためにｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄはＸｈｏＩ部位が設けられている。ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの塩基配列を図２に、制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を図３〜５に示した。
このベクターの所定の位置に重鎖と軽鎖の遺伝子を挿入することにより、実際の抗体タンパク質発現ベクターが完成することとなる。完成したベクターによって発現される抗体の形状はＦａｂ型であり、重鎖軽鎖はＮ末の可変領域に続いて定常領域ＣＨ１，ＣＬをそれぞれ有している。定常領域同士の−ＳＳ−結合によって、重鎖と軽鎖は結合されることになる。軽鎖定常領域ＣＬ遺伝子は前述のｃｐ３遺伝子と結合されており、結果として発現タンパク質はＦａｂ−ｃｐ３の形状となる。
具体的には、以下のような操作を行った。
用いたプライマー：
１）ｐＡＡＬＦａｂを鋳型にして５２７−５９９を用いたＰＣＲ，５４７−５９０を用いたＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した。
２）５４４−５４５，５４６−５４７，５４８−５４９にてＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した
３）１）２）を混合し５２７，５９０によるＰＣＲを行い、これをｐＡＡＬＦａｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ ｓｉｔｅにクローニングした
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ Ｌ鎖部分
４）５４２−５６２，５６１−６１３を用いたＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した
５）５３８−５３９，５４２−５４３にてＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した
６）４）５）を混合し５３８，５６２によるＰＣＲを行い、これをｐＡＡＬＦａｂのＳａｃＩ−ＮｈｅＩ ｓｉｔｅにクローニングした
ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ
６）ＶＨｓｔｕｆｆｅｒ部分の作製
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８ＴをＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩにて消化、ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを作用させて平滑末端に変えた後ｓｅｌｆ ｌｉｇａｔｉｏｎさせてＶＨ部分のｓｔｕｆｆｅｒを作製した。
７）ＶＨｓｔｕｆｆｅｒ部分の作製
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを鋳型にして５２７−６００にてＰＣＲ。６）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ ｓｉｔｅにクローニングした。
８）これをＫｐｎＩにて消化、ｓｅｌｆ ｌｉｇａｔｉｏｎさせてＶＬ部分のｓｔｕｆｆｅｒを作製
９）ＳｆｉＩ，ＮｃｏＩ，ＳｐｅＩ ｓｉｔｅの導入
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを鋳型にして５２７−６６３にてＰＣＲ。１）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ ｓｉｔｅにクローニングした。
１０）ＡｓｃＩ ｓｉｔｅの導入
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを鋳型にして５２７−ＬＣＰ３ＡＳＣにてＰＣＲし、それをＳａｃＩ完全消化、ＳａｌＩ部分消化した２）にクローニングした。
１１）ｇａｍｍａＣＨ１部分をヒト遺伝子に変換
ヒトｇａｍｍａＣＨ１部分にはＢｓｔＰＩ ｓｉｔｅが存在するためこれをなくす設計でクローニングを行った。扁桃ｃＤＮＡを鋳型にしてｈＣＨ１Ｂｓｔ−ｈＣＨ１ｍｉｄＳ，ｈＣＨ１ｍｉｄＡＳ−ｈＣＨ１Ｈ６にてＰＣＲしたのち、これを混合してｈＣＨ１Ｂｓｔ−ｈＣＨ１６ＳｍａにてＰＣＲし、そのＤＮＡ断片を３）のＢｓｔＰＩ−Ｓｍａ ｓｉｔｅにクローニングした
１２）Ｘｈｏ ｓｉｔｅの導入
１１）を鋳型に７０２−６６３にてＰＣＲを行い、これを１１）のＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ ｓｉｔｅにクローニングした。
１−２ 重鎖可変領域（ＶＨ）を一時的にクローニングするためのベクターの作製
公知の手法（Ｉｂａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９４：３５−４６，１９９７．参照）に従って、まずｐＡＡＬＦａｂベクター（図１の１））を作製した。ｐＡＡＬＦａｂベクターのＸｂａＩからＥｃｏＲＩの間を欠落させ、新たに制限酵素切断部位Ｋｐｎ Ｉ，Ｓｆｉ Ｉ，Ｎｃｏ Ｉ，Ｓｐｅ Ｉを付加して、ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを経て、ＶＨ（重鎖可変領域）をクローニング可能としたベクターｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ（図１の３））を作製し、重鎖可変領域を一時的にクローニングするためのベクターとした。ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの塩基配列を図６に、制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を図７〜８に示した。
具体的には
２．イムノグロブリン軽鎖ライブラリーの作製
２−１ ＰＣＲを用いたイムノグロブリン軽鎖遺伝子の単離
骨髄細胞（検体Ｎｏ．５９）４×１０７ｃｅｌｌｓ、および臍帯血と末梢血のリンパ球から、市販のキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて、２．６μｇのｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡは、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによって作製した。プライマーには、オリゴｄＴを用いた。得られたｃＤＮＡを鋳型にして、軽鎖遺伝子の取得用５‘プライマー（κ１〜κ６、λ１〜λ６）と３’プライマー（ｈＣＫＡＳＣプライマーまたはｈＣＬＡＳＣプライマー）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して１０μＬのＴＥバッファーに懸濁した。用いたプライマーの塩基配列とＰＣＲの条件は以下のとおりである。軽鎖遺伝子取得用プライマーの塩基配列中、下線部はＳｆｉＩサイト、ＡｓｃＩサイトを示す。
５’−プライマーκ１〜κ６
ｃＤＮＡ ２μＬ
１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付） １０μＬ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（２．０ｍＭ） １０μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４μＬ
５’側プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ） １μＬ
３’側プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ） １μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ７１μＬ
ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡２．５Ｕ／μＬ）１μＬ
９４℃ １分、５５℃ ２分、７４℃ １分を３５サイクル
２−２ ライブラリー作製に適した軽鎖を選択して軽鎖遺伝子ライブラリーを作製する方法
２−２−１ 軽鎖遺伝子のファージミドへの組込み
１で得たＰＣＲ産物を以下の条件で制限酵素処理した。
ＰＣＲ産物 １０μＬ
１０×ＮＥＢ４（ＡｓｃＩに添付） ５μＬ
１０×ＢＳＡ（ＳｆｉＩに添付） ５μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ２８μＬ
ＡｓｃＩ（ＮＥＢ社 １０Ｕ／μＬ） １μＬ
ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社 ２０Ｕ／μＬ） １μＬ
３７℃で１時間、５０℃で１時間反応後、そのうち１０μＬ分をアガロース電気泳動し、６００ｂｐ付近のバンドを切り出して、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製した。ＰＣＲ産物と同様に制限酵素処理したｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ（図１の４））をジーンクリーンＩＩキットで精製し、制限酵素処理したＰＣＲ産物と以下の条件で１６℃で４時間〜一晩反応させることによりライゲーションした。
制限酵素処理したｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ２μＬ
制限酵素処理したＰＣＲ産物 １μＬ
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ
（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅに添付）
１０ｍＭ ＡＴＰ １．５μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ８μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造１０Ｕ／μＬ）１μＬ
２−２−２ ファージミドの大腸菌への導入
得られたｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡを用いて以下のように大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。即ち、ｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡを一旦エタノール沈殿し、１／５ＴＥ（ＴＥを滅菌済ＭｉｌｌｉＱで５倍希釈したもの）３μＬに溶解した。そのうち、１．５μＬをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）２０μＬに懸濁し、以下の条件でエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーター
ＢＲＬ社 Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｃａｔ．ｓｅｒｉｅｓ １６００）
設定条件；ｖｏｌｔａｇｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ４ｋΩ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ３３０μＦ
ＤＣ ｖｏｌｔｓ ＬｏｗΩ
ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｅ Ｆａｓｔ
２−２−３ ファージミドで形質転換した大腸菌からのＦａｂ−ｃｐ３型抗体培地中への分泌
