JPH06316533A - クレブシェラ莢膜多糖ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、クレブシェラ種の細菌から精製さ
れた無毒性の免疫製剤およびその製法に関する。 【構成】 クレブシェラ細菌から本質的に純粋な莢膜多
糖類混合物を得て；上記莢膜多糖類を脱アシル化剤で処
理し；そして該莢膜多糖類からなる非発熱性の免疫原性
ワクチンを回収する；工程からなるクレブシェラワクチ
ンの製法および該方法により製造された製剤を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は無毒性の血清型特異的多
糖調製物から成る多価免疫製剤に関する。より詳細に
は、本発明はクレブシェラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｓｐｅｃｉｅｓ）の細菌（以後クレブシェラと称す）に
由来する精製された莢膜多糖（ＣＰＳ）を水酸化ナトリ
ウム（ＮａＯＨ）のような脱アシル化剤で処理して、非
発熱性の免疫原性ＣＰＳ製剤を製造することに関する。
さらに本発明は、免疫原性クレブシェラ種ＣＰＳを使用
してクレブシェラ感染症を防御することに関する。この
種の抗原から調製されたワクチンは、クレブシェラ感染
症にかかる恐れのある個体を能動免疫するために使用さ
れる。

【０００２】

【従来の技術】グラム陰性好気性菌（例えばクレブシェ
ラ）による感染頻度は、広範囲抗生物質の普及に伴って
ここ３０年の間に劇的に増加した。これらの感染症のう
ち肺炎または菌血症として分類されるものは最も高い致
死率を有し、それは平均で約２５％であり、１０％〜５
０％の範囲に及ぶ。マックゴーアン（ＭｃＧｏｗａｎ，
Ｊ．Ｅ．），バーネス（Ｂａｒｎｅｓ，Ｍ．Ｗ．），フ
ィンランド（Ｆｉｎｌａｎｄ，Ｍ．）の“ボストン市立
病院における菌血症：１２の選ばれた年（１９３５〜１
９７２）の発生および死亡率、特に院内感染の場合に関
して”Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３２：３１６〜３
３５，１９７５；ブリアン（Ｂｒｙａｎ，Ｃ．Ｓ．），
レイノルド（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｋ．Ｌ．），ブレンナ
ー（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｅ．Ｒ．）の“非大学病院におけ
るグラム陰性菌血症の１１８６例の分析：抗菌治療の結
果”Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：６２９〜６３
８，１９８３；グレイビル（Ｇｒａｙｂｉｌｌ，Ｊ．
Ｒ．），マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｌ．Ｗ．），
カラチェ（Ｃｈａｒａｃｈｅ，Ｐ），ワレス（Ｗａｌｌ
ａｃｅ，Ｃ．Ｋ．），メルビン（Ｍｅｌｖｉｎ，Ｖ．
Ｂ．）の“院内感染肺炎：継続的主要問題”Ａｍ．Ｒｅ
ｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１０８：１１３０〜１１４０，
１９７３；およびクロス（Ｃｒｏｓｓ，Ａ．），アレン
（Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｒ．），バーク（Ｂｕｒｋｅ，
Ｊ．），デューセル（Ｄｕｃｅｌ，Ｇ．），ハリス（Ｈ
ａｒｒｉｓ，Ａ．），ジョン（Ｊｏｈｎ，Ｊ．），ジョ
ンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．），ルー（Ｌｅｗ，
Ｍ．），マクミラン（ＭａｃＭｉｌｌａｎ，Ｂ．），メ
アーズ（Ｍｅｅｒｓ，Ｐ．），スカロバ（Ｓｋａｌｏｖ
ａ，Ｒ．），ウエンゼル（Ｗｅｎｚｅｌ，Ｒ．），テニ
ー（Ｔｅｎｎｅｙ，Ｊ．）の“緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）による院内感染症：
最近の傾向について“Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．
５（別冊）：Ｓ８３７〜Ｓ８４５，１９８３に記載され
るように、クレブシェラはこのような生命を脅かす感染
症の第一原因であり、下位呼吸気管からたびたび単離さ
れるグラム陰性菌であり、そして菌血症の最も一般的な
第二原因になっている。今のところ、クレブシェラ感染
症を防ぐための効果的な免疫学的方法は存在しない。

【０００３】数多くの細菌種、とりわけクレブシェラは
細菌細胞を粘液様の層中に包み込む明確な莢膜を保有し
ている。この莢膜は高分子量重合体を形成する多糖の繰
返し単位から構成される。この種の莢膜多糖（ＣＰＳ）
はそれらのそれぞれの細菌細胞に対してＫ抗原（または
莢膜抗原）特異性を賦与する。

【０００４】リオット（Ｒｉｏｔｔｏｔ，Ｍ．Ｍ．），
フォーニアー（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．），ピロー
（Ｐｉｌｌｏｔ，Ｊ．）の“肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）リボソーム製剤により
マウスに与えられた防御の莢膜血清型特異性”Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２４：４７６〜４８２，１９７９；
リオット，フォーニアー，ジューイン（Ｊｏｕｉｎ，
Ｈ．）の“肺炎桿菌リボソーム製剤の免疫防御活性にお
ける莢膜多糖の影響に関する直接的証明”Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．３１：７１〜７７，１９８１；および
クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．），ＭｃＡ．，ローレイ
（Ｒａｗｌｅｙ，Ｄ．）の“肺炎桿菌に対する耐性およ
び２つの細菌抗原の重要性”Ａｕｓｔｒａｌ．Ｊ．Ｅｘ
ｐｔ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６０：６２９〜６４
１，１９８２などに記載される研究は、動物実験におい
て実験用リボソームワクチンおよび実験用死滅全細胞ワ
クチンがクレブシェラ感染に対してある程度の防御を与
えうることを示した。防御は血清型特異的抗ＣＰＳ免疫
応答の誘発と関連があることが見出された。しかしなが
ら、マウスにＣＰＳをワクチン接種することにより防御
的免疫応答を引き出す従来の試みは今まで不成功におわ
り、この失敗はフォーニアー（Ｊ．Ｍ．Ｆｏｕｒｎｉｅ
ｒ），ジョリベーレノー（Ｃ．Ｊｏｌｉｖｅｔ−Ｒｅｙ
ｎａｕｄ），リオット（Ｍ．Ｍ．Ｒｉｏｔｔｏｔ）およ
びジューイン（Ｈ．Ｊｏｕｉｎ）のＩｎｆｅｃｔ．Ｉｍ
ｍｕｎ．３２：４２０〜４２６，１９８１に示されるよ
うに、マウスにおけるＣＰＳの弱い免疫原性が原因であ
った。

