DE69734885T2

DE69734885T2 - Klasse e-spannungsabhängiger calciumkanal-antagonist und verfahren

Info

Publication number: DE69734885T2
Application number: DE69734885T
Authority: DE
Inventors: Robert Newcomb; L. Andrew PALMA; G. Balazs SZOKE; Katalin Tarczy-Hornoch; F. William HOPKINS; L. Ruth CONG; P. George MILJANICH; Robin Dean; Laszlo Nadasdi; Laslo Urge; Scott Stephen BOWERSOX
Original assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2017-08-02
Also published as: DE69734885D1; WO1998005780A2; US6653460B1; AU4050397A; JP2001514482A; US6156726A; ATE312913T1; AU734576B2; WO1998005780A3; EP0920504B1; CA2262753A1; EP0920504A2; JP2006051033A; CN1226929A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse von Peptidverbindungen, die Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanäle spezifisch blockieren und Verfahren zur Blockierung solcher Kanäle. Die Erfindung betrifft auch therapeutische Behandlungen, wie zum Beispiel die Behandlung von konvulsivischen Erkrankungen unter Verwendung der Verbindungen.
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Stand der Technik
Spannungsabhängige Calciumkanäle sind in Neuronen und in Herz-, glattem und Skelettmuskeln und anderen reizbaren Zellen vorhanden. Von den Kanälen ist bekannt, dass sie an der Membranreaktion auf Reize, Muskelkontraktion und zellulären Sekretion, wie zum Beispiel der exocytotischen synaptischen Übertragung, beteiligt sind. In neuronalen Zellen sind spannungsabhängige Calciumkanäle nach ihren elektrophysiologischen und nach ihren biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften klassifiziert worden. Vor kurzem ist aufgrund der Molekularbiologie der Kanäle eine weitere Klassifizierung durchgeführt worden.
Calciumkanäle werden im Allgemeinen gemäß ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften als „Niedrigspannungs-aktivierte" (LVA) oder „Hochspannungs-aktivierte" (HVA) Kanäle klassifiziert. Von hochspannungsaktivierten Kanälen ist derzeit bekannt, dass sie mindestens drei Gruppen von Kanälen umfassen, die als L-, N- und P/Q-Typ-Kanäle bekannt sind. Diese Kanäle sind elektrophysiologisch voneinander unterschieden worden, sowie auch biochemisch, auf der Basis ihrer Pharmakologie und Liganden-Bindungseigenschaften. Dihydropyridine, Diphenylalkylamine und Piperidine binden daher an die Alpha₁-Untereinheit des L-Typ-Calciumkanals und blockieren einen Teil der HVA-Calciumströme in neuronalem Gewebe, welche als L-Typ Calciumströme bezeichnet werden. N-Typ Calciumströme sind sensitiv für Omega-Conopeptide, sind aber relativ unempfindlich gegen Dihydropyridin-Verbindungen, wie zum Beispiel Nimodipin und Nifedipin. P/Q-Typ-Kanäle sind andererseits gegen Dihydropyridinen unempfindlich, reagieren aber auf das Gift AgaIIIA der Trichternetzspinne empfindlich.
R-Typ Calciumkanäle, ähnlich wie L-, N-, P- und Q-Typ Kanäle werden durch beträchtliche Membran-Depolarisierungen aktiviert und werden daher als „Hochspannungs-aktivierte" (HVA) Kanäle klassifiziert. R-Typ Kanäle sind gegen Dihydropyridine und Omega-Conopeptide unempfindlich, aber ähnlich wie P/Q-, L- und N-Kanäle reagieren sie empfindlich auf das Gift AgaIVA der Trichternetzspinne. Immuncytochemische Färbestudien weisen darauf hin, dass diese Kanäle überall im Gehirn gefunden werden, besonders in den tiefen Mittellinienstrukturen (Caudate-Putamen, Thalamus, Hypothalamus, Amygdala, Cerebellum) und in den Nuclei des ventralen Mittelhirns und des Gehirnstammes. Von diesem Kanal wird angenommen, dass er hauptsächlich in den neuronalen Zellkörpern und Dendriten vorliegt, wo er zur zellulären elektrischen Aktivität beiträgt. Es deutet jetzt auch vieles darauf hin, dass R-Typ-Kanäle auf den präsynaptischen Nervenenden lokalisiert sein könnten.
Der molekulare Komplex, der neuronale spannungsempfindliche Calciumkanäle umfasst, besteht aus einer zentralen α₁-Untereinheit, einer α₂/δ-Untereinheit, einer β-Untereinheit und einer 95 kD-Untereinheit. Molekulargenetische Studien haben mindesten fünf mRNA-Klassen offenbart, welche die α₁-Untereinheiten, bezeichnet als A, B, C, D, und E, codieren. Wie durch elektrophysiologische Studien bestimmt, entsprechen diese den spannungsabhängigen Kanälen vom P/Q-Typ (α_1A, N-Typ (α_1B), L-Typ (α_1C, α_1D) und R-Typ (α_1B). (Snutch et al. 1990; Soong et al. 1993; Tsien et al. 1991; Biel et al. 1990; Mikami et al. 1989, Perez-Reyes et al. 1989, Tanabe et al., Williams et al., 1992; Fujita et al. 1993; Mori et al. 1991, Sather et al. 1993, Stea et al. 1994, Forti et al. 1994, Randall und Tsien 1994). Die Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanäle umfassen Ströme, die elektophysiologisch als R-Typ- und G2-Ströme charakterisiert werden.
