CN112941171A - 一种检测mpl基因w515l、w515s和w515a突变的引物探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针及其应用，所述引物探针组合物包括针对MPL基因W515L、W515S和W515A突变的PCR上游引物、PCR下游引物和探针；所述PCR下游引物的3’端末1位碱基与MPL基因W515L、W515S和W515A突变位点互补；所述PCR下游引物的3’端末2位碱基为错配碱基。本发明根据MPL基因W515L、W515S和W515A突变位点设计特异性引物探针，不需要多重PCR、实现了采用一对引物探针在一个反应体系中同时检测MPL基因W515L、W515S和W515A三种突变的效果，在MPL基因突变检测领域具有重要的应用前景。

Description

一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针及其应用。
背景技术
促血小板生成素受体(MPL)属于造血因子受体家族，与配体结合能够激活JAK-STAT等信号转导途径，对调节髓细胞的增生和巨核细胞的成熟具有重要作用。目前，已发现多种MPL基因突变类型，3％～5％的原发性血小板增多症(ET)和5％～10％的原发性骨髓纤维化(PMF)存在MPL基因突变。
MPL W515存在多种突变类型，目前已知的主要有MPL W515L、MPL W515S、MPLW515A、MPL W515K、MPL W515R等。传统的MPL检测方法为Sanger测序法，存在操作繁琐、检测时间长、灵敏度低的问题；二代测序虽然有较高的灵敏度，但是同样存在操作繁琐、检测时间长、成本高的问题。
现有的荧光定量PCR检测方法，在一个反应体系中通常只能检测一种突变类型，当检测多种突变类型时，需要配制多个反应体系才能完成检测。多重PCR可以实现在一个反应体系中检测多种突变的效果，例如，CN112410407A公开了同时检测两种或三种MPN致病基因突变的引物组以及包含该引物组的试剂盒，所述引物组包括两对引物，其中第一对引物为JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R，第二对引物为MPL-F和MPL-R。但是多重PCR涉及多对引物，需要反复优化反应体系，且对PCR反应酶的要求较高，多对引物间的相互干扰可能降低检测的灵敏度或特异性。
因此，需要一种能够快速简便、灵敏特异检测MPL基因常见突变类型的试剂盒。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针及其应用，所述引物探针基于荧光定量PCR，在一个反应体系中同时检测MPL W515L/S/A三种突变类型，简便快速，灵敏度高，特异性好，成本低廉。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括针对MPL基因W515L、W515S和W515A突变的PCR上游引物、PCR下游引物和探针；
所述PCR下游引物的3’端末1位碱基与MPL基因W515L、W515S和W515A突变位点互补；
所述PCR下游引物的3’端末2位碱基为错配碱基。
本发明中，采用3’末1位碱基与突变位点互补、3’端末2位碱基为错配碱基的引物进行PCR扩增，实现了仅扩增突变型MPL基因、不扩增野生型MPL基因的效果，利用荧光标记的特异性探针对PCR产物进行检测，实现了在一个反应体系中利用一对引物探针检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的效果。
优选地，根据MPL基因W515L、W515S和W515A突变碱基，将PCR下游引物的3’末1位碱基设计为突变碱基的互补简并碱基R(A/G)，实现了利用一对引物探针同时检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的效果。
优选地，所述探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、Cy3或Cy5中的任意一种。
优选地，所述淬灭基团包括BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB或TAMRA中的任意一种。
优选地，根据PCR下游引物的位置设计PCR上游引物，所述PCR上游引物包括SEQ IDNO:1所示的核酸序列，Tm值为58.7℃，GC含量61％，扩增片段长度为168bp；
SEQ ID NO:1：TAGGGGCTGGCTGGATGA。
优选地，所述PCR下游引物包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列，Tm值为55.8℃，GC含量50％；
SEQ ID NO:2：CCTGTAGTGTGCAGGAAACTGTR。
优选地，所述探针包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列，优选为在探针的5’端修饰FAM，3’端修饰MGB；
SEQ ID NO:3：CCCTTTTTGTCTCCTAGCCT。
第二方面，本发明提供了一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物探针组合物。
优选地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、UDG酶、dNTP或dUTP中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供了一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的体系，所述体系包括第一方面所述的引物探针组合物。
