DE2348897C3

DE2348897C3 - In die Atmungswege verabreichbarer Impfstoff zur Immunisierung von Tieren gegen Mycoplasmose der Atmungsorgane

Info

Publication number: DE2348897C3
Application number: DE2348897A
Authority: DE
Inventors: Eizo Hayatsu; Morimasa Yoshioka
Original assignee: KITASATO INSTITUTE TOKIO
Current assignee: KITASATO INSTITUTE TOKIO
Priority date: 1972-10-05
Filing date: 1973-09-28
Publication date: 1980-02-14
Also published as: DE2348897A1; DE2348897B2; FR2201878A1; JPS5540568B2; US3917819A; CA1016456A; AU461928B2; NL159584B; BE805570A; IT1055538B; FR2201878B1; NL7313052A; GB1439407A; IL43310A; JPS4955822A; AU6021373A; IL43310A0; SU625623A3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen in die Atmungswege verabreichbaren Impfstoff zur Immunisierung von Tieren gegen infektiöse Erkrankungen der Atmungsorgane, die durch Mycoplasma verursacht werden. ·

Bisher hat in allen Längern der Welt die Mycoplasmose der Atmungsorgane bei Tieren geherrscht. Es sind dies solche Krankheiten wie die durch Mycoplasma gallisepticum verursachten chronischen Atmungskrankheiten des Geflügels, die durch Mycoplasma synoviae verursachte Luft-Sacculitis des Geflügels, die durch Mycoplasma suipneumoniae verursachte enzootische Lungenentzündung des Schweins, die durch Mycoplasma mycoides var. capri verursachte ansteckende Brustseuche der Ziegen usw. Diese enzootischen Mycoplasma-Krankheiten der Atmungsorgane des Viehs sind sehr ansteckend, und es ist gut bekannt, daß infolge Infektion mit einer oder mehreren dieser Mycoplasma-Krankheiten die Geschwindigkeit der Körpergewichtszunahme, die Eierproduktion und die Befruchtung herabgesetzt werden, bei der Geflügelaufzucht die Zahl des Kükenverlustes ansteigt, bei Schweinen die Geschwindigkeit der Zunahme des Körpergewichts zurückgeht und bei Ziegen durch die genannte Krankheit Schwachwuchs und Tod infolge Durchfall verursacht wird. Daher wird der Geflügelindustrie und den Viehzüchtern durch die genannte Mycoplasmose ein großer wirtschaftlicher Schaden zugefügt. Es war daher erwünscht, Gegenmaßnahmen zu ergreifen, um die durch Mycoplasma verursachten enzootischen Atmungskrankheiten zu verhindern.

Mit dem Ziel, die enzootischen Mycoplasma-Krankheiten der Atmungsorgane beim Vieh zu heilen, wurden verschiedene Antibiotika untersucht und angewendet. Es ist jedoch außerordentlich schwierig, die vorgenannten Krankheiten durch Antibiotika auszurotten. Zur Immunisierung gegen die genannten Krankheiten sind lebende Impfstoffe mit geschwächten Stämmen bekannt (US-PS 35 34 136 [1970]). Da es bei lebenden Impfstoffen hinsichtlich der Grundlagen der Virulenz und der

ίο senkrechten Vererbung der Impfstofforganismen Probleme gibt, die noch einer vollständigen Klärung bedürfen, ist die Entwicklung von wirksamen und mit Sicherheit inaktivierten Impfstoffen erwünscht. Es sind verschiedene Hilfs-Impfmittel bekannt, die inaktivierte Impfstoffe enthalten und durch intramuskuläre Injektion verabfolgt werden (D. A. M c M a r t i η und M. Shi Trine, Am. J. of Veter. Res. 21,482 [I960]; und H. E. Adler, J. Fabricant, R. Yamamolo und ]. Berg. Am. }. of Veter. Res. 19, 440 [!958]). Alle diese

:o Hilfs-Impfsto.ffe vermögen jedoch die Mycoplasmose der Atmungsorgane nicht in genügendem Maße zu verhindern und wurden daher nicht in großem Umfang angewendet. Aus den DE-OS 16 17 612 und 20 35 118 sind inaktivierte Impfstoffe auf Mycoplasmen-Basis bekannt. Diese Impfstoffe haben jedoch den Nachteil, daß sie nur intramuskulär verabreicht werden können.

Aufgabe der Erfindung ist daher ein effektiver Impfstoff auf der Basis inaktivierter Mycoplasmen, der zur Immunisierung von Tieren gegen Mycoplasmose der Atmungsorgane in die Atmungswege verabreicht werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist ein in die Atmungswege verabreichbarer Impfstoff zur Immunisierung von Tieren gegen Mycoplasmose der Atmungsorgane auf der Basis inaktivierter Mycoplasmen, dadurch gekennzeichnet, daß er die abgetöteten Mycoplasmen in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 6,0 bis 7,8 in einer Konzentration von wenigstens 2,0 χ ΙΟ⁵ abgetöteten Zellen je ml Impfstoff und einen Suspensionsstabilisator enthält.

Es wurde gefunden, daß die enzootische Mycoplasmose der Atmungsorgane bei Tieren durch Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffs in die Atmungswege verhindert werden kann.

Der erfindungsgemäße Impfstoff wird in der Weise hergestellt, daß man Mycoplasma-Organismen züchtet, sammelt, abtötet, die abgetöteten Organismen in einem wäßrigen Medium suspendiert und dann der Suspension der abgetöteten Mycoplasma-Zellen einen Suspensionsstabilisator zusetzt.

