CN114395539B - 去除乙脑疫苗制品残留宿主dna和宿主蛋白的方法 - Google Patents
去除乙脑疫苗制品残留宿主dna和宿主蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114395539B CN114395539B CN202111679917.5A CN202111679917A CN114395539B CN 114395539 B CN114395539 B CN 114395539B CN 202111679917 A CN202111679917 A CN 202111679917A CN 114395539 B CN114395539 B CN 114395539B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- host
- dna
- solution
- protein
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 229940124726 Japanese encephalitis vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims abstract description 31
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 43
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 23
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 21
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 20
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 229960003239 encephalitis vaccine Drugs 0.000 claims 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 24
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 abstract description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 4
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 4
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本申请涉及病毒疫苗制品纯化领域，具体公开了去除乙脑疫苗制品残留宿主DNA和宿主蛋白的方法，具体步骤为；利用多模式介质Capto MMC与凝胶过滤层析介质组合联用的方式，对乙脑疫苗浓缩灭活液进行纯化，从而达到去除宿主DNA与宿主蛋白的目的。本申请的优点是：利用多模式介质Capto MMC与凝胶过滤层析介质组合联用的方式，对乙脑疫苗浓缩灭活液进行纯化，达到去除宿主DNA与宿主蛋白的目的，从而使成品乙脑疫苗DNA残留量与宿主蛋白残留量进一步降低，提高乙脑疫苗的产品质量。
Description
技术领域
本申请涉及病毒疫苗制品纯化领域，更具体地说，它涉及去除乙脑疫苗制品残留宿主DNA和宿主蛋白的方法。
背景技术
乙脑疫苗的制作是将病毒接种于适合的动物细胞上，经繁殖后将病毒释放到培养液中，与此同时一些残余的宿主细胞或其碎片也会进入到培养液中，经澄清，超滤浓缩，凝胶过滤层析后，提取得到的乙脑疫苗原液中会产生游离的宿主DNA与宿主蛋白以及与抗原蛋白结合的宿主DNA和宿主蛋白；其中超滤浓缩，凝胶过滤层析工艺会将一定比例的游离DNA与宿主蛋白去除，但仍会有残余DNA和宿主蛋白的存在，特别是与病毒或抗原蛋白结合的DNA与宿主蛋白会残留在原液中，若去除不彻底，这部分DNA与宿主蛋白会随着疫苗一起被注入到人体内，可能会在人体内引起不良反应，严重时可具有导致癌症发生的可能。
目前乙脑疫苗普遍采用浓缩、凝胶过滤层析等传统工艺进行提取，所得到的乙脑疫苗，存在以下缺陷：病毒疫苗提取后残留的宿主DNA含量过高；病毒疫苗提取后仍含有过高的宿主蛋白，杂蛋白去除率不高，导致疫苗在临床使用后有较大的副作用。上述缺陷，影响了病毒疫苗产品的质量，制约了疫苗产品的生产。
多模式层析填料Capto MMC是一种复合配基的阳离子交换层析介质，适用于快速、高效且具有成本效益的蛋白质纯化工艺，然而相关技术中未见有利用多模式层析填料Capto MMC用于疫苗制品的纯化方法的相关报道。
发明内容
为了实现在处理乙脑疫苗的过程中尽可能不损失抗原，即不影响疫苗制品的药效，又有效地去除残留宿主DNA与宿主蛋白的目标，本申请提供去除乙脑疫苗制品残留宿主DNA和宿主蛋白的方法，即利用多模式介质Capto MMC与凝胶过滤层析介质组合联用的方式，对乙脑疫苗浓缩灭活液进行纯化，达到去除宿主DNA与宿主蛋白的目的，从而使成品乙脑疫苗DNA残留量与宿主蛋白残留量进一步降低，提高乙脑疫苗的产品质量。