形質転換した上記の大腸菌を形質転換用培地（ＳＯＢ）２ｍＬに植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ａｍｐプレート）にまき、残りは、１％グルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有２×ＴＹ培地で培養し、グリセリンストックした。寒天培地は３０℃でｉｎｃｕｂａｔｅし、生えてきたコロニーを楊枝でつついて分離し、それぞれプラスミドを調製し、軽鎖遺伝子の塩基配列を調べた。
ＳＯＢ培地：９５０ｍＬの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後２５０ｍＭのＫＣｌ溶液１０ｍＬを加え、５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調製した。精製水を加えて１０００ｍＬに調整した後、オートクレーブで２０分間滅菌し、使用直前に滅菌した２ＭのＭｇＣｌ２を５ｍＬ加えた。
ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ ２０ｇ
ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ
ＮａＣｌ ０．５ｇ
２×ＹＴ培地：９００ｍＬの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後５Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．０に調製し、精製水を加えて１０００ｍＬとした。オートクレーブで２０分間滅菌して使用した。
ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １６ｇ
ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ
ＮａＣｌ ５ｇ
その他の試薬は以下から購入した。
メーカー 品名
シグマ アンピシリンナトリウム
和光純薬 フェノール
シグマ ＢＳＡ
ＤＩＦＣＯ ２×ＹＴ培地
和光純薬 カナマイシン硫酸塩
ナカライテスク ポリエチレングリコール６０００
ナカライテスク Ｔｗｅｅｎ２０
片山化学 ＮａＣｌ
和光純薬 ＩＰＴＧ
和光純薬 スキムミルク
和光純薬 アジ化ナトリウム
和光純薬 トリエチルアミン
和光純薬 過酸化水素
和光純薬 ＯＰＤ錠
和光純薬 エタノール
κ１、κ２、κ３、κ４、κ５、およびκ６、並びにλ１、λ２、λ３ａ、λ３ｂ、λ４、λ５、λ６、λ７、λ８、λ９、およびλ１０の全てについて以上の操作を行い、目的のクローンが得られているかどうか確認した。続いてκ１、κ２などの各グループのクローンをｉｎ ｖｉｖｏでの使用頻度に近い比率になるように混合した。これら軽鎖の各グループは、それぞれ実際の生体内でどのような割合で発現しているのかが既に知られている。ＰＣＲ法で増幅してベクターに組み込んだこれらの遺伝子クローンを、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用頻度に近い比率になるように混合しＶＬライブラリーとした。ＶＬライブラリーにおける各ｆａｍｉｌｙの構成比率を以下に示す。
＊＊発表時記載なし。
＊＊＊プライマーＶＫ６−２で作製したｃＤＮＡとプライマーＶＫ６−３で作製したｃＤＮＡを等量混合。
＊２ 発表時記載なし。
＊３ プライマーＶＬ２で作製したｃＤＮＡ５％とプライマーＶＬ２−２で作製したｃＤＮＡ１０％を混合。
＊４ プライマーＶＬ３ａ−２で作製したｃＤＮＡ１７％とプライマーＶＬ３ｂで作製したｃＤＮＡ１５％を混合。
＊５ プライマーＶＬ４ａで作製したｃＤＮＡ０．５％とプライマーＶＬ４ｂで作製したｃＤＮＡ０．５％とプライマーＶＬ４ｃで作製したｃＤＮＡ０．５％を混合。
＊６ プライマーＶＬ５ａｂｄｅで作製したｃＤＮＡ０．５％とプライマーＶＬ５ｃで作製したｃＤＮＡ０．５％を混合。
次に、ＶＬライブラリーから無作為に選んだ約１０００個の軽鎖遺伝子の塩基配列を確認した。すなわち、蛍光プライマーｈｕＣＨ１Ｊ（５’−ＡＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＣＣＣＧＧ−３’／配列番号：４５）を用い、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって塩基配列を決定した。得られた塩基配列を比較して重複するクローンを除いた。更にデータベースと照合し、ｄｅｌｅｔｉｏｎが無いと確認されたクローンについて、予め発現することがわかっている重鎖遺伝子のクローンの一つＶＨ３−４と組み合わせて、発現実験を行った。操作は以下のとおりである。ＶＨ３−４のアミノ酸配列を配列番号：１に示した。
まずＶＨ３−４をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、重鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。一方、ｄｅｌｅｔｉｏｎが無いと確認された軽鎖遺伝子クローンについてもＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、軽鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンＩＩキットで精製し、ＶＨ３−４の重鎖遺伝子とライゲーションすることにより、組み合わせた。得られたｌｉｇａｔｅｄＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。生えてきたコロニーを試験管にいれた培地にうえ、ＩＰＴＧで発現を誘導することにより、Ｆａｂ−ｃｐ３型の抗体分子を培養上清中に発現させた。２０時間程度の培養により、ヘルパーファージの感染無しでもＦａｂ−ｃｐ３型の抗体分子が培養上清に発現される。この培養上清を用いて以下のようなＥＬＩＳＡを行った。
２−２−４ ＥＬＩＳＡ法による重鎖と軽鎖の正しい発現と会合の検定
１）抗体結合９６ｗｅｌｌマイクロタイタープレートの作製
抗κ抗体（ＭＢＬ ｃｏｄｅ Ｎｏ．１６１）を０．０１Ｍナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ ＮａＮ３で１．２５μｇ／ｍＬで希釈し、１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加した。４℃で一晩静置することにより、ウェルに抗κ抗体を吸着させた。反応液を捨て、５％ ＢＳＡ ｉｎ ０．０１Ｍナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ ＮａＮ３を２００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し、３７℃で２時間静置することにより、非特異的な吸着を防ぐためのブロッキングを行った。
次に、非特異的活性吸収済の抗λ抗体（ＭＢＬ ｃｏｄｅ Ｎｏ．１５９）を０．０１Ｍナトリウムリン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ ＮａＮ３で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し氷室で一晩静置した。反応液を捨て、５％ ＢＳＡ ｉｎ ０．０１Ｍナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ ＮａＮ３を２００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で２時間静置し、非特異的な結合を防ぐためのブロッキングを行った。
２）１次反応
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｏｒｏｌとして）ヒトＦａｂ（１０μｇ／ｍＬ）を、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＰＢＳ／０．１％ＮａＮ３をそれぞれ１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加した。ＩＰＴＧでＦａｂ−ｃｐ３型の抗体分子の発現を誘導した培養上清の原液を１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で１時間反応させた。
３）２次反応
１次反応を終了したマイクロタイタープレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄した。次いでＰＢＳ／０．１％ＮａＮ３で希釈した抗Ｆｄ抗体（１μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で１時間反応させた。
４）３次反応
２次反応を終了したマイクロタイタープレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄した。次いでＰＢＳ／０．１％ＮａＮ３で希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（４０００倍希釈）を１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で１時間反応させた。
５）発色反応および吸光度測定
３次反応を終了したマイクロタイタープレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄した。次いで発色基質溶液（ＳＩＧＭＡ １０４ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔａｂｌｅｔｓ １粒あたり５ｍＬの５０ｍＭジエタノールアミンＰＨ９．８に溶解したもの）を１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加した。室温で反応させ、４０５ｎｍの吸光度が０．５以上になったと思われる時点で、停止液を添加し、プレートリーダー（タイターテック マルチスキャンＭＣＣ）で吸光度測定した。
このＥＬＩＳＡで陽性（吸光度０．５以上）となったクローンは、Ｆａｂ−ｃｐ３型の抗体分子の発現と会合がうまく行われているとし、κ鎖遺伝子、λ鎖遺伝子それぞれ反応性の高いものから１００個ずつ選択した。両者を混合してＦａｂ−ｃｐ３型の抗体分子の発現と会合がうまく行われているクローンのみを集めたライブラリーＫＬ２００とした。
３．軽鎖遺伝子ライブラリーと重鎖遺伝子ライブラリーの組み合わせライブラリー（Ｆａｂ抗体遺伝子ライブラリー）の作製
３−１−１ ＰＣＲを用いたイムノグロブリン重鎖遺伝子の単離
２−１と同様の手順を用いて臍帯血、骨髄液、および末梢血のリンパ球、並びに扁桃腺からｈｕｍａｎ μ ｐｒｉｍｅｒ（以下に示すプライマーの６３４）あるいはｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒを用いてｃＤＮＡを調製し、このｃＤＮＡを鋳型にして、以下に示すヒト抗体重鎖遺伝子の取得用５’プライマー（ＶＨ１〜ＶＨ７）と３’プライマー（ｈｕｍａｎ ＪＨプライマー４種を等量混合したもの、以下に示すプライマーの６９７〜７００）、または、ｈｕｍａｎ μプライマー（以下に示すプライマーの６３４）を用いて、ＰＣＲを行った。表中、下線をつけた部分はＳｆｉＩサイトを示す。ｈＶＨ２ａはｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ＶＨ２ ｆａｍｉｌｙに対応していないため、新たにＶＨ２ａ−２を設計した。またｈＶＨ４ａではＶＨ４ファミリー全体に対応していないため、新たにｈＶＨ４ａ−２を設計した。ＶＨ５ａもｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ＶＨ５ ｓｕｂｆａｍｉｌｙに対応していなかったため新たにＶＨ５ａ−２を設計した。またＶＨ７に対応するｐｒｉｍｅｒとしてｈＶＨ７を設計した。これらについても遺伝子増幅を行い、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄに組み込み、どのような遺伝子がとれたのかを塩基配列決定した。ｈＶＨ５ａ−２についてはｈＶＨ１ａと配列が酷似しているため、ｈＶＨ１ａで増幅させたものと同様の遺伝子産物が得られることが予想されるためこれについては使用しなかった。ＰＣＲ産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して１０μＬのＴＥバッファーに懸濁した。