Zur Züchtung wird ein flüssiges Kulturmedium für die Fortpflanzung der Mycoplasmazellen verwendet, das als Basis ein flüssiges Zuchtmedium folgender Zusammensetzung enthält:

Rinderherz-Infusion 7,0 g

Pepton 10,0 g

Natriumchlorid 5,0 g

Mit Wasser aufgefüllt auf 1000 ml

Das flüssige Medium wird zusätzlich mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle, wie Glucose, in einer Menge von 0,1 bis 1,0% (Gewicht/Volumen) versetzt. Bei der Züchtung von Mycoplasma gallisepticum wird ferner Geflügelserum in einer Menge von 5 bis 15 Vol.-% zugesetzt. Bei der Züchtung von Mycoplasma synoviae wird dem Medium ferner 5 bis 15% Geflügelserum, 0,001 bis 0,1% (Gewicht/Volumen) Diphosphopyridin-Nucleotid, 0,001 bis 0,1% L-Cystein-

NaH₂PO₄ · 2 H₂O
NaHPO₄

NaCl

507 mg
958 mg
8,5 g

10

Hydrochlorid und 0,01 bis 0,1% (Gewicht/Volumen) eines Multivitaminkonzentrats (100 χ Konzentrat) zugesetzt. Das letztere ist ein Multivitamin-Präparat, das für Zuchtmedien verwendet wird. Ein Liter des Konzentrats enthält:

d-Biotin 0,24 mg

Folsäure 0,44 mg

Niacinamid 0,12 mg

Calciumpantothenat 0,24 mg

Pyridoxalhydrochlorid (USP) 0,20 mg

Thiaminhydrochlorid 0,34 mg

Riboflavin 0,04 mg

Cholinchlorid 0,14 mg

Für die Züchtung von Mycoplasma suipneumoniae wird dem Medium ferner 10 bis 20% (Gewicht/Volumen) Schweineserum zugesetzt. Für die Züchtung von Mycoplasma mycoides var. capri wird dem Medium ferner 5 bis 15% (Gewicht/Volumen) Ziegenserum zugesetzt.

Alternativ kann jedes der obengenannten Seren durch 3 bis 8% (Gewicht/Volumen) einer Eigelb-.Komponente ersetzt werden. Die Eigelb-Komponente kann hergestellt werden, indem man ein Eigelb mit einer gleichen Menge reinem Wasser (z. B. entsalztes oder destilliertes Wasser) oder mit einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 6,0 bis 7,8, wie z. B. einer physiologischen Salzlösung, einer M/100 Phosphat-Pufferlösung oder einer Mischung aus M/100 Phosphatpul fer und physiologischer Salzlösung, extrahiert. Die Extraktion kann beispielsweise so erfolgen, daß eine Mischung aus Eigelb und entsalztem Wasser (Volumenverhältnis 1:1) zwei Stunden bei 56"C gerührt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt wird. Die Mischung wird dann mit IO⁴ U/min zentrifugiert und die resultierende überstehende Flüssigkeit steril filtriert, wobei man die Eigelb-Komponente r-rhält.

Jeder der so hergestellten Mycoplasma-Stämme wird in das so hergestellte flüssige Zuchtmedium für das Mycoplasmazellen-Wachstum eingeimpft und aerob 3 bis 7 Tage bei 35 bis 38°C kultiviert, wobei man Mycoplasmazellen in hoher Ausbeute erhält, z. B. 1,0 bis 5,0 g nasse Zellen je 1 I des flüssigen Kulturmediums.

Um die Mycoplasma-Zellen zu ernten, wird das flüssige Kulturmedium in einer Zentrifuge mit 8000 U/min oder mehr wenigstens 20 min oder mit einer kontinuierlichen Zentrifuge mit beispielsweise 16000 U/min (etwa 25 000 g) zentrifugiert.

Alternativ wird das flüssige Kulturmedium mit einem Aluminiumhydroxyd-Gel oder einem Aluminiumphosphat-Gel als Adsorbens versetzt, um die Mycoplasma-Zellen abzutrennen oder auszufällen. Die Menge des verwendeten Adsorbens liegt im Bereich von 10 bis 400 ml, vorzugsweise von 30 bis 100 ml je 11 des flüssigen Kulturmediums.

Die so geernteten Zellen werden dann mit einem physiologisch zulässigen wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 6,0 bis 7,8, vorzugsweise von 6,5 bis 7,4, wie einer physiologischen Salzlösung, einer M/100 Phosphatpuffer-Lösung oder einer Mischung aus M/100 Phosphatpuffer und physiologischer Salzlösung versetzt, um eine Zellen-Suspension der Mycoplasma-Stämme zu erhalten. Ein typisches Beispiel einer Mischung der phosphatgepufferten Salzlösung hat die folgende Zusammensetzung: Mit Wasser aufgefüllt auf
pH

1000 cm³
7,2

In der dargelegten Weise wird die erhaltene Zellen-Suspension auf eine solche Konzentration eingestellt, daß die Anzahl der Zellen je ml größer als 2,0x10⁵ wird.

Die resultierende Zellen-Suspension wird 5 bis 30 Minuten auf 50 bis 56°C erhitzt oder ihr wird ein Abtötungsmittel für die Zellen in einer Menge zugesetzt, die beispielsweise bei Formalin 0,01 bis 0,5% (Gewicht/Volumen), bei Natriumäthylquecksilber-Salicylat 0,01 bis 0,02% (Gewicht/Volumen) oder bei jS-Propiolacton 0,01 bis 0,2% (Gewicht/Volumen) beträgt.

Nach anderer Ausführung wird der Niederschlag in einer kleinen Menge der physiologischen Salzlösung suspendiert, und die Suspension wird einer Inaktivierungsbehandlung unterworfen, um die Mycoplasma-Zellen auf physikalischem Wege, wie durch Ultraschall-Zersetzung bei 10 kHz während einer Zeit von 0,5bis 1,0 Minuten oder durch französisches Pressen (French pressing) vollständig zu zerstören. Dann wird die Suspension mit der physiologischen Salzlösung auf die obengenannte Zeilen-Konzentration verdünnt, wobei man eine abgetötete Zellen-Suspension erhält.