Es gibt keine bekannten spezifischen oder selektiven Liganden für den Klasse E oder R-Typ neuronalen Calciumkanal. Obwohl das Spinnenpeptid Omega-Aga-IIIA diesen Kanal antagonisiert (Palma et al. 1995), blockiert es auch stark N-, P/Q- und L-Typ-Calciumströme (Cohen et al. 1993, Ertel et al. 1994) und es fehlt ihm daher an Spezifität. Der Mangel an spezifischen Liganden für den Kanal hat vordem die Aufklärung seiner Rolle(n) in der neuronalen Funktion verhindert. Tabelle 1 fasst Antagonisten der verschiedenen Subtypen an spannungsabhängigen Calciumkanälen zusammen, die hierin genannt werden.
Tabelle 1
Angesichts der Wichtigkeit von spezifischen Calciumkanälen in neuronalen Funktionen wäre es nützlich, pharmakologische Agenzien zu identifizieren, die Klasse E-Calciumkanäle spezifisch blockieren. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung einer neuen Klasse an Peptiden, die diesen Kanal selektiv blockiert. Diese Verbindungsklasse wird hierin durch die neuen hierin beschriebenen HG-Peptide beispielhaft erläutert, welche von Peptiden abstammen, die ursprünglich aus H.gigas isoliert wurden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse an Peptiden, die Klasse E-Calciumkanäle selektiv blockiert. Genauer gesagt sind solche Peptide, die im Allgemeinen hierin als Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanal-blockierende Peptide bezeichnet werden, in der Lage, Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanäle bei einer Konzentration zu blockieren, die etwa 10–50 und stärker bevorzugt nicht mehr als 10–20mal der Konzentration des HG-1-Peptids (SEQ ID NR: 1) entspricht, welche benötigt wird, um solche Kanäle zu blockieren. Die Peptide können, in einer anderen Ausführungsform ferner dadurch charakterisiert sein, dass ein bestimmtes Peptid L-Typ-, T-Typ-, P/Q-Typ- oder N-Typ-Calciumkanäle, wie sie hierin beschrieben sind, bei einer molaren Konzentration, die etwa 10mal der molaren Konzentration entspricht, die benötigt wird, um einen Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal halbmaximal zu blockieren, nicht zu wenigstens 50% blockieren kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform nimmt das Peptid die Form an: V₁-SEQ ID NR: 19-X₁₂X₁₃X₁₄-SEQ ID NR: 20-X₁₅-LGC-X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉-S-X₂₀-SEQ ID NR: 10-X₂₁X₂₂-T-X₂₃X₂₄X₂₅ wobei V₁ GVDKX₂₆G oder eine Deletion ist, wobei X₂₆ A oder P ist; SEQ ID NR: 19 ist CRYMFGGC; X₁₂ ist S oder E, X₁₃ ist V oder K, X₁₄ ist D oder N, SEQ ID NR: 20 ist DDCCP; X₁₅ ist R oder K, X₁₆ ist H oder K, X₁₇ ist S oder D, X₁₈ ist I oder L, X₁₉ ist F oder L, X₂₀ ist Y oder eine Deletion, SEQ ID NR: 10 ist YCAW, X₂₁ ist D oder E, X₂₂ ist L oder V, X₂₃ ist F oder G, X₂₄ ist S oder E oder eine Deletion, und X₂₅ ist F oder D oder eine Deletion.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das Peptid die Form auf: SEQ ID NR: 16-X₁-FGGC-X₂X₃X₄-SEQ ID NR: 17-X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀-SEQ ID NR: 18-X₁₁-TFSD, wobei X₁ ausgewählt ist aus der Klasse V; X₂ ausgewählt ist aus der Klasse II; X₃ ausgewählt ist aus der Klasse IV oder V; X₄ ausgewählt ist aus der Klasse III; X₅ ausgewählt ist aus der Klasse III oder IV oder eine Deletion ist; X₆ ausgewählt ist aus der Klasse IV oder V; X₇ ausgewählt ist aus der Klasse II oder IV; X₈ ausgewählt ist aus der Klasse II oder V; X₉ ausgewählt ist aus der Klasse VI; X₁₀ ausgewählt ist aus der Klasse II oder III; und X₁₁ ausgewählt ist aus der Klasse II, V oder VI. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform nehmen die variabeln Positionen in den vorstehenden zusammengesetzten Peptiden die folgenden Substituenten an: X₁ = M oder L; X₂ = S oder T; X₃ = V, K oder R; X₄ = N oder D; X₅ = K, Q oder eine Deletion; X₆ = H, R oder L; X₇ = S oder K; X₈ = L oder G; X₉ = F oder Y; X₁₀ = S oder N; X₁₁ = L, F oder G; und SEQ ID NR: 16 ist GVDKACRY; SEQ ID NR: 17 ist DDCCPRLGC und SEQ ID NR: 18 ist YCAWD. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt das Peptid irgendeine von SEQ ID NR: 1 (HG-1), SEQ ID NR: 8 (HG-8), SEQ ID NR: 13 (R9), SEQ ID NR: 14 (R11) und SEQ ID NR: 15 (SNX-629) dar.