Ｈｕｍａｎ ＶＨ ｐｒｉｍｅｒ ＳｆｉＩ ｓｉｔｅを下線で示す
１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付） １０μＬ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（２．０ｍＭ） １０μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４μＬ
５’側プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ） １μＬ
３’側プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ） １μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ７１μＬ
ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡２．５Ｕ／μＬ）１μＬ
ＰＣＲ条件：９４℃ １分、５５℃ ２分、７４℃ １分を３５サイクル
３−１−２ 重鎖遺伝子ライブラリーの作製
３−１−１で得たＰＣＲ産物を以下の条件で制限酵素処理した。
ＰＣＲ産物 １０μＬ
１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造） ５μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ３３μＬ
ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造１５Ｕ／μＬ） １μＬ
ＸｈｏＩ（宝酒造１２Ｕ／μＬ） １μＬ
３７℃で２時間反応後、そのうち１０μＬ分をアガロース電気泳動し、４００ｂｐ付近のバンドを切り出して、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製した。ＰＣＲ産物と同様に制限酵素処理したｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ（図１の３））をジーンクリーンＩＩキットで精製し、制限酵素処理したＰＣＲ産物と以下の条件で１６℃で４時間〜一晩反応させることによりライゲーションした。
制限酵素処理したｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ ２μＬ
制限酵素処理したＰＣＲ産物 １μＬ
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ
（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅに添付）
１０ｍＭ ＡＴＰ １．５μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ８μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造１０Ｕ／μＬ）１μＬ
３−１−３ ファージミドの大腸菌への導入
得られたＤＮＡを大腸菌ＤＨ１２Ｓに形質転換した。具体的にはＤＮＡを一旦エタノール沈殿し、１／５ＴＥ（ＴＥを滅菌済ＭｉｌｌｉＱで５倍希釈したもの）３μＬに溶解する。そのうち、１．５μＬをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）２０μＬに懸濁し、エレクトロポレーション法により形質転換を行った。
エレクトロポレーター
ＢＲＬ社Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｃａｔ．ｓｅｒｉｅｓ １６００）
設定条件；ｖｏｌｔａｇｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ４ｋΩ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ３３０μＦ
ＤＣｖｏｌｔｓ ＬｏｗΩ
ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｅ Ｆａｓｔ
形質転換用培地（ＳＯＢ）２ｍＬに上記操作の終了した形質転換大腸菌を植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ａｍｐプレート）にまき、残りは、１％グルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有２×ＹＴ培地で培養し、グリセリンストックした。寒天培地は３０℃でインキュベートし、生えてきたコロニーを楊枝でつついて分離し、それぞれプラスミドを調製し、重鎖遺伝子の塩基配列を調べた。ＶＨ１〜ＶＨ７の全てについてこれらのことを行い、目的のクローンが得られているかどうか確認した。これらの各グループ（ファミリー）のクローンをｉｎ ｖｉｖｏでの使用頻度に近い比率になるように混合してＶＨライブラリーとした。ＶＨライブラリーにおける各ファミリーの構成比率を以下に示す。
＊＊実際にはＶＨ１とＶＨ５は同一のプライマーで増幅されるため、分離して集計できない。
＊＊＊ＶＨ４プライマーで作製したｃＤＮＡとＶＨ４−２プライマーで作製したｃＤＮＡを混合してこの割合とした。
３−２ 組み合わせ遺伝子ライブラリーの作製
ＶＨライブラリー２００μｇを下記条件でＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、重鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。
ＶＨライブラリー２００μｇ １００μＬ
１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造） ４０μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ２０５μＬ
ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造４０Ｕ／μＬ） ３０μＬ
ＸｈｏＩ（宝酒造５０Ｕ／μＬ） ２５μＬ
ｄｅｌｅｔｉｏｎが無いと確認された軽鎖遺伝子クローンＫＬ２００、およびＶＬライブラリーの挿入されたベクターｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄについても下記条件でＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、軽鎖遺伝子を含む断片を、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。
ＫＬ２００またはＶＬライブラリー
を挿入したｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ １００μｇ １００μＬ
１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造） ４０μＬ
滅菌済Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ２３０μＬ
ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造４０Ｕ／μＬ） １５μＬ
ＸｈｏＩ（宝酒造５０Ｕ／μＬ） １５μＬ
次に、ＶＨ遺伝子ライブラリー断片と軽鎖遺伝子の挿入されたｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄベクターを、次の条件下、１６℃で一晩反応させてライゲーションした。
制限酵素処理した
ＶＨライブラリー断片 １０μｇ ５０μＬ
制限酵素処理したＫＬ２００または
ＶＬライブラリーの断片
を含むｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ４０μｇ ５０μＬ
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ
（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅに添付） １００μＬ
１０ｍＭ ＡＴＰ １００μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ６７０μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造１０Ｕ／μＬ）３０μＬ
反応の終了したＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。具体的にはＤＮＡを一旦エタノール沈殿し、１／５ＴＥ（ＴＥを滅菌済ＭｉｌｌｉＱで５倍希釈したもの）３０μＬに溶解した。これをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）５００μＬに懸濁し、エレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーター
ＢＲＬ社Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｃａｔ．ｓｅｒｉｅｓ １６００）
設定条件；ｖｏｌｔａｇｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ４ｋΩ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ３３０μＦ
ＤＣ ｖｏｌｔｓ ＬｏｗΩ
ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｅ Ｆａｓｔ
形質転換用培地（ＳＯＢ）１２ｍＬに上記操作の終了した大腸菌を植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ａｍｐプレート）にまき、残りは、１％グルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有２×ＹＴ培地５００ｍＬで培養し、グリセリンストックした。寒天培地は３０℃でインキュベートし、生えてきたコロニーの数から得られたクローンの数を推定した。それぞれ４．５×１０１０クローンが得られた。
扁桃ｍＲＮＡよりｒａｎｄａｍ ｈｅｘａｍｅｒにて合成したｃＤＮＡをもとに得た各ＶＨ ｆａｍｉｌｙをｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄベクターにクローニングし、ＫＬ２００と組み合わせたライブラリーをＡＩＭＳ１とした。（１．２８×１０１０の独立したクローン）
サイ帯血、骨髄液、末梢血、扁桃ｍＲＮＡよりｈｕｍａｎ ｍ ｐｒｉｍｅｒにて合成したｃＤＮＡをもとに得た各ＶＨ ｆａｍｉｌｙをｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄベクターにクローニングし、ＫＬ２００と組み合わせた遺伝子ライブラリーをＡＩＭＳ２とした．（３．２０×１０１０の独立したクローン）
サイ帯血、骨髄液、末梢血、扁桃ｍＲＮＡよりｈｕｍａｎ μ ｐｒｉｍｅｒにて合成したｃＤＮＡをもとに得た各ＶＨ ｆａｍｉｌｙをＶＬ ｌｉｂｒａｒｙと組み合わせたライブラリーをＡＩＭＳ３とした。（４．５０×１０１０の独立したクローン）
更に（ＡＩＭＳ１＋ＡＩＭＳ２）：ＡＩＭＳ３＝１：１で混合し、１×１０１１の独立したクローンからなるライブラリーとした（ＡＩＭＳ４と呼ぶ）。
４．ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子ライブラリーの調製
４−１−１ ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄの作製
ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ３μｇ（３μＬ）（図１の４）を参照）をＢｓｔＰＩ（３Ｕ／μＬ）３μＬ、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ＤＷ３９μＬと混合し、３７℃で２時間、制限酵素処理を行った。処理後、エタノール沈殿して得られた沈殿を１０μＬのＴＥバッファーに溶解した。これに、ＳａｃＩ（１０Ｕ／μＬ）１μＬ、１０×Ｌ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ＤＷ３４μＬを混合して３７℃で２時間、制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動して、４．７ｋｂ断片を回収した。回収物をエタノール沈殿して１０μＬとした（ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ断片）。
一方、プライマーｌｉｎＦ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）５μＬとプライマーｌｉｎＲ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）５μＬを混合し、９４℃で５分加熱した後、８０℃５分、７０℃５分、室温放置３０分によりアニールさせた。このうち、２μＬと上記で得られたｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ断片１μＬ、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ、ＤＷ９．５μＬ、Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ １μＬを混合し、１６℃で１６時間反応させた。反応後、エタノール沈殿して３μＬに濃縮し、そのうち１．５μＬを用いて、大腸菌ＤＨ１２Ｓコンピテントセル２０μＬをエレクトロポレーションにより形質転換した。得られたクローンのプラスミドを抽出し、塩基配列を確認して、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄと名づけた。図９にｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄの構造を模式的に示した。また、図１０〜図１２にｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示した。
ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄ２０μｇ（２０μＬ）を、１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ ３０μＬ、１０×ＢＳＡ ３０μＬ、ＮｃｏＩ（１０Ｕ／μＬ）１０μＬ、ＡｓｃＩ（１０Ｕ／μＬ）１０μＬ）と混合して３７℃で２時間、制限酵素処理を行った。アガロースゲル電気泳動により、４．５ｋｂ断片を回収し、エタノール沈殿して１０μＬとした（ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄ ＮｃｏＩ−ＡｓｃＩ断片、５μｇ得られた）。一方、ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミド（ＡＩＭＳ−４ライブラリーを構成するプラスミド）２０μｇ（２０μＬ）を、１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ ３０μｌ、１０×ＢＳＡ ３０μＬ、ＮｃｏＩ（１０Ｕ／μＬ）１０μＬ、ＡｓｃＩ（１０Ｕ／μＬ）１０μＬ）と混合して３７℃で２時間反応させた。アガロースゲル電気泳動して、６８０ｂｐ断片を回収し、エタノール沈殿して１０μＬとした（ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミドＮｃｏＩ−ＡｓｃＩ断片、１μｇ得られた）。
ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄ ＮｃｏＩ−ＡｓｃＩ断片２．５μｇ（５μＬ）、ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミドＮｃｏＩ−ＡｓｃＩ断片１μｇ（１０μＬ）、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、ＤＷ７２μＬ、Ｔ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ ３μＬを混合し、１６℃で１６時間反応させた。エタノール沈殿して３μＬに濃縮し、そのうち１．５μＬを用いて、大腸菌ＤＨ１２Ｓコンピテントセル０．２ｍＬをエレクトロポレーションにより形質転換した。エレクトロポレーション後のＤＨ１２ＳをＳＯＣ培地に植え、３７℃で１時間培養した後、ＴＹＧＡ培地２Ｌで３０℃一晩培養した。一部を寒天培地にまいてクローンの総数を見積もったところ、２．１×１０８であった。一晩培養した大腸菌からプラスミドを抽出したところ、２ｍｇ得られた。これをＡＩＭＳ−４ ＶＬライブラリープラスミドとした。
４−１−３ ＡＩＭＳ−４ ＶＬライブラリープラスミドへのＡＩＭＳ−４ Ｈ鎖の組込みと形質転換
４−１−２で得られたＡＩＭＳ−４ ＶＬライブラリープラスミド５００μｇ（２００μＬ）をＨｉｎｄＩＩＩ（５０Ｕ／μＬ）２０μＬ、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ ４０μＬ、ＤＷ ２４０μＬと混合し３７℃で２時間、制限酵素処理した後、ＢＡＰ Ｃ７５（０．４Ｕ／μＬ）を１０μＬ添加し、３７℃で２時間、５０℃で１５分反応させた。フェノール処理後、エタノール沈殿して、２０μＬ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解した。これに、ＸｈｏＩ（５０Ｕ／μＬ）２０μＬ、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ ４０μＬ、ＤＷ ３２０μＬを混合し、３７℃で２時間制限酵素処理した。これをアガロースゲル電気泳動して、４．５ｋｂ断片を回収し、エタノール沈殿して４０μＬとした（ＡＩＭＳ−４ ＶＬ ライブラリープラスミドＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＢＡＰ断片、２２０μｇ得られた）。
一方、ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミド６００μｇ（６００μＬ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ（５０Ｕ／μＬ）２０μＬ、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ ８０μＬ、ＤＷ １００μＬと混合し３７℃で２時間切断した。フェノール処理後、エタノール沈殿して、５０μＬ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解した。これに、ＸｈｏＩ（５０Ｕ／μＬ）２０μＬ、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ ４０μＬ、ＤＷ ２９０μＬを混合し、３７℃で２時間制限酵素処理した。その後、ＢＡＰ Ｃ７５（０．４Ｕ／μＬ）を１０μＬ添加し、３７℃で２時間、５０℃で１５分反応させた。アガロースゲル電気泳動して、０．５ｋｂ断片を回収し、エタノール沈殿して４０μＬとした（ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミドＸｈｏＩ ＢＡＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＢＡＰ断片、４１μｇ得られた）。
上記方法により調製したＡＩＭＳ−４ ＶＬライブラリープラスミドＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＢＡＰ断片５０μｇ（９．１μＬ）、ＡＩＭＳ−４ライブラリープラスミドＸｈｏＩ ＢＡＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＢＡＰ断片４１μｇ（４０μＬ）、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ３０μＬ、ＤＷ １９５．９μＬ、及びＴ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ ２５μＬを混合し、１６℃で１６時間反応させた。これをアガロースゲル電気泳動して、４．５ｋｂ断片を回収し、エタノール沈殿して１／１０ＴＥ ｂｕｆｆｅｒで３６μＬとした（３５μｇ得られた）。これに、１０×ｋｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、１０ｍＭ ＡＴＰ ５μＬ、Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（１０Ｕ／μＬ）４μＬを添加し、３７℃で１時間反応させた。さらに、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １０００μＬ、ＤＷ ８７５０μＬ、Ｔ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ ２００μＬを混合し、１６℃で１６時間反応させ、セルフライゲーションを行った。１−ブタノールで濃縮後、エタノール沈殿して１／１０ＴＥで２００μＬとし、これを用いて大腸菌ＤＨ１２Ｓコンピテントセル５ｍＬをエレクトロポレーションにより形質転換した。エレクトロポレーション後のＤＨ１２Ｓを５０ｍＬのＳＯＣ培地に植え、３７℃で３０分培養した後、ＴＹＧＡ培地２Ｌで３０℃一晩培養した。一部を寒天培地にまいてクローンの総数を見積もったところ、１．１×１０１１であった。このようにして得られたクローンの集合からなるライブラリーをＡＩＭＳ−５とした。図１３のａ）に、ＡＩＭＳ−５抗体遺伝子ライブラリーを構成するクローンの基本的な構造を示す。
４−２ ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子ライブラリー（ＡＩＭＳ−５）からｓｃＦｖ−ＣＬ抗体ファージライブラリーの作製
１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地３００ｍＬを入れた５リットルのフラスコ１６本にＡＩＭＳ−５懸濁液を２．５ｍＬを加え、３７℃で振とう培養し１時間おきに波長６００ｎｍにおける吸光度を測定しながら、吸光度が１．０になるまで増殖させた。培養液にヘルパーファージ液（Ｍ１３ＫＯ７）をフラスコ当たり１２ｍＬ加えてヘルパーファージを感染させ、３７℃で２時間培養し、ヘルパーファージ感染済みＤＨ１２Ｓとした。
５リットルのフラスコ２４本に２×ＹＴ培地６００ｍＬと１００μｇ／ｍＬのアンピシリン０．６ｍＬ、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン０．８ｍＬ、ヘルパーファージ感染済みＤＨ１２Ｓ２００ｍＬを加えて３７℃で２０時間振とう培養した。
菌体は４℃で８０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を集めた。上清に２０％のポリエチレングリコール／２．５Ｍ ＮａＣｌ ４Ｌを加えて約２０分間静かに攪拌した後、４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心、沈殿を１ＬのＰＢＳで溶かし、２０％のポリエチレングリコール／２．５Ｍ ＮａＣｌ ２００ｍＬを加えて約２０分間静かに攪拌した後、４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心した。上清を捨ててさらに４℃で８０００ｒｐｍ、３分間遠心して沈殿を回収した。沈殿は０．０５％ ＮａＮ３を加えたＰＢＳで溶解し、４℃で１０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を回収した後、４℃で８０００ｒｐｍ、３分間さらに遠心して上清を回収した。