Der so dargestellte inaktivierte Mycoplasma-Impfstofff ist eine Suspension von abgetöteten Mycoplasmazellen oder deren Bruchstücken in einer physiologischen Salzlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 7,8, wobei die Zahl der Zellen oder Teilstücke wenigstens 2,0x 10⁵ je ml der Suspension der lebenden Zelle entspricht

Eine ausgezeichnete Immunisierung kann sogar erreicht werden, wenn die Suspension der abgetöteten Zellen verwendet wird. Um die Immunisierungswirkung aber zu verstärken enthält die Suspension vorzugsweise einen Suspensionsstabilisator.

Als Suspensionsstabilisator ist eine der unten erwähnten physiologisch zulässigen Stoffe oder deren Mischungen in den angegebenen Mengen brauchbar.

Saccharide: Glucose (0,3-1,0%).
Saccharose (0,5-1,0%),
Lactose (0,1 - 1,0%) oder
Dextran (0,5-3,0%).

Aminosäuren: Glutaminsäure (0,1 —0,5%) oder
Glycin (0,5-5,0%).

Seren: Bei Mycoplasma gallisepticum oder

Mycoplasma synoviae:
Geflügelserum (0,1-1,0%) oder
Geflügelserum-Albumin (0,1 -0,5%).

Bei Mycoplasma suipneumoniae:
Schweineserum (0,1 — 1,0%) oder
Schweineserum-Albumin (0,1—0,5%).

Bei Mycoplasma mycoides var. capri:
Ziegenserum (0,1 — 1,0%) oder
Ziegenserum-Albumin (0,1 —0,5%).

Andere: SOPOÄ*) (0,05-0,5%),
Gelatine (0,01 —0,05%) oder das
Dinatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure (0,03—0,3%).

*) SOPOÄ: Sorbitanmonooleat des Polyoxyäthylenkondensais

Wenn der Suspensionsstabilisator der inaktivierten Zellen-Suspension zugesetzt ist, wird die Suspension durch physikalische Methoden, z. B. eine Ultraschallbehandlung bei 1OkHz während einer Zeit von 30 Sekunden bis 1 Minute oder durch Schütteln mit Glasperlen homogenisiert Dan.i, wird der Suspensionsstabilisator wie oben erwähnt in einer geeigneten Menge der Zellen-Suspension zugesetzt, um die Suspension des abgetöteten Mycoplasma-Impfstoffs zu erhalten.

Die durch Infektion mit Mycoplasma verursachte Erkrankung der Atmungsorgane wird durch Immunisierung dieser Organe in der Weise verhindert, daß die Impfstoffsuspension in die Luftröhren der Tiere eingesprüht oder eingespritzt wird. ι s

Es ist zu bemerken, daß die Suspension des abgetöteten Mycoplasma-Impfstoffs nach vorliegender Erfindung gar keinen erkennbaren Vorbeugungseffekt zeigt, wenn der Impfstoff alleine oder in Mischung mit verschiedenen Hilfsstoffen intramuskulär eingespritzt wird. Beispiele für solche Hilfsstoffe sind »Zusatzstoff MPMy«**), magnetisches Eisenoxid, eine Mischung aus Natriumalginat und Calciumchlorid, eine Mischung aus inaktivem Haemophilus gallinarum und Aluminiumhydroxid-Gel oder ein Aluminiumhydroxid-Gel.

Die Suspension des inaktiven Mycoplasma-Impfstoffs der vorliegenden Erfindung ergibt jedoch einen ausgezeichneten Vorbeugungseffekt, wenn es einzeln in die Atmungswege bzw. die Luftröhre eingesprüht oder intratracheal injiziert wird. Die durch Einspritzen oder Injektion des Impfstoffs in die Luftröhren durchgeführte Immunisierung ist eine sichere Methode ohne solche Nebenwirkungen wie die Verhärtung der Einspritzungsstellen, die bei intramuskulärer Injektion der bekannten inaktiven Impfstoffe häufig beobachtet wurde.

Die Menge der erfindungsgemäßen Suspension des abgetöteten Mycoplasma-Impfstoffs, der durch Einsprühen oder Einspritzen in die Luftröhren verabreicht wird, hängt von dem Infektionsgrad des Tieres ab. 0,5 ml oder mehr von einer Impfstoffsuspension des abgetöteten Mycoplasma gallisepticum oder Mycoplasma synoviae oder deren Mischungen kann verabfolgt werden, um Luft-Sacculitis des Geflügels zu vermeiden. 0,5 ml oder mehr der Impfstoffsuspension von abgetötetem Mycoplasma suipneumoniae kann verwendet werden, um bei Schweinen die enzootische Lungenentzündung zu vermeiden. 0,5 ml oder mehr einer Suspension von abgetöteten Mycoplasma mycoides \ar. capri kann verwendet werden, um bei Ziegen die ansteckende Brustseuche zu verhindern. Gewöhnlich werden die Impfstoffe in der Weise verabfolgt, daß sie mit einem Verneblungsapparat oder irgendeinem geeigneten Sprühapparat zwei- oder dreimal oder noch öfter innerhalb von zehn Tagen in die Luftröh.e eingesprüht oder eingespritzt werden.

Die Suspension der abgetöteten Mycoplasma-Impfstoffe der vorliegenden Erfindung zeigt außerordentliche Wirkungen bei der Immunisierung gegen die Infektion mit virulenten Mikroplasma-Stämmen selbst dann, wenn die Tiere nach Immunisierung mit dem

**) Zusatzstoff der folgenden Zusammensetzung:

Mannitmonooleat') 1,5 ml

Paraffinö!²) 8,5 ml

Mycobacterium butyricum (abgetötet und getrocknet).