优选地，所述体系还包括DNA聚合酶、UDG酶、dNTP或dUTP中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述引物探针组合物中的PCR上游引物在所述体系中的终浓度为200～1000nM，例如可以是200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1000nM，优选为600nM。
优选地，所述引物探针组合物中的PCR下游引物在所述体系中的终浓度为200～1000nM，例如可以是200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1000nM，优选为600nM。
优选地，所述引物探针组合物中的探针在所述体系中的终浓度为100～500nM，例如可以是100nM、200nM、300nM、400nM或500nM，优选为200nM。
优选地，所述DNA聚合酶在所述体系中的终浓度为0.1～0.5U/μL，例如可以是0.1U/μL、0.2U/μL、0.3U/μL、0.4U/μL或0.5U/μL，优选为0.14U/μL。
优选地，所述UDG酶在所述体系中的终浓度为0.01～0.05U/μL，例如可以是0.01U/μL、0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL或0.05U/μL，优选为0.012U/μL。
优选地，所述dNTP在所述体系中的终浓度为100～400μM，例如可以是100μM、200μM、300μM或400μM，优选为200μM。
优选地，所述dUTP在所述体系中的终浓度为200～600μM，例如可以是200μM、300μM、400μM、500μM或600μM，优选为400μM。
第四方面，本发明提供了一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的方法，所述方法包括：
将待测DNA加入第三方面所述的体系中，40～60℃预处理1～5min；92～98℃预变性1～5min；92～98℃变性10～30s，55～65℃退火延伸0.5～2min，40～50个循环。
第五方面，本发明提供了一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的装置，所述装置包括：
体系配制单元：用于配制第三方面所述的体系；
检测单元：用于将待测DNA加入配制的体系中，40～60℃预处理1～5min；92～98℃预变性1～5min；92～98℃变性10～30s，55～65℃退火延伸0.5～2min，40～50个循环。
第六方面，本发明提供了第一方面所述的引物探针组合物、第二方面所述的试剂盒、第三方面所述的体系或第五方面所述的装置在制备MPL基因突变检测产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明根据MPL基因W515L、W515S和W515A突变位点设计特异性引物探针，与优化的反应体系相互配合，实现了采用一对引物探针对MPL W515L、MPL W515S、MPL W515A三种突变类型的快速检测，覆盖的检测范围更大，操作更简单，无需进行多重PCR，对原材料的要求低，避免了多对引物间的干扰。
(2)本发明基于荧光定量PCR技术进行MPL基因W515L、W515S和W515A突变位点的同时检测，与测序法相比，检测速度快，灵敏度高，特异性好，为闭管检测，污染几率低，在MPL基因突变检测中具有重要的应用前景。
附图说明
图1为MPL基因W515L参考品的荧光定量PCR曲线图，图中曲线根据Ct值由低到高依次为10000拷贝样本、1000拷贝样本、100拷贝样本、10拷贝样本；
图2为MPL基因W515S参考品的荧光定量PCR曲线图，图中曲线根据Ct值由低到高依次为10000拷贝样本、1000拷贝样本、100拷贝样本、10拷贝样本；
图3为MPL基因W515A参考品的荧光定量PCR曲线图，图中曲线根据Ct值由低到高依次为10000拷贝样本、1000拷贝样本、100拷贝样本、10拷贝样本；
图4为10000拷贝野生型MPL基因参考品的荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例以人类基因组DNA序列(NCBI：NC_000001.11)为模板，设计检测MPL基因W515L/S/A突变的引物探针，并构建W515L、W515S、W515A三种突变质粒。
其中，特异性PCR下游引物的3’端末1位碱基为简并碱基R，3’端末2位碱基为错配碱基，序列为5’-CCTGTAGTGTGCAGGAAACTGTR-3’(SEQ ID NO:2)，Tm值为55.8℃，GC含量为50％；
根据特异性PCR下游引物的位置，设计PCR上游引物，序列为5’-TAGGGGCTGGCTGGATGA-3’(SEQ ID NO:1)，Tm值为58.7℃，GC含量为61％，扩增片段长度为168bp；
在扩增片段内设计荧光探针，5’端用FAM标记，3’端用MGB标记，序列为5’-FAM-CCCTTTTTGTCTCCTAGCCT-MGB-3’(SEQ ID NO:3)，Tm值为70℃，GC含量为50％。
实施例2
根据设计的引物探针配制表1所示的反应体系，反应体系配制完成后，分装至8联管中，使用ABI 7500荧光定量PCR仪进行扩增，扩增条件如表2所示。
表1
试剂 原浓度 终浓度 1×加入体积
2×PCR缓冲液 2× 1× 12.5μL
dNTP 33mM 0.2mM 0.15μL
dUTP 100mM 0.4mM 0.1μL
PCR上游引物 10μM 600nM 1.5μL
特异性PCR下游引物 10μM 600nM 1.5μL
荧光探针 10μM 200nM 0.5μL
热启动Taq DNA聚合酶 5U/μL 3.5U/25μL 0.7μL
UDG酶 1U/μL 0.3U/25μL 0.3μL
基因组DNA模板 10ng/μL 20ng/25μL 2μL
ddH<sub>2</sub>O NA NA 补至25μL(5.75μL)
表2
