PT96723B - Metodo para a destoxificacao de um antigenio toxico - Google Patents

Description

·/' vírus coro glutaraldeída a. uroa concentraç entre uma. hora e meia até cinco dias.

2é3 M durante A U»8 = Patent NS 4 @75 321 roeihora ainda este processo para a inactivação de toxinas bac ter lanas pela reacçSo da bactéria completa coro glutaraldeída a uroa concentração desde @,@@131 até 0,6526 H»

Supta, j, Biol» Stand», 15, 159-164 (1987) compara as vacinas de célula completa obtidas via tratamento ds calor clássico com as obtidas via método ds Relyveld ds reacçao de destoxificação por glutaraldeída» Ambas as tipos de vacina perdem de 3@ a 5@ % da sua potência em armazenamento a 35 *C durante 3@ dias» Além disso, estas preparações tfm desvantagens importantes quando comparadas com as vacinas de componentes ou acelulares desenvolvidas roais recentemente». e„g«„ baixa imunage-iieticidade e graves efeitos laterais causados pela toxicidade residual a partir da administração» Estas vacinas t'êm provado ser muito menos proteotoras do que as preparadas a partir das estirpes virulentas» Mar Wardlaw et al»» sLUIted jUliEms___MsJLs. r 9;89-100 (19765»

Para evitar os efeitos laterais causados palas vacinas de vírus completo, as pesquisas encaminharam—se para a. investigação dos componentes tóxicos da bactéria B» pa r tuss is» para utilização em vacinas de componentes e acelulares» Um antigénia importante de B» pertussis é a toxina pertussis (PT), uroa exoto-xina de proteína que desempenha um papel principal na patogénese da tosse convulsa e se crê ser o antigénio protector principal da 5--.-&grtu.S5is CA. A» Weiss et al», Ann, Rev. Microbio 1» , 4@s661 (1986=)3= A PT induz várias mudanças biopatológicas graves, quer esteia presente isoladaroente quer coroo contaminante de outros factores antigénicos deste organismo, numa tão baixa quantidade ι * ι *

tos de células como componentes de vacina em Quantidades suficientes para proporcionar um bom nivel de protecçSo. Por conseguinte, as células ou extractos de células de B. pertussis devem ser destoxifiçadas antes da sua utilização numa preparação de vacina >

Para a ti e s t o x i f i c a ç a o da. PT (ou de urna vacina tis componentes ou aeelular que contenha PT), têm sido descritos tr'§s métodos principais» Na publicação tio pedido de Patente Europeia NQ 121 249ftr, a fracção de hemag1utinina , puri ficada a pai ~ "Γ X £·” de um sobrenadante da cultura. de B» oertu «,c. i 53. e contendo PT, é destoxificada com formalina na presença de um aminoácido O n subsequen temen te,, u t i 1 i z ad a pa r a a formulação de uma vacina» A imunogeneticidade e 0 grau de O €£* SCO *· 1. τ i c aç ão a1cançados são excelentes, mas a toxicidade restabelece-se parcialmente sob armazenamento da preparação de vacina a 37 ‘-!C durante 3Θ dias» ct. I ÍHÍDUí íOl !! i! Ο2Ϊ í; 250 ( -r n • r 81 ), aplic OU um ,cão : anál ogo ao de Rei ν’ν'ξτ I Q P a a PT, roas na ÓS duas horas de ín cubaç lo á CSffí pS ratu ira de g luta n t r » rSiOSlCO θ. Θ s 05 % ! ? Ã a d i ção subs 0 = 02 M, outras duas hora S de i ncuba .ção B odu sida uma anato Kina com el SrV rad a imunogen e— Kin íS @ r a estável | B. sua to xi ci d ade n ao •Cií=s dia s de armazena íTíSíl c . / or ; = Contu :do, 0 3 o foi ma is ba.xx O Q o que 0 00 U ido com o liunoz, Infe método de destoxifica presença de sal= Ap ambiente na presença, quente de lisina até dié.lise final, foi. pr ticidade. Esta anato restabeleceu após 30 grau de destoxificaç método formalina/acninoácido»

de B

Patente Europeia My 94/A reagentes eficientes para a pertussis que conténs PT»

Na publicação do pedido de são apresentadas carbodiimidas como destoxificação da PT a fracçSes

Nestes vacinas eficazes a su ã a c t i v i d a d e termos3 permanece uma necessidade na técnica de ε sequras contra a. tosse convulsa, que mantenham e não reqresssm à situação tóxica sob armazena— men to , aumâris do invento r-

Jonforme um dos aspectos, o presente invento proporcio na um método para a destoxificação de um antigénio tóxico escolhido a partir de um microorganismo pstogénico* O método do presente invento envolve os passos de destoxificação parcial da toxina escolhida, ou de uma composição que contém o antigénio tóxico, com glutaraldeido* seguido pela reacção da toxina par- Tça de ami noác idos γγβ p. aração que contém Í è. t.GX xci QSQS sob a *C, escolhidos» 0 toxóide resultante,, ou toxóide, é estável em relação à reversão influencia de temperaturas scxma cie cerca de temperatura ambiente„