In einer anderen Ausführungsform schließt die Erfindung isolierte Polypeptide ein, umfassend eine Sequenz von Nucleotiden, welche ein Peptid codieren, ausgewählt aus den Peptiden, welche die Sequenzen aufweisen wie in SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 6; SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14 und SEQ ID NR: 15 definiert. In einer anderen Ausführungsform wird das Polynucleotid von Nucleotiden ausgewählt, welche Sequenzen aufweisen wie in SEQ ID NR: 23 bis SEQ ID NR: 43 definiert.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das isolierte Polynucleotid eine Sequenz von Nucleotiden, die ein Peptid codiert, das die Sequenz aufweist: V₁-SEQ ID NR: 19-X₁₂X₁₃X₁₄-SEQ ID NR: 20-X₁₅-LGC-X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉-S-X₂₀-SEQ ID NR: 10-X₂₁X₂₂-T-X₂₃X₂₄X₂₅, wobei V₁ GVDKX₂₆G oder eine Deletion ist, wobei X₂₆ A oder P ist; SEQ ID NR: 19 CRYMFGGC ist; X₁₂ S oder E ist, X₁₃ V oder K ist, X₁₄ D oder N ist, SEQ ID NR: 20 DDCCP ist; X₁₅ R oder K ist, X₁₆ H oder K ist, X₁₇ S oder D ist, X₁₈ I oder L ist, X₁₉ F oder L ist, X₂₀ Y oder eine Deletion ist, SEQ ID NR: 10 YCAW ist, X₂₁ D oder E ist, X₂₂ L oder V ist, X₂₃ F oder G ist, X₂₄ S oder E oder eine Deletion ist, und X₂₅ F oder D oder eine Deletion ist.
In einer anderen Ausführungsform codiert das isolierte Polynucleotid ein Peptid, welches die Sequenz aufweist: SEQ ID NR: 16-X₁-FGGC-X₂X₃X₄-SEQ ID NR: 17-X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀-SEQ ID NR: 18-X₁₁-TFSD, wobei X₁ ausgewählt ist aus der Klasse V, X₂ ausgewählt ist aus der Klasse II; X₃ ausgewählt ist aus der Klasse IV oder V; X₄ ausgewählt ist aus der Klasse III; X₅ ausgewählt ist aus der Klasse III oder IV oder eine Deletion ist; X₆ ausgewählt ist aus der Klasse IV oder V; X₇ ausgewählt ist aus der Klasse II oder IV; X₈ ausgewählt ist aus der Klasse II oder V; X₉ ausgewählt ist aus der Klasse VI; X₁₀ ausgewählt ist aus der Klasse II oder III; und X₁₁ ausgewählt ist aus der Klasse II, V oder VI.
In einem ähnlichen Aspekt schließt die Erfindung ein Verfahren zur Unterbindung von Anfällen in einem Patienten. Das Verfahren schließt das Verabreichen einer pharmazeutisch wirkungsvollen Dosis eines HG-Peptids an einen Patienten ein, welches im Stande ist, einen Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal bei einer Konzentration zu blockieren, die höchstens etwa 10–50mal der Konzentration des HG-1-Peptids (SEQ ID NR: 1) entspricht, das benötigt wird um diesen Kanal zu blockieren.
In einer ähnlichen Ausführungsform wird das in dem krampfhemmenden Behandlungsverfahren verwendete Peptid weiterhin dadurch charakterisiert L-Typ-, T-Typ-, Klasse A (P/2-Typ) – oder Klasse B (N-Typ) – Calciumkanäle bei einer Konzentration, die etwa 10mal der Konzentration entspricht, die benötigt wird, um den Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal halbmaximal zu blockieren, nicht zu wenigsten 50% blockieren zu können. Ein für die Verwendung in diesem Verfahren bevorzugtes Peptid hat die Sequenz: V₁-SEQ ID NR: 19-X₁₂X₁₃X₁₄-SEQ ID NR: 20-X₁₅-LGC-X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉-S-X₂₀-SEQ ID NR: 10-X₂₁X₂₂-T-X₂₃X₂₄X₂₅, wobei V₁ GVDKX₂₆G oder eine Deletion ist, wobei X₂₆ A oder P ist; SEQ ID NR: 19 CRYMFGGC ist; X₁₂ S oder E ist, X₁₃ V oder K ist, X₁₄ D oder N ist, SEQ ID NR: 20 DDCCP ist; X₁₅ R oder K ist, X₁₆ H oder K ist, X₁₇ S oder D ist, X₁₈ I oder L ist, X₁₉ F oder L ist, X₂₀ Y oder eine Deletion ist, SEQ ID NR: 10 YCAW ist, X₂₁ D oder E ist, X₂₂ L oder V ist, X₂₃ F oder G ist, X₂₄ S oder E oder eine Deletion ist, und X₂₅ F oder D oder eine Deletion ist.