本申请提供的去除乙脑疫苗制品残留宿主DNA和宿主蛋白的方法，采用如下的技术方案：
去除乙脑疫苗制品残留宿主DNA和宿主蛋白的方法，利用多模式介质Capto MMC与凝胶过滤层析介质组合联用的方式，对乙脑疫苗浓缩灭活液进行纯化，从而达到去除宿主DNA与宿主蛋白的目的。
通过采用上述技术方案，多模式层析介质Capto MMC耐受高盐，高流速、高载量，更容易清洗，原因在于多模式层析填料Capto MMC的基质是高流速琼脂糖，功能基团提供了多种交互方式，其中最显著的是离子相互作用、氢键和疏水相互作用，以吸附层析的方式高效的去除乙脑疫苗中的宿主DNA和宿主蛋白；而凝胶过滤层析介质为非吸附层析，是利用凝胶的网状结构，使得进入凝胶过滤层析介质的乙脑疫苗中的宿主DNA和宿主蛋白因尺寸不同而分离；采用吸附层析和非吸附层析的方式，能够在不影响疫苗制品的药效，又有效地去除残留宿主DNA与宿主蛋白的目标。
优选的，将乙脑疫苗浓缩灭活液进行多模式介质Capto MMC层析，使DNA与宿主蛋白牢固吸附在多模式层析介质Capto MMC上，而病毒蛋白直接穿透，收集吸收峰；再将收集的纯化液进行凝胶过滤层析，从而达到去除宿主DNA与宿主蛋白的目的，具体步骤为：(1)使用缓冲液平衡多模式层析介质Capto MMC至紫外、电导平衡，然后将乙脑疫苗浓缩灭活液加载到多模式层析介质Capto MMC中，宿主DNA与宿主蛋白牢固吸附在多模式层析介质CaptoMMC上，而乙脑病毒蛋白直接穿透出来，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用缓冲液洗脱，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为一步纯化液；
(2)将一步纯化液经过凝胶过滤层析介质，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白最终纯化液。
优选的，将乙脑疫苗浓缩灭活液进行凝胶过滤层析，收集吸收峰；再将收集的纯化液进行多模式介质Capto MMC层析，使DNA与宿主蛋白牢固吸附在多模式层析介质CaptoMMC上，而病毒蛋白直接穿透，从而达到进一步去除宿主DNA与宿主蛋白的目的，具体步骤为：
(1)使用缓冲液平衡凝胶过滤层析介质至紫外、电导平衡，然后将乙脑疫苗浓缩灭活液加载到凝胶过滤层析介质中，紫外检测波长280nm，收集吸收峰为一步纯化液；
(2)将一步纯化液加载到多模式层析介质Capto MMC中，宿主DNA与宿主蛋白牢固吸附在多模式层析介质Capto MMC上，而乙脑病毒蛋白直接穿透出来，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用缓冲液洗脱，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰即为乙脑病毒蛋白最终纯化液。
本申请的层析方法：一是将乙脑灭活液通过Sepharose 6 Fast FLow或Sepharose4 Fast Flow后，使用多模式层析介质Capto MMC，去除乙脑疫苗中的宿主残留DNA和宿主蛋白；二是将乙脑灭活液通过多模式层析介质Capto MMC后，再使用Sepharose 6 Fast FLow或Sepharose 4 Fast Flow，去除乙脑疫苗中的宿主残留DNA和宿主蛋白。多模式层析介质Capto MMC用在凝胶过滤之后或之前，都有去除宿主DNA和宿主蛋白的作用，且Capto MMC去除宿主细胞残留蛋白和宿主DNA效果更好，可在尽量保证抗原回收率的情况下，提高宿主蛋白和宿主DNA的去除率。
优选的，所述缓冲液为氯化钠溶液、醋酸钠溶液、磷酸钠溶液或PBS缓冲液中的至少一种。
优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液，且所述PBS缓冲液中的NaCl的摩尔含量为0.1～1.0mol/L。
优选的，所述缓冲液的pH值为6.0～8.0。
优选的，所述凝胶过滤层析介质为Sepharose 6 Fast FLow或Sepharose 4 FastFlow。
通过采用上述方案：本申请的凝胶过滤层析介质采用Sepharose 6 Fast FLow或Sepharose 4 Fast Flow。Sepharose凝胶介质具有非特异性吸附低，回收率高的特点，分离范围广泛，适合分离分子量大小差异大，而对分辨率要求不高的样品。Sepharose 6 FastFlow和Sepharose 4 Fast Flow的优点是具有高的化学和物理稳定性、快速流动性，而且易于维护，适合工业化大规模使用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
将Capto MMC多模式层析介质应用于病毒类疫苗的纯化中，采用流穿模式，即加样时目的蛋白流穿，杂质吸附在层析柱上，达到纯化目的。在保证疫苗抗原原始结构的前提下，有效去除宿主DNA与宿主蛋白，突破疫苗制品的质量瓶颈，提高产品质量标准。
附图说明
图1是本申请实施例1中编号为A2的乙脑浓缩灭活液进行Capto MMC多模式层析的图谱，横坐标代表体积，纵坐标代表紫外吸收。
图2是本申请实施例1中编号为A3的乙脑浓缩灭活液进行Capto MMC多模式层析后，再进行Sepharose 6 Fast FLow凝胶过滤层析的图谱，横坐标代表体积，纵坐标代表紫外吸收。