65 '): Nicht-ionischer Emulgator für pharmazeutische Zwecke,

ein Fettsäure-Teilester eines Polyolanhydrids.
²): Technisches weißes Mineralöl, das verwendet wird, wo U.S.P.- oder N.F.-Qualitäl nicht erforderlich ist.

Impfstoff mit anderen pathogenen Mikroorganismen infiziert werden.

Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele im einzelnen näher erläutert

Beispiel 1

Ein Liter des als Basis dienenden flüssigen Mycoplasma-Kulturmediums wurde mit 0,5% (Gewicht/Volumen) Glucose und 10VoI.-% erhitztem Hühnerserum versetzt, um ein flüssiges Kulturmedium zur Zellenfortpflanzung zu bilden. Dann wurde dem Medium Mycoplasma gallisepticum eingeimpft und zwei Tage unter aeroben Bedingungen bei 35 bis 38° C gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die Kulturflüssigkeit 30 Minuten bei 13 000 U/min zentrifugiert, um einen Niederschlag der Zellen des Mycoplasma gallisepticum zu erhalten. Diesem Niederschlag wurde eine wäßrige, mit Phosphat gepufferte, physiologische Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,2 zugesetzt, wobei man eine Zellensuspension mit mehr als 2,OxIO⁵ Zellen je ml erhielt Die so dargestellte Zellensuspension wurde mit 0,01% Formalin versetzt, um die Zellen abzutöten. Danach wurde die Suspension der abgetöteten Zellen durch Ultraschallbehandlung bei 1OkHz während einer Zeitdauer von 30 Sekunden homogenisiert und anschließend mit einer Mischung aus 0,02% Gelatine und 0,1% SOPOÄ versetzt, wobei man eine Suspension des abgetöteten Mycoplasma-gallisepticum-Impfstoffs erhielt.

Beispiel 2

Beispiel I wurde wiederholt, wobei jedoch von den Bestandteilen des Fortpflanzungsmediums von Mycoplasma gallisepticum das erhitzte Hühnerserum durch 6 Voi.-% einer Eigelbkomponente ersetzt wurde, die mit entsalztem Wasser extrahiert worden war. Man erhielt eine Suspension aus abgetötelem Impfstoff des Mycoplasma gallisepticum.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei aber die Zentrifugaltrennung der Zellen von Mycoplasma gallisepticum durch Zusatz von 50 ml Aluminiumhydroxyd-Gel zu 1000 ml Kulturmedium ersetzt wurde. Man erhielt eine Suspension aus abgetötetem Impfstoff von Mycoplasma gallisepticum.

Beispiel 4

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch Mycoplasma gallisepticum und 10Vol.-% erwärmtes Hühnerserum durch Mycoplasma synoviae und 13 Vol.-% erwärmtes Hühnerserum ersetzt wurden. Ferner wurden 0,01% Diphosphorpyridin-Nucleotid, 0,01% L-Cystein-Hydrochlorid und 0,025% des Multivitaminkonzentrats (100 χ Konzentrat) zugesetzt. Man erhielt einen abgetöteten Impfstoff von Mycoplasma synoviae.

Beispiel 5

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch Mycoplasma gallisepticum und das erwärmte Hühnerserum durch Mycoplasma suipneumoniae bzw. 2,0 Vol.-% erwärmtes Schweineserum ersetzt wurden. Die Züchtung dauerte vier Tage. Man erhielt eine Suspension eines abgetöteten Impfstoffs von Mycoplasma suipneumoniae.

Beispiel 6

Beispiel 5 wurde wiederholt, wobei jedoch das erhitzte Schweineserum durch 6 Vol.-% der in Beispiel 2

verwendeten Eigclbkompoiieiite ersetzt wurde. Man erhielt eine Suspension aus abgetötetem Impfstoff von Mycoplasma suipneumoniac.

D c i s ρ i c I 7

Beispiel I wurde wiederholt, wobei jedoch Mycoplasma gallisepticum und das erwähnte Hiihncrscrum durch Mycoplasma mycoides var. capri bzw. l,0Vol.-% erwärmtes Zicgenscrum ersetzt wurden. Man erhielt eine Suspension aus abgetötetem Impfstoff von Mycoplasma mycoides var. capri.

Beispiele

Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei aber das erhitzte Ziegenserum durch 6 Vol.-% der in Beispiel 2 verwendeten Eigelbkonionente ersetzt wurden. Man erhielt eine Suspension aus abgetötetem Impfstoff von Mycoplasma mycoides var. capri.

In den folgenden Versuchen (Versuche 1 bis 4) werden die Wirkung der Einsprühung des erfindungsgemäßen Impfstoffs in die Luftröhren und seiner intramuskulären Injektion mit einem Hilfsstoff in bezug auf die Mycoplasmose-Immunisierung verglichen.

Tabelle 1

Versuch 1

10 von spezifischen Krankheitskeimen freie (SPF), 10 Tage alte Küken in einer Versuchsgruppe wurden immunisiert, indem man die in Beispiel 1 erhaltene Suspension aus abgelötetem Impfstoff von Mycoplasma gallisepticum in die Luftröhre einsprühtc.

10 andere von spezifischen Krankheitskeimen freie, 10 Tage alte Küken wurden in einer zweiten Gruppe immunisiert, indem die gleiche Impfstoffsuspension wie in der ersten Gruppe intramuskulär eingesprilzt wurde.

Weitere 10 von spezifischen Krankheitskeimen freie. 10 Tage alte Küken wurden in einer anderen Gruppe immunisiert, indem man die gleiche Suspension wie in der ersten Gruppe je mit verschiedenen Hüfsstoffen intramuskulär einspritzte. Die Immunisierungen wurden mit Intervallen von 10 Tagen dreimal vorgenommen. Die Immunisieruiigsdosis betrug jedesmal 0,1 ml. 10 Tage danach wurden alle Versuchshühner in den drei Gruppen durch Besprühen mit einem virulenten Mycoplasma galliscplicum-Stamm mit 3,2 χ 10⁵ oder 1,6 χ 10⁴ lebenden Zellen getestet. Zwei Wochen nach diesem Test wurden die Versuchshühner geschlachtet und die Wirkungen der Impfstoffe hauptsächlich anhand der makroskopischen Verletzungen der Luftsäcke beurteilt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt.

Impfstoff

Hilfsstoff

Suspension von
getötetem Impfstoff
des Mycoplasma
gallisepticum,
welches in Beispiel 1
erhalten wurde

Zusatzstoff
MPMy

Magnetisches Eisenoxid

Natriumalginai +
Calciumchlorid

Inaktiviertes
Hemophilus gallinarum
+ Aluminiumhydroxid

Aluminiumhydroxid-Gel

Weg	Muskeln	Testdosis (Anzahl der lebenden Zellen)	Bewertung der Verletzung der Luftsäcke
In die		3,2 X 10'	2,65
	Muskeln	1,6 X 10"	1,80
In die		3,2 x 10'	2,75
	Muskeln	1,6 X 10⁴	2,10
In die		3,2 x 10'	2,80
	Muskeln	1,6 X 10⁴	2,00
In die		3,2 X 10'	2,70
	Muskeln	1,6 X 10⁴	1,90
In die		3,2 X 10'	3,00
	Muskeln	1,6 x 10"	2,05
In die		3,2 x 10⁵	2,70
	Luftröhren	1,6 x 10"	1,85
In die		3,2 X 10'	1,75
		1,6 X 10"	1,40
-		3,2 X 10⁵	3,15
	1,6 X 10⁴	2,00

Kontrollproben

- - 0,60

(Normal)

*) Mittelwert der Bewertungen, die den Verletzungsgrad der Luftsäcke bei den betreffenden, aus 10 Küken bestehenden Testgruppen zeigen. Die Bewertung jedes Kükens erhält man als Mittelwert der Bewertung des Krankheitsgrades von 4 Luftsäcken. Der Verletzungsgrad wird nach dem Zustand der Luftsäcke wie folgt bewertet:

0: Normal.

1: Dicke der Luftsäcke.

2: Verletzungsherde.

3: Bildung selbst eines käsigen Knotens.

4: Bildung vieler käsiger Knoten oder überall Bildung solcher Knoten.

ίο

Wie aus Tabelle 1 zu entnehmen ist, wurde gefunden, daß die oben genannte Suspension des abgestorbenen Impfstoffs keine deutliche Vorbeugung schaffen kann, wenn sie alleine oder in Mischung mit verschiedenen Hilfsstoffcn intramuskulär injiziert wird. Dagegen ergibt sie einen Vorbeugungseffekt, wenn sie direkt in die Luftröhre eingeimpft wird.

Versuch 2

Versuch i wurde wiederholt, wobei jedoch die Suspension des abgetöteten Impfstoffs von Mycoplasma gallisepticum und das virulente Mycoplasma gallisepticum durch die Suspension von abgetötetem

Tabelle 2

Impfstoff von dem in Beispiel 4 erhaltenen Mycoplasma synoviae bzw. virulentem Mycoplasma synoviae mit 5,7 χ 10⁵ lebenden Zellen ersetzt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Impfstoff

Hilfsstoff

Weg

Testdosis Bewertung der

(Zahl der Verletzung der

lebenden Zellen) Luftsäcke*)

Suspension von ab	—
getötetem Impfstoff	Zusatzstoff
des Mycoplasma	MPMy
synoviae, welches in
Beispiel 4 erhalten	Magnetisches Eisenoxid
wurde	Natriumalginat⁺)
	Calciumchlorid

Inaktiviertes Hemophilus
gallinarum + Aluminiumhydroxid-Gel

Aluminiumhydroxid-Gel

Kontrollproben

*) Ebenso wie in Tabelle 1.

in die Muskeln
in die Muskeln

in die Muskeln

in die Muskeln
in die Luftröhre

5,7 X 10'
5,7 x 10⁵

5,7 X 10'
5,7 X 10'

5,7 x 10'

5,7 X 10'
5,7 X 10'
5,7 X 10'

2,20 2,25

2,30 2,25

2,20

2,20 1,55 2,35 0,50

Versuch 3

Versuch 1 wurde wiederholt, wobei die Suspension des Impfstoffs aus abgetötetem Mycoplasma gallisepticum, das virulente Mycoplasma gallisepticum und die von Krankheitserregern freien Küken durch eine Impfstoffsuspension von in Beispiel 5 erhaltenem Mycoplasma suipneumoniae, virulentem Mycoplasma suipneumoniae mit 5,5 χ 10⁹ lebenden Zellen und 3 bis 4 Wochen alten, von Krankheitserregern freien Schweinen ersetzt wurden. Die Immunisierungsdosis betrug

Tabelle 3

jedesmal 0,5 ml. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Schweine auf Immunität getestet

i-3 indem sie mit virulentem Mycoplasma suipneumoniae mit 5,5 χ 10⁹ lebenden Zellen besprüht wurden. Nach 6 Wochen wurden die Testschweine seziert, um die Wirkungen der Impfstoffe an der pathologischen Veränderung der Lungenflügel auszuwerten. Die

so Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Impfstoff	Hilfsstoff	Weg	Testdosis (Zahl der lebenden Zellen)	Infeklionsrate*)
Impfstoffsuspension	—	intramuskulär	5,5 X 10'	8/10
von abgetötetem Mycoplasma	Zusatzstoff MPMy	intramuskulär	5,5 X 10'	7/10
das in Beispiel 5	Magnetisches Eisenoxid	intramuskulär	^c XlO'	8/10
erhalten wurde	Natriumalginat⁺) Calciumchlorid	intramuskulär	5,5X 10'	9/10

Fortsetzung

ImpfstolT

iiiirsstoir

Testdosis
(Zahl der
lebenden Zellen)

Infektionsrate*)

ImpfstofTsuspension Inaktiviertes Ilemophilus

von abgetötetem
Mycoplasma
suipneumoniae,
das in Beispiel 5
erhalten wurde

Kontrollprobe

gallinarum + Aluminiumhydroxid-Gel

Aluminiumhydroxid-Gel

intramuskulär	5,5	X	10'
intramuskulär	5,5	X	10"
in die Luftröhre	5,5	X	10"
—	5,5	X	10"

8/10

9/10 4/10 9/10 0/10

*) Der Nenner gibt die Zahl der Testschvveine und der Zähler die Zahl der Schweine mit positivem Lungenbefund an.

Versuch 4
Versuch 3 wurde wiederholt, wobei anstelle der 20 Mycoplasma mycoides var. capri, virulentes Mycoplas-

lmpfstoffsuspension von abgetötetem Mycoplasma suipneumoniae, von virulentem Mycoplasma suipneumoniae und von Krankheitserregern freien Schweinen eine Impfstoffsuspension von in Beispiel 7 erhaltenem ma mycoides var. capri mit 7,0x 10^s lebenden Zellen bzw. 3 Wochen alte, von Krankheitserregern freie Ziegen traten. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4	HiirsstofT	Weg	Tesldosis	Infektionsrate*)
Impfstoff			(Zahl der
			lebenden Zellen)
	-	intramuskulär	7,0 X 10^s	7/10
ImpfstolTsuspension	Zusatzstoff	intramuskulär	7,0 X 10^s	7/10
von abgetötetem	MPMy
Mycoplasma
mycoides
var. capri, das in	Magnetisches Eisenoxid	intramuskulär	7,0 X 10^s	S/10
Beispiel 7 erhalten	Natriurnalginaf¹)	intramuskulär	7,0 X 10^s	S/10
wurde	Calciumchlorid
	Inaktiviertes Ilemophilus	intramuskulär	7,0 X 10^s	7/10
	gallinarum + Aluminium
	hydroxid-Gel

Aluminiumhydroxid-Gel

Kontrollprobe

intramuskulär 7,0 x 10^s S/10

in die Luftröhre 7,0 X 10^s 4/10

7,0 x 10^s 8/10

0/10

*) Der Nenner zeigt die Anzahl der Testziegen, der Zähler die Anzahl der Ziegen mit positivem Lungenbefund.

Um die Vorbeugungswirkung der Impfstoffsuspension von abgetötetem Mycoplasma auf die durch Ansteckung von mit virulentem Mycoplasma infizierten Tieren verursachten Erkrankungen der Atmungsorgane kennenzulernen, wurden die folgenden Versuche (Tests 5 bis 9) durchgeführt.

Versuch 5

10 Tage alte, von Krankheitserregern freie Küken wurden 2 oder 3 Male bei zeitlichen Zwischenräumen von 10 Tagen mit mehr als 0,1 ml Impfstoffsuspension des in Beispiel 1 erhaltenen, abgetöteten Mycoplasma gallisepticum durch Injektion oder Einsprühen in die Luftröhre immunisiert. 10 Tage nach der letzten

Immunisierung wurden insgesamt 40 Kühlen, davon 20 aus der immunisierten Gruppe und 20 aus einer nicht immunisierten Gruppe (Kontrollgruppe) mit 10 Küken zusammengesperrt, die durch Besprühen mit virulentem Mycoplasma gallisepticum mit 2,3 χ 10^s lebenden Zellen infiziert worden waren. Nach 4 Wochen wurde die Vorbeugungswirkung des inaktivierten Impfstoffs auf die Mycoplasma-Krankheiten der Atmungsorgane, die sich von dem genannten Mycoplasma-Stamm ableiten, gemäß dem Ausmaß der Verletzung der Luftsäcke und den Resultaten der Isolierung von Mycoplasma gallisepticum aus den Luftröhren, Lungen und Luftsäkken bewertet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 angegeben.

13

Tabelle 5

Art der Verabfolgung Luftsack der abgetöteten infiziert

ImpfstolTsuspension f⁺ —η

14

Isolation des Mycoplasma galliseplicum (^H -2) Gesamtaus

wertung

Luftröhre Lunge Luftsack ( ⁺ -3)

Infektionsratc

Injektion in die
Luftröhre (intratracheal)

Sprühen

Kontrollprobe

0/20

0/20 5/20

0/20

0/20
7/20

0/20

0/20
5/20

0/20

0/20
5/20

0/20

0/20
7/20

Der Nenner gibt die Zahl der Testküken und der Zähler die Zahl der Küken an, die an einer Luftsack-Krankheit leiden.

■* -2: Der Nenner gibt die Zahl der Testküken und der Zähler die Zahl der Küken an, aus deren Luftröhren, Lungen und Luftsäcken Mycoplasma galliscpticum isoliert worden war.

"" -3: Der Nenner gibt die Zahl der Testküken und der Zähler die Zahl der Küken an, die an Luftsackkrankheit leiden und aus deren Luftröhren, Lungen und Luflsäcken Mycoplasma galliscpticum isoliert worden ist, d.h. die Zahl der infizierten Küken.