Um a n ti ei éni o exemplar ei çSo deste método ê 3. Ο Μ X Π c!, O Jr> s podem ser sujeitas i-ttJ método desti a toxina d o tétano OU a toxina da a u t x 1 x z s .nvsn ud xnc 1 ue»is pu-r exempiu,, .fteria» Este método pode ser utilizado para inactivar a toxina, s„ g», toxina pertussis (PT)„ que está presente como componente principal ou apenas como que C. on t'§ffl factores ant iq ΟΠ % CD5 que e„ g H 5 OS outros an tia én IOS de B. fila me n t osa (FHA>, o f ac tor 69K e 5 te in ve Π fe D pode redu zir El to xicid ad e .3. X. Q)< in a escolhida. xs ol ada ou ζί’Π] sozinhos são não-tóxicos. assut i ad a t_ om * *

outros u. qíi"í|-íuí3xçc5HS ds pa toqén i c o, pa r a de vacina.» fn« i.ns np-.rf!i-=sis destoxificada que é estável em relação à rsvsr

Conforme outro aspecto, este invento proporciona :oxxna pertus °C ou superiores -.· r- _ C.S ^Ίΐ0 ado po r um alto q do trado pela capacid· atíe do ser! tss » A prese nça do en se. i os es pecxti c1 os. i = atos ou aqlomera CãO de toKóide do invento é também caracter e»s sensibilização d células de ovário de Hamster Chinês» As toxinas des-toKifiçadas deste .invento são suficientemente estáveis p-ars preservar a i m li n oçi en e t i c i dade durante mais do que um sTi"ê‘s- sod c on d 1 c Ses· de armazenamento adversas a 37 °C« Estes toxõxdes O {Ba t.0 r i-âis de partida úteis para a composiçã o de vacinas de B« per tussis de* icas alta qualidade e podem também ser utilizados para vacinas mi ou. para a preparação de soros hi per imunes»

Conforme outro aspecto do presente invento, são proporcionadas composições de factores antigénicos de B, pertussis,, e»g„, hemaglutinina filamentosa <FHA), α factor ò9?< ou outras aglutininas de B,, oertussis, que são úteis ρ-ara a preparação de vacinas para o organismo e que contêm pelo menos traços de quantidades de toKina PT tiestoKifiçada como anteriormente se d esc r e veu»

Ainda num outro aspecto, sSo proporcionadas vacinas contra a infecção da B« pertussis que permanecem estáveis a temperaturas at-é 56 °C e não requerem condições de embarque e entrega especialmente refrigeradas» As vacinas deste invento são caracterizadas pela sua manutenção e armazenamento fáceis s-ob 8 - 8 -

condições menos do que óptimas, zando os toxóides do presente invento possibilitam a execução de programas de vacinação em regiões isoladas ou pobremente desenvolvidas;. onde as condições de armazenamento refrigerado., normal-mente requeridas para a manutenção de outras vacinas toxoidiza-das, estão indisponibilizadas e as condições atmosféricas são extremas» Mesmo nestas condições, as vacinas deste invento são estáveis e de alta qualidade».

Ainda um out.ro aspecto do presente invento è um método para a preparação de vacinas mono- ou multifuncionais que incorporam uma quantidade eficaz dos toxóides do presente invento» Outros aspectos e vantagens do presente invento são ainda descritos na sua descrição detalhada seguinte»

Descrição Detalhada do.... Invento 0 presente invento proporciona um método para a desto-xificação de antigénios tóxicos patogénicDs seleccionados, e. g», toxina de B. pertussis,, para utilização em formulações de vacinas.. formulações de vacina melhoradas que cont'§m o toxóide seleccionado e as preparações que contêm o antigénio toxoidizado» É razoavelmente esperado que o método do presente invento seja capaz de toxoidizar numerosos antigénios tóxicos a. partir de uma variedade de microorganismos patogénicos para os quais são desejáveis vacinas, e.g», toxina do tétano ou toxina da difteria, entre outros» Contudo, para facilidade de descrição s experimentação, a toxina pertussis do agente patogénico Bordete11a pertussis é aqui empregue para ilustrar a eficácia deste método de toxaidização*

Descrito brevemente, a. PT tDKòicliâ,ad'à. deste invento ê produzida pela destoxif .icação parcial da toxina utilizando glutaraldeitío como reagente e, eín seguida, pela reacção da PT com formaldeído na presença de anjinoécidos»

De acordo com este invento, são obtidos extractos de PT a partir do meio de cultura de fermentação ou cultura de Borde te 11 -a oertussis, Estão descritas e prontameots disponíveis em coiecçóes comerciais, íypa Luiture ftmer xcai

Collection, Rockvi 1la, Maryland, várias estirpes de Bordete1la método deste i nvento= Qua1quer pode se r usada nos processos tía 3o de qu s sej a capaz de produzir o presente mventD, com a com factor antigénico desejado, PT, em quantidades adequadas, num meio de cultura liquido.

Exemplos de estirpes que podem ser utilizadas no presente invento incluem, sem limitação, B» oertussis fase I, B, pertussis fase II ? B, pertussis fase I CS, B» qertussis Tohama, B. oertussis astir oe 18 —323« B» per tussis estirpe 13- pei r tuss is ss t .1 r pe 50 B» f3e?~ t.U SS- 5. S esti rpe Wsl 1 c. ome 28 e i of Bxoioqxcs B» oer tussis estirpe 165» Uma es- x.x r pe ρ rs pai ra utilização no presen te invento é a B» oer tuss is f a- reriaa