图3是本申请实施例2中编号为B2的乙脑浓缩灭活液进行Sepharose 6 Fast FLow凝胶过滤层析的图谱，横坐标代表体积，纵坐标代表紫外吸收。
图4是本申请实施例2中编号为B3的乙脑浓缩灭活液进行Sepharose 6 Fast FLow凝胶过滤层析后，再进行Capto MMC多模式层析的图谱，横坐标代表体积，纵坐标代表紫外吸收。
图5是对比例1中编号为C2的乙脑浓缩灭活液进行多模式Capto adhere层析的图谱，横坐标代表体积，纵坐标代表紫外吸收。
图6是对比例1中编号为C3乙脑浓缩灭活液进行多模式Capto adhere层析后，再进行Sepharose 6 Fast FLow凝胶过滤层析的图谱，横坐标代表体积，纵坐标代表紫外吸收。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明，予以特别说明的是：以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。
实施例
实施例1
使用AKTA avant 150自动层析设备将200mL乙脑疫苗浓缩灭活液(编号为A1)经过XK16层析柱，进行多模式Capto MMC层析，紫外检测波长280nm，流速为1.49cm/min，流动相为0.01mol/L PBS缓冲液(pH7.5、NaCl 0.15mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白一步纯化液(编号为A2，图谱见图1)。再将一步纯化液经过Sepharose 6 Fast FLow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为25cm/h，流动相为0.01mol/L PBS缓冲液(pH7.5、NaCl0.15mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白最终纯化液(编号为A3，图谱见图2)。
将A1、A3分别进行抗原含量、DNA残留量、宿主蛋白残留量检测。检测数据见表1。
表1 A1、A3抗原含量、DNA残留量、宿主蛋白残留量检测结果
备注：残留DNA含量按《Vero细胞DNA残留量测定标准操作规程》检测。
通过实验结果，分析抗原回收率、DNA残留量及宿主蛋白残留量，比较不同工艺对相同病毒疫苗浓缩灭活液处理后宿主DNA和宿主蛋白去除情况：病毒浓缩灭活液进行多模式介质Capto MMC层析，再进行凝胶过滤层析，与传统工艺的凝胶过滤层析相比，不降低抗原回收率的同时，使宿主DNA残留量由100pg/剂降低至50pg/剂以下，使宿主蛋白残留量降低至0.5μg/剂以下。
实施例2
使用AKTA avant 150自动层析设备将320mL乙脑疫苗浓缩灭活液(编号为B1)经过XK50层析柱，进行Sepharose 6 Fast FLow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为25cm/h，流动相为0.01mol/L PBS缓冲液(pH7.5、NaCl 0.15mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白一步纯化液(编号为B2，见图3)。再将一步纯化液(100mL)经过多模式CaptoMMC层析，紫外检测波长280nm，流速为1.49cm/min，流动相为0.01mol/L PBS缓冲液(pH7.5、NaCl 0.15mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白最终纯化液(编号为B3，见图4)。
将B1、B3分别进行抗原含量、DNA残留量、宿主蛋白残留量检测。检测数据见表2。
表2 B1、B3抗原含量、DNA残留量、宿主蛋白残留量检测结果
备注：残留DNA含量按《Vero细胞DNA残留量测定标准操作规程》检测。
通过实验结果，分析抗原回收率、DNA残留量及宿主蛋白残留量，比较不同工艺对相同病毒疫苗浓缩灭活液处理后宿主DNA和宿主蛋白去除情况：病毒浓缩灭活液进行凝胶过滤层析，再进行多模式介质Capto MMC层析，与传统工艺的凝胶过滤层析相比，不降低抗原回收率的同时，使宿主DNA残留量由100pg/剂降低至50pg/剂以下，使宿主蛋白残留量降低至0.5μg/剂以下。
对比例
对比例1
使用AKTA avant 150自动层析设备将乙脑疫苗浓缩灭活液(编号为C1)经过Hiscreen层析柱，进行多模式Capto adhere层析，紫外检测波长280nm，流动相为0.01mol/LPBS缓冲液(pH7.5、NaCl 0.15mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白一步纯化液(编号为C2，见图5)。再将一步纯化液经过Sepharose 6 Fast FLow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流动相为PBS缓冲液(pH7.5、NaCl 0.15mol/L)，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白最终纯化液(编号为C3，见图6)。