In einem weiteren verwandten Aspekt schließt die Erfindung Verfahren zur Hemmung der Freisetzung von neurohypophysären Hormonen in den Blutkreislauf ein, wie zum Beispiel Oxytocin. Ein solches Verfahren kann zum Beispiel eingesetzt werden, um frühzeitige Wehen oder den Milchspende-Reflex zu verhindern. Das Verfahren schließt Verabreichung eines Klasse E-Kanalblockierenden HG-Peptids in einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoff ein. Zusätzlich zu den HG-Peptiden, welche wie hierin erörtert Klasse E-Kanäle blockieren, kann dieses Behandlungs-Musterbeispiel das Verabreichen eines L-Typ-Calciumkanalblockers, eines N-Typ-Calciumkanalblockers oder eines P/Q-Typ Calciumkanalblockeragens einschließen. Ein wirkungsvolles therapeutisches Regime ist in diesem Zusammenhang eines, in dem vorzeitige Wehen beendet werden. Ein solches Regime kann auch verwendet werden, um den Milchspende-Reflex in einer stillenden Frau zu verhindern.
Die Erfindung schließt auch Verfahren zur Auswahl von Verbindungen zur Verwendung in den vorhergehenden Behandlungsverfahren (Hemmung der Prolactin-Freisetzung, krampfhemmende Aktivität) ein. Das Verfahren umfasst Untersuchen einer Verbindung auf die Fähigkeit, Klasse E-Calciumkanäle in neuronalem Gewebe selektiv zu blockieren und Auswahl der Verbindung, die Calciumströme durch diese Klasse E-Calciumkanäle bei einer Konzentration blockiert, die nicht mehr als etwa 10–50mal einer Konzentration des HG-1 Peptids entspricht, das diese Ströme wirkungsvoll blockiert.
In einer ähnlichen Ausführungsform schließt die Erfindung ein Verfahren zu Auswahl von Verbindungen zur Verwendung in der Behandlung von Erkrankungen wie zum Beispiel Epilepsie oder Übersekretion von Oxytocin ein, in welchen eine Blockierung der Klasse E-Calciumkanäle angezeigt ist. Das Auswahlverfahren schließt Überprüfen der Verbindung in einem Testsystem ein, das Klasse E-Kanalaktivität misst, sowie Auswahl der Verbindung, wenn sie Calciumströme durch solche Kanäle bei einer Konzentration blockiert, die nicht mehr als etwa 50mal einer Konzentration des HG-1-Petptids entspricht, das in der Blockierung solcher Kanäle wirkungsvoll ist. Ein beispielhafter Durchmusterungstest ist der hierin beschriebene „Whole-cell patch clamp" von neurohypophysären Enden. Das Auswahlverfahren kann außerdem zusätzliche Durchmusterungen verwenden, wie zum Beispiel N-, L-, oder P/Q-Typ-Calciumkanaltests, um sicherzustellen, dass die ausgewählte Verbindung selektiv für Klasse E-Kanäle ist.
In einem anderen Aspekt schließt die Erfindung rekombinante Verfahren zur Produktion von Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal-blockierenden Peptiden ein. Im Besonderen schließt die Erfindung für die Verwendung in einem solchen Verfahren Nucleotidfragmente ein, welche die Sequenzen aufweisen: SEQ ID NRn: 23 bis SEQ ID NR: 43.
Diese und andere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden deutlicher werden, wenn die folgende genaue Beschreibung der Erfindung in Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1(A–C) zeigt ein HPLC-Profil von (A) Elution aus rohem Gift von Hysterocrates gigas, (B) Rechromatographie des Peaks von Feld A, und (C) Rechromatographie des Peaks von Feld B, wobei der Pfeil in jedem Fall den HG-1-Peak kennzeichnet;
2A zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von HG-1 (SEQ ID NR: 1), HG-2 (SEQ ID NR: 2), HG-3 (SEQ ID NR: 3), R1 (SEQ ID NR: 11), R2 (SEQ ID NR: 12), R9 (SEQ ID NR: 13) und R11 (SEQ ID NR: 14) die angeglichen sind, um konservierte Bereiche und Cysteinreste zu zeigen;
2B zeigt HG-1 (SEQ ID NR: 1), HG-2 (SEQ ID NR: 2), HG-6 (SEQ ID NR: 6), HG-7 (SEQ ID NR: 7) und HG-8 (SEQ ID NR: 8) angeglichen, um konservierte Bereiche zu zeigen;
2C zeigt Propeptide von HG-1, HG-2, HG-8 (SEQ ID NR: 21) und HG-4 (SEQ ID NR: 22) angeglichen, um konservierte Bereiche zu zeigen;
2D zeigt HG-1, HG-2, HG-6, HG-7, HG-9 (SEQ ID NR: 9), HG-8 und HG-4 angeglichen, um konservierte Bereiche zu zeigen;
2E zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von HG-1 (SEQ ID NR: 1), HG-2 (SEQ ID NR: 2) und HG-3 (SEQ ID NR: 3) angeglichen, um die konservierten und variablen Bereiche V₁–V₄ (Fettdruck) zu zeigen;