Versuch 6-1

Versuch 5 wurde wiederholt, wobei jedoch die Impfstoffsuspension des gelöteten Mycoplasma galli-

Mycoplasma synoviae mit 5,OxIO⁵ lebenden Zellen ersetzt wurden. Die Berührung der immunisierten Gruppe und der nicht immunisierten Gruppe mit der

septicum und das virulente Mycoplasma gallisepticum 25 infizierten Gruppe erfolgte 12 Tage nach der letzten

dii.'ch die Impfstoffsuspension des in Beispiel 4 Immunisierung. Die erhaltenen Resultate sind in der

erhaltenen Mycoplasma synoviae bzw. das virulente Tabelle 6-1 gezeigt.

Tabelle 6-1

Art der Verabfolgung Luftsack der abgetöteten Impf- infiziert Stoffsuspension (⁴-1)

Isolation des Mycoplasma synoviae

Gesamtauswertung

Ansleckungsverhältnis

Luftröhre

Luftsack

Injektion in die

Luftröhre

(intratracheal)

Sprühen
Kontrollprobe

0/20

0/20 3/20

0/20

0/20 5/20

1/20

1/20
8/20

1/20

1/20
8/20

5 40

('-1, ⁴-2, ⁺-3: Siehe die Legende zu Tabelle 5)

Versuch 6-2

Versuch 6-1 wurden wiederholt, wobei jedoch die
immunisierte Gruppe während 7 Tagen nach der letzten
Immunisierung mit dem infektiösen Bronchitis-Virus 50 worden waren. Die erhaltenen Resultate sind in der und dem N'ewcastie-Krankheiisvirus infiziert wurde, die Tabelle 6-2 angegeben.

durch diese Viren enthaltendes Trinkwasser verabreicht wurden. 5 Tage danach wurden die infizierten Gruppen mit 10 Küken zusammengesperrt, die mit dem virulenten Mycoplasma synoviae wie in Test 6-1 infiziert

Tabelle 6-2

Art der Verabfolgung Luftsack der abgetöteten Impf- infiziert Stoffsuspension (⁺-li

Isolation des Mycoplasma svnoviae
(⁺-2)

Luftröhre

Luftsack

Gesamtauswertun?

r-3)

Infektionsrate

Injektion in die

Luftröhre

(intratracheal)

0/20

Sprühen 0/20 0/20

Kontrollprobe 6/20 5/20

(' -1, ⁺-2, ■* -3: Siehe die Legende zu Tabelle 5)

2/20

1/20
9/20

2/20

1/20
9/20

5 45

Versuch 7-1

Versuch 5 wurde wiederholt, wobei jedoch die Itnpfstoffsuspension des abgetöteten Mycoplasma gallisep.'.icum durch eine Mischung aus der Impfstoffsuspension des in Beispiel 1 erhaltenen abgetöteten Mycoplasma gallisepticum und der Impfstoffsuspension des in Beispiel 4 erhaltenen abgetöteten Mycoplasma synoviae

Tabelle 7-1

ersetzt wurde. Die Ansteckung der immunisierten und der nicht immunisierten Gruppe durch die infizierte Gruppe erfolgte 12 Tage nach der letzten Immunisic rung. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 7-1 angegeben.

Art der Verabfolgung Luftsack

der abgetöteten infiziert

Impfstoff-

suspension (⁺-1)

Isolation des Mycoplasma gallisepticum (⁺—2)

Gesamlaus- Infektions

wertung rate

Luftröhre

Lunge Luftsapk

Injektion in die
Luftröhre
(intra tracheal)

0/20

Sprühen 0/20 0/20

Kontrollprobe 4/20 8/20

(⁺-1, ' -2, ' -3: Siehe die Legende zu Tabelle 5)

0/20

0/20 5/20 0/20

0/20
4/20

0/20

0/20
8/20

0 40

Versuch 7-2

Der Versuch 7-1 wurde wiederholt, wobei jedoch das virulente Mycoplasma gallisepticum durch das virulente Mycoplasma synoviae mit 7,0 x 10⁵ lebenden Zellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in derTabelle 7-2 dargestellt.

Tabelle 7-2

Art der Verabfolgung Luflsack
der abgetöteten Impf- in'iziert
stofisuspension (⁺ -1)

Isolation des Mycoplasma synoviae
Luftröhre Luftsack

Gesamtauswertung Infektionsrate

Injektion in die

Luftröhre

(intratracheal)

0/20

Sprühen 0/20 0/20

Kontrollprobe 2/20 4/20

("* -1, ⁺ -2. ⁴ —3: Siehe die Legende zu Tabelle 5)

Versuch 8

Versuch 5 wurde wiederholt, wobei jedoch die von Krankheitserregern freien Küken, die impfstoffsiispcnsion aus abgctötelem Mycoplasma gallisepticum und das virulente Mycoplasma gallisepticum durch drei Wochen alle, von Krankheitserregern freie Schweine, eine Impfstoffsuspcnsion aus nach Beispiel 5 erhaltenem, abgetötetem Mycoplasma suipncumoniae bzw. virulentes Mycoplasma suipncumoniae mit 5,OxI(V' lebenden Zellen ersetzt wurden. Die Immunisicmngsdosis des Impfstoffs war jedesmal 0,5 ml. 6 Wochen nach der Ansteckung wurden die Schweine seziert, um einen pathologischen Befund an den Lungen festzustellen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 8 dargestellt.

1/20

0/20
7/20

Tabelle 8

t,o 1/20

0/20
7/20

0 35

Impfstoff

Art der
Immunisierung

lnfcktionsratc*)

Impfstoffsuspcnsion
des abgetöteten
Mycoplasma
suipncumoniae

Konlrollgruppe

Sprühen

Intralracheale Injektion

2/10

3/10

8/10

*) Her Nenner gibt die Anzahl der Tcslschweine und der Zähler die Anzahl der Schweine mit positivem Lungenbefund an.