将C1、C3分别进行抗原含量、DNA残留量、宿主蛋白残留量检测。检测数据见表3。
表3 C1、C3抗原含量、DNA残留量、宿主蛋白残留量检测结果
备注：残留DNA含量按《Vero细胞DNA残留量测定标准操作规程》检测。
结合实施例1和对比例1以及表1和表3可知，本申请的多模式层析介质Capto MMC去除宿主蛋白的效果要优于多模式Capto adhere。
综上所述，利用多模式介质Capto MMC与凝胶过滤层析介质组合联用的方式，对乙脑疫苗浓缩灭活液进行纯化，可达到去除宿主DNA与宿主蛋白的目的。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (5)
1.去除乙脑疫苗制品残留宿主 DNA 和宿主蛋白的方法，其特征在于：将乙脑疫苗浓缩灭活液进行凝胶过滤层析，收集吸收峰；再将收集的纯化液进行多模式介质 Capto MMC 层析，使 DNA 与宿主蛋白牢固吸附在多模式层析介质 Capto MMC 上，而病毒蛋白直接穿透，从而达到进一步去除宿主 DNA 与宿主蛋白的目的，具体步骤为：
（1）使用缓冲液平衡凝胶过滤层析介质至紫外、电导平衡，然后将乙脑疫苗浓缩灭活液加载到凝胶过滤层析介质中，紫外检测波长 280 nm，收集吸收峰为一步纯化液；
（2）将一步纯化液加载到多模式层析介质 Capto MMC 中，宿主 DNA 与宿主蛋白牢固吸附在多模式层析介质 Capto MMC 上，而乙脑病毒蛋白直接穿透出来，紫外检测波长 280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用缓冲液洗脱，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰即为乙脑病毒蛋白最终纯化液。
2.根据权利要求1所述的去除乙脑疫苗制品残留宿主 DNA 和宿主蛋白的方法，其特征在于：所述缓冲液为氯化钠溶液、醋酸钠溶液、磷酸钠溶液或PBS缓冲液中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的去除乙脑疫苗制品残留宿主 DNA 和宿主蛋白的方法，其特征在于：所述缓冲液为PBS 缓冲液，且所述PBS 缓冲液中的NaCl的摩尔含量为0.1～1.0 mol/L。
4.根据权利要求3所述的去除乙脑疫苗制品残留宿主 DNA 和宿主蛋白的方法，其特征在于：所述缓冲液的pH值为6.0～8.0。
5.根据权利要求1所述的去除乙脑疫苗制品残留宿主 DNA 和宿主蛋白的方法，其特征在于：所述凝胶过滤层析介质为Sepharose 6 Fast FLow 或 Sepharose 4 Fast Flow。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111679917.5A CN114395539B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 去除乙脑疫苗制品残留宿主dna和宿主蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111679917.5A CN114395539B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 去除乙脑疫苗制品残留宿主dna和宿主蛋白的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114395539A CN114395539A (zh) | 2022-04-26 |
| CN114395539B true CN114395539B (zh) | 2023-12-29 |
Family
ID=81228392
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111679917.5A Active CN114395539B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 去除乙脑疫苗制品残留宿主dna和宿主蛋白的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114395539B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103768590A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留dna的方法 |
| CN111298109A (zh) * | 2020-03-09 | 2020-06-19 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 利用多模式层析介质Capto adhere去除乙脑疫苗制品中残留宿主DNA的方法 |
-
2021
- 2021-12-31 CN CN202111679917.5A patent/CN114395539B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103768590A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留dna的方法 |
