BG1494U1 - Средство за in vitro определяне на w515a/k/l/r мутации на mpl гена в кръвна проба - Google Patents

Abstract

Средство за in vitro определяне на W515A/K/L/R мутации в MPL гена в кръвна проба, приложимо в рутинната клинична практика с оглед навременното диагностициране на хронични миелопролиферативни заболявания при хората. То позволява осъществяване на директна хибридизация с алел-специфични олигонуклеотиди, свързани с маркирани микросфери (Luminex TM), така че приложено на цяла кръвна проба, окончателните резултати в клиничното диагностициране да се получат в рамките на по-малко от 5 h.

Description

Област на техниката

Полезният модел се отнася до средство за in vitro определяне на W515 A/K/L/R мутации на гена за миелопролиферативна левкемия (MPL) в кръвна проба, приложим в рутинната клинична практика с оглед навременното диагностициране на хронични миелопролиферативни заболявания при хората.

Предшестващо състояние на техниката

Мутациите на човешкия MPL ген, засягащи кодона, кодиращ аминокиселинната позиция W515, са установени при група хематологични малигнени заболявания, предимно есенциална тромбоцитемия (ЕТ) и първична миелофиброза (PMF), които се характеризират с лоша прогноза и налагат адекватни медицински грижи. Ето защо достъпността на клинични маркери за ранното им установяване в кръвни проби на пациентите е от особено значение за навременно диагностициране на заболяванията и адекватната лекарска намеса.

Заявка за патент US 2011/0020805 А1 предлага in vitro определяне на мутации в кодон 515 на гена MPL с помощта на PCR амплификация на геномна ДНК, като същевременно се описва и кит за осъществяване на мутационен анализ. Последният съдържа специфични маркирани генетични сонди, прави и обратни праймери, както и MPL генен фрагмент, включен в плазмид. Определянето на мутациите, съгласно тази заявка за патент, се основава на т. нар. тестове “Real Time” и “Light Cycler”, което, обаче е изключително трудоемко, защото изисква множество повторения на PCR амплификацията в реално време и изисква наличие на оборудване, което е достъпно само в някои молекулярно-биологични лаборатории.

Техническа същност на полезния модел

Задача на полезния модел е да се създаде средство за in vitro определяне на W515 A/K/L/R мутации на MPL гена в кръвна проба, което да е лесно приложимо в рутинната клинична практика с оглед навременното диагностициране на хората.

По своята същност, средството за in vitro определяне на W515 A/K/L/R мутации на MPL гена в кръвна проба, съгласно полезния модел, представлява контейнер от какъвто и да е тип, съдържащ:

- ампула с ДНК амплификационна смес, включваща буфер, ДНК полимераза и два специфични за MPL олигонуклеотидни праймери, от които поне единият е маркиран с биотин;

- ампула, съдържаща флуоресцентно маркирани микросфери, натоварени със специфични олигонуклеотидни сонди за детекция на мутациите MPL W515A/L/K/R;

- ампула, съдържаща фикоеритрин, свързан ковалентно със стрептавидин;

- пет ампули с референтна ДНК, съдържащи съответно по 1 microg/microl от дивия тип MPL и от мутациите W515A, W515L, W515K и W515R;

- ампула, съдържаща хибридизационен буфер и

- ампула, съдържаща буфер за промиване.

От своя страна, специфичните олигонуклеотидни сонди за детекция на мутациите на MPL W515, свързани с флуоресцентно маркирани микросфери, които позволяват детекция с флоуцитометрична система, са представени от:

(а) олигонуклеотидна сонда със секвенция 5'-GAAACTGCCACCTCAGCA-3 (за дивия тип MPL) (б) олигонуклеотидна сонда със секвенция 5-GAAACTGCGCCCTCAGCA-3 (за мутацията W515 А) (в) олигонуклеотидна сонда със секвенция 5'-GAAACTGCTTCCTCAGCAG-3 (за мутацията W515K) (г) олигонуклеотидна сонда със секвенция 5-GAAACTGCAACCTCAGCAG-3 (за мутацията W515L) (д) олигонуклеотидна сонда със секвенция 5-GAAACTGCCTCCTCAGCAG-3 (за мутацията W515R).

MPL олигонуклеотидните праймери, маркирани с биотин в 5'-края, са представени от:

a) олигонуклеотиден праймер със секвенция 5-TAGCCTGGATCTCCTTGGTG

b) олигонуклеотиден праймер със секвенция 5-AGAGGTGACGTGCAGGAAGT-3.