Ei. i onama, que está disponível no Instituto de Fermentação, Usaka, Japão, sob o número de· acesso ΪFu-14073, utili zaçãa no pr3~ coEn is x π ver i ta $ a e sti rpe de P L.» a ;oI hida pode Q iCi[ \f i~i "| vida | 30 r UHiiS var iedatíe de íSC :idos pe 1 a s per X ÍOS Π B. técni r /3 » ; _! Q conhsc idos íS de c ul ti v açSo que empr soam dl feren t gc. passos de ias 1 2. p U. 1, O os ou sólidos , que de pendem da quan t ida·- de e origem ou método de conservação da cultura semente» uontu— do, qualquer método conhecido será suficiente parai utilização na - -v. ' - í ?. 0 \ p Γ s C- ΰ Π t- t:J 1Π VSH u Ο η O Q l..i L.1 [J r O p O r C .L O n 3. U.ÍB .1. Γ) QC Ll 1 P Π i. o OS Li Π1 -::l dZlíí0íí — s-So convencionalmente aceitável para. produção em larga escala»

Um meio adequado para o crescimento de um inoculante de B, oertussis pode ser escolhido por um perito na técnica incluindo P sem limitação., meio da Gengou CPatente Europeia NQ Θ 077 64ôs os meios descritos em N» Andorn et al», AddI» Hicrobiol» fcjiot.ee hnol OQ » / A « x -C-o a '_i*~3g CÍ988) e re fsrências aqui citadas; meio de Verway cu.s. Pa tent 4 784 5B9jí meio sintético B2 EP» Van Hemert, ín Proa» Indust» Microbiol=, < Eu. 11, M» -J » , ed = ), vol = 13, EIsevier Bei», Amsterdão (1977)3 ou a= mod i f i c ac Ses

Para o crescimento da cultura da fc>» per tuss.is, que é o material de partida do presente invento* é adicionado um inoculante a um meio liquido adequado e a fermentação é conduzida empregando métodos de fermentação convencionais e desenhos de fermentadores conhecidos na técnica» Os peritos na técnica apreciarão que podem ser obtidos resultados diferentes que dependem da seiseção de uma combinação particular do desenho do fermentador convencional, meio de fermentação, método s parâmetros» As combinações preferidas ρ-ara utilização no presente inventa são as adequadas para utilização em produção em larga escala» Exemplos destas combinações de métodos, desenhos e meios-são exemplificados na publicação do Pedido de Patente Europeia NQ A Θ77 646, publicação do Pedido de Patente Europeia· NQ A 121 2495 publicação do Pedido de Patente Europeia NQ A 239 5Θ4.? Andorn et ai

Bate et al» (1983), Bekura et e Svoboda et al □dos citados anLeriurments. Os métodos descritos na publicação do

Pedidu de Patente Europeia NQ A izl 249; Andorn et

£3 X

C1 X.BQOS anteriarmente.- e Pedido de Patente Europeia NS A k:39 5Θ4 são os mais preferidos» 3

Na prática desta invente», depois de se completar fermentação5 o meio de cultura da fermentação da Br. pertussis é mantido em condições de esterilidade, para. evitar a desnaturação e/du degradação do factor PT desejada»

Numa encorporação preferida deste invento, o meio de cultura é arrefecido até 1-1© °C e mantida a esta temperatura» O pH é ajustado para u.m valor abixo de 7,©» Preferivelmente, o pH ώ ajustado para uma qama , sntrs pH — s p*H == L·;i4 com acido g/L ou. 2-feno x ietanol _ até uma (5 X =/ c- ^ ... /b it wC Lrt< sej ado, nnrln l_i w w ΒΒΓ às so1ucSes tampão utili zadas fosfórico ou. acético» Pode, facultativamente, ser adicionado ao meio de cultura um conservante, e» q,, , timerosai de sódio, até uma concentração final até ©. concentração final entre ©,5 “ também adicionado um conservar nos processos deste invento»

Num primeiro passo facultativo no método deste invento, o meio de cultura da fermentação pode ser passado par um filtro, para dele se removerem os peletes e partículas maiores, cora a con diçã o de que seja evx ta do o conta r Lo L.OiT« riscos L! có c on taui.ii § a- çSo pro ivsn i en tes do meio Q nvo 1 v ente» U ΠιΟ io d & c u 1 tur a resu. 1 ta n- te pode SU j 9 ito aos pa sso 5 segui Π tíHS d o método * Pi It ern a tiv a *** men te, pode s er tratada ps X os píí.SSIj :S sagu tes um SD lu ção ma •í {· pur if ío ada que c ontenha a PT » Por t ac i I id a d-a de eup t «. X et nação 5 o mé t odo refe ri Γ“1:ΐ s~á. a um a "so lu c3d d a* τ ac to r anti g i. ca " , que 0 >de inclu ;ir o meio de c ul ti ara de τ or mentação C|U8 na r*“* 1 mente o PT, ou. uma so 1 uçli j purif icad a que c on tém ,0 outros antis génios de p: pca r n u. s s i s apenas com definida como uma preparação que contém PT e, facultativamente, outros factares antigénicos da B, pertussistais como FHA. Esta p r e ρ a r a ç ã o p o c quantidades contaminantes de Pi, D0 3.0 □rdo com 0 facto >r an u X C| & n Í: c 0 é ai luid. aprox imad a men *te Θ, 02 até A OS •J 1$ A..UÍ mg /mi L jj n um meio aquosi neutr o, i = e a «I pH = 5 a tá 1 rtodo deste invento, a solução de tté uma concentração de toxina de mg/mL, preferivelmente, 0,1 até :amponizado até pH aprox i madamen te cerca de pH = 9« Preferivelmente, a gamei de pH é 7, Zr-7, /« Um Lampão aquoso d esejàve1 pqtí cá esta diluição è s a 1 i n a t a tn p on i z a de. por fosfato < P8S >. Um t ansplo e κ em ρ x a r* contém fosfato 5® ml 11 e NiciO 1 0,5 M e é a q u x r e T ΗΓ ΓΌ d O por