2F zeigt einen Vergleich von HG-1, R9, R11, HG-8 und SNX-629 (HG-1 (7–41); SEQ ID NR: 15);
3 zeigt einen Vergleich der Sequenz von HG-1 mit den Peptiden Grammatoxin S1A (Lampe et al. 1993) und Hanatoxin mit angeglichen in Fettdruck gezeigten Cysteinresten;
4A–4G zeigen codierende Sequenzen für HG-1 (SEQ ID NR: 23 (Leader), SEQ ID NR: 24 (codierend) und SEQ ID NR: 25 (gesamte Sequenz gezeigt)), HG-2 (SEQ ID NR: 26 (Leader), SEQ ID NR: 27 (codierend) und SEQ ID NR: 28 (gesamte Sequenz gezeigt)), HG-3 (SEQ ID NR: 29 (Leader), SEQ ID NR: 30 (codierend) und SEQ ID NR: 31 (gesamte Sequenz gezeigt)), HG-4 (SEQ ID NR: 32 (Leader), SEQ ID NR: 33 (codierend) und SEQ ID NR: 34 (gesamte Sequenz gezeigt)), HG-4' (SEQ ID NR: 35 (Leader), SEQ ID NR: 36 (codierend) und SEQ ID NR: 37 (gesamte Sequenz gezeigt)), HG-6 (SEQ ID NR: 38 (Leader), SEQ ID NR: 39 (codierend) und SEQ ID NR: 40 (gesamte Sequenz gezeigt)), HG-9 (SEQ ID NR: 41 (Leader), SEQ ID NR: 42 (codierend) und SEQ ID NR: 43 (gesamte Sequenz gezeigt)), wobei in jeder Sequenz der Beginn der Leadersequenz durch eine Linie und den Buchstaben „L" gekennzeichnet ist, der Beginn des codierenden Bereiches des reifen Peptids durch eine Linie und einen Pfeil gekennzeichnet ist und das Ende der codierenden Sequenz mit einer dritten Linie gekennzeichnet ist;
5 zeigt, wie gekennzeichnet, die Frequenz eines Calciumstroms im „Whole-cell patch clamp" (192C-Zelle) in der Anwesenheit und Abwesenheit von 33 nM HG-1;
6 zeigt die Effekte von unterschiedlichen Konzentrationen an HG-1 auf den Peak-Calciumeinwärtsstrom in Zellen, welche Klasse E(192C)- und Klasse B(S-3)-Typ-Alpha-1-Untereinheiten stabil exprimieren und die Auswirkungen von AgaIIIA auf 192C-Zellen, welche die Klasse E Alpha-1-Untereinheit exprimieren;
7 zeigt die Auswirkungen von Nicardipin, Omega-Conotoxin MVIIA (SNX-111), Omega-Conotoxin MVIIC (SNX-230) und HG-1 (SNX-482) auf den Calciumstrom (getragen von Barium) in neurohypophysären Enden;
8(A–C) zeigt Konzentrations-Wirkungs-kurven für verschiedene Verbindungen auf die interne Calciumkonzentration im Anschluss an Kalium-Depolarisierung, wie gemessen durch die Fluoreszenzrate der Zellen, die mit der calciumempfindlichen Farbe INDO-1 behandelt wurden: (A) auf 192C-Zellen, die Klasse E-Kanäle exprimieren, die Auswirkungen von HG-1 und Aga-IIIA; (B) auf GH3-Zellen, die sowohl L-Typ- als auch T-Typ- Calciumkanäle aufweisen, die Auswirkungen von HG-1, Aga-IIIA und Nitrendipin, wobei die Einfügung einen typischen Zeitverlauf der INDO-1-Fluoreszenz in Zellen zeigt, die der Kalium-Depolarisierung in der Abwesenheit und Anwesenheit von 5 μM Nitrendipin unterworfen wurden; (C) auf IMR-32-Neuroblastoma-Zellen, die hauptsächlich N-Typ-Calciumkanäle aufweisen, die Auswirkungen von HG-1, Aga-IIIA und SNX-194 (met-12 zu norleu-12-SNX-111);
9A und 9B zeigen die Auswirkungen von unterschiedlichen Dosierungen an SNX-482 (HG-1) auf Krampfverhalten in DBA/2.-Mäusen, die audiogenen Reizen ausgesetzt werden;
10 zeigt kumulative Dosis-Reaktions-Kurven von Krämpfen, die in Antwort auf elektrische Reize in der Abwesenheit und Anwesenheit des HG-1-Peptids SNX-482 erzeugt wurden;
11A und 11B zeigen die Auswirkungen von unterschiedlichen Dosen an SNX-629 auf Krampfverhalten in DBA/2 Mäusen, die audiogenen Reizen ausgesetzt wurden; und
12 zeigt kumulative Dosis-Reaktions-Kurven für 0, 1 oder 5 μg SNX-629 auf elektrisch stimulierte Krämpfe.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Der Begriff „Polynucleotid", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein polymeres Molekül, welches ein Rückgrat aufweist, das Basen trägt, die in der Lage sind, Wasserstoffbrückenbindungen mit typischen Polynucleotide einzugehen, wobei das Polymerrückgrat die Basen in einer Weise präsentiert, um solche Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Polymermolekül und einem typischen Polynucleotid (z.B. einzelsträngiger DNA) in einer sequenzspezifischen Weise zu erlauben. Solche Basen sind typischerweise Inosin, Adenosin, Guanosin, Cytosin, Uracil und Thymidin. Polymere Moleküle schließen doppel- und einzelsträngige RNA und DNA und Rückgratmodifikationen davon ein, zum Beispiel Methylphosphonat-Bindungen.