【０００５】今や、免疫原性ＣＰＳ製剤は莢膜生産をう
ながすように調整された培地で培養したクレブシェラの
培養上清から得られることが発見された。これらのＣＰ
Ｓ抗原はその後高度に精製され、この高度精製産物は動
物において免疫原性を有し且つ非発熱性であることがわ
かった。例えば、クリズ（Ｃｒｙｚ，Ｓ．Ｊ．，Ｊ
ｒ．），フューアー（Ｆｕｒｅｒ，Ｅ．），ジャーマニ
ー（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ，Ｒ．）の“クレブシェラ莢膜
多糖の精製およびワクチン能力”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．５０：２２５〜２８０，１９８５；およびクリ
ズ，フューアー，ジャーマニーの“ヒトにおける肺炎桿
菌Ｋ１莢膜多糖ワクチンの免疫原性および安全性”ザ・
ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディズィーズ
（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕ
ｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ），１５１巻，４号，１９８５年
４月を参照されたい。さらに、クリズ，フューアー，ジ
ャーマニーの“相同莢膜多糖で免疫化することによる肺
炎桿菌ＫＰ１−０による実験上の致命的火傷敗血症の予
防”Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５０：８１７〜８２
２，１９８４およびクリズ，フューアー，ジャーマニー
の”抗莢膜多糖の受動転移（ｐａｓｓｉｖｅ ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ）による致命的な肺炎桿菌火傷敗血症に対する
防御”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：１３９〜１４
２，１９８４に示されるように、抗−血清型特異的ＣＰ
Ｓは実験上の致命的クレブシェラ感染症を予防するのに
きわめて有効であることが見出された。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】１つの実施態様におい
て、本発明は、比較的精製された莢膜多糖をクレブシェ
ラ菌から誘導し；その莢膜多糖を脱アシル化剤で処理
し；そして非発熱性の免疫原性クレブシェラワクチンを
回収する；諸工程から成るクレブシェラワクチンの製法
を提供する。

【０００７】他の実施態様において、本発明は、少なく
とも２つの異なる血清型のクレブシェラ菌から莢膜多糖
を誘導し；その莢膜多糖を脱アシル化剤で処理し；各血
清型の非発熱性、免疫原性莢膜多糖を回収し；そしてこ
れらの莢膜多糖の各々の少なくとも一部を組み合わせて
多糖免疫原性ワクチンを製造する；諸工程から成る多価
クレブシェラワクチンの製造を提供する。

【０００８】さらに他の態様において、本発明は莢膜多
糖誘導体を含有する免疫原性クレブシェラワクチンを提
供する。

【０００９】さらに別の態様において、本発明は、少な
くとも２つの異なる血清型のクレブシェラ菌から誘導さ
れる莢膜多糖の混合物を含有する多価免疫原性クレブシ
ェラワクチンを提供する。

【００１０】さらに別の態様において、本発明は、比較
的精製された莢膜多糖をクレブシェラ菌から誘導し；そ
の莢膜多糖を脱アシル化剤で処理し；そして非発熱性の
免疫原性ワクチンを回収することにより製造された免疫
原性クレブシェラワクチンを提供する。

【００１１】さらに別の態様において、本発明は、少な
くとも２つの異なる血清型のクレブシェラ菌から莢膜多
糖を誘導し；その莢膜多糖を脱アシル化剤で処理し；各
血清型の非発熱性、免疫原性莢膜多糖を回収し；そして
これらの莢膜多糖の各々の少なくとも一部を組み合わせ
ることにより製造された多価免疫原性ワクチンを提供す
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、精製されたク
レブシェラ血清型特異的莢膜多糖から成る免疫製剤に関
する。この新規免疫剤はクレブシェラヒト血液単離物の
莢膜血清型に由来する莢膜多糖（ＣＰＳ）の適当な血清
型を、ＮａＯＨのような脱アシル化剤と組み合わせるこ
とにより調製される。これらの多価ワクチンは非経口、
経口または鼻咽頭経路で投与する場合、クレブシェラ感
染に対する能動免疫に有用である。また、これらのワク
チンはＣＰＳに対する血清抗体レベルを増すために非経
口的に投与される。

【００１３】安全でしかも免疫原性のある多価クレブシ
ェラ血清型特異的莢膜多糖ワクチンは、精製されたクレ
ブシェラ莢膜多糖を希水酸化ナトリウムのような脱アシ
ル化剤で処理する新規方法によって製造された。莢膜多
糖は既知莢膜血清型のクレブシェラ菌株を莢膜生産を促
進するように調整された培地上で培養することにより得
られる。この莢膜多糖は界面活性剤を用いる共沈、エタ
ノール沈澱、有機溶媒による抽出、および超遠心分離に
より精製される。その後、精製された莢膜多糖を希水酸
化ナトリウム中で処理して、同時精製された毒性のリポ
多糖を無毒化する。得られた莢膜多糖は１×１０⁶ ダル
トンに等しいかまたはそれより大きい分子量を有し、対
応する天然の莢膜多糖に関して免疫学的に反応性であ
り、マウスおよびモルモットに対して無毒性であり、し
かも５μｇ／ｋｇ（体重）に等しいかまたはそれより多
い用量でウサギに対して比較的非発熱性（例えば体温上
昇０．３℃以下）である。

