DK172282B1 - Kapselpolysaccharid-vaccine mod Klebsiella og fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

i DK 172282 B1

Den foreliggende opfindelse angår polyvalente immuniserende præparater sammensat af ikke-toxiske serotype-specifikke polysaccharid-præparater.

5 Nærmere bestemt angår den her beskrevne opfindelse behandlingen af rensede kapselpolysaccharider (CPS) afledt fra baciller af Klebsiella-arter, i det følgende benævnt "Klebsiella", med et deacylerende middel, såsom natriumhydroxid (NaOH), til opnåelse af et ikke-pyrogent immuno-10 gent CPS-præparat. Sådanne immunogene CPS'er af Klebsiella-arter kan anvendes til frembringelse af beskyttelse imod Klebsiella-infektioner. En vaccine formuleret på basis af sådanne antigener kan anvendes til aktiv immunisering af individer, som har risiko for Klebsiella-15 infektioner.

Den hyppighed, hvormed der forekommer infektioner, som skyldes Gram-negative aerobe baciller, såsom Klebsiella, er forøget dramatisk i løbet af de seneste tre årtier, 20 hvilket er sammenfaldende med den udstrakte anvendelse af bredspektrerede antibiotika. Blandt disse infektioner medfører de tilstande, der kan klassificeres som lungebetændelse eller bakteriæmi, de højeste ledsagende dødelighedstal, som gennemsnitligt er omkring 25%, og som befin-25 der sig i intervallet fra 10 til 50%. Som det er beskrevet af McGowan, J.E., Barnes, M.W., og Finland, M., "Bacteremia at Boston City Hospital: occurrence and mortality during 12 selected years (1935 - 1972), with special reference to hospital acquired cases", J. Infect. Dis. 132: 30 316-335, 1975; Bryan C.S., Reynolds, K.L., og Brenner, E.R., "Analysis of 1186 episodes of gram-negative bacteremia in non-university hospitals: the effect of antimicrobial therapy", Rev. Infect. Dis. 5: 629-638, 1983;

Graybill, J.R., Marshall, L.W., Charache, P., Wallace, 35 C.K., og Melvin, V.B., "Nosocomial pneumonia. A continu ing major problem", Am. Rev. Resp. Dis. 108: 1130-1140, 2 DK 172282 B1 1973; og Cross, A., Allen, J.R., Burke, J., Ducel, G., Harris, A., John, J., Johnson, D., Lew, M, MacMillan, B., Meers, P., Skalova, R., Wenzel, R., og Tenney, J., "Nosocomial Infections due to Pseudomonas aeruginosa: review 5 of recent trends", Rev. Infect. Dis. 5(Suppl.): S837- S845, 1983, er Klebsiella en fremtrædende årsag til så danne livstruende infektioner, idet den er den hyppigst isolerede Gram-negative bakterie fra de nedre luftveje og den næsthyppigste årsag til bakteriæmi. For øjeblikket 10 eksisterer der ikke nogen effektive immunologiske metoder til kontrol af Klebsiella-infektioner.

Talrige bakteriearter, heriblandt Klebsiella, har en veldefineret kapsel, som omgiver bakteriecellen i et viskost 15 lag. Kapslen er sammensat af gentagne enheder af monosac-charider, som danner en polymer med høj molekylvægt. Sådanne kapselpolysaccharider (CPS) bibringer K (eller kapsel-) antigenisk specificitet til deres respektive bakterieceller .

20

Undersøgelser, eksempelvis som beskrevet af Riottot, M.M., Fournier, J.M. og Pillot, J., "Capsular serotype specificity of the protection conferred on mice by Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations", Infect. Immun.

25 2A: 476-482, 1979; Riottot, M.M., Fournier, J.M., og

Jouin, H., "Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations", Infect. Immun. 31_: 71-77, 1981; og Cooper, J. McA., og Rawley, 30 D., "Resistance to Klebsiella pneumoniae and the impor tance of two bacterial antigens", Austral. J. Expt. Biol. Med. Sci. ^0: 629-641, 1982, har vist, at en eksperimentel ribosomal vaccine, dvs. en vaccine udvundet fra præparationer af ribosomer, og en eksperimentel dræbt vacci-35 ne bestående af hele celler er i stand til at tilvejebringe en vis grad af beskyttelse imod Klebsiella- 3 DK 172282 B1 infektioner i eksperimentelle dyremodeller. Beskyttelsen viste sig at være i overensstemmelse med induktionen af et serotype-specifikt anti-CPS-immunrespons. Forsøg på at fremkalde et beskyttende immunrespons hos mus gennem vac-5 cination med CPS er imidlertid foreløbigt faldet mindre heldigt ud, og de mangelfulde resultater er blevet tilskrevet den ringe immunogenicitet af CPS i mus, således som det er bemærket af J.M. Fournier, C. Jolivet-Reynaud, M.M. Riottot og H. Jouin, Infectc. Immun. 32: 420-426, 10 1981.

Det har nu overraskende vist sig, at man kan opnå immunogene præparater af CPS fra supernatanten af Klebsiella dyrket i et medium, som er beregnet til at understøtte 15 dannelsen af kapsler. Disse CPS-antigener kan derefter oprenses til høj renhed, og det herved opnåede høj trensede produkt er blevet påvist at være iramunogent og ikke-pyrogent i dyr som beskrevet af Cryz, S.J., Jr., Furer, E., og Germanier, R., "Purification and vaccine potential 20 of Klebsiella capsular polysaccharide", Infect. Immun.

50: 225-280, 1985; og Cryz, S.J., Jr., Furer, E., og Germanier, R., "Safety and Immunogenicity of Klebsiella pneumoniae Kl Capsular Polysaccharide Vaccine in Humans",

The Journal of Infectious Diseases, Vol. 151, No. 4, 25 April 1985. Endvidere, som anført i Cryz, S.J., Jr., Furer, E., og Germanier, R., "Prevention of fatal experimental burn wound sepsis due to Klebsiella pneumoniae KP1-0 by immunization with homologous capsular polysaccharide", J, Infect. Dis. 150: 817-822, 1984, og Cryz, 30 S.J., Jr., Fiirer, E. og Germanier, R., "Protection against fatal Klebsiella pneumoniae burn wound sepsis by passive transfer of anticapsular polysaccharide", Infect. Immun. 45: 139-142, 1984, har anti-serotype-specifikke CPS vist sig at være særdeles effektive til at forebygge 35 dødelige eksperimentelle Klebsiella-infektioner.

4 DK 172282 B1

Ifølge et første aspekt af opfindelsen tilvejebringes en immunogen polyvalent Klebsiella-vaccine omfattende relativt rene kapselpolysaccharider af serotyperne 2, 3, 5, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 28, 30, 35, 43, 52, 5 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64.

Ifølge et andet aspekt af opfindelsen tilvejebringes en immunogen polyvalent Klebsiella-vaccine omfattende relativt rene kapselpolysaccharider af serotyperne 2, 3, 5, 10 9, 10, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 28, 30, 35, 39, 43, 52, 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64.

Ifølge et tredje aspekt af opfindelsen tilvejebringes en immunogen polyvalent Klebsiella-vaccine omfattende rela-15 tivt rene kapselpolysaccharider af serotyperne 2, 3, 5, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 27, 28, 30, 35, 43, 52, 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64.

Opfindelsen tilvejebringer også en fremgangsmåde til 20 fremstilling af en polyvalent Klebsiella-vaccine, hvilken fremgangsmåde er særegen ved, at den omfatter trinene: man udvinder en relativt ren kapselpolysaccharidblanding fra Klebsiella-bakterier af serotyperne 2, 3, 5, 9, 10, 25 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 28, 30, 35, 43, 52, 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64; behandler kapselpolysacchariderne med et deacetylerende middel; 30 udvinder kapselpolysacchariderne; og kombinerer i det mindste en del af kapselpolysacchariderne af hver serotype til dannelse af en ikke-pyrogen immu-35 nogen vaccine.

5 DK 172282 B1

Blandingen kan desuden indeholde kapselpolysaccharid af serotype 39 eller 27.

Opfindelsen vil nu blive beskrevet mere detaljeret ved 5 hjælp af et eksempel.

Den foreliggende opfindelse er rettet mod et immuniserende præparat sammensat af rensede serotype-specifikke kap-selpolysaccharider fra Klebsiella. Dette hidtil ukendte 10 immuniserende middel fremstilles ved at kombinere passende serotyper af kapselpolysaccharider (CPS), opnået ved kapsel-serotype-bestemmelse af Klebsiella-isolater fra humant blod, med et deacyleringsmiddel, såsom NaOH. Disse polyvalente vacciner er nyttige til aktiv immunisering 15 imod Klebsiella-infektioner, når de indgives ad parenteral eller oral vej eller gennem næse-svælg-rummet. Disse vacciner kan også indgives ad parenteral vej med henblik på at forøge serumniveauerne af antistoffer mod de nævnte CPS.

20

En sikker og immunogen polyvalent serotype-specifik Kleb-siella-vaccine på basis af kapselpolysaccharider er således nu blevet fremstillet ved den hidtil ukendte fremgangsmåde, som består i at behandle rensede Klebsiella-25 kapselpolysaccharider med et deacylerende middel, såsom fortyndet natriumhydroxid. Kapselpolysacchariderne opnås ved at dyrke stammer af Klebsiella med kendt kapsel-serotype på et medium, som er beregnet til at fremme en sådan produktion. Kapselpolysacchariderne oprenses ved 30 samtidig udfældning med et detergens, udfældning med ethanol, ekstraktion med organiske opløsningsmidler og ul-tracentrifugering. De rensede kapselpolysaccharider behandles derefter med fortyndet natriumhydroxid for at de-toxificere det samtidigt udfældede toxiske lipopolysac-35 charid. De resulterende kapselpolysaccharider har en molekylvægt, som er 1 x 106 dalton eller derover, og de er 6 DK 172282 B1 immunologisk reaktive med hensyn til tilsvarende naturligt forekommende kapselpolysaccharider. Endvidere er de ikke-toxiske over for mus og marsvin, og de er relativt ikke-pyrogene (eksempelvis svarende til en stigning i le-5 gemstemperatur på højst 0,3 °C) i kaniner, når der anvendes doser på mindst 5 pg/kg legemsvægt.

Den polyvalente Klebsiella-vaccine ifølge opfindelsen er sikker og immunogen ved anvendelse på mennesker. Vaccinen 10 inducerer dannelsen af opsonisk antistof, som udviser beskyttelse imod dødelige eksperimentelle Klebsiella-infektioner.

Som tidligere nævnt har foreløbige undersøgelser vist, at 15 en eksperimentel ribosomal vaccine og en eksperimentel dræbt vaccine på basis af hele celler er i stand til at yde beskyttelse imod Klebsiella-infektioner i eksperimentelle dyremodeller, og denne beskyttelse har vist sig at have sammenhæng med induktionen af et serotype-specifikt 20 anti-CPS-immunrespons. De hidtidige forsøg på at tilvejebringe et beskyttende immunrespons i mus ved vaccination med renset CPS har imidlertid, i det mindste i nogle tilfælde, ført til utilfredsstillende resultater.

25 Som beskrevet i de tidligere nævnte publikationer af Cryz et al har man isoleret og oprenset CPS fra supernatanten af Klebsiella KP1-0 (serotype 1) kulturer. CPS blev co-præcipiteret fra den celle-fri supernatant af kulturen ved tilsætning af et detergens, såsom Cetavalon (N-cetyl-30 N,N-N-trimethylammoniumbromid). CPS'et blev separeret fra detergenset ved at opløse bundfaldet i 1 M CaCl2, hvorefter CPS'et blev fjernet fra opløsningen ved tilsætning af ethanol til en koncentration på 80% (v/v). Derefter blev CPS'et opløst i destilleret vand og ekstraheret omhygge-35 ligt med et tilsvarende volumen chloroform/butanol (5:1). Den vandige fase blev opsamlet, dialyseret imod destille- 7 DK 172282 B1 ret vand til fjernelse af spor af de organiske opløsningsmidler og derefter centrifugeret ved 100 000 x g i 16 timer til fjernelse af størstedelen af det tilstedeværende lipopolysaccharid (LPS). Den CPS-holdige superna-5 tant blev opsamlet, og der tilsattes ethanol indtil en koncentration på 80% (v/v) til udfældning af CPS. Det udfældede CPS blev opløst i destilleret vand og lyofilise-ret. Det på denne måde fremstillede CPS bestod primært af carbonhydrat og havde en molekylvægt på over 1 x 106 som 10 bestemt ved gelfiltreringschromatografi. De antisera, der dannedes som respons på immuniseringen af kaniner med renset CPS, viste sig at beskytte mus imod dødelig K. pneumoniae KP1-0 sepsis. På lignende måde blev mus, som var blevet aktivt immuniseret med renset KP1-0 CPS, be-15 skyttet imod dødelig K. pneumoniae KP1-0 sepsis.

K. pneumoniae KP1-0 CPS viste sig at fremkalde et specifikt immunrespons ved indgivelse ad subcutan vej til mennesker. Denne immunisering medførte imidlertid en høj 20 forekomst af lokale reaktioner, som var karakteriseret ved smerter, opsvulmen og rødmen, og som skyldtes lave niveauer af LPS, der kontaminerede CPS"et. Ifølge opfindelsen detoxificeres det kontaminerende LPS ved deacyle-ring, som foretages ved at behandle det lyofiliserede CPS 25 i en 0,1 M NaOH - 95% (vol/vol) ethanolopløsning. Denne procedure bevirker en mærkbar reduktion af pyrogenicite-ten af CPS som bestemt ved intravenøs indgivelse til kaniner. Desuden viste det sig, at sådanne NaOH-behandlede CPS'er var tilsvarende immunogene i mennesker med en væ-30 sentligt reduceret forekomst af lokale reaktioner efter injektion. Humant immunoglobulin G (IgG) fremkaldt som respons på immuniseringen med CPS har vist sig at frembyde en høj grad af beskyttelse imod dødelige K. pneumoni-ae-infektioner ved passiv overføring til mus. Det skal 35 forstås, at også andre deacylerende midler, såsom kalium- 8 DK 172282 B1 hydroxid, lithiumhydroxid og ammoniuitihydroxid, kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse.

Disse og andre karakteristika ved den foreliggende opfin-5 delse vil fremgå mere klart, når den følgende detaljerede beskrivelse af en foretrukken udførelsesform for opfindelsen læses i sammenhæng med de ledsagende tabeller. Disse tabeller har følgende betydninger: 10 Tabel 1 viser den kemiske sammensætning af seks individuelle Klebsiella-kapselpolysaccaharider og en hexavalent vaccine fremstillet ud fra disse polysaccharider ifølge en foretrukken udførelsesform for opfindelsen.

15 Tabel 1

Klinisk sammensætning af individuelle Klebsiella-kapsel-polysaccharider

Fremstilling KomponentA

20 (% tørvægt)

Carbon- Nuclein- Pro- Rest-_hydrat syrer_tein fugtighed KDO1 K2 polysaccharid 79,6 1,32 1,03 9,5 0,04 25 K3 polysaccharid 73,7 0,88 0,73 8,5 0,10 K10 polysaccharid 56,3 1,59 3,39 7,7 0,15 K21 polysaccharid 70,7 0,97 1,57 9,5 0,06 K30 polysaccharid 70,1 0,55 2,44 11,5 0,16 K55 polysaccharid 63,2 0,36 0,71 9,2 0,04 30 1 KDO = 2-keto-3-deoxyoctonat. Specifik analyse for tilstedeværelse af LPS.

Tabel 2 viser virkningen af at behandle de ovennævnte 35 kapselpolysaccharider i natriumhydroxid med hensyn til molekylvægt og pyrogenicitet.

9 DK 172282 B1

Tabel 2

Virkning af natriumhydroxid-behandling på molekylvægt og

pyrogenicitet af Klebsiella-CPS

5 Serotype NaOH- Kd 1 Kd< 0, 5 (%)1 MPD 1 af CPS behandling_(pg)_ 2 Nej 0, 04 99, 4 <0,1

Ja 0, 03 99,2 >10 10 3 ' Nej 0,04 98 0,5

Ja 0,05 98 >10 10 Nej 0, 03 98, 3 <0,1 15 Ja 0, 09 99,2 >10 21 Nej 0, 10 98,3 0,5

Ja 0,05 99,2 >10 20 30 Nej 0,05 99 1

Ja 0,02 100 >50 55 Nej 0,1 99,7 1

Ja 0,06 99, 2 50 25 1 Som bestemt ved chromatografi over Sepharose CL-4B som tidligere beskrevet af Wong, K.H., Barrera, O., Sutton, A., May, J., Hochstein, D.H., Robbins, J.B., Parkman, P.D. og Seligman, E.B., Jr. i "Standardiza-

30 tion and control of meningococcal vaccines, group A

and group C polysaccharides", J. Biol. Standardization 5: 197-215, 1977.

MPD = minimal pyrogen dosis, som defineres som den 35 mindste mængde antigen, der ved intravenøs indgivelse til kaniner vil frembringe en forøgelse af legemstemperaturen på +0,3 °C. Mængden af antigen udtrykkes som pg/ml/kg kanin-kropsvægt.

10 DK 172282 B1

Tabel 3 viser responset på anti-kapselpolysaccharid-immunoglobulin G-antistof efter parenteral indgivelse af vaccinen til frivillige forsøgspersoner.

DK 172282 B1

CM

ro L-Π (\]

LΓ) v CM

tf X CN

æ æ ° c ro S' H ro oo υ 1 00 O o ™ i

(0 ro Z, “ CM U

> Ui r> cd cm S

* ^ cd' ^ 2 -H

□ Γ- CD 1-1 1-1 4-0

1—1 I

® fi w ^ 00 3 η - ω N g S η Η H g

JO (ti II -H

Π > CM CM I

^ u v v 8 C % S *> * " ft ^ -S « ' 2 *

g i- -V ^ -H

> M O „ o

* ® 0 CD -H

0 ij -H cn G

S Π T3 — CM to a ^ i4 CD I g

3 φ $ ! s ^ 5 I

* 3 $ * v esI n S ω c ω 2 Jr v \ . 01 °·Η m P o o Crn

•HOd ^ ^ .-Η ΓΜ C-O

40 t? B ° g

5 M Λί _ ly B

5 W — CD (ti 4-0 η ·Η CD LO β αο X 4J Η Ν -Η 44 X φ ιι u οο £ g ~ DJ CM U Ti * ij S V V CM « £

% U m ™ -H

4j cti ro - æ XT)

ω 0D m “> 4-0 M

w 4—0 Μ—t dj ro 0) QJ 4-0 3 4-1 -r4 η -V 4-0 4-1

X — — β 0) CO

m OO CD β 44 g m I cno Λ QO 3 U CNJ CM W > g

1 VI X5 44 -H

% s “ ~ N ΰ s is - s ^ » s a -8 § ^ co ^ d ro CD “ Γ! Ή 44 01 1-1 00 _. 44 Ο) -Η

tn < i _< (D -M r-H

W ^ fO rrt .· i\ Q) *? I <U 4J .2 m .ti

r-l O1 n 4-1 i—ΙΟ (H -I

β « β φ ό o .h 4-> MniS

dg(ti[0<D<4-4<D\ £ Λ g m g 3 Cn rH g SS oo toaoo) .5 B g

Ή Οί·Η·γΗ<—I &1 i—I Φ tO t> H Hl S

g d-IW(tilSl(titnrHO o(rtRm Λ («Λί4-Ι444-1βΦ44 (2 k rn Φ Ο44(0β0βφβοφ Εη ιηΟοΕ^ΦΜ^ΟοΚτί „ N ^ 12 DK 172282 B1

Tabel 4 beskriver evnen hos det frembragte anti-(kapsel-polysaccharid)-IgG-antistof-respons til at beskytte imod dødelige Klebsiella-infektioner.

5 Tabel 4

Evnen hos præ-immun og post-immun IgG til at beskytte imod Klebsiella K2 brandsårs-sepsis

IgG overført1 Angribende stamme2 Dødelighed3 p4 10

Præ-immun Klebsiella 1614 70% <0,01

Post-immun 0

Præ-immun Klebsiella 98 70% <0,01 15 Post-immun 0

Præ-immun Klebsiella E32 100% <0,05

Post-immun 50% 20 Præ-immun Klebsiella B5055 90% <0,05

Post-immun 30%

Præ-immun Klebsiella 1737 60% <0,01

Post-immun 0 25 1 IgG (0,3 ml) blev overført intravenøst 24 timer før angrebet. ELISA-titeren var under 2 for præ-immun IgG (udvundet fra sera før immunisering) og 256 for Postimmun IgG (udvundet fra vacciner 28 dage efter immuni- 30 sering).

2 Alle stammer var kapsel-serotype 2. Den angribende dosis var ca. 5 x 101 bakterier.

3 Der anvendes grupper på 10 mus.

4 "Chi-kvadrat-analyse".

13 DK 172282 B1

Tabel 5 viser anti-(kapselpolysaccharid)-IgG-antistof-titeren for et intravenøst immun-gammaglobulin (IVIG) fremstillet ud fra sera fra donorer, som er immuniseret med den hexavalente vaccine, sammenlignet med et præparat 5 fremstillet ud fra normalt humant serum.

Tabel 5

IgG-titere over for Klebsiella-CPS til stede i hyperim-munt og normalt IVIG

10 _

IgG-ELISA-titer

Kapsel-serotype IVIG- 2 3 10 21 30 55 15 præparat__

Globuman 32 64 256 64 64 128

Klebsiella- immun-IVIG 4096 4096 4096 4096 8192 8192 20

Tabel 6 viser evnen hos det ovennævnte immun-gammaglobulin til at fremme phagocytose og drab af Klebsiella-teststammer.

DK 172282 B1 O o\° ω cm lo .5 LO ^ h m tn O “ -H °

p O rH rH

5 C KO

S3 +i +i o ^ e -H o

q LO O ^ 4-J LO

^ CO 00 CM 03

.03 Λ U

v tO 3 Λ w o, - 'S °

•H ^ H S

C ~ *} S

2 m O <H IH 1 2 3 4 5 6 7 3

53 +1 +1 +1 CQ

H ^ -P

Q CM U1 (Ti CD h <D

.oo cm en fy c

03 v; Γ" Μ M

<—i x) a>

1—I jS

aj o» — —i H rrt T—* .id

CO — . Jj CsJ ΰ 4-J

Λ n d ^ · w

QJ Pi g O O

*—I ’\1 cS , Li

W +1 +l U O

<h di £ r- o æ 4-1 03 % g, cm (T æ o 0,,0 Λ "" . r~ 2 2 Λ 03 * ^ * - Ό o3 g

M g ^ CO

IT t5 03 $ o "" g

2, onoy: iH

Η Φ P (U p ° tn W 2 Η β +l +l W ° 03 CN n ^ 3

U 03 ^ n 2 ° O

o 03 a 03 R1 1-1 -H

(T W . <H I, 4-1 03 03 ~ X 03

^ Η M

a 5 d £ m « ~ £ ft m g ” o o * S g 2 S 2 +l ^ g * oj o o ^ 2 g 3

X) U IT) 03 ‘d ,—I

3 · m U_| W

>1 « υ ^ m

•X ^ ω · C

03 5-,--03 c; ., ·Η 03 u

.* ftH g 'H

m —i cm ° P g 03 o'-' ° 00 u, Ϊ « ® 2 03 £ Xj i? 4-1 T3 3 03 H Lf) +1 03p»Wo! 4 d fl) ° 5 0) 5 3- 1 2 lT) ^ # § 0) > 03 a6 I ^ C ^ d 4- 1 . S -H 03 03 V- CQ O -H i-i Μ Λ 03 > φ 6 03 Λ ΰ 3 <S Π P. Ή Μ 4—3 QJ 3-1 tø rH ϊ> C .X 4-4 0) 03 CD 3-( 0) Η Λ >i 4-· Ό · α -Η I g p d C3 -HI n β 03 β p 4-J β Μ Μ 7 t5 Ο 03 Λ P ,Ρ t! -Η O >

,Q M H O' (U g O D fi ^4 H

03 !> £> β ιΗ K i—I

HH H csi DK 172282 B1 i 15

Endelig viser tabel 7 en sammenligning imellem den beskyttende evne (på vægtbasis) hos immun-gammagiobulinet og et normalt gammaglobulinpræparat (Globuman) over for dødelige Klebsiella-infektioner.

5

Tabel 7

Beskyttelse imod dødelig Klebsiella-brandsårs-sepsis ved indgivelse af IVIG præparater t 10 IVIG Dosis Dødelighed Gennemsnitstid overført_(mg/kg) antal døde/total (%) inden død (timer) p 1

Humant albumin 500 13/15 (87%) 103,4

Globuman 500 5/16 (31%) 124,8 <0,01

15 50 10/15 (67%) 888 NS

5 12/15 (80%) 96 NS

Klebsiella- immun-IVIG 500 1/16 (6%) 144 <0,01 50 4/15 (27%) 138 <0,01 20 _5_5/15 (33%)_115,2_<0, 01 1 Signifikansen refererer til dødelighed sammenlignet med en human-albumin-behandlet kontrolgruppe. NS =-ikke signifikant, p > 0,05. Beregnet ved "chi-kvadrat-analyse".

25 I de følgende eksempler er kapselpolysaccharider blevet isoleret og renset fra de følgende stammer af Klebsiella: K. pneumoniae 5055: Kapsel-serotype 2; 30 K. ozaenae C5046: Kapsel-serotype 3; K. pneumoniae 919: Kapsel-serotype 10; K. pneumoniae 1702-49: Kapsel-serotype 21; K. pneumoniae 7824: Kapsel-serotype 30 og K. pneumoniae 3985-51: Kapsel-serotype 55.

35 De ovennævnte stammer blev leveret til Swiss Serum and Vaccine Institute den 19. maj 1983 af I. Ørskov, Statens Seruminstitut, København, Danmark, og de er kapsel- 16 DK 172282 B1 serotype-reference-stammer. Alle stammer opbevares lyofi-liseret i ampuller.

Fremstillingen af Klebsiella-kulturer til oprensning af 5 CPS foregik på følgende måde: En ampul, der indeholder en lyofiliseret kultur, åbnes, og kulturen rekonstitueres og podes på agarplader. Pladerne dyrkes i 18 - 24 timer ved 37 °C. Med en steril løkke udtages en lille mængde af kulturen, som derefter benyttes til at pode 30 ml HYEM-10 væske [2% (w/v) Hycase-SF (Humko Sheffield, Memphis, Ten., USA), 0,3% (w/v) gærekstrakt (Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA)] og 2% (w/v) maltose tilsat som en 10% steril stamopløsning i en 125 ml kolbe. Kulturen blev dyrket ved 37 °C og 100 omdrejninger pr. minut i 8 timer.

15 Derefter benyttes 1 ml af kulturen til at pode 500 ml HYEM-væske i en 2 liter afskærmet Erlenmeyer-kolbe. Disse kulturer (8 kolber til i alt 4 liter medium) dyrkes ved 37 °C under omrystning (100 omdrejninger pr. minut) i 16 timer. Ved dyrkningens afslutning bekræftes den mikrobi-20 elle renhed af hver kolbe ved Gram-farvning. Det skal bemærkes, at man også kan anvende andre dyrkningsbetingelser for Klebsiella og andre betingelser for rensning af CPS, såfremt dette er ønskeligt, men man opnår ikke nødvendigvis de samme resultater.

25

Bakteriecellerne fjernes ved i to omgange at centrifugere ved 8000 x g i 30 minutter i sterile plast-centrifuge-flasker, idet der anvendes en Sorval RC-2B centrifuge. Supernatanten filtreres sekvensvis igennem et 0,80 og 30 et 0,45 pm millipore-filter (Millipore Corp., Bedford, Mass., USA).

Alle de efterfølgende operationer blev udført under anvendelse af autoklaveret udstyr af glas eller plast. Ce-35 tavlon (N-cetyl-N,N,N,-trimethylammoniumbromid, E. Merck and Co.), som en 10% (w/v) stamopløsning, sattes til den 17 DK 172282 B1 celle-fri supernatant af kulturen til en endelig koncentration på 0,5% (w/v). Blandingen blev omrørt i 30 minutter ved stuetemperatur, hvorved der dannedes et bundfald. Det resulterende CPS-holdige bundfald blev opsamlet ved 5 centrifugering ved 5000 x g i 30 minutter. Supernatanten blev borthældt, hvorefter bundfaldet blev resuspenderet i omkring 100 ml 1 M CaCl2. Blandingen blev omrørt ved omgivelsestemperatur, indtil bundfaldet gik i opløsning. Der tilsattes ethanol af teknisk renhed til en slutkon-10 centration på 80% (v/v) for at udfælde CPS'et. Bundfaldet blev opsamlet ved centrifugering ved 5000 x g i 30 minutter, hvorefter det blev opløst i omkring 100 ml destilleret vand. Opløsningen blev ekstraheret med et tilsvarende volumen chloroform/butanol (5:1), indtil der ikke var no-15 gen synlig hvid udfældning i grænsefladen, hvilket typisk krævede 3-5 gange ekstraktion. Efter hver ekstraktion blev materialet centrifugeret ved 1000 x g i 15 minutter for at forøge grænsefladens skarphed. Materialet omkring grænsefladen samt den organiske fase blev borthældt. Den 20 CPS-holdige vandige fase blev dialyseret imod destilleret vand ved 4 °C, idet der minimalt anvendtes 2 x 50 volumener vand. Det dialyserede materiale blev derefter centrifugeret ved 100 000 x g i 18 timer (Beckamn Model L2-65B ultracentrifuge) for at sammenpresse lipopolysaccharidet 25 (LPS) til en tablet. Supernatanten blev opsamlet, hvorefter CPS'et blev udfældet ved tilsætning af ethanol til en slutkoncentration på 80% (v/v).

Det udfældede CPS blev opsamlet ved centrifugering ved 30 5000 x g i 30 minutter og derefter opløst i 100 - 150 ml sterilt destilleret vand. CPS-opløsningen (15 - 20 ml) blev fordelt i sterile glaskolber (totalt volumen 50 ml) med kendt vægt, og efter lukning af kolberne blev opløsningerne frosset ved -70 °C i minimum 4-5 timer og der-35 efter lyofiliseret. Efter lyofiliseringen blev kolberne vejet på ny, og begyndelsesvægten blev trukket fra til 18 DK 172282 B1 bestemmelse af den mængde materiale, der befandt sig i kolben. Dette materiale (opbevaret ved 4 °C) blev mærket med hensyn til indhold, prøvenummer, mængde (vægt af CPS) og fremstillingsdato.

5

En detoxificering af de spormængder af LPS, som var til stede i CPS-præparationerne, blev foretaget ved deacyle-ring på følgende måde: Hver serotype (oprenset fra hver af de seks stammer angivet i tabel 1) af lyofiliseret CPS 10 (17,5 mg) blev anbragt i 20 ml af en 0,1 N NaOH -95% et- hanol-opløsning, der befandt sig i en steril Erlenmeyer-kolbe. Kolberne blev anbragt på et roterende rysteapparat ved 37 °C og omrystet i 30 minutter ved 75 omdrejninger pr. minut. Væsken blev fjernet med en Pasteur-pipette, og 15 der tilsattes 20 ml sterilt phosphatpuffer-holdigt saltvand (pH 7,4). Opløsningens pH blev sænket til 7 ved dråbevis tilsætning af steril 1% CH3COOH. Man lod CPS'et gå i opløsning ved henstand natten over ved 4 °C. CPS- opløsningerne (1,2 mg/ml) blev kombineret i lige store 20 dele i en steril blandebeholder. Opløsningen blev derefter ledt igennem et 0,45 pm filter (Nalge Co., Rochester, NY, USA) under aseptiske betingelser. 1 ml af den sterile opløsning blev anbragt aseptisk i en hætteflaske med volumen 3 ml, som blev forsynet med en lukning, hvorefter 25 opløsningen blev frosset ved -70 °C og lyofiliseret under sterile betingelser. Hætteflaskerne blev tilsmeltet under vakuum. Hver hætteflaske (bestemt slutprodukt) indeholdt 50 pg af hver af 6 serotyper af CPS som angivet i tabel 1 til i alt 300 pg pr. hætteflaske, som blev betegnet 1 hu-30 man dosis. Det skal bemærkes, at det tidsrum, hvorunder CPS-materialet behandles med NaOH, kan varieres fra 15 til 60 minutter, selv om dette ikke nødvendigvis fører til ækvivalente resultater.

35 Analyse af det udfældede CPS og slutproduktet foregik som beskrevet nedenfor.

19 DK 172282 B1

Protein

Bestemmelsen af protein foregik efter metoden beskrevet af Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L. og Randall, 5 R.J., "Protein measurements with the folin phenol reagent", (1951) J. Biol. Chem. 193: 265 - 275 ved brug af okseserumalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) som standard.

10 Nucleinsyrer

Indholdet af nucleinsyrer blev bestemt kvantitativt ved måling af absorbansen af en 1 mg/ml CPS-opløsning i destilleret vand ved 260 nm i en 1 cm cuvette. Omdannelses-15 hastigheden er følgende: 1 optisk densitetsenhed svarer til 50 pg nucleinsyre pr. ml.

Carbonhydrat 20 Det totale indhold af carbonhydrat blev målt ved hjælp af phenol-svovlsyre-metoden, idet man anvendte "Dextran T- ® 500" (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) som standard.

25 Restfugtighed

Restfugtigheden blev bestemt ved anvendelse af et fugtig-hedsanalyseapparat af typen 26-321a (Dupont Instruments, Monrovia, CA., USA).

30

Molekylvægtsbestemmelse

Molekylvægten af CPS blev bestemt ved chromatografi over "Sepharose CL-4B" (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, 35 Sverige). En kolonne med dimensionerne 94 x 1,5 cm blev kalibreret ved anvendelse af "Blue Dextra 2000" (Pharma- 20 DK 172282 B1 cia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) til bestemmelse af det tomme volumen og ved anvendelse af Cu-eddikesyre til bestemmelse af det totale kolonnevolumen. En 5 mg prøve af CPS blev tilført i 2 ml phosphatpuffer-holdigt salt-5 vand (PBS), pH 7,4. Kolonnen blev elueret med PBS, hvorefter fraktioner på 2,5 ml blev analyseret for indhold af carbonhydrater ved phenol-svovlsyre-metoden. Fordelingskonstanten (Kd) for vaccinen blev beregnet som beskrevet af Wong, K.H., Barrera, 0., Sutton, A., May, J., 10 Hochstein, D.H., Robbins, J.P., Robbins, J.B., Parkman, P.D. og Selegmann, E.B., "Standardization and control of meningococcal vaccines, group A and group C polysaccharides", J. Biol. Standardization 5: 197-215, 197.