Der Begriff „Vektor" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die neue Nucleinsäuren in sich aufnehmen kann und diese neuen Sequenzen in einem geeigneten Wirt vermehren kann. Vektoren schließen rekombinante Plasmide und Viren ein, sind aber nicht auf sie beschränkt. Der Vektor (z.B. Plasmid oder rekombinantes Virus), der die Nucleinsäure der Erfindung umfasst, kann in einem Träger vorliegen, zum Beispiel einem Plasmid im Komplex mit Protein, einem Plasmid im Komplex mit auf Lipiden basierenden Nucleinsäure-Transduktionssystemen, oder anderen nicht-viralen Trägersystemen. Der Begriff „Polypeptid", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Verbindung, die aus einer einzelnen Kette an Aminosäureresten verbunden mit Peptidbindungen zusammengesetzt ist. Der Begriff „Protein" kann mit dem Begriff „Polypeptid" synonym sein oder kann sich zusätzlich auf einen Komplex aus zwei oder mehreren Polypeptiden beziehen.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe „beträchtliche Homologie" oder „beträchtliche Identität" sowie Abwandlungen davon auf die Übereinstimmung einer Aminosäuresequenz mit einer anderen Aminosäuresequenz oder einer Polynucleotidsequenz mit einer anderen Polynucleotidsequenz von mindestens 70% und vorzugsweise mindestens etwa 80% oder größer, wenn solche Sequenzen in einer „Best-fit"-Ausrichtung angeordnet sind. In dem Fall von Nucleotidsequenzen implizieren die Begriffe auch, dass die fragliche Nucleotidsequenz in einem Durchmusterungstest durch eine Hybridisierungssonde, abgeleitet von einer festgelegten Polynucleotidsequenz, nachgewiesen werden kann.
I. Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanal-blockierende Peptide
Dieser Abschnitt beschreibt die neue Klasse von Peptiden, die der Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, unter Konzentration auf ihre strukturellen Eigenschaften. Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanal-blockierende Peptide, die hierin abwechselnd als HG-Peptide, oder als HG-1-Derivate oder – auch Analoge bezeichnet werden, werden auf Basis ihrer Strukturen definiert und – auch auf der Basis ihrer Calciumkanal-blockierenden Eigenschaften in vitro, wie nachstehend in Abschnitt II beschrieben.
A. Isolierung von Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal-blockierenden Peptiden
HG-Peptide können gemäß etlichen Verfahren identifiziert und isoliert werden, die Standardtechniken anwenden. Hauptsächlich schließen solche Verfahren biochemische Reinigung von natürlichen Quellen, Isolierung und/oder Identifizierung von Nucleotid-codierenden Sequenzen und synthetische oder rekombinante Erzeugung der charakterisierten Moleküle ein. Während in den nachfolgenden Beispielen die „natürliche Quelle" die Giftdrüse einer besonderen Tarantelart ist, wird klar sein, dass die hierin beschriebenen Isolierungs- und/oder Identifizierungstechniken allgemeiner auf Taranteln sowie auch auf andere Spinnen und Organismen angewandt werden können. Diese Verfahren werden durch das nachstehende Beispiel erläutert.
1. Reinigung von HG-1 vom Hysterocrates gigas-Gift. Es ist die Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass für Klasse E-Calciumkanäle selektive Peptide im Gift der Alte Welt- und Neue Welt-Taranteln wie zum Beispiel H. gigas identifiziert und daraus isoliert werden können. Diese Peptide sind bei neutralem pH-Wert relativ sauer und sind auch relativ hydrophob. Sie werden daher am günstigsten durch Techniken isoliert, welche diese Eigenschaften ausnützen. Diese Techniken werden allgemein von Newcomb, et al. (1989) beschrieben.
Beispiel 1 stellt beispielhafte Verfahren bereit, die verwendet werden können, um HG-1 vom H. gigas-Gift zu reinigen. Kurz gesagt wird das Spinnengift gemäß von Standard-„Melktechniken" geerntet und dann bis zur Verwendung schockgefroren. Die aufgetaute Probe wird dann, wie in Beispiel 1 genau beschrieben, auf eine HPLC-Säule aufgetragen. Die Elution wird durch Absorption bei 220 nm und durch endogene Fluoreszenz gemäß Standardtechniken überwacht. Ein linearer Methanolgradient in 12 mM Natriumphosphat (pH 6,2) von 0–100% über 125 Minuten bei 1 mL/min liefert eine gute Auftrennung der Giftbestandteile.
1A zeigt die Absorptions-(A₂₂₀; obere Spur) und Fluoreszenz (untere Spur)-Muster, erzeugt durch Elution einer HPLC-Säule, auf welche das rohe Gift von H. gigas aufgetragen wurde, wie in Beispiel 1 ausführlich beschrieben. Der Pfeil stellt den Peak der HG-1-Aktivität dar, festgestellt durch an 192C-Zellen (HEK-Zellen, die stabil mit dem Klasse E-Kanal transfiziert sind) durchgeführten elektrophysiologische Messungen, wie in Beispiel 6 beschrieben. 1B zeigt das Elutionsprofil, das erhalten wurde, wenn der Peak von Feld A unter Verwendung eines wässrigen Puffers von 0,1% TFA nochmals chromatographiert wurde, und 1C zeigt die Muster, die nach der Rechromatographie des Peaks von Feld B erhalten wurden, eluiert mit einem wässrigen Puffer von 0,05% HFBA.