【００１４】本発明の多価クレブシェラ莢膜多糖ワクチ
ンはヒトに対して安全であり且つ免疫原性を有する。こ
のワクチンは実験上の致命的クレブシェラ感染症を防御
するオプソニン抗体の産生を誘発する。

【００１５】先に述べたように、従来の研究は実験用リ
ボソームワクチンおよび実験用死滅全細胞ワクチンが動
物実験においてクレブシェラ感染を防御しうることを示
し、また防御は血清型特異的抗ＣＰＳ免疫応答の誘発と
関連することがわかった。しかしながら、精製ＣＰＳを
ワクチン接種することによりマウスの防御的免疫応答を
誘発する従来の試みは、少なくとも若干の例において成
功しなかった。

【００１６】先に示したクリズたちの文献に記載される
ように、ＣＰＳはクレブシェラＫＰ１−0 （血清型１）
培養物の上清から単離され、精製された。ＣＰＳはセタ
バロン（Ｃｅｔａｖａｌｏｎ）のような界面活性剤の添
加により細胞不含の培養上清から共沈させた。この沈澱
物を１Ｍ ＣａＣｌ₂ に溶解してＣＰＳを界面活性剤か
ら分離し、次にエタノールを８０％（容量／容量）まで
添加することによりＣＰＳを溶液から採取した。その
後、ＣＰＳを蒸留水に溶解し、等容量のクロロホルム／
ブタノール（５：１）で十分に抽出した。水相を集め、
蒸留水に対して透析して微量の有機溶媒を除き、その後
１００，０００×ｇで１６時間遠心分離して存在するリ
ポ多糖（ＬＰＳ）の大部分を除いた。ＣＰＳ含有上清を
集め、エタノールを８０％（容量／容量）まで加えてＣ
ＰＳを沈澱させた。ＣＰＳを蒸留水に溶解して凍結乾燥
した。このようにして調製されたＣＰＳは主に炭水化物
から構成され、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定して
１×１０⁶ 以上の分子量を有していた。精製ＣＰＳによ
るウサギの免疫化に応答して誘発された抗血清は、致命
的な肺炎桿菌ＫＰ１−０敗血症からマウスを防御するこ
とが見出された。同様に、精製ＫＰ１−０ ＣＰＳで能
動免疫されたマウスは致命的な肺炎桿菌ＫＰ１−０敗血
症から防御された。

【００１７】肺炎桿菌ＫＰ１−０ ＣＰＳは皮下経路で
ヒトに投与した場合、特異的免疫応答を誘発することが
見出された。しかしながら、免疫化はＣＰＳを汚染する
低レベルのＬＰＳのために痛み、腫れおよび紅斑により
特徴づけられる局部反応を高比率で保有していた。本発
明によれば、凍結乾燥ＣＰＳを０．１Ｍ ＮａＯＨ−９
５％（容量／容量）エタノール溶液中で処理して脱アシ
ル化することにより、汚染性ＬＰＳが無毒化される。こ
の方法はウサギへの静脈内投与により測定した場合にＣ
ＰＳの発熱性を著しく減じる。さらに、この種のＮａＯ
Ｈ処理ＣＰＳは注射の際の局部反応の発生率を非常に低
下させると共に、ヒトに対して同様に免疫原性を有する
ことが見出された。ＣＰＳによる免疫化に応答して誘発
されたヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、マウスに受
動転移した場合に、致命的肺炎桿菌感染症に対して高度
の防御を与えることがわかった。水酸化カリウム、水酸
化リチウムおよび水酸化アンモニウムのようなその他の
脱アシル化剤も勿論本発明において使用するのに適して
いる。

【００１８】本発明のこれらの特徴ならびにその他の特
徴は、本発明の好適な実施態様の次の詳細な説明を添付
の表と照合して読む場合に、十分に明らかになるであろ
う。

【００１９】以下の実施例において、莢膜多糖は次のク
レブシェラ菌株から単離して精製した。

【００２０】肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）５
０５５：莢膜血清型２； Ｋ．オゼネ（Ｋ．ｏｚａｅｎａｅ）Ｃ５０４６：莢膜血
清型３； 肺炎桿菌９１９：莢膜血清型１０； 肺炎桿菌１７０２−４９：莢膜血清型２１； 肺炎桿菌７８２４：莢膜血清型３０；および 肺炎桿菌３９８５−５１：莢膜血清型５５ 上記の菌株はデンマーク国コペンハーゲン，スタテンス
血清研究所（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍｉｎｓｔｉｔ
ｕｔ）のオースコフ（Ｉ．Ｏｒｓｋｏｖ）によりスイス
セーラムエンドワクチンインスティチュート（Ｓｗｉｓ
ｓ Ｓｅｒｕｍａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ）に供給され、これらは莢膜血清型標準菌株であ
る。全ての菌株はアンプル中で凍結乾燥されて貯蔵され
ており、スタテンス血清研究所、ロンドンのパブリック
・ヘルス・ラボラトリー・サービスからいつでも容易に
入手し得る。