Tampão D »

Após a diluição, a solução pode ser facultativamente esterilizada por filtração, e* q =, através de uma membrana, estéril de 0,22 pm = A solução de factor antigénico é tratada com solução aquosa da glutaraldeido desde Q , ®3 até @, =57 %, numa. base ponderai» Mais preferivelmente, ê empregue neste passo do tratamento uma. d i 1 ui cão que contém Θ,55 % do q lutara Ideido aquoso a 25 %= Para os fins deste passo, o glutaraldeido a 0,55 % numa ba.se ponderai está preferivelmente presente num tampão E> descrita an terá ormente» A solução de qiutara 1 deido e aplicada s solução do factor antigénico durante aproKimadamente 1 a 4 horas» liais preferivelmente, é empregue um intervalo de i até 3 horas no passo de tratamento de glutaraldeido, com um tempo de 2 horas presentemente preferido» A temperatura do passo de tratamento de glutaraldeido â, desejavelmente, a temperatura ambiente, entre aproKimadamente 2Θ °C e 25 °C = Facultativamente, podem ser utilizados tempos de reacçSo mais curtos em combinação com temperaturas mais elevadas que a. ambiente, ou podem ser usados tempos mais longos com temperaturas mais baixas que a ambiente» Pode também obter-se a inactivação a diferentes temperaturas de reacção e tempos de contacto adequadamente modificados, por exemplo, uma temperatura de 1Θ °C pode ser usada durante 2 a 8

^.iSO horas empregue horas, mais preferivelmente durante 4 horas» Poda ser uma temperatura de 30 *C durante 3Θ minutos a 2 horas, mais preferivelmente 1 hora» AI ternativamente, pode ser usada uma temperatura de 37 °C durante entre 15 minutos e 1 hora, mais preferivelmente 3O minutos»

Este passo do tratamento com glutaraldsído pode resultar numa tíestoxificação parcial do factor antigénico, dependendo do tempo de reacção e concentração dos reagentes» Por exemplo, o tratamento com glut-araldeído na concentração anteriormente descrita durante 2 horas a 20-25 *C produz uma redução de ©,©©3 % da actividade tóxica» As outras condições de tratamento podem resultar numa maior redução da actividade tóxica»

Após este passo de destoxificação, á adicionado pelo menos um aminoácido seleccionado ao factor antigénico parcialmen— te destoxif içado na solução =, 0 aminoácido έ adicionado até uma concentração final de aproximadamente ©,©5 até 2 %, numa base ponderai» A concentração preferida do aminoácido é de ©,S %=, numa base ponderai»

Us am i n oé c i d os seleccionados pera utilização neste passa podem incluir triptofana, glicina, lisina e seus derivados» ou outros aminoácidos, tais como os presentes nos hidrolisatos de proteína» Preferivelmente, os aminoácidos s-lo triptofano, lisina e glicina ou seus derivados» Os aminoácidos são preferivelmente preparados em solução, e« g», no Tampão D anteriormente descrito e pode ser adicionado à solução de factor antigénico separadamen— te ou como uma mistura da dois ou mais aminoácidos» Num encorpo-

presentemente preferido, são preparadas t r ê"s so 1 uç Ses em que contãm. respec tivamen te, so1uçáo d e Tween 8© a 1© % lume), 33 mL de N-aceti1—tri ptofano 57,4 mM e 11 mL Q glicina 2 M, > a ΐί N v*v_ - * · rci-Y:

Estas três soluções bíd e s t e r i 1 ia d -a s par filtra· cSd através de uma memnrana esisn d& ^ ^ jijíi j-im h ponderai e, mais ina é ad icionad ά cr. a d fa c t or a ni. ido nu íhS C oncentr &Ç ViJ·,... Ε:Π T. ΓΒ 1 s 1 fcs pre fe f™ ive 1men te, ers tre d e 4 % d ina P Lfiltí também ss r prep a t ad a n um an te u A formal •j n a é ad xc ion aci » de am inoá eido em qu an ti da de s ap numa base an f xcisn xco e egu.ivalent.es durante um período de tempo entre 3 e 1Φ dias, ma is preferivelmente 7 dias» Durante o tratamento com formalina, as toxinas são mantidas a uma temperatura entre 37 e 45 °C= Hum preferido, durante este pS5'su, as tempera tura ers tre 39 e 41 °C „ p {·- s f e ri toxinas sao ve1mente, as toxinas sSo também agitadas periodicamente durante este período de tempo e sSo mantidas sob condições estéreis»

Nd fim do passo de tratamento formalina/aminoácido, a solução de toxóide de .8, pertussis pode ser armazenada a baixas temperaturas, preferivelmente entre 2 e 6 °C, durante a noite»

Quaisquer agregados formados durante o pr 'QC85SD £}© de?s to XX ficaçêl· são, em seguida, destruídos. suj ex tando O toxóide a. ul tr a-sons Por exemplo, a. solucSo pode ser su. i si ta a tra taíiisn to C Dffl ul tra -sons a uma frequência de cerca iá-SO kHz com uma potência até 1 ®0© watts durante um período de tempo de 1 —30 segundos» Prefe···