Figure BDA0003000165860000071
Figure BDA0003000165860000081
扩增结束后进行结果分析，设置阈值为75000，样本分别为W515L质粒参考品和野生型MPL基因的混合物、W515S质粒参考品和野生型MPL基因的混合物、W515A质粒参考品和野生型MPL基因的混合物或野生型MPL基因的荧光定量PCR曲线分别如图1、图2、图3和图4所示，可以看出，本发明可以在同一个反应体系中同时检测出MPL W515L、MPL W515A、MPLW515S三种突变，最低可检测10拷贝/μL的样本，同时保持良好的特异性(野生型样本无非特异扩增)。
综上所述，本发明根据MPL基因W515L、W515S和W515A突变位点设计特异性引物探针，与优化的反应体系相互配合，实现了采用一对引物探针对MPL W515L、MPL W515S、MPLW515A三种突变类型的快速检测，灵敏度高，特异性好；与现有的MPL荧光定量PCR检测方法相比，实现了一孔检测多种突变类型的效果，覆盖的检测范围更大，操作更简单，无需进行多重PCR，对原材料的要求低，避免了多对引物间的干扰。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 迈杰转化医学研究（苏州）有限公司
<120> 一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针及其应用
<130> 20210318
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccctttttgt ctcctagcct 20

Claims (10)

1.一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括针对MPL基因W515L、W515S和W515A突变的PCR上游引物、PCR下游引物和探针；
所述PCR下游引物的3’端末1位碱基与MPL基因W515L、W515S和W515A突变位点互补；
所述PCR下游引物的3’端末2位碱基为错配碱基。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述PCR下游引物的3’端末1位碱基为简并碱基R。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团；
优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、Cy3或Cy5中的任意一种；
优选地，所述淬灭基团包括BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB或TAMRA中的任意一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的引物探针组合物，其特征在于，所述PCR上游引物包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；
优选地，所述PCR下游引物包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
优选地，所述探针包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
5.一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的引物探针组合物；
优选地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、UDG酶、dNTP或dUTP中的任意一种或至少两种的组合。
6.一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的体系，其特征在于，所述体系包括权利要求1-4任一项所述的引物探针组合物；
优选地，所述体系还包括DNA聚合酶、UDG酶、dNTP或dUTP中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求6所述的体系，其特征在于，所述引物探针组合物中的PCR上游引物在所述体系中的终浓度为200～1000nM；
优选地，所述引物探针组合物中的PCR下游引物在所述体系中的终浓度为200～1000nM；
优选地，所述引物探针组合物中的探针在所述体系中的终浓度为100～500nM；
优选地，所述DNA聚合酶在所述体系中的终浓度为0.1～0.5U/μL；
优选地，所述UDG酶在所述体系中的终浓度为0.01～0.05U/μL；
优选地，所述dNTP在所述体系中的终浓度为100～400μM；
优选地，所述dUTP在所述体系中的终浓度为200～600μM。
8.一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的方法，其特征在于，所述方法包括：
将待测DNA加入权利要求6或7所述的体系中，40～60℃预处理1～5min；92～98℃预变性1～5min；92～98℃变性10～30s，55～65℃退火延伸0.5～2min，40～50个循环。
9.一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的装置，其特征在于，所述装置包括：
体系配制单元：用于配制权利要求6或7所述的体系；
检测单元：用于将待测DNA加入配制的体系中，40～60℃预处理1～5min；92～98℃预变性1～5min；92～98℃变性10～30s，55～65℃退火延伸0.5～2min，40～50个循环。
10.权利要求1-4任一项所述的引物探针组合物、权利要求5所述的试剂盒、权利要求6或7所述的体系或权利要求9所述的装置在制备MPL基因突变检测产品中的应用。
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