В този състав средството, съгласно полезния модел, позволява осъществяване на директна хибридизация с алел-специфични олигонуклеотиди, свързани с маркирани микросфери (Luminex ТМ), така че приложено на цяла кръвна проба, окончателните резултати в клиничното диагностициране да се получат в рамките на по-малко от 5 h; то позволява бързо и точно количествено определяне на най-честите мутации, засягащи MPL гена и асоциирани с хронични миелопролиферативни заболявалия, да се провежда с аналитична чувствителност от 1 %, което е от изключително значение за диагнозата, прогнозата и назначаването на адекватно лечение на пациентите; позволява едновременното изследване на много проби в плаки, съдържащи 96 или 386 гнезда с различни проби; съставът на средството може допълнително да се допълва със сонди, микросфери и други праймери, така че да позволи едновременното откриване на всички известни или в бъдеще описани мутации, свързани с хронични миелопролиферативни заболявалия,

Пояснение на приложените фигури

Фигура 1 представя аналитичната чувствителност на средството;

фигура 2 представя прага за отделяне на положителни проби за отделните мутации.

Средството за определяне на W515A/K/ L/R мутации в човешкия MPL ген, съгласно настоящия полезен модел, се илюстрира със следните примерни изпълнения, без да ограничават неговия обем.

Пример 1.

Средството за in vitro определяне на W515A/K/L/R мутации в човешкия MPL ген, съгласно полезния модел, представлява контейнер от какъвто и да е вид, съдържащ ампула с 5 вида флуоресцентно маркирани микросфери в разтвор (Tris EDTA буфер с pH 8,0) с обща концентрация 960 бр. за една ДНК проба, като първия вид микросфери са конюгирани с 10 pmol олигонуклеотидна сонда със секвенция 5'GAAACTGCCACCTCAGCA-3 (за дивия тип MPL). Вторият вид - олигонуклеотидна сонда със секвенция 5-GAAACTGCGCCCTCAGCA-3 (за мутацията W515А), третият вид с олигонуклеотидна сонда със секвенция 5'-GAAA CTGCTTCCTCAGCAG-3 (за мутацията W515K), четвъртият вид - с олигонуклеотидна сонда със секвенция 5'-GAAACTGCAACCTCAGCAG-3 (за мутацията W515L), и петият вид с - олигонуклеотидна сонда със секвенция 5'-GAAAC TGCCTCCTCAGCAG-3 (за мутацията W515R).

В отделна ампула е поместена ДНК амплификационна смес, която за реакция от 25 microl включва 2,5 microl PCR буфер (Invitrogen), 1,5 U Taq полимераза (Invitrogen); 3 mM MgCl₂; 0,2 тМ dNTP смес, 10 pmol MPL олигонуклеотиден праймер със секвенция 5-TAGCCTGGATCTC CTTGGTG, който е маркиран с биотин в 5'-края, и 10 pmol MPL олигонуклеотиден праймер S’AGAGGTGACGTGCAGGAAGT, който е маркиран с биотин в 5'-края.

В контейнера са поместени също ампула, съдържаща 10 pmol фикоеритрин, свързан ковалентно със стрептавидин (SAPE), пет ампули с референтна ДНК, съдържащи съответно дивия тип MPL и мутациите W515A, W515К, W515L и W515R в концентрация от по 1 microg/microl, ампула, съдържаща 150 microl разтвор за промиване (за всяка проба) и ампула с 20 microl хибридизационен буфер (Wakunaga Pharmaceuticals) (за всяка проба).

Действие на полезния модел

В съд, съдържащ 20 microl ДНК амплификационната смес се добавят 100 ng плазмидна или геномна ДНК и сместа се подлага на циклична амплификация при следния температурен режим: 95°С за 5 min; 35 цикъла от по 95°С за 30 s, 58°С за 40 s, 72°С - 2 min и крайна екстензия на 72°С за 10 min. След това 5 microl от всеки PCR продукт се смесват с 20 microl хибридизационен буфер (Wakunaga Pharmaceuticals), 3 microl смес от микросфери с олигонуклеотидни сонди и 2 microl SAPE (Wakunaga Pharmaceuticals) и се извършва хибридизация на 70°С за 30 min.

След инкубацията към всяка реакция се прибавят 75 microl буфер за промиване (Wakunaga Pharmaceuticals) и се извършва центрофугиране на 4000 rpm за 2 min. Отстранява се супернатантата и микросферите се ресуспендират в 75 microl буфер за промиване (Wakunaga Pharmaceuticals).