© « o tra tameí i to cd«i u1tra-sens en vo1ve uma f r ’SC|i.l· 20 k.Hz* A gama de potência pode ser, mais pre •l· étfjÇj— Byo watts, 0 tempo de sujeição a ul "SB orefe rivelmente entre 5 e 15 segundos, A ..... _ 4. ... resultante é filtrada, preferivelmente através de um crivo de 15

Como passo final no método da dastoxificação deste invento, o produto incubada é dialisado contra PBS, de uma maneira convencional, para remover quaisquer reagentes em excesso» São realizadas mudanças da tampão de diálise e da duração da diálise num número suficiente de vezes para proporcionar que a concentração de formalina residual esteja abaixo de 2ΘΘ ppm» Mais preferivelmente, a concentração de formalina é mantida a cerca de 2Θ ppm» Esta concentração é suficiente para reduzir a concentração de outros agentes usados no processo de inactivaçlo para concentrações não detestáveis ou insignificantes» A toxina de B» pertussis purificada resultante, ou a mistura de outros factores antigánicos ds B» pertussis que contem PT toxoidada, pelo método deste invento é caracterizada pela completa e irreversível inactivaçlo da toxicidade» Esta estabilidade contra a reversão para uma forma tóxica é mantida mesmo sob condições de armazenamento em que a temperatura é superior á temperatura ambiente*, cerca ds 23 °C = Esta estabilidade é demonstrada em testes experimentais durante pelo menos uma semana a 5ó °C e durante pelo menos quatro semanas a 37 °C» Adicional-mente, espera-se que os toxóides do invento permaneçam estáveis durante mais do que dois anos a temperaturas de armazenamento entre 4 até 8 °C» Este toxóide ou factor antigénico resultante pode, em seguida, ser empregue como componente nas preparações do antigénio de B» pertussis, que pode ser distribuído para preparação posterior de vacinas ou em formulaçSes de vacina»

Por conseguinte, este invento também proporciona vacinas que contêm uma quantidade iraunoprotectora da toxóides ou factores antigénicos do invento, i» e», são administradas quantidades suficientes do PT toxoidado ou outros factores antigénicos para eliciar uma resposta do anticorpo protector contra a infec-ção por B» pertussis com sérios efeitos laterais»

Tais vacinas podem ser preparadas por técnicas convencionais» Por exemplo» uma vacina para protecção da estimulação contra a infecçSo por B =__pertussis em humanos pode conter toxéi- des s factores antigénicos estáveis anterior-mente descritos e um agente de suporte convencional adequado» Um ou mais dos toxóides ou factores antigénicos deste invento podem estar numa solução aquosa tamponisatía a um pH fisiológico para utílicaçSo directa» Alternativamente, os antigénios toxoidados podem ser misturados ou adsorvidos com um adjuvante convencional 5 tal canso hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio» Um tal toxéide de B„ pertussis pode também ser combinado com outros imunogénios para preparar a combinação ou vacinas muiti-funcionais capazes de induzir a protecçlo contra asais do que uns agente patoqénico» ver5 e, g», New Trends and Developments in Vaccines, eds» Voller et e.I», University Park Press, Baltimore, MD (1978) »

Estas vacinas podem ser administradas por uma via apropriada5 s» <3=3 pelas vias subcutânea, intravenosa ou intramuscular» A quantidade do toxéide escolhido do presente invento em cada dose de vacina á escolhida pelo médico assistente, tendo em consideração a idade do paciente, o seu peso, sexo, condição física geral e outras condições deste tipo» A quantidade para induzir uma resposta imunoprotectora no paciente, sem efeitos laterais adversos significativos, pode variar, dependendo do imunogénio empregue e da presença optativa de um adjuvante» Geralmente, espera-se que cada dose compreenderá de 2 a 5© pg/g de antigânios preferivelmente de 5 até 25 pg/g de cada um dos toxéide e factor antigénico» As doses iniciais podem ser facultativamente seguidas por impulsos auxiliares» quando desejável»

Os exemplos seguintes ilustram os métodos de preparação de um toxóide exemplar do invento e as determinações da sua imunogeneticidade e resistência á reversão à toxicidade durante o

armasenamenta * i ambém uma prsparaçac! de vacina exemplar empregando o toxóide deste invento. Exemplo í Método de Tqx o i d i s aç ão A toxina de B. oertussis foi extraída e puri T ÍC -3. d -3. -¾ partir de cu lturas BíTí crescimenti □ num fermentacar. conforme descrito na Publ icação do Pedido de Patente Eu rope i a N2 EP-A-® “ ϊΓΓ~ι ·«< V.Í 20« r egista da em 6 ds Novembro de 19tí9 , em co-pro- priedade, que & -aqui incorporada por referência.