【００２１】

【実施例】ＣＰＳを精製するためのクレブシェラ培養物
の調製は次のようにして開始した。凍結乾燥した培養物
を含むアンプルを開き、再調製し、そして寒天平板上に
接種した。この平板は３７℃で１８〜２４時間増殖させ
た。次に、白金耳一杯の培養物を使って、１２５ｍｌフ
ラスコ中のＨＹＥＭ培地〔２％（重量／容量）ハイケー
ス−ＳＦ（Ｈｙｃａｓｅ−ＳＦ；米国テネシー州メンフ
ィス，フムコ・シェフィールド），０．３％（重量／容
量）酵母エキス（米国ミシガン州デトロイト，ジフコ・
ラボラトリーズ）〕３０ｍｌおよび２％（重量／容量）
マルトース（１０％無菌原液として添加）に接種した。
この培養物は３７℃、１００ＲＰＭで８時間増殖させ
た。この培養物１ｍｌを使って、２リットルのバッフル
付三角フラスコ中のＨＹＥＭ培地５００ｍｌに接種し
た。これらの培養物（合計で４リットルの培地に対して
フラスコ８個）は３７℃で振とう（１００ＲＰＭ）しな
がら１６時間増殖させた。培養の終りに各フラスコの微
生物純度をグラム染色によって確かめた。本発明におい
ては、必ずしも同じ結果であるとは限らないが、所望に
よりクレブシェラのその他の増殖条件およびＣＰＳの精
製条件を使用し得ると理解すべきである。

【００２２】細菌細胞はソーバル（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＣ
−２Ｂ遠心分離機を使って、無菌のプラスチック製遠心
ボトル中８０００×ｇ、３０分の遠心分離を２回行うこ
とにより除去した。続いて、上清は０．８０μｍおよび
０．４５μｍミリポアフィルター（米国マサチューセッ
ツ州ベッドフォード，ミリポア・コーポレーション）を
通して濾過した。

【００２３】その後の作業は全て加圧滅菌したガラス器
具またはプラスチック器具を用いて行なった。細胞不含
の培養上清に１０％（重量／容量）原液としてのセタバ
ロン（Ｃｅｔａｖａｌｏｎ：臭化Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，
Ｎ−トリメチル−アンモニウム；Ｅ．メルク＆カンパニ
ー）を最終濃度が０．５％（重量／容量）になるまで添
加した。この混合物を室温で３０分攪拌し、沈澱物を形
成させた。生じたＣＰＳ含有沈澱物を５０００×ｇで３
０分遠心分離することにより集めた。上清を捨て、沈澱
物は１Ｍ ＣａＣｌ₂ 約１００ｍｌ中に再懸濁した。沈
澱物が溶解するまでこの混合物を室温で攪拌した。工業
銘柄のエタノールを最終濃度が８０％（容量／容量）に
なるまで添加してＣＰＳを沈澱させた。この沈澱物を５
０００×ｇで３０分遠心分離することにより集め、そし
て蒸留水約１００ｍｌに溶解した。この溶液は等容量の
クロロホルム／ブタノール（５：１）で界面相に肉眼視
できる白色沈澱物が存在しなくなるまで抽出した。一般
に３〜５回の抽出が必要だった。それぞれの抽出の後
に、この物質を１０００×ｇで１５分遠心分離して界面
相の鮮明さを高めた。界面相の物質と有機相を捨てた。
ＣＰＳ含有水相は４℃において蒸留水少なくとも２×５
０容量に対して透析した。その後透析された物質を１０
０，０００×ｇで１８時間遠心分離し（ベックマンＬ２
−６５Ｂ型，超遠心分離機）、リポ多糖（ＬＰＳ）を沈
澱させた。上清を回収し、最終濃度が８０％（容量／容
量）になるまでエタノールを加えることによりＣＰＳを
沈澱させた。

【００２４】沈澱したＣＰＳを５０００×ｇで３０分遠
心分離することにより集め、滅菌蒸留水１００〜１５０
ｍｌに溶解した。このＣＰＳ溶液（１５〜２０ｍｌ）を
既知重量の滅菌ガラスフラスコ（全容積５０ｍｌ）に分
配し、キャップをかぶせ、−７０℃で最低４〜５時間凍
結して乾燥させた。凍結乾燥後フラスコの重量を再びは
かり、初めの重量を差し引いてフラスコ中の物質の量を
求めた。この物質（４℃で貯蔵）には内容物、ロット番
号、量（ＣＰＳの重量）および生産日付に関するラベル
を付けた。

【００２５】ＣＰＳの調製物中に存在する微量のＬＰＳ
の無毒化は次のように脱アシル化することにより達成し
た。各血清型の凍結乾燥ＣＰＳ（表１に示した６種類の
菌株の各々から精製したもの）１７．５ｍｇを滅菌三角
フラスコ中の０．１Ｍ ＮａＯＨ−９５％エタノール溶
液２０ｍｌに加えた。フラスコを回転振とう機上に置い
て３７℃、７５ＲＰＭで３０分振とうした。この液体を
パスツールピペットで取り出し、この容器に無菌のリン
酸緩衝塩水（ｐＨ７．４）２０ｍｌを加えた。この溶液
は無菌の１％ＣＨ₃ ＣＯＯＨを滴下することによりｐＨ
７に下げた。ＣＰＳは４℃で一晩溶解させた。これらの
ＣＰＳ溶液（１．２ｍｇ／ｍｌ）を無菌の混合容器中で
等割合で組み合わせた。その後、この溶液は無菌条件下
に０．４５μｍフィルター（米国ニューヨーク州ロチェ
スター，ナルゲ・カンパニー）を通過させた。この無菌
溶液１ｍｌを無菌的に３ｍｌバイアル中に入れ、キャッ
プをかぶせ、−７０℃で無菌条件下に凍結乾燥した。バ
イアルは真空下で密封した。各バイアル（最終製品と呼
ぶ）は表１に示した６種類の血清型のＣＰＳをそれぞれ
５０μｇずつ含み、合計で３００μｇ含み、これを１ヒ
ト用量（ｏｎｅ ｈｕｍａｎ ｄｏｓｅ）と呼んだ。Ｃ
ＰＳ物質をＮａＯＨで処理する時間は、必ずしも等しい
結果であるとは限らないが、１５分〜６０分の範囲で変
化しうると理解すべきである。