030 207/20!

Versuch 9

Versuch 8 wurde wiederholt, wobei jedoch die von Krankheitserregern freien Schweine, die Impfstoffsuspension aus abgetötetem Mycoplasma suipneumoniae und das virulente Mycoplasma suipneumoniae durch 3 Woehen alle, von Krankheitserregern freie Ziegen, eine Impfstoffsuspension von in Beispiel 7 erhaltenem, abgetötetem Mycoplasma mycoides van capri bzw. durch virulentes Mycoplasma mycoides var. capri mit 5,0 χ 10^b lebenden Zellen ersetzt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 9 dargestellt.

Tabelle 9	Art der Immunisierung	Infektions- nlc)*
Impfstoff	Sprühen	3/10
ImpfstoiTsuspension von abgetötetem Mycoplasma mycoides var. capri

Kontrollprobe - 10/10

*) Der Nenner gibt die Anzahl der Testziegen und der Zähler die Anzahl der Ziegen mit positivem Lungenbefund an.

Versuch 10

Um die Wirkung eines Suspensionsstabilisators in einem Impfstoff aus abgetötetem Mycoplasma kennenzulernen, wui den die folgenden Vergleichsversuche durchgeführt. Die in Beispiel 1 erhaltene Suspension aus abgetöteten Zellen von Mycoplasma gallisepticum wurde mit dem Suspensionsstabilisator versetzt und mit der gleichen Suspension, jedoch ohne Zusatz des Suspension^stabilisators verglichen.

Von spezifischen Krankheitserregern freie, 10 Tage alte Küken wurden durch dreimaliges Besprühen in Zeiträumen von 10 Tagen einmal mit der abgetöteten Zellen-Suspension und zum anderen mit dem den Suspensionsstabilisator enthaltenden abgetöteten Impfstoff immunisiert (Immunisicrungsdosis jedesmal: wenigstens 0,1 ml). 10 Tage danach wurden die Küken einem Immunilätslest unterzogen, indem sie mit virulentem Mycoplasma galliscpiicuni mit etwa 7,4 χ 10^J lebenden Zellen besprüht wurden. Zwei Woehen nach diesem Immunilätstcst wurden die Tcstkükcn geprüft, um die Wirkung der Impfstoffe hauptsächlich anhand der Luftsäcke und durch die Ergebnisse der Isolation von Mycoplasma-Sla'mmen aus Luftröhre, Luivgcn und Luftsäckcn zu bewerten. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 10 dargestellt.

Tabelle 10

Impfstoff

Bewertung der Verletzung der Kükenluflsack- krankheit('-l)	Isolierung von Mycoplasma gallisepticum (' -2) Luftröhre Lunge	0/10	Lurts
0,70	2/10	0/10	1/10
0,50	1/10	10/10	0/10
2,10	10/10	8/10

Inaktivierter Impfstoff ohne
Suspensionsstabilisator

Inaktivierter Impfstoff mit
Suspensionsstabilisator

Kontrollprobe

¹ -I: libcnso wie in Tabelle 1.

' -2: Die Anzahl der Küken, aus denen Mycoplasma gallisepticum isoliert wurde. Das heißt, der Nenner ist die Zahl der Teslkükcn, und der Zähler ist die Anzahl der Küken, aus denen Mycoplasma gallisepticum isoliert wurde.

Die Mycoplasmose der Atmiingsorgane bei Tieren, wie die chronische Almungskrankheit bei Geflügel, die endemisch auftretende Lungenentzündung bei Schweinen und die ansteckende Lungen- und Krustseuche bei Ziegen, wird durch Immunisierung wirksam vermieden, wenn man als crfimlungsgcmäßen Impfstoff eine Suspension abgetöteter Mycoplasma-Zellen mit einem Suspcnsionsstabilisator, wie Gelatine, Ticrscrum, Sac-"> (> chariden. Aminosäuren und Polyoxyäihylensoibiianmonooleat, in die Atmungswcge bzw. die Luftröhre der Tiere cinspriihl oder einspritzt.

Claims

Patentansprüche:

1. In die Atmungswege verabreichbarer Impfstoff zur Immunisierung von Tieren gegen Mycoplasmose der Atmungsorgane auf der Basis inaktivierter Mycoplasmen, dadurch gekennzeichnet, daß er die abgetöteten Mycoplasmen in einem wäßrigen Medium miteinem pH-Wert von 6,0 bis 7,8 in einer Konzentration von wenigstens 2,OxIO⁵ abgetöteten Zellen je ml Impfstoff und einen Suspensionsstabilisator enthält.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er als Suspensionsstabilisator Saccharide, Aminosäuren, das Sorbitanmonooleat des Polyoxyäthylenkondensats, Gelatine oder das Dinatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure enthält.

3. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er als Suspensionsstabilisator 0,3—1,0% Glucose, 0,5-1,0% Saccharose, 0,1 —1,0% Laktose oder 0,5—3,0% Dextran enthält.

4. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er bei Mycoplasma gallisepticum oder Mycopiasma synoviae 0,1 — 1,0% Geflügelserum oder 0,1 —0,5% Geflügelserum-Albumin als Suspensionsstabilisator enthält.

5. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er bei Mycoplasma suipneumoniae 0,1 bis 1,0% Schweineserum oder 0,1—0,5% Schweineserum-Albumin als Suspensionsstabilisator enthält.

6. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er bei Mycoplasma mycoides var. capri 0,1 — 1,0% Ziegenserum oder 0,1—0,5% Ziegenserum-Albumin als Suspensionsstabilisator enthält.