Um litro da toxina PT purific -Suei íOÍ lugar». tratada â temperatura ami: jian te, -e» q „ , ”ιΠΓ de uma solução de g1utara1dexdo 3. 5 55 % < peso/ vol em primeiro , com 1ΦΘ mL ?.) preparada

em Tampão D« ft solução é diluída até uma concentração de protel™ na final de ô52 mg/mL em Tampão D, anteriormente descrito,; a pH nmrtr o3 -2 é fôí» ter i 1 X £ 3.0 3. f i 1 irada t 3.'C rsvés túSr uma estér il d -P. í-J.J. pm» U passo de trat afflen to com y 1 i. u tara deixas do 3. pr Dsseguír dursnte 2 ha ras» Em seguida , T oram nados 4 s . 4 mL cie uma s o I u ç M o de T wsen 8Θ a í 0 % C peso 33 mL ds a ί'ι-Ι“·3. C0'ti 1-tri ptofano 57 3 4 m!i e 11 mL ds 9 ic in 1 a r~. , idicin-

Estas três soluções foram preparadas num Tampão Ώ e foram estere- lisa das por fi 1 tr ação através de uma membr 3. η 3. i I de @ 5 Λ.Λ. pm» Foi 5 BíTi segui d 3. ς ad iclonada uma eo luç ão de τ or íTíb 1 in 3 «i / ;4 < p/v ) em T amp 3α D, em tr’§"s por 5 de BC: om o esquema se ou inte í for 3íFi adicionados s - no nr 1 x me 3-ΓΟ d xcí i! dO mL s - no segu ndo dia, 3 3 mL 5 e - no terc eiro d Zíã 5 22 mL de formal ina„ A C DFl C entr ação f ma 1 de formali na f i.í JL de •1· jj jtUtZl· A (p/V *1 Dur an te w sé ti mo d xe de ira tamento de f orma 1 in a, a toxi; na PT foi man i. Í cl -3. 40 C ± 1 °C 3 ob agitação e condi ç 3e ÇO vT. ™ jij rei s.« Ν Ν í ;· e No fim do !_·f~OC Gr?5c-G η a crLJ 1 U.í_ -SC) da parte maiur da PT toxificada foi arenasenada durante a no i te 1 °C, antes de ser submetida a ultra-sons» A solução foi sujeita a tratamento com ultra—sons e a solução de antigénio resultante foi filtrada através de um crivo de 5*3 μη *

Exemplo 2

Propriedades Tóxicas do Componente de Vacina A preparação do toxóide do Exemplo í è comparada com os produtos preparados por toxoidização com glutaraldeído isolado, apenas com formalina e aminoácidos e com qiutaraldeído e formsli— tiemoRscrar na/aminoácidos, conforme aqui descrito, para vantagens dos produtos s métodos deste invento»

Um estudo sobre a toxicidade residual dos toxóides foi zido d©pois de cada a 4 UC QUSf a *> / ” i—· lostrs estar armazenada durante 1 mês, °C = 0 estuda incluiu um exame da morfolo gia celular do ovário do hamster Chinês íCHO), no qual as células expostas à PT activa formam aglomerados prontamente distinguí veis, por um perito na técnica, oa; células em c rescimen to normal» Ver, e» g, , Oillenius et al*5 J, Biol 3tancu, 13 ^ ,, <1985),, 0 teste é realizado misturando diluições em série do in ti qénico a S-©CE •m t est ados com uma su spensa o de L-HD em p Θ uL de mei Qe d© cul tu r a Qm placa «ε. dei x ando as I é 1 u 1 as ass s Γ itar e : c rose :er a 37 u No fim da i ncubaç ; Mo ς cr, /t- o r©Q ist ados os valore s exa minaça Q m icros cóp ica - b.s i. _ teste é ssnsi - pg de Ιοκ in a ac ti .va. de

Os resultados ilustrados na Tabela 1 seguinte mostram que o tratamento com formalina/aminoácidos apenas produz uma .. Λ i! Ο \ .. Λ i! Ο \ in ac ti vação completa5 a CjLlcS.1 g c on tu d 0 5 é i n s té:ve 1 © reverta i. toxici dade após quatro SHiTlíEíD -55 a 37 °C» 0 tratam errco s Cí com qlutar aldeído produz uma in&cti vacãn incompleta? mas estável» 0 processo do presente- invento» que contém tratamento cocn glutara 1-deido e formalina/aminoácidos, proporciona uma inactivação nâo sé completa, mas também estável»

IABfcLA -3 d a

Propriedades tóxicas da loxina ds a. pertussis

Teste de Morfologia das Células ÇHu

Prec araciu dt? An tiqénio CPU/uq 3@ d - 4 °C 3® d ~ 37 °C (i) FormaIina/sminoác idos < Θ,,ΦΦΨ* •7 cp <2 > G1 u t a r a 1 d -s £ d 0 ® ? 13 13 i 3) Glutaraldeído + formaIi na/ami noác idos < Θ?Θ1όφ < <012*

Corresponde ao limite de detecção do ensaio X d" 'U (unidade citopática) é a menor dose de antigénio que induz a al teraclfo d a mor foiogia de todas as células» Para a toxina nativa», í CPU corresponde à concenfc ração de cerca de .. . > ? C ' D estudo envolva também um teste cie sensibilização a tos , com VSl x na adsor vxdtó em hi-dr Ò Λ .1 ÍJ Cf de a 1 um í— dez rato s < Quí X SS OF1) a* a o inc :>cu.la dos in :tr avenas a dose u :-z~: VãC :i nas que cont ém 6 μια de t :ok óide de μπι d e FH A trata da» Após 4 d i as ? os ra tos s Sc? aperi tone a1mente com 1 mg de hist amina em sa 1 i na mo, tamponizada, )") LlciS Hi oras após o desa fio ? é* req is t«iCÍ«í cíl fSZtíD de mortalidade d e c a d a grupo. Ver? e. y = 5 HunOZ et al,, Infe :Ct = Imij.no 1, „ 33 s o jd! y *“ ti .cí w (1981), 0 teste de h istamina é sensível ci*cê cerca de 3ã ng de to >;ina activa/rato. a.m h tal como o teste os CHU, que o tra t amen to d e f o r m a 1 i ~ éc i do deu ! uma xnactivaçSo Í-Ufãp X stâ. 5 mas reversívels Cí-S incubação da vacina a. 37 C durante um mês. Contudo;! *CfS falhou na dstscçlo da toxi cidade ou reversS o à toxici- dade nas preparações tratadas nSo só cora qlutaraldeítío, mas também com qiutaraldeído e formalina/aminoácidos, Este resultado nSo é contraditório com os f esu1 fados tío teste de CHO s porque o teste? de desafio de histamir "sa è menos sensível do q ue o t Ed -B t E5 ó -S CHO e não detecta o nível de toxici dade residual Π Λ •amostras tratad las com glutaraldeído»