【００２６】表１は６種類のそれぞれのクレブシェラ莢
膜多糖の化学組成、および本発明の１つの態様において
これらの多糖から製造された６価ワクチンを示す。

【００２７】

【表１】 原料ＣＰＳおよび最終製品の分析は以下に記載する通り
であった。

【００２８】タンパク質：タンパク質は標準品としてウ
シ血清アルブミン（米国ミズリー州セントルイス，シグ
マ・ケミカル・カンパニー）を使って、ローリー（Ｌｏ
ｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．），ローゼンブロー（Ｒｏｓｅｎｂｒ
ｏｕｇｈ，Ｎ．Ｊ．），ファール（Ｆａｒｒ，Ａ．
Ｌ．）およびランドール（Ｒａｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｊ．）
の“フォリンフェノール試薬によるタンパク質の測定”
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５〜２７５（１
９５１）に記載の方法により測定した。

【００２９】核酸：核酸含有量は１ｃｍのキュベット中
２６０ｍｍにおいて１ｍｇ／ｍｌＣＰＳ−蒸留水溶液の
吸光度を測定することにより定量した。換算率は次の通
りである：１光学密度単位が核酸５０μｇ／ｍｌに相等
する。

【００３０】炭水化物：炭水化物の総含有量は標準品と
してデキストランＴ−５００（スウェーデン国ウプサ
ラ，ファーマシア・ファイン・ケミカルズ）を使ってフ
ェノール／硫酸法により測定した。

【００３１】残留水分：残留水分は２６−３２１ａ型水
分アナライザー（米国カリフォルニア州モンロビア，デ
ュポン・インスツルメント）を使って測定した。

【００３２】分子量決定：各ＣＰＳの分子量はセファロ
ースＣＬ−４Ｂ（スウェーデン国ウプサラ，ファーマシ
ア・ファイン・ケミカルズ）でのクロマトグラフィーに
より測定した。９４ｃｍ×１．５ｃｍカラムはブルーデ
キストラ２０００（ＢｌｕｅＤｅｘｔｒａ ２０００；
スウェーデン国ウプサラ，ファーマシア・ファイン・ケ
ミカルズ）を使ってボイド容積（Ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍ
ｅ）を測定し、またＣ₁₄−酢酸を使って総カラム容積を
測定した。ＣＰＳの５ｍｇ試料を２ｍｌのリン酸緩衝塩
水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に加えた。このカラムをＰＢ
Ｓで溶離し、フェノール／硫酸法を使って各分画（２．
５ｍｌ）の炭水化物含有量について分析した。ワクチン
の分配定数（Ｋｄ）はワング（Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｈ），バ
ーレラ（Ｂａｒｒｅｒａ，Ｏ．），サットン（Ｓｕｔｔ
ｏｎ，Ａ．），メイ（Ｍａｙ，Ｊ．），ホッチスタイン
（Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｈ．），ロビンス（Ｒｏｂ
ｂｉｎｓ，Ｊ．Ｂ．），パークマン（Ｐａｒｋｍａｎ，
Ｐ．Ｄ．），セリグマン（Ｓｅｌｉｇｍａｎｎ，Ｅ．
Ｂ．）の“髄膜炎菌ワクチン，グループＡおよびグルー
プＣ多糖類の標準化および調節”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａ
ｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ５；１９７〜２１５，１９
７７ に記載されるごとく計算した。

【００３３】ＫＤＯ：ＬＰＳの一成分である２−ケト−
３−デオキシオクトネート（ＫＤＯ）はオスボーン（Ｏ
ｓｂｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．）の“グラム陰性細胞壁Ｉに関す
る研究，ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のリポ多糖における２−ケト−３
−デオキシオクトネートの役割についての証明”Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５０：４９
９〜５０６，１９６３に記載されるようにして定量し
た。

【００３４】６種類の血清型のＣＰＳの化学組成は表１
に示す。ＣＰＳ調製物は主に炭水化物から成り、微量の
タンパク質、核酸およびＬＰＳが存在していた。

【００３５】各ＣＰＳ調製物はそれぞれ希ＮａＯＨで処
理した。ＮａＯＨ処理の前後に、ＣＰＳ調製物は分子量
およびウサギに静脈内投与した際の発熱性について分析
した。表２を参照されたい。ＣＰＳの免疫原性はそれら
の比較的大きな分子量と関係があり、またヒトに非経口
投与した際のＣＰＳの安全性はワングたちの上記文献に
記載されるようにウサギにおける発熱性と逆の関係にあ
ることが知られている。従って、理想的なＣＰＳ調製物
は高分子量を有し、しかも非発熱性であるだろう。全て
の天然クレブシェラＣＰＳは高分子量を有し（セファロ
ースＣＬ−４Ｂ上にてＫｄが０．１に等しいかまたはそ
れより小さい）、大部分の炭水化物はＫｄ＝０．５に達
する前に溶出された。ＮａＯＨ処理はこれらの特性に対
してほとんど影響を及ぼさなかった。天然ＣＰＳはウサ
ギに対して０．１μｇ／ｋｇ（またはそれ以下）〜１．
０μｇ／ｋｇの最小発熱用量（ＭＰＤ）を有していた
（表２参照）。ＮａＯＨ処理後に、ＭＰＤはいくつかの
血清型において５０μｇ／ｋｇ以上に増加し、試験した
全ての血清型において発熱性は最低で２０倍減少した。
それ故、クレブシェラＣＰＳのＮａＯＨによる処理は非
発熱性の高分子量抗原分画をもたらす。

【００３６】表２は上記の莢膜多糖を水酸化ナトリウム
で処理することによる分子量および発熱性に対する影響
を示すものである。

【００３７】

【表２】 次に、６価クレブシェラＣＰＳワクチンを処方した。こ
のワクチンは表１に示した６種類のクレブシェラ菌株に
由来するＮａＯＨ処理ＣＰＳを５０μｇずつ含んでいた
（１ヒト用量は抗原の合計量３００μｇに等しい）。こ
のワクチンの特性は次の通りである： １）ワクチンは動物に対して無毒性であった。腹腔内経
路で１ヒト用量のワクチンを投与されたマウスまたはモ
ルモットには死亡が全く観察されなかった。さらに、ワ
クチン投与後に正常の体重増加曲線を示した。

【００３８】２）ワクチンはウサギに対して非発熱性で
あった。ワクチン５０μｇ／ｋｇ（ウサギの体重）の投
与は＋０．３℃以下の発熱応答を誘発した。

【００３９】３）ワクチンは高分子量であった。セファ
ロースＣＬ−４Ｂカラムでクロマトグラフ処理を行なっ
たときワクチンのＫｄは０であり（カラムのボイド容積
に等しい）、９９％以上の物質が０．５以下のＫｄで溶
出された。

【００４０】４）ワクチンは主に炭水化物（７２．８
％、乾燥重量）から成り、微量のタンパク質（１．６４
％）、核酸（０．９４％）およびＫＤＯを含んでいた。
残留水の含有量は９．３％であった。

【００４１】５）ワクチンは無菌の凍結乾燥白色粉末と
して得られた。

【００４２】６価クレブシェラＣＰＳワクチンのヒトに
おける安全性および免疫原性：ボランティアは年令が２
２才から６２才までの健康な男性および女性であった。
使用直前にワクチンを滅菌蒸留水で調製した。このワク
チン（０．５ｍｌ）を三角筋領域に皮下投与した。ワク
チン投与後５日間、ボランティアは発熱、局所の痛み、
腫れ、紅斑、硬結、頭痛および倦怠感を含めてワクチン
接種に対する諸反応を記録した。静脈血の試料をワクチ
ン接種時およびワクチン接種後１４日目と２８日目に各
自から採取した。血清を集めて−２０℃で保存した。

【００４３】約３５％（２２人のうち８人）の人が２４
時間続く軽い痛みを感じたと報告した。３人のボランテ
ィアは倦怠感と軽い頭痛によって特徴づけられる全身反
応を示した。全ての症状は発生後２４〜４８時間以内に
自然に消え失せ、いかなる場合にもワクチンの正規の活
性を制限しなかった。

【００４４】酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
により測定した６種類のワクチン成分のそれぞれに対す
る免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）応答を表３に示す。ワク
チン接種者の８２％（Ｋ３）〜９５％（Ｋ２）が４倍ま
たはそれ以上のＩｇＧ力価の増加を応答して、このワク
チンがヒトにおいて高度の免疫原性を有することが判明
した。ワクチン投与後のＩｇＧ力価の平均増加は５倍
（Ｋ２１）ないし１８．６倍（Ｋ２）の範囲であった。

【００４５】表３はヒトボランティアにワクチンを非経
口投与した後の抗−莢膜多糖免疫グロブリンＧ抗体の応
答を示す。

【００４６】

【表３】 ６価クレブシェラＣＰＳワクチンによって誘発された免
疫応答の防御能力を確かめるために、次の実験を行なっ
た。免疫後にＫ２ＣＰＳに対して４倍またはそれ以上の
力価増加を示した１０人のボランティアの血清からＩｇ
Ｇを単離した。また、免疫前にもこれらのボランティア
からＩｇＧを採取した。マウス（２０ｇの雌，ＮＭＲＩ
株）にはそれぞれ尾の静脈から塩水０．３ｍｌ中のＩｇ
Ｇ２．３ｍｇを投与した。約２４時間後にマウスをやけ
どさせ、前記のような種々の毒性クレブシェラ血清型２
菌株を用いて対抗（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）させた。結果
を表４に示す。ＥＬＩＳＡ検定法で測定して検出できな
い量（力価２より小）の特異的抗Ｋ２莢膜抗体を有して
いた免疫前ＩｇＧは、致命的な敗血症の予防に効果がな
かった（死亡率６０〜１００％）。高度に有意な防御
（ｐ＜０．０５ないしｐ＜０．０１）は、高レベル（力
価＝２５６）の抗Ｋ２ＣＰＳ抗体を有していた免疫Ｉｇ
Ｇによって５種類のクレブシェラＫ２対抗菌株全部に対
して得られた。これらの結果は、クレブシェラＣＰＳの
投与により誘発されたヒトのＩｇＧ抗体応答がクレブシ
ェラ感染に対して高度に有意な防御を与えうることを示
している。さらに、防御応答は菌株特異性ではなく、す
なわち抗莢膜血清型２抗体は５種類全部の莢膜血清型２
−保有対抗菌株からの防御をもたらした。

【００４７】表４は致命的なクレブシェラ感染症に対す
る誘発された抗莢膜多糖ＩｇＧ抗体応答の防御能力を示
すものである。

【００４８】

【表４】 表３および表４のデータを要約すると、６価ワクチンへ
処方されたＮａＯＨ処理クレブシェラＣＰＳはヒトボラ
ンティアに対して安全であり且つ免疫原性を有すること
が判明した。８０％以上のワクチン接種者が個々のワク
チン成分に対して有意な（４倍またはそれ以上の増加）
ＩｇＧ抗体応答を示した。上記ワクチンでの免疫化によ
って誘発されたヒトＩｇＧ抗体をマウスに受動転移する
と、その抗体は致命的なクレブシェラ感染に対して高度
に有意な防御を与えることができた。対照的に、免疫前
に同じボランティアから調製したＩｇＧは致命的なクレ
ブシェラ感染に対して何らの防御も与えなかった。