| CN111298109A (zh) * | 2020-03-09 | 2020-06-19 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 利用多模式层析介质Capto adhere去除乙脑疫苗制品中残留宿主DNA的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114395539A (zh) | 2022-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Orr et al. | Recent advances in bioprocessing application of membrane chromatography | |
| CN106749660B (zh) | 单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法 | |
| RU2204596C2 (ru) | Способ стабилизации напитков | |
| US20120283419A1 (en) | Separation of protein monomers from aggregates by solid weak anion exchange support functionalized with amine moieties | |
| CN105153297B (zh) | 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法 | |
| CN110066314B (zh) | 一种高效提高多聚体分离分辨率的亲和纯化工艺 | |
| JP2009521672A (ja) | 生体分子の調製 | |
| KR20170138462A (ko) | 바이러스에 대한 무균 정제 방법 | |
| US20220032266A1 (en) | Large Pore Agarose | |
| Kimberlin et al. | An experimental examination of the scrapie agent in cell membrane mixtures: III. Studies of the operational size | |
| CN111876393A (zh) | 一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法 | |
| CA2763309C (en) | Multi-media affinity column to prevent leaching of ligands | |
| US4485038A (en) | Method for the production and purification of human leukocyte interferon | |
| CN114395539B (zh) | 去除乙脑疫苗制品残留宿主dna和宿主蛋白的方法 | |
| Silva et al. | Continuous chromatography purification of virus-based biopharmaceuticals: a shortcut design method | |
| CN115948351A (zh) | 一种分离纯化cvb1的方法 | |
| CN103768590B (zh) | 利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留dna的方法 | |
| CN111298109A (zh) | 利用多模式层析介质Capto adhere去除乙脑疫苗制品中残留宿主DNA的方法 | |
| CN111575249B (zh) | 新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法 | |
| CN109535239B (zh) | 一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法 | |
| JP2022547159A (ja) | 生物学的調製物のクロマチン含有量を低減する組成物及び方法 | |
| Yoshimoto et al. | Connected flow-through chromatography processes as continuous downstream processing of proteins | |
| US20110152510A1 (en) | Simple load and elute process for purification of genomic dna | |
| CN115058414B (zh) | 一种纯化质粒dna的方法 | |
| JP7344232B2 (ja) | バイオセパレーションのための複合材料 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |