DE2212277B2

DE2212277B2 - Verfahren zur Herstellung einer Totvaccine gegen infektiöse atrophische Rhinitis der Schweine

Info

Publication number: DE2212277B2
Application number: DE2212277A
Authority: DE
Inventors: Tadayoshi Tokio Kasuga; Minoru Chiba Kawahira; Yasukiyo Yokohama Nakase
Original assignee: KITASATO INSTITUTE TOKIO
Current assignee: KITASATO INSTITUTE TOKIO
Priority date: 1971-05-12
Filing date: 1972-03-14
Publication date: 1978-06-29
Also published as: DE2212277A1; CS167976B2; IT1043894B; FR2137478B1; DD98697A5; DK133018B; SU403134A3; JPS5127731B1; NL158225B; DK133018C; RO60758A; CA983851A; NL7204347A; DE2212277C3; US3873691A; BE781322A; GB1354075A; FR2137478A1

Description

20

Die atrophische Rhinitis der Schweine ist in verschiedenen Ländern der Erde vorherrschend und verursacht der Schweinezucht ernstlichen wirtschaftlichen Schaden, wie die Hemmung des Schweinewachstums und die Herabsetzung des Wirkungsgrades des Futters. Daß ein verursachender Vertreter der obenerwähnten Krankheit hauptsächlich Bordetella bronchiseptica ist, wurde experimentiell bestätigt durch R. F. Gross und Mitarbeiter (Amer. Vet. Med. Assoc, Band 141,1467 [1962]), J. R. D u η c a η und Mitarbeiter (Amer. Jour. Vet. Res., Band 27, 457 [1966]), R. F. Ross und Mitarbeiter (Vet. Med., Band 58, 566 [1963]), S h i m i ζ u und Mitarbeiter (Jap, J. Vet. Med., Band 32 Ergänzung, 30 [1970]) und durch die Erfinder (Jap. J. Vet. Med., Band 33Ergänzung[1971]). J5

Zur Verhütung der obenerwähnten Krankheit, hat man fortlaufende Verabreichung solcher chemischer Stoffe wie Antibiotika, Sulfonamidarzneistoffe usw. angewandt. Wegen des Auftretens von arzneimittelresistenten Mikroorganismen ist jedoch die Ausrottung dieser Krankheit schwierig geworden. Darüber hinaus ergeben sich Probleme, z. B. Auftreten von Superinfektion wegen der fortlaufenden Verabreichung solcher chemischer Stoffe und wegen der Begrenzung der Verabreichung von Antibiotika aus gesundheitlichen und wirtschaftlichen Gründen. Daher sind Verfahren zum Verhüten dieser Krankheit unter Anwendung von chemischen Stoffen nicht immer befriedigend, so daß ein Bedarf nach angemessenen Maßnahmen zur Verhütung der genannten Krankheit besteht.

Im Jahre 1969 haben J. R. Ganaway und Mitarbeiter angegeben, daß die Vaccinierung zur Verhütung der Pneumonie der Meerschweinchen, welche sich von Bordetella bronchiseptica herleitet, wirksam war (Lab. Anim. Care, Band 15,1956 [1965]). Im Hinblick hierauf bereiteten D. L. Harris und Mitarbeiter ein durch Formalin inaktiviertes Vaccine dieses Mikroorganismus und versuchten vergebens, Schweine vor atrophischer Rhinitis durch Anwendung dieser Vaccine zu bewahren. Sie richteten ihre t>o Anstrengungen auf die Studien der abgeschwächten lebenden Vaccine und urteilte, daß die Schweine in ihrem Immunitätsmechanismus unterschiedlich sind von Meerschweinchen (Am. J. Vet. Res., Band 30, 1161 [1969]). Die Gründe hierfür liegen wahrscheinlich darin, b5 daß Mikroorganismen mit K-Antigen schwierig und nur bei Anwendung eines spezifisch geeigneten Kulturmediums erhalten wird und daß die Immunitätsverhältnisse nicht nur von Tier zu Tier unterschiedlich sind, sondern die erhaltenen Ergebnisse vom Alter der untersuchten Tiere und der Zeit der Untersuchung nach der Infektion abhängen.

Nunmehr ist es jedoch gelungen, atrophische Rhinitis beim Schwein durch Animpfung mit Bordetella bronchiseptica zu erzeugen und es wurde bestätigt, daß dieser Mikroorganismus der pathogene Keim für die atrophische Rhinitis des Schweins ist. Ferner wurde gefunden, daß eine Vaccine, welche aus einem K-Antigen besitzenden Keim bereitet wurde, welcher im Mikroorganismus Bordetella bronchiseptica enthalten ist, eine bemerkenswerte Schutzfähigkeit besitzt, wohingegen eine Vaccine, welche aus einem K-Antigen freien Keim bereitet wurde, der in diesem Mikroorganismus enthalten ist, eine solche Fähigkeit nicht zeigt

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Totvaccine gegen infektiöse atrophische Rhinitis der Schweine, dadurch gekennzeichnet, daß man den Phase I Organismus von einer K-Antigen aufweisender Bordetella bronchiseptica in einem Grundmedium aus Nähragar oder Nährbrühe und zusätzlich 0,5 bis 1,0 Gew.-% Kasaminosäure, 0,05 bis 0,1 Gew.-o/o Hefeextrakt und entweder 0,1 bis 0,5 Gew.-% Aktivkohlepulver oder 0,3 bis 1,0 Gew.-% Anionenaustauschharz bei 37⁰C züchtet, die entstehenden Zellen abtrennt und abtötet bzw. ein Lysat der Zellen inaktiviert und in üblicher Weise konfektioniert.

Im einzelnen wird die abgetötete Vaccine bereitet, indem man als Ausgangsmaterial einen in Bordetella bronchiseptica enthaltenen Phase I Organismus verwendet, welcher aus beispielsweise dem Atmungstraktus von Schweinen oder Hunden isoliert wurde und welcher hinreichend K-Antigen sowie ein Antigen besitzt, welches in der Lage ist, den Mäusen ein Schutzvermögen gegen intracerebrale Infektion, welche sich von diesen Mikroorganismen herleitet, zu erteilen. Der Phase I Organismus, auf welchen hier Bezug genommen ist, ist, wie in dem Bericht der Erfinder (Kitasato Arch. Exp. Med., Band 30, 57 [1957]) angegeben, ein gramnegativer Keim, welcher auf einem Blutagarmedium eine kokkoide Form bzw. Kokkenbazillusform zeigt, welche Kapseln bzw. Einhüllungen aufweist und welche keine oder kaum Geißeln aufweist und welche solche Eigenschaften besitzt wie das Auftreten einer starken Agglutination gegenüber Anti-K-Serum, jedoch einer geringen oder leichten Agglutination gegenüber Anti-O-Serum; ferner das Auftreten hoher Ansteckungskraft bei Injektion in Mäusegehirn; und das Auftreten bedeutender Nekrotoxicität beim intrakutanen Einspritzen in Meerschweinchen. (Vorstehend ist das Anti-K-Serum ein Kaninchenserum, hergestellt durch Adsorbieren eines mit Phase I Organismus immunisierten Kaninchenserums mit einem Phase III Organismus oder Phase I Organismus, erhitzt auf 100 bis 120⁰C; der Phase III Organismus ist eine Phase I Organismus, welcher seine Kapseln bzw. Einhüllungen verloren hat; und das Anti-O-Serum ist ein Kaninchenserum, immunisiert mit einem Phase I Organismus, oder Phase III Organismus, erhitzt auf 100 bis 120°C.)

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Vaccine besitzt ausgezeichnete Immunisierungsfähigkeit und Sicherheit, bewahrt Schweine vor der Krankheit durch Injektion oder Inhalation, und kann den Schweinen ausgezeichnete Immunität exakt und wirtschaftlich erteilen. Die Vaccine besitzt solche Eigenschaften, daß bei deren intraperitonealer Injektion

von Mäusen, und 10 Tage danach Einspritzen des Mikroorganismus Bordetella bronchiseptica in das Gehirn von Mäusen in einer Dosis von 10 bis 100 LD₅₀ (LD50 bedeutet die Menge an Mikroorganismen, welche fähig ist, 50% der Mäuse abzutöten), die Mäuse vor Infektion bewahrt werden, und daß beim Einspritzen der Vaccine in Schwein oder Kaninchen, Antikörper (K-Antikörper) erzeugt werden, welche fähig sind, den Phase I Organismus stark zu agglutinieren.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen abgetöteten Vaccine verwendet man gewöhnlich ein Blutagarmedium als Grundmedium. Dies hat seinen Grund darin, daß die Anwesenheit oder Abwesenheit von K-Antigen im Mikroorganismus Bordetella bronchiseptica ein wichtiger Schlüssel zum Beherrschen des obenerwähnten Schutzvermögens der Vaccine ist und das Blut im Blutagarmedium eine Aktion des Verhütens des Verschwindens des K-Antigens besitzt. Jedoch ist es schwierig, eine große Menge an Blut zur Bereitung der Vaccine sicherzustellen. Demgemäß wurden K-Antigen schützende Substanzen geprüft, welche anstelle von Blut verwendbar sind und es wurde gefunden, daß eine spezifische Kombination von Kasaminosäure, Hefeextrakt und Aktivkohle oder Ionenaustauschharz noch ausgezeichneter als Blut ist und daß eine Vaccine, welche aus dem Mikroorganismus bereitet wurde, der in einem Medium kultiviert wurde, welches diese Kombination enthält, hinsichtlich des Verhütungseffektes ausgezeichnet ist. Daher macht die Erfindung die Massenherstellung der erfindungsgemäßen Vaccine höchst einfach.

Es sind zwar Kulturmedien zum Züchten des Phase I Organismus von Bordetella bronchiseptica bekannt, die auch für das Verfahren'der Erfindung als Grundmedien eingesetzt werden, die jedoch bei Fehlen der spezifisehen Zusammensetzung des Nährmediums keine Mikroorganismen mit K-Antigen hervorbringen.

Die anstelle von Blut erfindungsgemäß verwendete Kombination setzt sich zusammen aus 0,5 bis 1,0 Gew.-% Kasaminosäure, 0,05 bis 0,1 Gew.-% Hefeextrakt, und entweder 0,1 bis 0,5 Gew.-% Aktivkohlepulver oder 0,3 bis 1,0 Gew.-% Anionenaustauschharz, bezogen auf das Gewicht eines festen oder flüssigen Grundmediums wie Nähragar oder Brühe (Methods in Microbiology, Band 3 A, Seiten 116-117, herausgegeben von J. R. N ο r r i s und D. W. R i b b ο η s, Academic Press, 1970). Diese Kombination wird anstelle von Blut in das Grundmedium von Nähragar oder -brühe einverleibt.

Die Vaccine wird erfindungsgemäß in solcher Weise so bereitet, daß man einen K-Antigen besitzenden Phase I Organismus von Bordetella bronchiseptica in dem obenerwähnten Holzkohle-Brühmedium oder Holzkohle-Agarmedium kultiviert, um die aktive Substanz genügend beizubehalten und um die Massenproduktion möglich zu machen, und daß man die sich ergebenden Zellen abtötet oder ein Lysat der Zellen inaktiviert durch Wärmebehandlung bei 50 bis 6O⁰C, durch Verwendung von· Natrium-äfhylmercurithiosalicylat oder Formalin, oder durch Anwendung einer physikalisehen Arbeitsweise unter Verwendung eines Schallzerkleinerers oder einer geeigneten Schüttelvorrichtung zum Zerkleinern der Zellen in Bruchstücke (Schütteleinrichtung mit Glassplittern als Zerkleinerungsmedium). Mit allen diesen Hilfsmitteln wird die immunisierende Eigenschaft erhöht. Die so bereitete abgetötete Vaccine benutzt man, so wie sie ist, oder nach dem Hinzusetzen eines Hilfsstoffes wie Aluminiumoxydgel oder öl.

Arbeitsvorgänge zum Bereiten der erfindungsgemäßen abgetöteten Vaccine sind nachstehend unter Bezugnahme auf die Ausführungsbeispiele erläutert. In den Beispielen beziehen sich alle Prozentangaben auf das Gewicht.

Beispiel 1

Ein K-Antigen besitzender Phase I Organismus von Bordetella bronchiseptica wird eingeimpft in ein Medium, welches bereitet wurde durch Hinzusetzen von 0,5 bis 1,0% Kasaminosäure, 0,05 bis 0,1 Gew.-% Hefeextrakt und 0,5 bis 0,1% Aktivkohlepulver zu Nähragar als Grundmedium; in ein Medium, welches bereitet wurde durch weiteres Hinzusetzen von 0,5 bis 1,0% Polypepton zu dem obenerwähnten Medium; oder in ein Medium, welches in der Zusammensetzung mit dem obenerwähnten Medium identisch ist mit der Ausnahme, daß 0,3 bis 1,0% Anionenaustauschharz anstelle des Aktivkohlepulvers zugesetzt wurden. Dann kultiviert man 48 Stunden bei 37° C. Die sich ergebenden Zellen werden gesammelt und auf eine Konzentration von 1 bis 200 Billionen je ,cm³ verdünnt. Die Zellenlösung wird dann mittels Schallbehandlung (10 kc) zerkleinert. Das erhaltene zerkleinerte Lysat wurde mit 0,01% Natrium-äthylmercurithiosalicylat inaktiviert.

Beispiel 2

Ein K-Antigen besitzender Organismus von Bordetella bronchiseptica, wird eingeimpft in ein Medium, welches hergestellt wurde, indem man 0,5 bis 1,0% Kasaminosäure, 0,05 bis 0,1% Hefeextrakt und 0,1 bis 0,5% Aktivkohlepulver zu einer Nährbrühe als Grundmedium hinzugibt; oder in ein Medium, welches in der Zusammensetzung mit dem obenerwähnten Medium identisch ist mit der Ausnahme, daß 0,3 bis 1,0% Anionenaustauschharz anstelle des Aktivkohlepulvers hinzugesetzt ist. Dann unterwirft man einer Setzkultur oder einer Schüttelkultur bei 37⁰C 48 Stunden lang. Nach dem Sammeln der sich ergebenden Zellen durch Zentrifugieren, bewirkt man zur Bereitung einer Vaccine den gleichen Arbeitsgang wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Zu der Vaccine von Beispiel 1 setzt man ein Aluminiumoxydgel in solcher Weise hinzu, daß die Menge an Aluminiumionen 2 bis 10 mg/cm³ wird, wodurch eine Hilfsvaccine erhalten wird. Eine Vaccine, welche in der Wirksamkeit mit der obenerwähnten Vaccine identisch ist, kann auch erhalten werden, indem man die gleiche Menge eines ölhilfsstoffes, anstelle des Aluminiumoxydgels, zum Emulgieren hinzusetzt.

Beispiel 4

In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 wird eine Kulturflüssigkeit bereitet, indem man in ein flüssiges Medium einen K-Antigen besitzenden Phase I Organismus von Bordetella bronchiseptica einimpft und kultiviert, und man dann die sich ergebenden Zellen durch Hinzusetzen von 0,01 bis 0,02% Natriumäthylmercurithiosalicylat inaktiviert. In die Kulturflüssigkeit werden 2 mg/cm³ eines Aluminiumoxydgels einverleibt und man läßt über Nacht bei 4°C stehen. Dann wird die überstehende Flüssigkeit entfernt zur Bereitung einer Vaccine in Form eines Gels, an welches die Zellen des genannten Organismus und lösliche wirksame Substanzen absorbiert worden sind.

Klinische Wirkungen der erfindungsgemäßen herge-

stellten Vaccine sind nachstehend unter Bezugnahme auf Beispiele gezeigt.

Versuch 1

Die nach Beispiel 1 erhaltene Vaccine wird auf eine Konzentration bzw. eine äquivalente Konzentration von 1 bis 200 Billionen je cm³ verdünnt. 1 cm³ der verdünnten Vaccine werden im Verlaufe von 1 bis 3 Wochen, je 3mal je Woche 3 bis 30 Tage alten Ferkeln in die Nasenhöhle durch Einsprühen inhaliert, wodurch den Ferkeln eine aktive Immunisierung verliehen werden kann. Außerdem wird die verdünnte Vaccine 2-bis 4mal in den angegebenen Intervallen in Mutterschweine eingespritzt und dann werden ferner während der Schwangerschaft Verstärkungsinjektionen bewirkt, wodurch infolge der Mutter-Fötus-Immunität den geborenen Ferkeln passive Immunisierung verliehen werden kann.

Versuch 2

Jedes der in Beispiel 1 bis 4 bereiteten Vaccinen wird auf eine Konzentration von 30 Billionen je cm³ verdünnt. Anschließend wird 1 cm³ der verdünnten Vaccine intramuskulär in 100 Ferkel im Alter von 7 bzw. 21 Tagen eingespritzt. 2 Wochen nach der ersten Injektion spritzt man ferner 2 cm³ dieser verdünnten Vaccine intramuskulär in die Ferkel ein. Nach 6 Monaten werden klinische Symptome der Ferkel beobachtet und mit Symptomen von Kontrollferkeln verglichen, denen keine Vaccine eingespritzt worden ist. Jedes Ferkel wird nach 6 Monaten zur Erforschung

lü seiner Nasenmuschelatrophie anatomisch untersucht, und man erhält die Ergebnisse, welche in Tabelle I angegeben sind. Aus Tabelle I ergibt sich, daß die erfindungsgemäße Vaccine bemerkenswert wirksam ist und daß noch ausgezeichnetere Wirkungen erzielt werden können, wenn mit der Vaccineanimpfung in einem frühen Stadium nach der Geburt begonnen wird. (Selbst wenn der Keim nachgewiesen worden ist, sind die angeimpften Gruppen in ihren klinischen Symptomen leicht und die 7 Tage alte Gruppe kann ohne Hervorbringung der Nasenmuschelatrophie verbleiben.)

Tabelle 1

Gruppe

Injektionszeit

El. bronchiseptica
Wiederherstellungsrate (%)

Nr. 1 Nr. 2 Nr. Nr. 4

Positive Rate der Nasenmuschelatrophie (%)

Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4

7 Tage alt 7. und 21. Tag nach

Entbindung
21 Tage alt 21. und 35. Tag nach

Entbindung
Kontroll- —
gruppe

Bemerkung:

Die in den Spalten Nr. 1 bis 4 gezeigten 2^ahlen sind Ergebnisse, welche erhalten wurden durch Verwendung der Vaccine, welche in den Beispielen 1 bis 4 bereitet wurden.

29	18	23	17	0	0	0	0
29	20	21	20	7	8	9	4
87	78	84	69	46	52	63	47

Versuch 3

Die mit Schall behandelte, wie für Versuch 1 bereitete Vaccine, wird auf eine Konzentration von 200 Billionen je cm³ verdünnt. Dann werden 5 cm³ der verdünnten Vaccine durch den Nasenhohlraum von jeweils 100 Ferkeln, welche 8 Tage alt sind, inhaliert. Nach 3 Wochen wird die Aluminiumoxydgel-Vaccine, welche in Beispiel 3 bereitet wurde, und welche auf eine Konzentration von 30 Billionen je cm³ verdünnt worden ist, intramuskulär in die Ferkel in einer Dosis von 2 cm³ eingespritzt (Gruppe A). Ferkel einer anderen Gruppe (Gruppe B) werden einzeln intramuskulär zweimal in Abständen von 3 Wochen mit 2 cm³ der in Beispiel 3 bereiteten Aiuminiumoxydgelvaccine injiziert, welche auf eine Konzentration von 30 Billionen je cm³ verdünnt worden ist. Danach werden die klinischen Symptome der angeimpften Ferkel mit denjenigen Kontrollferkeln verglichen, weiche nicht mit der Vaccine angeimpft worden sind. Als Ergebnis findet man, wie in Tabelle II angegeben, daß selbst bei Inhalationsanwendung die erfindungsgemäß hergestellten Vaqcine erfolgreich den Agglutinintiter steigert und im Hinblick der positiven Rate der Nasenmuschelatrophie wirksam ist. (Selbst wenn die Keime nachgewiesen sind, sind die angeimpften Gruppen in ihren klinischen Symptomen leicht und sind in der positiven Rate der Nasenmuschelatrophie niedrig wie im Falle des Versuchs 2.)

Tabelle II	Impfungsvorgang	Agglutinintiter vor zweiter Impfung	4 Wochen nach zweiter Impfung	B. bronchiseptica Wiederherstel lungsrate im Altersstadium von 3-6 Monaten (%)	Positive Rate der Nasenmuschel atrophie im Alters stadium von 6 Monaten (%)
Gruppe	Inhalation + Injektion Injektion +Injektion	22,4 22,5 <5	50,2 113,0 <5	33 17 80	0 6,3 76.2
A B Kontrolle

Versuch 4

Jede der Vaccine, welche nach den Beispielen 1 bis 4 hergestellt sind, wird auf eine Konzentration von 30 Billionen je cm¹ verdünnt. Dann spritzt man 3 bis 10cm^J der verdünnten Vaccine intramuskulär 2- bis 4mal in Mutterschweine in Abständen von 2 bis 4 Wochen ein, um die Mutterschweine grundsätzlich zu immunisieren. Während der Schwangerschaft der Mutterschweine wird ferner eine Verstärkerinjektion 2- bis 3mal bewirkt, indem man 3 bis lOcni' der obenerwähnten verdünnten Vaccine jedesmal einspritzt. Als Ergebnis sind die entbundenen Ferkel wegen der Mutter-Fötus-Immunität stark immunisiert worden und, wie in Tabelle III gezeigt, wurde gefunden, daß die erfindungsgemiiß

hergestellten Vaccine wirksam sind im Hinblick auf die Rate der positiven Nasenmuschelatrophie der entbundenen Ferkel, gegenüber nicht geimpften Kontrollmutterschweinen.

In den Tabellen bezeichnet »Agglutinintiter« die Wirkung der Vaccine, nämlich die durch die Vaccine ausgelöste Antikörperbildung nach Infektion des Schweines mit der Krankheit. Wenn beispielsweise der Agglutinintiter 320 oder darüber beträgt zeigen die Ferkel beträchtlichen Vaccine-Effekt. Wenn der Agglutinintiter 2500 oder mehr beträgt, werden die Antikörper des Mutterschweines mit der Muttermilch auf die Ferkel übertragen, so daß die Ferkel durch die übertragenen Antikörper einen Monat lang gegen die Krankheit geschützt sind.

Tabelle III

Gruppe Nr.

Muiierschwein

Anzahl der
Injektionen

Injektionsdosis

(ml)

Agglutinintiter I Woche vor Entbindung

Entbundene Ferkel
Zahl

Agglutininliter
1 Woche nach
Entbindung

Positive Rate der
Nasenmuschelatrophie im Altersstadium von 1 Mona ι

Kontrolle

2
3

3
3
3

10
10
10
10

12

25 12i!00 25 iiOO

12 «00

10

9
10
11
10

800- 3 200 3/8

800- 6 400 4/9

800- 6 400 4/10

800- 1 600 5/8

6 400-12 800

12 800-25 600

6 400-12 800

<5

2/9
3/10
2/11
1/10

8/8

Bemerkung:
Die Zahlen in den Spalten Nr. er tsprechcn den Vaccinen, welche in den betreffenden Beispielen 1 bis 4 bereitet wurden.

In allen in den Tabellen aufgeführten Versuchen waren die dort untersuchten Schweine, wie vor der Untersuchung durch Kultur- und Serumtest bestätigt wurde, vor der ersten Vaccine-Injektion nicht mit Krankheitskeimen (Rhinitis) infiziert. Nach der Injektion mit Vaccine wurden die Schweine wieder in den Schweinestall gebracht, um dann entweder natürlich oder künstlich infiziert zu werden.

Die prophylaktische Schutzwirkung der erfindungsgemäß hergestellten Totvaccine ergibt sich aus folgen-4» den Versuchen:

Eine Gruppe von 68 Schweinen wurde, wie in Versuch 1 beschrieben, mit der Totvaccine infiziert.

Eine weitere Gruppe von 64 Schweinen blieb unbehandelt.

Es zeigte sich, daß aus der Gruppe der unbehandelten Schweine 37 sich mit der genannten Krankheit infizierten (etwa 58%), während aus der Gruppe der mit der Totvaccine behandelten Schweine nur 5 Schweine (etwa 7%) infiziert wurden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung einer Totvaccine gegen infektiöse atrophische Rhinitis der Schweine, dadurch gekennzeichnet, daß man den Phase I Organismus von ein K-Antigen aufweisender Bordetella bronchiseptica in einem Grundmedium aus Nähragar oder Nährbrühe und zusätzlich 0,5 bis 1,0 Gew.-% Kaiaminosäure, 0,05 bis 0,1 Gew.-°/o Hefeextrakt und entweder 0,1 bis 0,5 Gew.-% Aktivkohlepulver oder 0,3 bis 1,0 Gew.-% Anionenaustauschharz bei 37° C züchtet, die entstehenden Zellen abtrennt und abtötet bzw. ein Lysat der Zellen inaktiviert und in üblicher Weise konfektioniert.