JP6875411B2 - イオン交換クロマトグラフィーを用いた一塩基置換検出方法 - Google Patents
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Description
〔1〕
2種類以上のアレル特異的プライマーを用いて増幅された2種類以上の遺伝子増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて判別する方法であって、前記2種類以上のアレル特異的プライマーの少なくとも一つの5’末端が、非ヌクレオチド成分を付加されていることを特徴とする、遺伝子変異を検出する方法: ここで、当該非ヌクレオチド成分は、好ましくは、ヒドロキシ基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、チオール基、スルホン酸基、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、及びヨード基からなる群から選択されるイオン性官能基、又は、当該イオン性官能基を少なくとも1つ以上含む分子であり、更に好ましくは、表1に示される蛍光物質であり、かつ、当該遺伝子増幅産物の大きさの差は、好ましくは、0塩基対、1塩基対、2塩基対、3塩基対、4塩基対、5塩基対、6塩基対、7塩基対、8塩基対、9塩基対、又は10塩基対であり、より好ましくは、0塩基対、1塩基対、又は2塩基対であり、更に好ましくは、0塩基対である。
〔2〕
イオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーである上記〔1〕に記載の検出方法。
〔3〕
非ヌクレオチド成分が、プライマーの5’末端の電荷に変化を引き起こさせる物質である上記〔1〕又は〔2〕に記載の検出方法。
〔4〕
以下の工程を含む、試料中の二本鎖デオキシリボ核酸に含まれる多型部位における少なくとも一つのアレルの存在を検出する方法:
(a)多型部位を含む二本鎖デオキシリボ核酸を含む試料を提供する工程;
(b)第1のプライマー、第2のプライマー、及び第3のプライマーを提供する工程、
ここで、第1のプライマーの配列は、当該多型部位において第1のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖に相補的でありかつ3'末端の3つの塩基の何れか1つ又は2つ又は3つの塩基或いは3'末端の2つの塩基の一方又は両方の塩基が当該多型部位に対応し、
第2のプライマーの配列は、当該多型部位において第2のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖に相補的でありかつ3'末端の3つの塩基の何れか1つ又は2つ又は3つの塩基或いは3'末端の2つの塩基の一方又は両方の塩基が当該多型部位に対応し、
第3のプライマーの配列は、当該多型部位を含まずかつ当該二本鎖デオキシリボ核酸の第1の鎖に相補的であり、
第1のプライマー及び第2のプライマーの少なくとも1つが、非ヌクレオチド成分を付加されている、
ここで、当該非ヌクレオチド成分は、好ましくは、ヒドロキシ基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、チオール基、スルホン酸基、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、及びヨード基からなる群から選択されるイオン性官能基、又は、当該イオン性官能基を少なくとも1つ以上含む分子であり、更に好ましくは、表1に示される蛍光物質である;
(c)ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
ここで、当該ポリメラーゼ連鎖反応は、第1のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖にハイブリダイズした第1のプライマーからのポリメラーゼによる鎖の伸長が、第1のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖にハイブリダイズした第2のプライマーからのポリメラーゼによる鎖の伸長と比較して優先的に生じ、かつ、第2のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖にハイブリダイズした第2のプライマーからのポリメラーゼによる鎖の伸長が、第2のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖にハイブリダイズした第1のプライマーからのポリメラーゼによる鎖の伸長と比較して優先的に生じる条件で行われる;
(d)当該ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーに掛ける工程、ここで、好ましくは、イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーである;
ここで、第1のプライマー及び第3のプライマーからのポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物と第21のプライマー及び第3のプライマーからのポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物の大きさの差は、0塩基対、1塩基対、2塩基対、3塩基対、4塩基対、5塩基対、6塩基対、7塩基対、8塩基対、9塩基対、又は10塩基対であり、より好ましくは、0塩基対、1塩基対、又は2塩基対であり、更に好ましくは、0塩基対である;及び
第1及び第2のアレルの一方又は両方の存在を前記増幅産物の溶出位置又は溶出時間に基づいて検出する工程。
〔5〕
前記(a)の工程が、ヒトなどの哺乳類体細胞検体からゲノムDNAを抽出する工程である、上記〔4〕に記載の方法。
〔6〕
前記多型部位が、UGT1A1*28多型(rs8175347)、UGT1A1*6多型(rs4148323)、JAK2 1849G>T (V617F)変異部位(rs77375493)、MPL 1589G>T (W515L)変異部位(rs121913615)、又はMPL 1588:1599TG>AA (W515K)変異部位(rs121913616)である、上記〔4〕又は〔5〕に記載の方法。
〔7〕
前記非ヌクレオチド成分が、プライマーの5’末端の電荷に変化を引き起こさせる物質である、上記〔4〕〜〔6〕の何れかに記載の方法。
〔8〕
第3のプライマーが非ヌクレオチド成分を付加されている、上記〔4〕〜〔7〕の何れかに記載の方法:
ここで、当該非ヌクレオチド成分は、好ましくは、ヒドロキシ基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、チオール基、スルホン酸基、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、及びヨード基からなる群から選択されるイオン性官能基、又は、当該イオン性官能基を少なくとも1つ以上含む分子であり、更に好ましくは、表1に示される蛍光物質である。