Τ’Λ 7*^8“**? Λ **5 propriedades |ÓXÍCSS fJs H = psrtussis HdSΟrV2_d5

Preparações de Vacina

Teste de Sensibil ização a Ristamina em Ratos

Preparação de Antiaénio F-.ízt ãi S.Ci Ci tií íuO t t áS, X X d cXCÍ w 30 d “ 4 °C 3© d - o/ *C (i > Forma1ina/aminoácidos 0/10 Ó/10 <2) Blutaraldeído 0/10 0/10 (3) G lutar a Ide ido *?· Formai I ina 0/ 1 & 0/Í0

Exemplo a

Propriedades Antiqénicas do componente de Vacina

As preparações de toxóide obtidas por inactivação cora tratamento de formalina/aminoácido apenas* tratamento com gluta-raIdeido isolado ou com o método do presente invento* conforme descrito no Exemplo 1* foram testadas num imunoensaio de enzima utilizando um anticorpo de coelho especifico dirigido contra a PT» Este anticorpo foi obtido por imunização de coelhos com toxéide inac tivado por forma1ina/aminoácidos„ 1

bste anticorpo foi conjugado com biotina para permitir 5 1 igaao por ura reso-ence de estrepcavioi· a detecção do anticorpo na;; pero:·-: idase5 por determinação da absorv'§nc.1.a a 49Θ nm.

Os resultados sIq ilustrados- na Tabela 3» Eles- mostram que a toxina nativa é mais ef.ici.iBntemente reconhecida» 0 to-xéide preparado por inactivação de gIu tar aIde i do isolado mostra a react.ivida.de mais baixa» Os toxóides preparados por tratamento com formalina/aminoácido ou pelo tratamento do método deste inventa mostram uma rssctividade intermédia»

TABELA

Propriedades Antiqénicas da ReaccSo da Pi Toxoidizada com An tx—PT ds uoelho

Testa de Sensibilização de Histamina em Ratos

Preparação de Antioénio D em. 49# nm T o x i n a n ativa Θ = /4 F orma1i na/aminoácidos 0,39 GlutaraIdeido +· Λ i & ? Λ.Ο Formalina BIutara1deido fj? 12 1

Grupos de 12 ratos- (Balfa/c) foram imunizados par 2 uq das- oreoe.raç-Ses de toKóide? dadas duas vezes- em intervalos de sete dias,: 14 dias após a segunda injecçlo? eles foram desafiados- intranasa 1 mente por uma estirpe de B. pert.ussis hioervirulen— ta l(18~32d Ac+)s ver, e. q;

Lett.. , 42 ΐ 75- •80 depois do desaf Os re que método do com a mei hor ef

BrexXH et ax o 5 i~fc.flcy tlxor 1jxox "eqistadas- as mortalidades 6 dia na Tabela 4 seguinte, mostram tticâc; ítectora da Pi jxoiuizaaa em rtaoos

Preparação de Antiaénio Wy de mortes Menhuma 10 F orma1ina/arainoác idos 4 Glutara1dsxdo D Glutaraldeído -'-· 2 Formalina t

">ã

Exemplo 5

Preparação de Vacina ΟΓϋΐθ US» Pa ten t 4 &75 321 s .a.. 0 tr 'atsmento com for®: al ina Pa ten te Europeia Ny 10-1 249»

Para formular as vacinss, os antiqénios de B, pertu.ss.is devem estar isentos de propriedades toxicas». enquanto retêm -propriedades imunológicas satisfatórias. Este objectivo é alcançado pela toKoidização da toxina B. pertussis e/ou por tratamento semelhante aplicado a outros antigènios* os quais contêm geralmente quantidades contaminantes da toxina PT. 0 tratamento com glutaraldeído* cc resulta numa inactivação incomp! resulta numa inactivação completa* mas ρβ r ciei fnsn t e reversíve1 ? s 1munogeneticid ade canser vada» Contudo * θ. -Θ. p í. !. C! õS Ç -~k O do método do presente invento„ e. q», tratamento da solução que < contém PT com glu.taralde.ida e formalina/aminoácidos* conforme aqui se descreve» resulta surpreendentemente não só numa inactivação completa, mas também numa inactivação irreversível. A solução resultante também ss caracteriza por conservar a imuncoeneticidade» Por conseguinte* os produtos e processos do presente invento são valiosos pelas suas contribuições- para a segurança e imunoqeneti-cidade das vacinas de Et._pertussis que contêm estes antigênios.