15 KDO

2-keto-3-deoxyoctonat (KDO), som er en bestanddel af LPS, blev analyseret kvantitativt som beskrevet i Osborn, M.J., "Studies on the gram-negative cell wall I. Evidence 20 for the role of 2-keto-3-deoxyoctonate in the lipopoly-saccharide of Salmonella typhimurium", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50: 499-506, 1963.

Den kemiske sammensætning af 6 serotyper af CPS er vist i 25 tabel 1. CPS-præparaterne var primært sammensat af carbonhydrater, idet der var spormængder af protein, nucle-insyrer og LPS til stede.

Hvert CPS-præparat blev individuelt behandlet med fortyn-30 det NaOH. CPS-præparaterne blev analyseret såvel før som efter NaOH-behandlingen med hensyn til molekylvægt og py-rogenicitet i kaniner efter intravenøs indgivelse (tabel 2) . Det er velkendt, at immunogeniciteten af CPS er afhængig af deres relativt høje molekylvægte, og at sikker-35 heden af CPS ved parenteral indgivelse til mennesker står i omvendt forhold til pyrogeniciteten i kaniner, således 21 DK 172282 B1 som det er beskrevet i den ovennævnte reference af Wong et al. Et ideelt CPS-præparat vil derfor have en høj molekylvægt og være ikke-pyrogent. Alle naturlige Klebsiel-la-CPS havde høje molekylvægte (Kd mindre end eller lig 5 0,1 på "Sepharose CL-4B"), idet størstedelen af carbon- hydratet blev elueret, inden der opnåedes en Kd-værdi på 0,5. Behandlingen med NaOH havde kun en negligerbar indvirkning på disse karakteristika. Naturligt forekommende CPS udviste en minimal pyrogendosis (MPD) på højst 0,1 - i 10 1,0 pg/kg for kaniner (tabel 2). Efter behandlingen med

NaOH forøgedes MPD-værdien til over 50 pg/kg for visse serotyper, hvilket svarede til en formindskelse af pyro-geniciteten på mindst 20 gange for samtlige testede serotyper. Behandling af Klebsiella-CPS med NaOH resulterer 15 derfor i antigeniske fraktioner med høje molekylvægte, hvilke fraktioner er ikke-pyrogene.

Derefter formuleredes en hexavalent Klebsiella-CPS-vaccine. Denne vaccine indeholdt 50 pg NaOH-behandlet CPS 20 udledt fra hver af de 6 Klebsiella-stammer anført i tabel 1 (1 human dosis svarer til 300 pg totalt antigen). Vaccinens karakteristika er følgende: 1) Vaccinen var ikke-toxisk over for dyr. Der observere-25 des ikke nogen dødelighed blandt mus eller marsvin, som modtog 1 human dosis vaccine ad intraperitoneal vej. Desuden kunne man bemærke normale kurver for vægtforøgelsen efter indgivelse af vaccinen.

30 2) Vaccinen var ikke-pyrogen over for kaniner. En indgi velse af 50 pg vaccine pr. kg legemsvægt bevirkede et feberrespons på mindre end +0,3 °C.

3) Vaccinen havde en høj molekylvægt. Ved chromatografi 35 over en "Sepharose CL~4B"-kolonne var vaccinens Kd-værdi 0 (svarende til kolonnens tomme volumen), og mere end 99% 22 DK 172282 B1 af materialet blev elueret med en Kd-værdi på mindre end 0,5.

4) Vaccinen bestod primært af carbonhydrat (72,8% tør 5 vægt) med sporniveauer af protein (1,64%), nucleinsyrer (0,94%) og KDO. Det resterende vandindhold var 9,3%.

5) Vaccinen opnås i form af et sterilt, hvidt, lyofilise-ret pulver.

10

Sikkerhed og immunogenicitet af hexavalent Klebsiella CPS-vaccine i mennesker

En gruppe af frivillige forsøgspersoner bestod af sunde 15 mennesker af begge køn med en alder på mellem 22 og 62 år. Lige inden anvendelsen blev vaccinen rekonstitueret i sterilt destilleret vand. Vaccinen (0,5 ml) blev indgivet subcutant i delta-muskelregionen. Reaktionerne på vaccinationen, herunder feber, lokale smerter, opsvulmen, rød-20 men, induration, hovedpine og utilpashed, blev noteret af forsøgspersonerne i 5 dage efter vaccinationen. Veneblodprøver blev udtaget fra hver forsøgsperson på vaccinationstidspunktet og henholdsvis 14 og 28 dage efter vaccinationen. Det opsamlede serum blev opbevaret ved -20 °C.

25

Omkring 35% (8 ud af 22) af forsøgspersonerne rapporterede en lettere smertefuld reaktion, der varede i 24 timer. Tre af forsøgspersonerne bemærkede en systemisk reaktion, som var karakteriseret ved en følelse af utilpashed og 30 lettere hovedpine. Alle symptomerne forsvandt spontant i løbet af 24 - 48 timer efter fremkomsten, og de begrænsede på ingen måde de vaccinerede personers normale aktiviteter.

35 Immunoglobulin G (IgG) responset på hver af de 6 vaccinekomponenter, bestemt ved en enzym-bundet immunosorbent- 23 DK 172282 B1 analyse (ELISA), er vist i tabel 3. Vaccinen viste sig at være særdeles immunogen i mennesker, idet mellem 82% (K3) og 95% (K2) af de vaccinerede personer udviste et respons svarende til en forøgelse af IgG-indholdet på mindst 4 5 gange. Den gennemsnitlige stigning i IgG-koncentrationen efter vaccination var på mellem 5 gange (K21) og 18,6 gange (K2).

For at bekræfte den beskyttende kapacitet af det immunre-10 spons, som frembringes af den hexavalente Klebsiella-CPS-vaccine, foretog man de følgende eksperimenter: IgG blev isoleret fra serum hidrørende fra 10 forsøgspersoner, som udviste en forøgelse på mindst 4 gange med hensyn til K2-CPS efter immuniseringen. Et antal mus (20 g af hunkøn, 15 NMRI-stammen) modtog hver 2,3 mg IgG i 0,3 ml saltvand via halevenen. Omkring 24 timer senere blev musene forbrændt og udsat for forskellige virulente stammer af Klebsiella serotype 2 som tidligere beskrevet. Resultaterne er vist i tabel 4. Præ-immun-IgG, som indeholdt ik-20 ke-påviselige niveauer af specifikke anti-K2-antistoffer som bestemt ved ELISA-analyse (koncentration mindre end 2), var ineffektive med hensyn til forebyggelse af dødelig sepsis (dødelighedstal på 60 til 100%). En meget signifikant beskyttelse (fra p under 0,05 til p under 0,01) 25 blev ydet imod alle 5 angribende Klesiella K2-stammer af immun-IgG, som indeholdt høje niveauer (titer = 256) af anti-K2 CPS-antistof. Disse resultater viser, at IgG-antistof-responset i mennesker, som opnås gennem vaccination med Klebsiella CPS, er i stand til at tilvejebringe 30 en særdeles signifikant beskyttelse imod Klebsiella-infektioner. Desuden er det beskyttende respons ikke stamme-specifikt, hvilket betyder, at anti-serotype 2-antistoffet gav beskyttelse imod alle 5 angribende stammer, som indeholdt kapsel-serotype 2.