【００４９】６価クレブシェラワクチンを使用するヒト
超免疫抗クレブシェラグロブリンの調製：上記の６価ク
レブシェラＣＰＳワクチンを用いてボランティアを免疫
化した。約６週間後、免疫後に６種類全部のワクチン成
分に対して４倍またはそれ以上のＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力
価の増加を示した１３人から静脈血（１人あたり平均し
て２４０ｍｌ）を採取した。静脈内使用のためのガンマ
グロブリン（ＩＶＩＧ）はエタノール分画化、イオン交
換クロマトグラフィー、限外濾過および透析により粗採
取血清から調製した。タンパク質含有量を５０ｍｇ／ｍ
ｌに調節し、この調製物を安定剤溶液中で凍結乾燥し
た。この凍結乾燥調製物をクレブシェラ免疫ＩＶＩＧと
呼ぶ。ＩＶＩＧ調製物であるグロブマン（Ｇｌｏｂｕｍ
ａｎ；スイス国ベルン，スイス血清ワクチン研究所）
は、出発粗製ヒト血漿プールが６価クレブシェラＣＰＳ
ワクチンで免疫化されていないヒト供与者から得られた
（すなわち正常のヒト血清である）ことを除いて、同じ
方法で調製された。

【００５０】クレブシェラ免疫ＩＶＩＧは実質的にグロ
ブマンよりも高いＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価（１６倍ない
し１２８倍）を有していた。表５を参照されたい。さら
に、クレブシェラ免疫ＩＶＩＧのみが、インビトロ系で
試験した場合に、オプソニン形成を促進でき且つその後
６種類の血清型の試験菌株（ワクチン中にこれらの菌株
の莢膜抗原が含まれる）の全てを殺滅し得ることがわか
った。表６を参照されたい。この種の“オプソニン”Ｉ
ｇＧ抗体の誘発は免疫ＩＶＩＧの防御能力にとってきわ
めて重要である。なぜなら、病気の状態でのクレブシェ
ラの排除が抗体に依存する食作用および殺滅によると考
えられるからである。

【００５１】表５は正常ヒト血清から得られた調製物と
比較した場合の、６価ワクチンで免疫化した供与者の血
清から得られた免疫静脈内ガンマグロブリンの抗莢膜Ｉ
ｇＧ抗体の力価を示す。

【００５２】

【表５】 表６はクレブシェラ試験菌株の食作用および殺滅を促す
上記の免疫ガンマグロブリンの能力を示す。

【００５３】

【表６】 致命的なクレブシェラ火傷敗血症を予防するグロブマン
およびクレブシェラ免疫ＩＶＩＧの能力について測定し
た。マウス（１８〜２０ｇの雌，ＮＭＲＩ株）はそれぞ
れ段階的用量のＩＶＩＧ調製物（５ｍｇ／ｋｇ〜５００
ｍｇ／ｋｇ）または５００ｍｇ／ｋｇのヒトアルブミン
（アルブマン；スイス国ベルン，スイス血清ワクチン研
究所）を０．２ｍｌの容量で静脈内投与された。約２４
時間後マウスをやけどさせ、６０個の肺炎桿菌莢膜型２
細菌を感染させた。その結果を表７に示す。対照として
ヒトアルブミンを投与されたマウス群の死亡率は８７％
であった。Ｋ２抗原（クレブシェラ対抗菌株によって発
現される）に対して３２のＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価を有
するグロブマンは、試験した最高用量（５００ｍｇ／ｋ
ｇ）においてのみ有意な防御（Ｐ＜０．０１）を示し
た。対照的に、クレブシェラ免疫ＩＶＩＧは５ｍｇ／ｋ
ｇ程度の低用量（グロブマンの１／１００の用量）で良
好な防御を与えた。

【００５４】表７は致命的なクレブシェラ感染症に対す
る免疫ガンマグロブリンと正常ガンマグロブリン（グロ
ブマン）との防御能力（重量基準による）の比較を示
す。

【００５５】

【表７】 表５〜７からのデータを要約すると、６価クレブシェラ
ＣＰＳワクチンで免疫されたボランティアの採取血清か
ら調製したＩＶＩＧ（クレブシェラ免疫ＩＶＩＧ）は、
正常ヒトの採取血清から調製したＩＶＩＧと比較した場
合、６種類のワクチン成分に対して実質的により高いＩ
ｇＧ力価を有する。クレブシェラ免疫ＩＶＩＧのみが６
種類全部のクレブシェラ試験菌株の食作用およびその後
の殺滅を促進した。クレブシェラ免疫ＩＶＩＧの防御能
力は、同一方法で正常ヒト血清から得たＩＶＩＧと比較
して１００倍以上（重量基準）であった。

【００５６】次に、２４種類のクレブシェラ血清型から
成る多価ワクチンを調製した。ヨーロッパおよび北アメ
リカの１３の臨床センターから集めた全部で７０３のク
レブシェラ血液単離物の莢膜血清型について研究した。

【００５７】莢膜血清型の研究はパルフレイマン（Ｐａ
ｌｆｒｅｙｍａｎ，Ｊ．Ｍ．）の“カウンター免疫電気
泳動によるクレブシェラ血清型の分類”，ジャーナル・
オブ・ハイジーン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｙｇｉｅ
ｎｅ），８１巻２号，２１９〜２２５頁，１９７８年１
０月に記載のごとく行なった。全出現頻度を表８に示
す。これらの血清型から、クレブシェラ血清型を含む特
に有効な多価ワクチンを以下のようにして調製した。あ
る種の血清型のクレブシェラ莢膜多糖によるワクチン接
種は、他のある種の血清型に対する抗体の産生をも促進
するということが認められた。こうして、例えば血清型
２のＣＰＳワクチンの投与は血清型２，６９および１に
対する抗体の産生を促進し；血清型２１のＣＰＳワクチ
ンの投与は血清型２１および１１に対する抗体の産生を
促進し；血清型３のＣＰＳワクチンの投与は血清型３お
よび６８に対する抗体の産生を促進し；血清型１０のＣ
ＰＳワクチンの投与は血清型１０および７に対する抗体
の産生を促進し；そして血清型６４のＣＰＳワクチンの
投与は血清型６４および１４に対する抗体の産生を促進
する。ある種の血清型のこの交叉反応性は必ずしも相互
補足的であるとは限らない。例えば、血清型３５のＣＰ
Ｓワクチンの投与は血清型３５および３３に対する抗体
の産生を促進するが、その促進の程度は血清型３３のＣ
ＰＳワクチンの投与が血清型３３および３５に対する抗
体の産生を促進する程度よりも一層大きいものである。