Edman-Abbau sowie eine Aminosäureanalyse jener Aminosäuren, die in der aktiven, HG-1-enthaltenden Fraktion (Glu und Ile) nicht enthalten sind, zeigte, dass das TFA-gereinigte Material (aktiver Peak in Feld B) 95–99% rein ist (wobei der früher eluierende Teil des Peaks größere Reinheit aufweist). Das aktive Material von dieser Auftrennung wurde unter Verwendung eines wässrigen Puffers aus 0,05% Heptafluorbuttersäure (HFBA) (0–65% Methanol über 5 Minuten, gefolgt von 65–85% über 50 Minuten; 1C) rechromatographiert. Dieses Material war beim Edman-Abbau und der Aminosäureanalyse von 99%iger oder größerer Reinheit.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren ergab das Gift von H. gigas reproduzierbares Material, das zwischen 70–80% Methanol eluierte und dem Klasse E-Calciumstrom entgegenwirkte. Weitere Reinigung wurde durch Umkehrphasechromatographie bei saurem pH-Wert unter Verwendung wässriger Puffer von 0,1% TFA gefolgt von 0,05% HFBA erhalten. Ein Bioassay von 1 mL-Fraktionen zeigte, dass die Klasse E-Calciumantagonisten bei beiden dieser Lösungsmittelsysteme gemeinsam mit dem Hauptmaterial chromatographierten (Pfeile, 1B und 1C), wie gemessen durch „Whole-cell patch clamp" sowie auch durch Depolarisierung, die durch Veränderungen in internen Calciumkonzentrationen hervorgerufen werden. Das gereinigte natürliche Produkt wurde als HG-1 gekennzeichnet. Der Aminosäurengehalt und die Sequenz dieses Peptids werden im nachstehenden Unterabschnitt 2 erörtert.
2. Bestimmung der Struktur von HG-1. Das gereinigte HG-1-Peptid wurde einer Matrix-unterstützten Laserdesorptions-Massenspektometrie unterzogen. Von diesem Verfahren wurde für HG-1 eine annähernde molekulare Masse von 4500 gemessen, während die Anwesenheit von endogener Fluoreszenz die Anwesenheit von Tryptophan anzeigte. Basierend auf diesen Ergebnissen und den Ergebnissen der Aminosäureanalyse (Beispiel 3), wurde eine wie in Tabelle 2 gezeigte Aminosäurezusammensetzung bestimmt. In der Tabelle werden die Aminosäuren durch gebräuchliche 3-Buchstaben-Identifikatoren gekennzeichnet und sind in Fällen, wo die beiden Enantiomere nicht durch die Analyse getrennt wurden (His), als DL aufgeführt oder sie wurden in der Aminosäureanalyse nicht nachgewiesen (Pro und Cys).
Tabelle 2 Aminosäurezusammensetzung von HG-1
Der Edman-Abbau von 0,5 nMol des alkylierten Volllängen-Peptids stellte eine Sequenzinformation für Position 35 bereit, die auf die Anwesenheit von 6 Cysteinresten und einen einzelnen Prolinrest hindeutete. Trypsin wurde verwendet, um 2 nMol des alkylierten Peptids bei Position 23 zu spalten und die Sequenz des carboxyterminalen Fragments ergab die Sequenz von HG-1 bis Position 39, während niedrige Erträge an Ser und Asp (ungefähr 1 pMol) auf den Positionen 40 und 41 erhalten wurden. Der aminoterminale Teil der Sequenz wurde durch Sequenzierung des Rests der tryptischen Fragmente bestätigt, die keine zusätzliche Sequenz jenseits Aminosäure 41 von HG-1 zeigten. Die carboxyterminale Ser-Arg-Sequenz wurde durch Spaltung mit Carboxypeptidase A bestätigt. Beide Carboxypeptidasen A und Y setzten die freie Carboxylform von Asp frei. Von jenen Aminosäuren, für welche die Chiralität bestimmt wurde (d.h. alle außer Gly, Pro, Cys und His), wurden nur die L-Enatiomere nachgewiesen. Die Sequenz von HG-1 sagt ein Peptid einer molekularen Masse von 4495,10 Daltons voraus. Diese Masse stimmt mit der Masse überein, die unter Verwendung von Elektrospray-Massenspektrometrie bestimmt wurde (4494,86 ± 0,11 Daltons).
Die Aminosäuresequenz von HG-1 wird in 2 gezeigt und wird SEQ ID NR: 1 zugeordnet.
3. Isolierung von Nucleotidsequenzen, die HG-Peptide codieren. Von den in 2 gezeigten HG-Peptidsequenzen können Oligonucleotidprimer entworfen und synthetisiert werden, um codierende Sequenzen für Nucleotide zu isolieren und zu bestimmen, welche die dargestellten HG-Peptide sowie andere HG-Peptide codieren. Ein nützliches Verfahren zur Isolierung solcher Sequenzen ist die rasche PCR- Amplifikation von cDNA-Enden(PCR-RACE)-Reaktion (Frohman et al. 1988, Frohman 1990), die in Beispiel 10 genau beschrieben ist.