35 24 DK 172282 B1

En opsummering af de i tabellerne 3 og 4 angivne data viser, at NaOH-behandlet Klebsiella CPS, som er formuleret til en hexavalent vaccine, er såvel sikker som immunogen ved indgivelse til forsøgspersoner. Mere end 80% af de 5 vaccinerede personer reagerede med et signifikant (mindst 4 gange forøget) IgG-antistof-respons på de individuelle vaccinekomponenter. Human IgG-antistof, som fremkaldes ved immunisering med den ovennævnte vaccine, når denne passivt overføres til mus, viste sig i stand til at til-10 vejebringe en stærkt signifikant grad af beskyttelse imod dødelige Klebsiella-infektioner. I modsætning hertil gav IgG-antistof, som var frembragt af de samme forsøgspersoner forud for immuniseringen, ikke nogen beskyttelse imod dødelige Klebsiella-infektioner.

15

Fremstilling af et humant hyperimmunt anti-Klebsiella-globulin ved anvendelse af den hexavalente Klebsiella-vaccine 20 Frivillige forsøgspersoner blev immuniseret med den ovenfor beskrevne hexavalente Klebsiella-CPS-vacccine. Omkring 6 uger senere blev prøver af veneblod (gennemsnitligt 240 ml pr. person) udtaget fra 13 personer, som viste mindst en firedobbelt forøgelse i IgG-ELISA-titer 25 over for alle 6 vaccinekomponenter efter immuniseringen.

Et gammaglobulin til intravenøs anvendelse (IVIG) blev fremstillet ud fra det samlede rå serum gennem ethanol-fraktionering, ionbytterchromatografi, ultrafiltrering og diafiltrering. Proteinindholdet blev indstillet til 50 30 mg/ml, og præparationen blev lyofiliseret i en stabilisatoropløsning. Denne præparation benævnes Klebsiella-immun-IVIG. Globuman (Swiss Serum and Vaccine Institute, Bern, Schweiz), et IVIG-præparat, blev fremstillet på tilsvarende måde med den undtagelse, at den som udgangs-35 materiale anvendte mængde humant plasma blev opnået fra 25 DK 172282 B1 donorer, som ikke var blevet immuniseret med den hexava-lente Klebsiella-CPS-vaccine (dvs. normalt humant serum).

Dette Klebsiella-immun-IVIG havde væsentligt højere IgG-5 ELISA-titer-værdier (16 til 128 gange) end Globuman (tabel 5) . Desuden viste det sig, at kun Klebsiella-immun-IVIG var i stand til at lette opsoniseringen og det efterfølgende drab af alle 6 serotyper af teststammer, hvis kapsel-antigen var repræsenteret i vaccinen, når 10 denne blev testet i et in vitro system (tabel 6). Induktionen af et sådant "opsonisk" IgG-antistof er af kritisk betydning for den beskyttende evne hos et immun-IVIG, eftersom en fjernelse af Klebsiella i en sygdomstilstand menes at skyldes antistof-afhængig phagocytose og drab.

15

Man bestemte evnen hos Globuman og Klebsiella-immun-IVIG til at forebygge Klebsiella-brandsårs-sepsis ved profylaktisk anvendelse. Der anvendtes mus (18 - 20 g hunkøn, NMRI-stammen), der hver modtog graduerede doser af IVIG-20 præparationerne (5 - 500 mg/kg) eller humant albumin i doser på 500 mg/kg (Albuman, Swiss Serum and Vaccine Institute, Bern, Schweiz) intravenøst i 0,2 ml saltvand. Omkring 24 timer senere blev musene forbrændt og inficeret med 60 K. pneumonia-bakterier (kapselform, type 2).

25 Resultaterne er vist i tabel 7. Dødelighedstallet for gruppen af mus, som modtog humant albumin som kontrol, var 87%. Globuman, som havde en IgG-ELISA-titer på 32 over for K2-antigenet (udtrykt ved den angribende Kleb-siella-stamme), gav kun en signifikant beskyttelse (p 30 mindre end eller lig 0,01) i den højeste afprøvede dosis (500 mg/kg). I modsætning hertil gav Klebsiella-immun-IVIG en god beskyttelse i doser så lave som 5 mg/kg (1/100 af Globuman).

35 Ved at opsummere data fra tabellerne 5-6 finder man, at et IVIG fremstillet ud fra de samlede sera fra forsøgs- 26 DK 172282 B1 personer, der var immuniseret med den hexavalente Kleb-siella-CPS-vaccine (Klebsiella-immun-IVIG), udviser væsentligt højere IgG-titer-værdier over for 6 vaccinekomponenter i sammenligning med et IVIG fremstillet ud fra 5 normalt humant serum. Kun Klebsiella-immun-IVIG fremskyn-dende phagocytosen og det efterfølgende drab af alle 6 teststammer af Klebsiella. Den beskyttende evne hos Kleb-siella-immun-IVIG var 100 gange større (på vægtbasis) i sammenligning med IVIG, der var fremstillet ud fra nor-10 malt humant serum ved identiske metoder.

Derefter fremstilledes en polyvalent vaccine bestående af 24 Klebsiella-serotyper. I alt 703 Klebsiella-blodisola-ter fra 13 kliniske centre i Europa og Nordamerika blev 15 undersøgt med hensyn til kapsel-serotype.

Undersøgelsen af kapsel-serotyper blev gennemført som beskrevet i Palfreyman, J.M., "Klebsiella Serotyping by Counter-Current Immuno-Electrophoresis", Journal of Hygi-20 ene, Volume 81, nr. 2 pp. 219-225, oktober 1978. Den samlede frekvens af forekomsten er vist i tabel 8. Ud fra disse serotyper fremstilledes særligt effektive polyva-lente vacciner omfattende Klebsiella-serotyper som angivet i det følgende. Det blev bemærket, at vaccination med 25 Klebsiella-kapselpolysaccharider af bestemte serotyper også understøttede produktionen af antistoffer overfor visse andre serotyper. F.eks. vil en vaccination med CPS af serotype 2 fremme produktionen af antistoffer mod se-rotyperne 2, 69 og 1, en vaccination med CPS af serotype 30 21 vil fremme produktionen af antistoffer mod serotyperne 21 og 11, en vaccination med CPS af serotype 3 vil fremme produktionen af antistoffer mod serotyperne 3 og 68, en vaccination med CPS af serotype 10 vil fremme produktionen af antistoffer mod serotyperne 10 og 7, og en vacci-35 nation med CPS af serotype 64 vil fremme produktionen af antistoffer mod serotyperne 64 og 14. Denne tværreaktivi- 27 DK 172282 B1 tet, som kendetegner bestemte serotyper, er dog ikke nødvendigvis reciprok. F.eks. vil en vaccination med CPS af serotype 35 fremme produktionen af antistoffer mod sero-typerne 35 og 33 i meget større udstrækning end den, 5 hvormed en vaccination med CPS af serotype 33 fremmer produktionen af antistoffer mod serotyperne 33 og 35.