回収したファージ溶液の力価は以下のようにチェックした。すなわち、ファージ溶液をＰＢＳで１０６、１０７、１０８希釈し、その１０μＬをＤＨ１２Ｓ ９９０μＬに感染させ、３７℃で１時間培養した。これをＬＢＧＡプレートに１００μＬ播いて３０℃で１８時間培養した。コロニーの数をカウントすることにより希釈前の原液の力価を算出した。ファージ溶液原液を２％スキムミルク及び０．０５％ ＮａＮ３を含むＰＢＳに２×１０１４／ｍＬになるよう懸濁した。５．ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体ライブラリーから特定の抗原に特異的に結合するファージの選択
本実施例では、モデル抗原としてＣ．ｅｌｅｇａｎｓの細胞内で発現していると考えられるｃＤＮＡである「ＣＣ０４６」の大腸菌での発現産物を用いた。具体的には、ＣＣ０４６のＮ末端の９６アミノ酸に相当する部分（ＣＣ０４６抗原）を用いた。ＣＣ０４６抗原に特異的に結合するファージの選択（スクリーニング）は、以下に示すパニング法によって行った。
５−１ スクリーニング用試験管の作製
ＣＣ０４６抗原をＰＢＳで２０μｇ／ｍＬに調製し、試験管３本（Ｎｕｎｃ社製Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に３ｍＬずつ添加して４℃で１８時間インキュベートして、試験管内表面へ抗原を吸着させた。吸着後、抗原溶液を捨て、２％スキムミルク含有ＰＢＳ溶液３ｍＬずつを加えて２５℃で１時間反応させ、ファージ抗体が非特異的に試験管に結合することを防ぐためにブロッキングを行った。
５−２ スクリーニング操作
作製した抗原吸着済試験管に４で得たＡＩＭＳ−５ライブラリーを２％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳになるよう溶解して１×１０１４ＣＦＵ／９ｍＬに調製し、この液を試験管３本に３ｍＬずつ添加して２５℃で２時間反応させた後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳで４回、ＰＢＳで４回、および滅菌した超純水（ＭｉｌｌｉＱにて作製）で１回洗浄した。
続いて抗原結合試験管に結合したファージを以下のように回収した。すなわち、０．１Ｍトリエチルアミン（ｐＨ１２．３）を試験管１本当たり３ｍＬ添加し、ローテーターを用いて室温で２０分間反応させ乖離させた後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）１．１ｍＬを加えて中和し、この液を回収した。
５−３ 回収したファージの増幅
回収した液は（ファージの大腸菌への感染）（ヘルパーファージの感染）（ファージの回収）の処理を行い、含まれているファージを精製・増幅した。
１）ファージの大腸菌への感染
大腸菌（ＤＨ１２Ｓ）を２×ＹＴ培地５０ｍＬで培養し、波長６００ｎｍの吸光度が０．５になるよう増殖させ、上記で乖離させたファージ液を加えて３７℃で１時間振とう培養した。
２）ヘルパーファージの感染
１）の培養液６２．３ｍＬをとり、２×ＹＴ培地４２５ｍＬ、４０％ グルコース１２．５ｍＬ、および１００μｇ／ｍＬアンピシリン０．５ｍＬを加えて３７℃で波長６００ｎｍにおける吸光度が０．５になるまで培養した後、４℃、５０００ｒｐｍで１０分間遠心して菌体を沈殿させ、回収して１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン０．３ｍＬを加えた２×ＹＴ培地３００ｍＬに懸濁した。これに３×１０１０ｃｆｕ／ｍＬのヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を１／１００量加え、３７℃で１時間振とう培養した。
培養液を予め３７℃に暖めた培地（２×ＹＴ培地に１００μｇ／ｍＬアンピシリンと７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた液）９００ｍＬに加えて３７℃で一晩培養した。
３）ファージの回収
２）の培養液を４℃で７０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、その上清に２．５Ｍの塩化ナトリウムを加えた２０％のポリエチレングリコールを１／５量加えて室温で２０分間静置した後、４℃で８０００ｒｐｍ、１５分間遠心して沈殿を回収し、培養液の１／１０量の滅菌ＰＢＳを加えて溶解し、再度２．５Ｍの塩化ナトリウムを加えた２０％のポリエチレングリコールを１／５量加えて４℃で１００００ｒｐｍ、２０分間遠心して上清を捨て、さらにスピンダウンして４℃で１００００ｒｐｍ、２分間遠心した。これに０．０５％のＮａＮ３を加えたＰＢＳを培養液の１／１００量加えて沈殿を溶解し、ファージを回収した。
５−４ 増幅したファージによる再スクリーニング
増幅したファージを用いて５−２と同様に抗原結合試験管を用いてスクリーニングを繰り返した。スクリーニングでの洗浄は、非特異に吸着したファージを乖離し、結合力の高いファージを選択する上で重要なステップであることから、２回目以降のスクリーニングにおける洗浄条件は以下のようにした。
２回目；ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で６回、ＰＢＳで６回、滅菌した超純水で１回
３回目；ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で１３回、ＰＢＳで１３回、滅菌した超純水で１回
５−５ スクリーニングによって得られた抗体の抗原結合活性（アフィニティー）の測定
本発明者らは、以上のスクリーニングにより得られたファージを大腸菌に感染させ、その後ヘルパーファージを重感染させることなく長時間培養することにより、大腸菌外にｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体が分泌されてくることを発見した。
そこで、ファージによってコードされるｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の抗原結合活性を、ファージ表面に発現されている抗体ではなく、ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を用いて行った。具体的な方法は以下のとおりである。
５−５−１ ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の発現誘導
まず、以上のスクリーニングにより得られたファージを大腸菌ＤＨ１２Ｓに感染させた。次に、ファージの感染した大腸菌を、ＹＴＧＡ培地（１％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有２×ＹＴ培地）を含む寒天培地にまき、生えてきたコロニーの中から数十個を選択し、１％グルコースと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地３ｍＬにそれぞれのクローンを植え終夜培養した。０．１％グルコースと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地１０ｍＬに終夜培養した培養液を１００μＬを入れ、対数増殖期に達したら、１ＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を１０μＬ加えてさらに３０℃で２１時間培養した後、培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブにとり、４℃で１００００ｒ．ｐ．ｍ．５分間遠心してその培養上清をとり、０．１％となるようアジ化ナトリウムを添加して検体とした。
５−５−２ ＥＬＩＳＡ法による抗原結合活性（アフィニティー）の測定
まず、ＥＬＩＳＡ用のプレートを以下のように調製した。ＣＣ０４６抗原１０μｇ／ｍＬを９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに１００μＬ添加して４℃で１８時間結合させたのち、５％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（ブロッキング液）を各ウェルに２００μＬ添加して３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、ＰＢＳで１回洗浄してアフィニティーの測定に用いた。
このようにして得られたプレートの各ウェルに、５−５−１で得られた検体を１００μＬずつ加え、２５℃１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで４回洗浄し、５００倍希釈のウサギ抗ｃｐ３抗体（ＭＢＬ製）を１００μＬ加えて２５℃で１時間反応させた。各ウェルをＰＢＳで４回洗浄した後、１０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭＢＬ製）を１００μＬ加えて、２５℃で１時間反応させた。再度ＰＢＳで４回洗浄し、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液１００μＬを加えて暫時反応させた後、１．５Ｎ リン酸１００μＬを加えて反応を停止し、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果２５クローン中２１クローンに活性が確認された。
これら２１クローンについてＤＮＡ塩基配列を決定したところ、７種類のクローンであることがわかった。ＤＮＡ塩基配列の解析は、ＤＮＡシークエンサー（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用いた公知の方法（ジデオキシ法）により行った。
５−５−３ 免疫蛍光染色法による各クローンの抗原結合活性の比較
５−５−２で得られた７種類のクローンについて抗原結合活性を免疫蛍光染色法により比較した。免疫染色の材料にはＣ．ｅｌｅｇａｎｓの初期胚を用いた。
まず、周知の方法を用いてＣ．ｅｌｅｇａｎｓを飼育し、受精卵を得た。受精卵が初期胚にまで成長した後に、スライドグラス上にとり、−２０℃に冷却したエタノール中にスライドグラスごと１０分間浸した。次に、−２０℃に冷却したアセトンに１０分間浸した。室温に放置し、アセトンが揮発したらＰＢＳに５分間浸した。次いで、５％スキムミルク含有ＰＢＳに１時間浸してブロッキングした。
次に、５−５−２で陽性（活性が認められた）であったサンプル（ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体溶液）の培養上清を５％ スキムミルク含有ＰＢＳで２倍に希釈し、２５μＬを上記で準備したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの結合したスライドグラス上の初期胚に添加し、室温で２時間反応させた。
反応後、抗体液をスライドグラスから除き、洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ）中に室温で１０分間浸して洗浄を行った。洗浄液を取り替えてもう２度同じ操作を繰り返した。
次にウサギ抗ｃｐ３抗体（ｃｐ３タンパク質をウサギに免疫することによって作製）を５％スキムミルク含有ＰＢＳで２００倍希釈したもの２５μＬをスライドグラス上の初期胚に添加し、室温で２時間反応させた。反応が終了したら抗体液をスライドグラスから除き、洗浄液中に室温で１０分間浸して洗浄を行った。洗浄液を取り替えてもう２度同じ操作を繰り返した。
続いて、Ｃｙ３標識抗ウサギＩｇＧ抗体を５％スキムミルク含有ＰＢＳで８００倍希釈したもの２５μＬをスライドグラス上に滴下し、４℃で１晩反応させた。
反応が終了したら、抗体液をスライドグラスから除き、洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ）中に室温で１０分間浸して洗浄を行った。洗浄液を取り替えてもう１度同じ操作を繰り返した。