Exemplo 6

Estabilidade ds Preparação de Vacina A preparação de vacina obtida por inacti vacao com o método do presente inv: en to 5 uOi i i w rme descrito no Exemplo 1 e o processo de preparação des •cri to Π o E x em p 1 o 5 * foi subme tida a d i ferentes tratamentos por calors uma semana, a. cr .· r-.s""- n JO “ l_. ς *4 semanas a 37 °C ou mantida dur ante 1 ano a 4-8 °C, As amostras de vacina ·. '-£50

foram, em seguida, ensaiadas para a PT aciiva pelo ensaio d© sensibilização a histamina em ratoss conforme se descreveu no Exemplo 2, Os resultados mostrados na Tabela 5 mostram a ausência de reversão á toxicidade após os tratamentos anteriores»

1ABELA

Propriedades Tóxicas da PrsoaracSo de vacina de B» pertussis Adsorvida

Teste de rvBibx 1 ilação a Hxstamina em Rat.;j~·

Preparação admin istrada íratamento

Razão de mortal idade solvente - 0/10 PT nativa @, 50 pg 10/10 0,17 pg 10/10 &, 05 m tr / 1 0 vacina nenhum 25 pg 0/10 vacina 7 dias, 56 °C pg 0/ 10 vacina 28 dias, 37 °C / "V ug 0/10

Imunogeneticidãde s LstahilIdade em Armazenamento a Longo Prazo a 4—8 °C adas em is != tan tes d i versos i h is-ta mi na da PT 3 como se d a r e s ρ o :sta imune dos ratos i&CeÍD cl-3 dose de PT inacti-

As preparações de ant.iqénio? formuladas como no Exemplo 5 5 foram armazenadas a 4-8 °C & en·; para a actividade de sens-ibiiizaçãí descreveu no Exemplo 2, e para a ED58 di Swiss OFÍ para a PTS i. e.? a determinai vada necessária para induzir a seroconservaçao de 5ô % dos ratos. Foram realizados testes- semelhantes na vacina DTP tri vai ente adsorvida, contendo toxéide de difteria., toxé-ide de tétano e componentes de vacina pertussis acelulares de hemaqlutinina filamentosa e toxina pertussis inactívada5 preparada conforme se descreveu no Exemplo i do presente invento. Os resultados (Tabela 6) mostram a ausência de reversão e a ausência de varia— qSes siqnificativas da ED5€i.

OsUOOCi fcfFí cf t X CXOSOS S d: tafai1idade

Estudos de f v-sc ina r-\F* -Z.íU/ td. wUC \este de mor- ED50 Lote MS (meses > t a 1 i d -ad e HSF ng/rato 306<1) 0 ©/1 €> 42 10 0/ 1 © <103 ."ρ-γ 0/1© -42 31 © C11 0 0 / 1 © < 1 ©3 1© 0/ 10 < 1 ©3 O” 0 / 1 0 46 353(2) Çj 0/ 1 0 69 15 0/ 10. < 1 ©3 *7*7 0/10 3.54 (? í 0 0 / 1 0 50 15 0/ 1 © J 27 0/10 B0 /í-J J © 0/10 76 J. ϋ 0/1 0 <103 0*7 .1— f 0/ 10 45 íi) rT inactivada, (2) DTP trivalente hemag1utinina f i1amentos vada, 25 uq>. 25 μα» ítoxóide de difteria. (FHA) de B„ pertusçis e PT inacti·- jer aplicado a outros toxina do tétano e U método do presente invento pode antigéniosj tais como toxina da difteria, semelhantes» Tais modificações e alterações è.s- composições e processos do presente inventa sSo consideradas como estando abrangidas pelo 'âmbito e alcance das reivindicações- apensas a esta fnsffiória 28 V* V* 4| 28 V* V* 4

REIVIMDICAÇSE: lã, - Método pera a destoxificação de um -antigénio tóxica de uma preparação parcialmente ou extensivamente purificada que contém o referido antigénio a partir de um microorqanismo patogénico, caracfcerizada por compreender a tratamento da referida preparação com glutaraldeído para destoxificar parcialmente o referido antigénio e a reacção do antigénio parcialmente dsst.oK.i~ ficado com formalina na presença de aminoàcidos seleccionados, 2â, - Método de acordo com a 'reivindicação 1, caracte-riçado por o referido antigénio ser a toxina da tosse convulsa, 3â, - Método de acordo com a reivindicação 1, caracta-rizado por os referidos aminoàcidos serem escolhidos a partir tío grupo constituído por triptofsno, glicina, lisina e seus derivados „ 4§» - Método de acordo com a reivindicação 1, caracts-rizado por o referido tratamento com glutaraldeído compreender o tratamento ds uma solução aquosa que contém o referido antigénio numa concentração entre ©s©2 e 2 mg/ml com €n,@3 a €>, @7 % de solução aquosa ds glutaraldeído a 25 %s numa base ponderai» 5ã. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracte-rizado por o referido tratamento com formalina e aminoácido compreender a adição â referida solução de antigénio tratada com glutaraldeído de entre ®,05 a 2 %5 numa base ponderai, de pelo menos um aminoácido escolhido e de entre í a i© %, numa base ponderai? de formalina, mantendo a referida solução a uma temperatura entre 37' e 45 °C, 6ã» -· Método de acordo com a reivíríiíxtsâção 5=, caracte-risado por compreendes também a sujeição facultativa da solução a ultra-sons para a remoção de agregados formados durante a desto-xificaçSo* 7§. = ~ Método de acordo com a reivindicação 5, caracte-risado por compreender a diáliss da solução para a remoção do reagente em excesso, em que a concentração de formalina residual é sempre inferior a 2ΘΘ ppm na referida solução.

Lisboa, 8 de Fevereiro de 1991

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VfCTOR CORDON, 10-A 3.“ 1200 LISBOA