これら修飾物質の効果は、アレル特異的プライマーを用いて増幅された遺伝子増幅産物の長さを至適化することで、さらに発揮される。即ち、同じ修飾物質であっても、遺伝子増幅産物の長さが短いほどのその違いが顕著に表れる。従って、本発明では、5’末端に非ヌクレオチド成分が付加されたアレル特異的プライマーを用いて増幅された遺伝子増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析又は判別する際に、非ヌクレオチド成分の種類だけでなく、遺伝子増幅産物の長さを適切に組み合わせることによって、本発明の効果を最大限に発揮することが可能となる。
5’-GTTGTACATCAGAGACGAA-3’
5’-CTGCTGCTGCTGAGGTTTC-3’
5’-CTGCTGCTGCTGAGGAA-3’
5’-TGCTGCTGCTGAGCGC-3’
5’-GGCGGTACCTGTAGTGTGC-3’
5’-Biotin-CTGCTGCTGCTGAGGAA-3’
5’-NH2-CTGCTGCTGCTGAGGAA-3’
5’-Cy3.5-CTGCTGCTGCTGAGGAA-3’
以下の試薬を含む25μLの反応溶液を調製し、CFX96(バイオラッド社)にて2ステップのアレル特異的PCRによる増幅を行った。
Claims (5)
- 2種類以上のアレル特異的プライマーを用いて増幅された2種類以上の遺伝子増幅産物を、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて判別する方法であって、前記アレル特異的プライマー若しくはそれと対をなすプライマーの少なくとも一方の5’末端が、非ヌクレオチド成分を付加されていることを特徴とする、遺伝子変異を検出する方法: ここで、当該非ヌクレオチド成分は、ヒドロキシ基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、チオール基、スルホン酸基、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、及びヨード基からなる群から選択されるイオン性官能基、又は、当該イオン性官能基を少なくとも1つ以上含む分子であり、かつ、当該遺伝子増幅産物の大きさの差は、0塩基対、1塩基対、又は2塩基対である。
- 以下の工程を含む、試料中の二本鎖デオキシリボ核酸に含まれる多型部位における少なくとも一つのアレルの存在を検出する方法:
(a)多型部位を含む二本鎖デオキシリボ核酸を含む試料を提供する工程;
(b)第1のプライマー、第2のプライマー、及び第3のプライマーを提供する工程、
ここで、第1のプライマーの配列は、当該多型部位において第1のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖に相補的でありかつ3'末端の3つの塩基の何れか1つ又は2つ又は3つの塩基或いは3'末端の2つの塩基の一方又は両方の塩基が当該多型部位に対応し、
第2のプライマーの配列は、当該多型部位において第2のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖に相補的でありかつ3'末端の3つの塩基の何れか1つ又は2つ又は3つの塩基或いは3'末端の2つの塩基の一方又は両方の塩基が当該多型部位に対応し、
第3のプライマーの配列は、当該多型部位を含まずかつ当該二本鎖デオキシリボ核酸の第1の鎖に相補的であり、
第1のプライマー及び第2のプライマーの少なくとも1つが、非ヌクレオチド成分を付加されている、
ここで、当該非ヌクレオチド成分は、ヒドロキシ基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、チオール基、スルホン酸基、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、及びヨード基からなる群から選択されるイオン性官能基、又は、当該イオン性官能基を少なくとも1つ以上含む分子である;
(c)ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
ここで、当該ポリメラーゼ連鎖反応は、第1のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖にハイブリダイズした第1のプライマーからのポリメラーゼによる鎖の伸長が、第1のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖にハイブリダイズした第2のプライマーからのポリメラーゼによる鎖の伸長と比較して優先的に生じ、かつ、第2のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖にハイブリダイズした第2のプライマーからのポリメラーゼによる鎖の伸長が、第2のアレルを持つ二本鎖デオキシリボ核酸の第2の鎖にハイブリダイズした第1のプライマーからのポリメラーゼによる鎖の伸長と比較して優先的に生じる条件で行われる;
(d)当該ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物をアニオン交換クロマトグラフィーに掛ける工程;
ここで、第1のプライマー及び第3のプライマーからのポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物と第2のプライマー及び第3のプライマーからのポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物の大きさの差は、0塩基対、1塩基対、又は2塩基対である;及び
(e)第1及び第2のアレルの一方又は両方の存在を前記増幅産物の溶出位置又は溶出時間に基づいて検出する工程。 - 前記(a)の工程が、ヒトなどの哺乳類体細胞検体からゲノムDNAを抽出する工程である、請求項2に記載の方法。
- 前記多型部位が、UGT1A1*28多型(rs8175347)、UGT1A1*6多型(rs4148323)、JAK2 1849G>T (V617F)変異部位(rs77375493)、MPL 1589G>T (W515L)変異部位(rs121913615)、又はMPL 1588:1599TG>AA (W515K)変異部位(rs121913616)である、請求項2又は3に記載の方法。
- 第3のプライマーが非ヌクレオチド成分を付加されている、請求項2〜4
の何れかに記載の方法:
ここで、当該非ヌクレオチド成分は、ヒドロキシ基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、チオール基、スルホン酸基、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、及びヨード基からなる群から選択されるイオン性官能基、又は、当該イオン性官能基を少なくとも1つ以上含む分子である。
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