続いて、５０ｍＬの洗浄液に１ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰＩを１μＬ添加し、この中にスライドグラスを室温で１０分間浸した。
液を吸い取った後、封入剤をのせ、カバーグラスをかけて顕微鏡観察した。
５−５−４ ウエスタンブロットによる各クローンの抗原結合活性の比較
以下に示す周知の方法により５−５−２で得られた各クローンの抗原結合活性を比較した。
ＣＣ０４６精製抗原を１レーンあたり１００ｎｇまたは１０ｎｇ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをメンブレンに転写した。
メンブレンをブロッキングした後、５−５−２で得られた各クローンの培養上清を４倍希釈（５％スキムミルク共存下）にしてメンブレンにのせ、反応させた。
室温で１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗った。洗浄済みのメンブレンに抗ｃｐ３抗体（５００倍希釈、５％スキムミルク共存下）を添加し、室温で１時間反応させた。反応後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗った。
洗浄済みメンブレンにＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（×１０００、ＭＢＬ ｃｏｄｅ Ｎｏ．４５８）を添加し、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗った。
化学発光試薬（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ；Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ，ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）にメンブレンを浸し、ラップに包んで、フィルムに露光した。フィルムを現像して結果を評価した。
以上の結果及び５−５−３の結果より、最も抗原結合活性の高いクローンを選択し（クローンＣＣ０４６Ｎ２と呼ぶ）、以降の実験に用いた。
６．ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体からＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体への変換
６−１ ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体発現用ベクターの作製
図１３のｂ）下段に示されるように、ｐ６×Ｈｉｓ−ＧＦＰベクター（クロンテック製）の開始コドンとＨｉｓ−ｔａｇ配列の間に、ＡｓｃＩサイトを付加して発現用ベクターｐＡｓｃＨＧＦＰを作製した。
このベクターのＡｓｃＩサイトにｓｃＦｖ−ＣＬ遺伝子を挿入することにより、実際の抗体タンパク質発現用のベクターが完成する（図１３のｃ））。このベクターより発現される抗体はｓｃＦｖ−ＣＬ型であり、ＧＦＰはＨｉｓ−ｔａｇを介してＣＬ領域に連結することとなる。
ＡｓｃＩサイトを付加する具体的な操作は以下のように行った。ｐ６×Ｈｉｓ−ＧＦＰ ベクター（０．１ｍｇ／ｍＬ）０．５μＬ，１０×ＬＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒＩＩ １０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ １６μＬ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０μＬ，プライマーＧＦＰＡｓｃＦ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ，プライマーＧＦＰＡｓｃＲ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ，ＬＡ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）１μＬ，滅菌水６０．５μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で５分保温した。９４℃ １分，５５℃ １分，７２℃ ４分を３０サイクル繰り返し、さらに７２℃，７分インキュベートした。
上記と同様の方法により、ＲＦＰ（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を発現させるベクターｐＡｓｃＨＲＦＰを作製することができる。また、これを用いて以下の操作を行えば、ＲＦＰ融合型のｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を発現させることができる。
６−２ クローンＣＣ０４６Ｎ２よりｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子の増幅
クローンＣＣ０４６Ｎ２を用いてＰＣＲ法を行い、ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子を増幅した。この際、ＡｓｃＩサイトを含む２つのプライマーを合成し、これらを用いることにより、ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子部分にコードされるアミノ酸配列を変化させない条件においてＶＨ遺伝子のＮ末端のＳｆｉＩサイトをＡｓｃＩサイトに変換した。図１３のｂ）上段に増幅されたｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子を模式的に示した。
ＰＣＲ法に用いたプライマーを以下に示す。なお、小文字部分がＡｓｃＩ部位である。
クローンＣＣ０４６Ｎ２ ０．５μＬ，１０×ｂｕｆｆｅｒ＃１ １０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ １０μＬ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４μＬ，プライマーＡｓｃ３Ｆ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ，プライマーＡｓｃＲ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ，ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）１μＬ，滅菌水７２．５μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で１分保温した。９４℃ １分，５５℃ １分，７２℃ １分を２５サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、フェノール処理、エタノール沈殿して１０μＬに濃縮した。
得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動で確認後フェノール処理後、エタノール沈殿して１０μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。
６−３ 発現ベクターへのｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子の導入
６−２で得られたＰＣＲ産物を以下の条件で制限酵素処理した。
ＰＣＲ産物１０μＬ
他方、同様に発現用ベクターｐＡｓｃＨＧＦＰ（図１３のｂ）下段）を制限酵素処理し、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。
次に上記処理をしたＰＣＲ産物と発現用ベクターを、１６℃、４時間〜一晩、以下の条件下で反応させることによりライゲーションした。
制限酵素処理したｐＡｓｃＨＧＦＰ ２μＬ
制限酵素処理したＰＣＲ産物 １μＬ
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ
（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅに添付）
１０ｍＭ ＡＴＰ １．５μＬ
滅菌済ＭｉｌｌｉＱ ８μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造１０Ｕ／μＬ）１μＬ
以上の操作の結果得られたベクター（ｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミド）をＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体作製に用いた。ｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミドのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図１４に示した。
７．大腸菌内でのＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の産生
７−１ ｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミドの大腸菌への導入
ｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミドを用いて、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。具体的にはｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミドを１／１０量をＴＥ３μＬに溶解し、これをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ製）２０μＬに懸濁し、エレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーター
ＢＲＬ社Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｃａｔ．ｓｅｒｉｅｓ １６００）
設定条件；ｖｏｌｔａｇｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ４ｋΩ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ３３０μＦ
ＤＣ ｖｏｌｔｓ ＬｏｗΩ
ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｅ Ｆａｓｔ
形質転換用培地（ＳＯＢ）２ｍＬに上記操作の終了した大腸菌を植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、ＴＹＧＡ寒天培地上で培養した。形賀転換体２４クローンについて大腸菌からプラスミドＤＮＡを周知の方法を用いて調製し、制限酵素ＰｖｕＩＩによって切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。その結果（正しい向きの場合は０．３，１．７，４．３ｋｂの長さの断片が得られる）により、挿入されたｓｃＦｖ−ＣＬ遺伝子の向きが正しいクローンを選択した。
８．ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の精製及び解析
８−１ ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の発現誘導及び精製