Selv om serotyperne 1 og 39 optræder med relativ hyppighed i en absolut forstand, således som det er vist i ta-10 bel 8, har disse serotyper hidtil været endemiske til bestemte lokaliteter og ikke særligt egnede til en vaccine til generel anvendelse, om end en vaccine indeholdende disse serotyper med fordel kunne anvendes i de bestemte lokaliteter, hvor disse serotyper forekommer. Selv om og-15 så Klebsiella serotype 27 optræder med en grad af relativ hyppighed, vil en inkludering af CPS af denne serotype nok ikke være passende i alle tilfælde på grund af en mulig sammenhæng mellem forekomsten af Klebsiella serotype 27 og spondylitis ankylopoetica syndrom.

20 Når man skal udvikle en effektiv polyvalent vaccine for Klebsiella, er det vigtigt at inkludere CPS af tilstrækkeligt varierede serotyper for at opnå en fornuftig grad af beskyttelse. Det er imidlertid også vigtigt at begræn-25 se antallet af serotyper til et forsvarligt antal. I denne sammenhæng er det ikke nødvendigvis ønskeligt i en enkelt vaccine at inkludere CPS af alle de serotyper, der er anført i tabel 8. Udover at være ineffektiv, og for visse patienters vedkommende uetisk, vil en vaccine, som 30 indeholder alle serotyper, i mange tilfælde bevirke forøget ubehag for den vaccinerede person, og den kan potentielt resultere i en for stor forekomst af antigener og undertrykke et immunrespons, som ellers ville være blevet frembragt af en vaccine med et færre antal forskellige 35 serotyper.

28 DK 172282 B1

Den foreliggende opfindelse muliggør talrige vacciner med forskellige serotype-kombinationer, men de foretrukne po-lyvalente vacciner er de, der indeholder Klebsiella-sero-typerne 2, 3, 5, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 28, 5 30, 35, 43, 52, 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64; de der indeholder Klebsiella-serotyperne 2, 3, 5, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 28, 30, 35, 39, 43, 52, 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64; og de der indeholder Klebsiella- serotyperne 2, 3, 5, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 10 27, 28, 30, 35, 43, 52, 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64.

29 DK 172282 B1

Tabel 8

Hyppighed af kapsel-serotyper blandt bakteriæmiske Klebsiella- isolater 5 Rækkefølge Kapsel-serotype Antal isolater Hyppighed (% af alle stammer) 12 63 8,96 2 21 55 7,82 3 55 34 4,83 10 4 53 20 2,85 5 25, 68 18 2,56 6 22 17 2,42 7 3, 10, 16, 43, 61, 64 15 2,13 8 17, 33, 62 14 2,00 15 9 7, 9 13 1,85 10 18, 28, 30 12 1,70 11 1, 39 11 1,57 12 27, 52, 60, 63 10 1,42 13 15 9 1,28 20 14 5, 8, 38, 48, 54 8 1, 13 15 20, 41, 46 7 1,00 16 26, 31, 35, 80 5 0,71 17 11, 12, 14 4 0,57 18 13, 36, 44, 51, 56, 57 3 0,43 25 19 23, 24, 34, 37, 45, 47, 2 0,29 49, 50, 58, 70, 71 20 4, 6, 29, 40, 42, 65, 1 0,15 69, 72, 74 21 19, 32, 59, 66, 67, 79 0 0 30 81, 82

Ikke type-bestemmelige 71 10,10 I det efterfølgende eksempel blev serotyper af NaOH-behandlede kapselpolysaccharider kombineret som beskrevet 35 ovenfor med hensyn til den hexavalente vaccine til frembringelse af en vaccine, der bestod af CPS-derivater af 30 DK 172282 B1 de følgende 24 serotyper: 2, 3, 5, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 27, 30, 35, 43, 52, 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64. Vaccinen blev lyofiliseret. Én human dosis indeholdt 50 pg af hvert antigen svarende til i alt 1200 pg anti-5 gen. 5 sunde voksne forsøgspersoner modtog hver én dosis vaccine subcutant i 0,5 ml saltvand. En af forsøgspersonerne følte smerte på injektionsstedet, og denne smerte begyndte 4 timer efter immuniseringen og varede i omkring 24 timer. Der opsamledes veneblodprøver 28 dage efter 10 vaccinationen, og blodets serum blev analyseret ved ELISA for IgG-titer til CPS-vaccinekomponenterne. Resultaterne er vist i tabel 9.

31 DK 172282 B1

Tabel 9

Immunoglobulin G (IgG) respons efter vaccination med 24-valent Klebsiella-CPS-vaccine 5 Gennemsnitlig IgG-ELISA-titer CPS- Post-immun1 Post-immun2 Gennemsnitlig serotype forøgelse _(gange)_ 10 2 2 28 14 3 5 41 8 55 60 14 9 13 92 7 10 7 18 2,5 15 15 9 41 4,5 16 16 54 3,3 17 7 19 2,7 18 6 77 12 21 5 17 3,4 20 22 5 14 2,8 25 6 35 5,8 27 4 19 44, 30 7 26 3,7 35 3 8 2,7 25 43 4 14 3,5 52 8 29 3,6 53 5 15 3 55 5 19 3,8 60 3 26 8,6 30 61 4 179 45 62 2,5 19 7,6 63 4 18 4,5 _64_5_20_4 1 På immuniseringstidspunktet 35 2 28 dage efter immunisering 32 DK 172282 B1

Det kan sammenfattende anføres, at alle 24 serotyper af Klebsiella-CPS, som var indeholdt i vaccinen, var i stand til at fremkalde et specifikt IgG-antistof-respons efter parenteral indgivelse til mennesker.

4

Claims (6)

1. Immunogen polyvalent Klebsiella-vaccine omfattende relativt rene kapselpolysaccharider af serotyperne 2, 3, 5, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 28, 30, 35, 43, 52, 5 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64.

2. Immunogen polyvalent Klebsiella-vaccine omfattende relativt rene kapselpolysaccharider af serotyperne 2, 3, 5, 9, 10, 15', 16, 17, 18, 21, 22, 25, 28, 30, 35, 39, 43, 10 52, 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64.

3. Immunogen polyvalent Klebsiella-vaccine omfattende relativt rene kapselpolysaccharider af serotyperne 2, 3, 5, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 27, 28, 30, 35, 43, 15 52, 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af en polyvalent Klebsiella-vaccine, kendetegnet ved, at den omfatter trinene: 20 man udvinder en relativt ren kapselpolysaccharidblanding fra Klebsiella-bakterier af serotyperne 2, 3, 5, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 28, 30, 35, 43, 52, 53, 55, 60, 61, 62, 63 og 64; 25 behandler kapselpolysacchariderne med et deacetylerende middel; udvinder kapselpolysacchariderne; og 30 kombinerer i det mindste en del af kapselpolysacchariderne af hver serotype til dannelse af en ikke-pyrogen immunogen vaccine. DK 172282 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor vaccinen yderligere indeholder kapselpolysaccharid af serotype 39.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor vaccinen yderligere 5 indeholder kapselpolysaccharid af serotype 27.