【００５８】さらに、表８に示すように、血清型１およ
び３９は絶対的意味での相対頻度で現われるが、これら
の血清型は今までのところ特定の地域に特有のものであ
って、一般用途のワクチンにはあまり適していない。し
かしながら、これらの血清型を含むワクチンは、これら
の血清型が出現する特定の地域において有益に利用され
るであろう。また、クレブシェラ血清型２７はある程度
の頻度で現われるが、この血清型のＣＰＳの混入はクレ
ブシェラ血清型２７の出現と強直性脊椎炎との間に起こ
りうる関連性ゆえに全ての場合に適しているとは限らな
い。

【００５９】有効な多価クレブシェラワクチンを開発す
る際に、十分変化にとんだ血清型のＣＰＳを混入して適
度の防御を賦与することが重要である。しかしながら、
血清型の数を正当化し得る数に制限することも大切であ
る。これに関して、表８に示したあらゆる血清型のＣＰ
Ｓを単一のワクチン内に混入することは望ましくないか
も知れない。全ての血清型を含むワクチンは、効果がな
く且つ若干の医師にとって倫理的でない上に、多くの場
合にワクチン接種者の不快感を強め、抗原の過負荷をも
たらし、そしてより少数の異なる血清型を含むワクチン
から誘発されるはずの免疫応答を抑制する恐れがある。

【００６０】本発明によれば、種々の血清型の組合せを
含む多数のワクチンが可能であるが、好適な多価ワクチ
ンはクレブシェラ血清型２，３，５，９，１０，１５，
１６，１７，１８，２１，２２，２５，２８，３０，３
５，４３，５２，５３，５５，６０，６１，６２，６３
および６４を含むもの；クレブシェラ血清型２，３，
５，９，１０，１５，１６，１７，１８，２１，２２，
２５，２８，３０，３５，３９，４３，５２，５３，５
５，６０，６１，６２，６３および６４を含むもの；お
よびクレブシェラ血清型２，３，５，９，１０，１５，
１６，１７，１８，２１，２２，２５，２７，２８，３
０，３５，４３，５２，５３，５５，６０，６１，６
２，６３および６４を含むものである。

【００６１】

【表８】 次の実施例では、６価ワクチンに関して先に述べたよう
にＮａＯＨ処理莢膜多糖の血清型を組み合わせて、次の
２４種類の血清型：２，３，５，９，１０，１５，１
６，１７，１８，２１，２２，２５，２７，３０，３
５，４３，５２，５３，５５，６０，６１，６２，６３
および６４のＣＰＳ誘導体を含むワクチンを調製した。
このワクチンは凍結乾燥した。１ヒト用量は各抗原を５
０μｇずつ、合計で１２００μｇ含んでいた。５人の健
康な成人ボランティアはそれぞれ０．５ｍｌ中のワクチ
ン１用量を皮下投与された。１人のボランティアは注射
部位に痛みを感じ、この痛みは免疫の４時間後に始まっ
て約２４時間持続した。ワクチン注射後２８日目に静脈
血を採取し、この血清はＣＰＳワクチン成分に対するＩ
ｇＧ力価についてＥＬＩＳＡにより分析した。その結果
を表９に示す。

【００６２】

【表９】 要約すると、ワクチン中に含まれる２４種類の血清型の
クレブシェラＣＰＳの全ては、ヒトに非経口投与した際
に、特異的ＩｇＧ抗体応答を誘発することが出来た。

【００６３】本発明の好適な実施態様についてここに説
明したが、当業者なら種々の変更ならびに修飾（特に、
混入される莢膜多糖の血清型の数に関するようなワクチ
ン処方の変更）が本発明の範囲から逸脱することなくな
し得ることは明らかだろう。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 脱アシル化剤による処理によって混入し
   ているリポ多糖類を無毒性にした、本質的に純粋な莢膜
   多糖類からなる免疫原性クレブシェラワクチン。
2. 【請求項２】 莢膜多糖類が、１−５％ハイケース−Ｓ
   Ｆ、０．１−１％酵母エキスおよび１−１０％マルトー
   スからなる培地中で培養されたクレブシェラの培養上清
   物から精製される、請求項１記載の本質的に純粋な莢膜
   多糖類からなる免疫原性クレブシェラワクチン。
3. 【請求項３】 莢膜多糖類の平均分子量が１×１０⁶ ダ
   ルトンである、請求項１記載の本質的に純粋な莢膜多糖
   類からなる免疫原性クレブシェラワクチン。
4. 【請求項４】 クレブシェラ細菌から本質的に純粋な莢
   膜多糖類混合物を得て；上記莢膜多糖類を脱アシル化剤
   で処理し；そして該莢膜多糖類からなる非発熱性の免疫
   原性ワクチンを回収する；工程からなるクレブシェラワ
   クチンの製法。
5. 【請求項５】 上記脱アシル化剤が水酸化カリウムから
   なる請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 上記脱アシル化剤が水酸化カリウム、水
   酸化リチウムまたは水酸化アンモニウムからなる群から
   選択される請求項４記載の方法。
7. 【請求項７】 莢膜多糖類がハイケース−ＳＦ、酵母エ
   キスおよびマルトースからなる培地中で培養されるクレ
   ブシェラの培養上清物から精製される請求項４記載の方
   法。