まず、７−１によって得られたｐｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰプラスミドをもつ大腸菌を１リットルの１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有２×ＹＴ培地に懸濁し、３０℃で培養した。大腸菌の濃度を波長６００ｎｍの吸光度により測定し、ｌｏｇ ｐｈａｓｅになったところで、１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、３０℃でさらに２１時間培養した。次に、培養液を遠心分離して菌体を回収し、菌体に３０ｍＬの５０ｍＭ Ｎａ−リン酸緩衝液／３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８を加え、超音波処理により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、その上清３０ｍＬを平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（ゲル容量２．８ｍＬ）にアプライした。５０ｍＭ リン酸ナトリウム／３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８、２５０ｍＬでカラムを洗浄した後、１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１２０，１５０，２００，２５０ｍＭ イミダゾール１ｍＬで溶出した。各溶出フラクションに波長３６６ｎｍの光を照射し、蛍光を発するフラクション（３０−９０ｍＭ）を選択した。選択したフラクションのタンパク濃度を測定した結果、約２００μｇのタンパク質が得られていた。この精製タンパク質溶液を用いて以下の解析を行った。
８−２ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製タンパク質の解析
８−１で得られた精製タンパク質溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。なお、比較例として、精製前の菌体破砕液（粗抽出液）を用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１５に示した。図１５において、レーン２が精製タンパク質溶液を流したレーンである。また、レーンＭ及びレーン１には、分子量マーカー及び比較例である精製前の菌体破砕液を泳動した。
図１５に示されるように、粗抽出物では夾雑しているタンパク質のため判別できないが、精製タンパク質溶液では濃縮され、予測される位置（矢印で示される位置）にバンドが明らかに検出できた。
８−３ 精製タンパク質のＥＬＩＳＡ法による抗原結合活性（アフィニティー）の測定
８−１で得られた精製タンパク質（ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体）の抗原（ＣＣ０４６）に対する結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。具体的な方法及び条件を以下に示す。
まず、ＥＬＩＳＡ用のプレートを以下のように調製した。抗原２０μｇ／ｍＬを９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに１００μＬ添加して４℃で１８時間結合させたのち、５％ＢＳＡ（ブロッキング液）を各ウェルに２００μＬ添加して３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、ＰＢＳで１回洗浄してアフィニティーの測定に用いた。
このようにして得られたプレートの各ウェルに、８−１で得られた精製タンパク質溶液を倍数希釈したものを１００μＬずつ加え、３７℃１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで４回洗浄し、５０００倍希釈のウサギ抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ社製）１００μＬ加えて３７℃で１時間反応させた。各ウェルをＰＢＳで４回洗浄した後、１００００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭＢＬ製）を１００μＬ加えて、３７℃で１時間反応させた。各ウェルをＰＢＳで４回洗浄した後、発色基質溶液（ＯＰＤ）を１００μＬ加え、前に述べたようにプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、５−５−３におけるｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体と同等の抗原活性が認められた。
８−４ 精製タンパク質溶液を用いた免疫蛍光染色
次に、８−１で得た精製タンパク質溶液に、抗原ＣＣ０４６に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体分子が存在することを証明するために、様々なステージにおけるＣ．ｅｌｅｇａｎｓの胚細胞について免疫蛍光染色を行った。
まず、８−１で得た精製タンパク質溶液（ｓｃＦｖ−ＣＬ−ＧＦＰ）を５％ スキムミルク含有ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、２５μＬを前に述べた要領で準備したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの結合したスライドグラス上に添加し、４℃で１晩反応させた。
次に抗体液をスライドグラスから除き、洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ）中に室温で１０分間浸し、洗浄液を取り替えてもう１度同じ操作を繰り返した。
５０ｍＬの洗浄液に１ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰＩを１μＬ添加し、この中にスライドグラスを室温で１０分間浸した。
液を吸い取ったのち、封入剤をのせ、カバーグラスをかけて顕微鏡観察した。
このようにして調製したサンプルの染色像の観察には、フィルターセットＮｏ．１０（励起フィルターＢＰ４５０−４９０、ダイクロイックミラーＦＴ５１０、バリアフィルターＢＰ５１５−５６５）（Ｚｅｉｓｓ社製）を用いた。尚、ＤＡＰＩによるＤＮＡ染色を同時に行った。
初期胚を観察した結果を図１６のａに示す。矢印Ａ示した部分（中心体部分）にＧＦＰによる蛍光が観察される。即ち、はっきりと抗原ＣＣ０４６を認識する分子の存在が確認される。よって、精製タンパク質溶液中に、ＣＣ０４６を特異的に認識し、かつ蛍光を発するＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の存在が確認された。また、ＣＣ０４６は中心体に局在することがわかる。尚、矢印ｄで示した部分にはＤＡＰＩによる蛍光が観察される。
また、図１６のｂは、５−５で得られたクローンより取得したｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を用いて同様の免疫蛍光染色を行った結果である。この場合には２次抗体として上述のようにウサギ抗ｃｐ３抗体を、３次抗体としてＣｙａｎｉｎ３標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。矢印Ｂで示した部分に蛍光が観察される。尚、矢印Ｄで示した部分にはＤＡＰＩによる蛍光が観察される。
図１６のａとの比較より、ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体よりもＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を用いた方が感度及び解像度の点から優れていることがわかった。尚、ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を用いた場合の染色像の観測には、フィルターセットＮｏ．１５（励起フィルターＢＰ４５６／１２、ダイクロイックミラーＦＴ５８０、バリアフィルターＬＰ５９０）（Ｚｅｉｓｓ社製）を用いた。また、ＧＦＰ融合型の場合と同様にＤＡＰＩによるＤＮＡ染色を同時に行った。
本実施例の方法では、５．の「ＳｃＦｖ−ＣＬ抗体ライブラリーから特定の抗原に特異的に結合するファージの選択」を約２週間で行うことができた。また、６．の「ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体からＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体への変換」から７．の「大腸菌内でのＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の産生」までを約１週間で行うことができた。したがって、最終形態のＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を単離するのに１ヶ月を要しないこととなる。このように、本発明の方法によれば極めて短期間で蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ型の抗体を取得することが可能である。なお、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ型の抗体作製に要する期間は、実験環境によってさらに短縮することができるものである。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想定できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
産業上の利用の可能性
本発明により、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ型の抗体の新規な作製方法が提供される。本発明の作製方法によれば、極めて短期間で所望の抗体を得ることができる。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーとして、生体内の多様性を包含するのに十分なクローン数を有するものを用いることにより、多種多様な抗体を認識可能な抗体が得られる。
また、本発明で得られる蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ型抗体は、特定波長の光の照射によりそれ自体で蛍光を発するため、検出に２次抗体、３次抗体等を必要としない。したがって、本発明で得られる抗体を免疫学的測定方法に利用した場合には、操作工程の簡略化、及び測定時間の短縮化が図れる。また、一般的な酵素免疫測定法では検出（測定）に特別の試薬（基質）を必要とするが、本発明で得られる抗体では特定波長の光の照射のみで検出が可能となるため、生細胞内ないし生体内において直接検出することができる。
また、異なる抗原に対して、異なる蛍光タンパク質を融合した抗体を作製し、これらを同時に用いて免疫染色することにより、同時に多色染色することが可能である。
さらに、イントラボディー技術と組み合わせることにより、生細胞内ないし生体内において特定の機能に関与する抗原分子をリアルタイムに測定することが可能となる。
以上のように、本発明により得られる蛍光タンパクと融合したｓｃＦｖ型抗体は、免疫染色の分野において用途の広い検出試薬に利用できるといえる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の実施例において、可変領域ライブラリーの作製に用いた各種のベクターの構造を模式的に示す図である。
１）ｐＡＡＬＦａｂ：Ｄ１．３ｍｕｔａｔｉｏｎ用ベクター。
２）ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ：Ｅ８発現用ベクター。ｐＡＡＬＦａｂをもとに、制限酵素サイトを改変した。新たにＰｓｔＩ、ＸｂａＩ、およびＫｐｎＩサイトを付加し、ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩサイトの位置を変更した。
３）ｐＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ：重鎖可変領域遺伝子クローニング用ベクター。ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔをもとに、制限酵素サイトを改変した。ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ間を欠落させ、新たにＫｐｎＩ、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩおよびＳｐｅＩサイトを付加した。重鎖可変領域遺伝子をＳｆｉＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニング可能。