Пробите се анализират на машина LabScan 100 (Luminex Corp.). Събират се поне 100 събития от всеки използван регион с микро- сфери. За всяка партида реакции се включва контрол на фоновата флуоресценция, т.е. проба, съдържаща само микросфери без амплификационен продукт. Стойностите за фоновия среден интензитет на флуоресценция (MFI) се изваждат от стойностите на MFI за всяка проба и получените стойности се използват за изчисляване на относителните индекси на мутанта по формулата: Индекс (мутантен алел) - [MFI (мутантен алел)/ [MFI (мутантен алел 1) + MFI (мутантен алел 2) + MFI (мутантен алел 3) + MFI (мутантен алел 4) + MFI (див тип алел)].

Въз основа на стойностите на индекса на мутантния алел, получени от всички проби с плазмидни стандарти се построява калибрационна крива и по нея се извършва екстраполация на индекса на мутантния алел от клиничните проби (с неизвестно съдържание на мутантен алел) за количествено определяне на процента на мутантния алел в пробата. За количествено определяне на аналитичната чувствителност на средството, съгласно полезния модел, се изготвят серия разреждания на 100% мутантния плазмид със 100% див тип плазмид за генериране йй референтни проби с W515 мутантни алели при нива 100 и 20 % (фиг. 1). За определяне на праговата стойност на индекса на всеки мутантен алел тестът се извършва трикратно със стандарт от 100% за всеки алел (див тип и мутантни), като за всеки отделен тест се изчислява максималния индекс за всеки мутант измежду пробите, в които той отсъства. След това е изчислена средната от максималните стойности и праговата стойност се дефинира като средна+стандартно отклонение. Стойностите са както следва: 0,072, 0,086, 0,038 и 0,244 съответно 3aW515A,W515K,W515LHW515R (фиг. 2). При последващи тестове чувствителността е дефинирана като най-ниското съдържание на мутантен алел, което дава индекс над праговата стойност. Чувствителността не се различава за отделните мутанти и е 1,0% за всички мутанти алели (Табл. 1).

Пример 2. Изпитване с помощта на средството, съгласно полезния модел.

Тъй като директното ДНК секвениране представлява утвърден метод за откриване на всякакъв вид мутации в геномна ДНК, чувствителността на средството, съгласно полезния модел, е сравнен с директното ДНК секвениране при използване на едни и същи плазмидни стандарти. Чрез секвениране е възможно откриването на 10% мутантен алел. Очевидно средството, съгласно полезния модел, показва по-добра чувствителност върху изкуствени плазмидни стандарти (1% мутантен алел чувствителност). Допълнително е изследвано съдържанието на W515A/K/L/R алели в ДНК проби, изолирани от периферна кръв на 25 пациенти с известни хронични миелопролиферативни заболявалия. Само една проба показа индекс на мутантния алел над гореспоменатите прагови стойности. Стойността за мутанта W515R е 0,391 и тази проба се преценява като позитивна за този мутант. След това находката е потвърдена чрез директно секвениране. Всички други проби са преценени като негативни за MPL мутация както чрез директно секвениране, така и чрез микросферовия метод.

Тези резултати недвусмислено потвърждават, че средството, съгласно полезния модел позволява количествено определяне с по-добра чувствителност върху проби с геномна ДНК, изолирана от периферна кръв, в сравнение с директното ДНК секвениране.

1494 Ul

Таблица 1: Определяне на чувствителността на микросферовия метод

‘Стойностите на индекса на мутантния апел над определените прагови стойности са удебелени и в сиви клетки

Claims (1)

1. Претенции

   1. Средство за in vitro определяне на W515 A/K/L/R мутации в MPL гена в кръвна проба с участието на MPL специфични олигонуклеотиди, характеризиращо се с това, че представлява контейнер от какъвто и да е вид, съдържащ:

   - ампула с ДНК амплификационна смес, включваща буфер, ДНК полимераза и два специфични за MPL олигонуклеотидни праймера, от които поне единият е маркиран с биотин;

   - ампула, съдържаща флуоресцентно маркирани микросфери, натоварени със специфич ни олигонуклеотидни сонди за откриване на мутациите W515A/K/L/R;

   - ампула, съдържаща фикоеритрин, свързан ковалентно със стрептавидин;

   - пет ампули с референтна ДНК, съдържащи съответно по 1 microg/microl от дивия тип MPL и от мутациите W515А, W515К, W515L и W515R;

   - ампула, съдържаща хибридизационен буфер и

   - ампула, съдържаща буфер за промиване.