４）ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ：重鎖可変領域遺伝子クローニング用ベクター。ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ、およびｐＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄをもとにＤＮＡ配列を改変した。マウスγＣＨ１をヒトγＣＨ１で置きかえた。新たに、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩ、およびＡｓｃＩサイトを付加した。軽鎖可変領域をＳｆｉＩ−ＡｓｃＩサイトにクローニング可能。
図２は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの塩基配列を示す図である。
図３は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（１）。
図４は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（２）。
図５は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（３）。
図６は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの塩基配列を示す図である。
図７は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（１）。
図８は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（２）。
図９は、ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子ライブラリーの調製に用いたベクターｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄの構造を模式的に示した図。
図１０は、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す図（１）。
図１１は、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す図（２）。
図１２は、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す図（３）。
図１３は、本発明の実施例における操作手順を示した図。ａ）に示すのは、ＡＩＭＳ−５ライブラリーを構成するクローンにおけるｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の遺伝子の模式図。ｂ）に示すのは、ＰＣＲによってｓｃＦｖ−ＣＬ抗体のコードされた領域のＤＮＡを増幅し、ＰＣＲ産物をｐＡｓｃＨＧＦＰベクターに組み込むことを表す模式図。ｂ）の上段にＰＣＲ産物（増幅されたｓｃＦｖ−ＣＬ抗体遺伝子）、同下段にｐＡｓｃＨＧＦＰベクターが表される。ｃ）に示すのは、ｂ）の操作により得られる、ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体発現用ベクターである。
図１４は、ｓｃＦｖ（ＣＣ０４６Ｎ２）−ＣＬ−ＧＦＰのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列。メチオニンを含む３アミノ酸のあとに、ＶＨドメイン−リンカー−Ｖλドメイン−Ｃλドメイン−Ｈｉｓ−ｔａｇ−ＧＦＰという順に並んでいる構造となっている。Ｖドメインの番号およびＣＤＲの位置については、Ｋａｂａｔの決め方に従った。Ｖλドメインの１０番目のアミノ酸は欠失している。
図１５は、大腸菌で発現させたＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した結果（ゲル）を示す図である。レーンＭは分子量マーカーを、レーン１は粗抽出液を、レーン２は精製タンパク質をそれぞれ流した結果である。染色は、クーマシーブリリアントブルーで行った。矢印は、ＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体の位置を示す。
図１６は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの初期胚を、ＣＣ０４６に特異的な２種類の形態のｓｃＦｖ−ＣＬ抗体で染色した図。ａ）はＧＦＰ融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ−ＧＦＰで直接染色した図（矢印Ａで示した部分にＧＦＰの蛍光が観察される。また、矢印ｄで示した部分にはＤＡＰＩによる蛍光が観察される）。ｂ）は、ｃｐ３融合型ｓｃＦｖ−ＣＬ抗体を反応させた後、２次抗体（ウサギ抗ｃｐ３抗体）と３次抗体（Ｃｙａｎｉｎ３標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体）を反応させて検出した図（矢印Ｂで示した部分にＣｙａｎｉｎ３の蛍光が観察される。また、矢印Ｄで示した部分にはＤＡＰＩによる蛍光が観察される。）。
Claims (21)
- 以下の工程を含む、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体の作製方法。
１）ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製する工程、
２）前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを抗原でスクリーニングすることにより、該抗原に結合可能なｓｃＦｖ抗体を発現しているファージクローンを選択する工程、
３）工程２）で選択したファージクローンより、ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子を取得する工程、
４）工程３）で取得した遺伝子を組込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能な発現ベクターに、該遺伝子を組込む工程、及び
５）工程４）で得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、前記融合タンパク質を発現させる工程。 - 前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、重鎖可変領域と機能的なコンフォーメーションを再構成するように選択された軽鎖可変領域を少なくとも一部分含んで成る、ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のｓｃＦｖ抗体の作製方法。
- 前記ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを構成する各ファージクローン表面のｓｃＦｖ抗体は、ＶＨ領域、ＶＬ領域、リンカー及びＣＬ領域を有する、ことを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載のｓｃＦｖ抗体の作製方法。
- 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のｓｃＦｖ抗体の作製方法。
- 請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の方法により作製される、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体。
- ＶＨ領域、ＶＬ領域、及びリンカーにより構成されるＦｖ領域、ＣＬ領域、並びに該Ｆｖ領域に該ＣＬ領域を介して連結される蛍光タンパク質を有してなる、ことを特徴とする蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体。
- 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする請求の範囲第６項に記載のｓｃＦｖ抗体。
- 請求の範囲第５項乃至第７項のいずれかに記載のｓｃＦｖ抗体を用いた免疫学的測定方法。
- 請求の範囲第１項に記載の工程１）〜４）により取得される、ｓｃＦｖ抗体遺伝子、及び蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有する組換えベクター。
- 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子はＶＨ遺伝子、リンカー配列、ＶＬ遺伝子、及びＣＬ遺伝子からなる、ことを特徴とする、請求の範囲第９項に記載の組換えベクター。
- 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする請求の範囲第９項又は第１０項に記載の組換えベクター。
- 以下の構造を有する組み換えベクター。
- ５’側より順に、開始コドン、ｓｃＦｖ抗体遺伝子を導入する部位、及び蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクター。
- 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子は、ＶＨ遺伝子、リンカー配列、ＶＬ遺伝子、及びＣＬ遺伝子からなる、ことを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の発現ベクター。
- 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子を導入する部位と前記蛍光タンパク質をコードする塩基配列との間にＨｉｓ−ｔａｇ、ｍｙｃ−ｔａｇ、又はＨＡ−ｔａｇをコードする塩基配列を有する、ことを特徴とする請求の範囲第１３項又は第１４項に記載の発現ベクター。
- 前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ及びこれらの変異体の中から選択される１又は２以上の蛍光タンパク質である、ことを特徴とする請求の範囲第１３項乃至第１５項のいずれかに記載の発現ベクター。
- ｓｃＦｖ抗体をその表面に発現しているファージクローンにより構成されるｓｃＦｖ抗体ライブラリー、及び
ｓｃＦｖ抗体遺伝子を組み込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクター、を含む、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体作製用キット。 - 前記ｓｃＦｖ抗体はＶＨ領域、ＶＬ領域、リンカー、及びＣＬ領域から構成される、ことを特徴とする請求の範囲第１７項に記載のキット。
- ｓｃＦｖ抗体遺伝子を有するファージクローン又はファージミドクローンから構成されるｓｃＦｖ抗体遺伝子ライブラリー、及び
ｓｃＦｖ抗体遺伝子を組み込むことにより該遺伝子の発現産物と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクター、を含む、蛍光タンパク質を融合したｓｃＦｖ抗体作製用キット。 - 前記ｓｃＦｖ抗体遺伝子はＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子、リンカー配列、及びＣＬ遺伝子から構成される、ことを特徴とする請求の範囲第１９項に記載のキット。
- 前記ベクターは請求の範囲第１３項乃至第１６項のいずれかに記載される発現ベクターである、ことを特徴とする請求の範囲第１７項乃至第２０項のいずれかに記載のキット。
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