Unter Verwendung von HG-1 als ein Beispiel wurden, basierend auf den N-terminalen Sequenzen von HG-1 (z.B. GVDKAGC) und unter Verwendung von Insekten-Codon-Präferenzen zur Verminderung der Degeneration, 3'-Oligonucleotidprimer entworfen und hergestellt. Poly-A-mRNA wurde von den Gift-erzeugenden Zellen von 3–5 Spinnen isoliert und cDNA wurde unter Verwendung der in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren produziert. Die cDNA wurde am Ende mit TdT versehen und unter Verwendung eines 3'-Primers, ein degenerierter Oligonucleotidprimer basierend auf der N-terminalen Sequenz von HG-1, als ein Substrat für PCR verwendet. Die Amplifikationsprodukte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert; basierend auf dieser Analyse wurden 5'-degenerierte Primer erzeugt und verwendet, um nicht-codierende Bereiche am 5'-Ende des codierenden Bereichs zu erhalten (z.B. stromaufwärts vom codierenden Bereich, der für den N-terminalen Teil des Peptids codiert). Dieses Verfahren ist für die Erlangung vollständiger codierender Bereiche von einer kleinen Menge an Ausgangsmaterial vorteilhaft. Sequenzen der isolierten Fragmente wurden gemäß den im Fachgebiet bekannten Standardverfahren bestimmt. Beispielhafte Nucleotidsequenzen werden in den 4A–4G gezeigt. In den Figuren werden, wie gekennzeichnet, Leader-Sequenzen gefolgt von das reife Peptid codierenden Bereichen gezeigt.
Das resultierende codierende DNA-Segment kann gemäß den im Fachgebiet bekannten Verfahren synthetisiert werden, in einen geeigneten Vektor inseriert und verwendet werden, um Peptid-erzeugende Zellen zu konstruieren, einschließlich aber nicht limitiert auf Hefezellen, Insektenzellen, Säugerzellen, Pflanzenzellen oder bakteriellen Zellen.
4. Synthese von Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal-blockierenden Peptiden. HG-Peptide und HG-1-Derivate können durch chemische synthetische Mittel erzeugt werden oder, wie nachstehend beschrieben unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Verfahren rekombinant exprimiert werden.
a. Festphasensynthese. Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, können durch ein Festphasensyntheseverfahren unter Verwendung eines automatisierten Peptidsynthesegeräts, gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren, synthetisiert werden. N-alpha-geschützte (F-moc)-Aminosäure-Anhydride werden in kristallisierter Form erzeugt und unter Nutzung von Schutzgruppen für Seitenketten zur schrittweisen Aminosäureaddition an den N-Terminus verwendet. Das synthetische Verfahren basiert auf gebräuchlichen Verfahren des Fachgebiets und berücksichtigt, dass das HG-1-Peptid säurelabil ist. Das Peptid wird vom Harz abgespalten und wird dann in der Anwesenheit von oxidiertem und reduziertem Glutathion (Verhältnis 1:2) bei pH 9,5 weiter verarbeitet (oxidiert), um die Bildung von Zwischenketten-Disulfidbindungen in der richtigen Konfiguration hervorzurufen. Der Fortschritt des Oxidationsschrittes kann durch analytische HPLC auf einer C18-Säule überwacht werden. Präparative Reinigung des Peptids wird durch Verwendung des präparativen HPLC-Systems (Septech annular expansion column (Septech, Wakefield, RI) erreicht.
Das Peptid kann durch eine anfängliche Auftrennung durch Gelfiltration isoliert werden, um Peptid-Dimere und höhere Polymere zu entfernen und auch, um unerwünschte Salze wie zum Beispiel Guanidinhydrochlorid, das in der Oxidationsreaktion verwendet wird, zu entfernen. Das teilweise gereinigte Peptid wird weiter durch präparative HPLC-Chromatographie gereinigt und die Reinheit der Peptide wird durch die Analyse der Aminosäure-zusammensetzung bestätigt.
Das HG-1 entsprechende synthetische Peptid wird als SNX-482 (SEQ ID NR: 1) bezeichnet. Ein synthetisches Peptid, welches HG-1(7–41) entspricht, wird als SNX-629 (SEQ ID NR: 15) bezeichnet.
b. Rekombinante Expression von Klasse E-sgannunysabhängigen Calciumkanal-blockierenden Peptiden. Peptide können in Bakterien, Hefe oder vorzugsweise Insektenzellen gemäß im Fachgebiet gut bekannten rekombinanten Mitteln erzeugt werden. Gemäß dem allgemeinen Musterbeispiel wird zelluläre DNA von den Gift-erzeugenden Zellen einer ursprünglichen Spinne wie zum Beispiel H. gigas erhalten und der codierende Bereich für HG-1 oder eine HG-1-Analogvariante wird, wie im Unterabschnitt 2 vorstehend beschrieben, isoliert.
Alternativ kann die Aminosäure-Codierungssequenz für HG-1 verwendet werden, um eine entsprechende DNA-Codierungssequenz, mit einer für die Expression in den ausgewählten Zellen optimierten Codonverwendung (z.B. Bakterien-, Säuger-, Hefe- oder Insektenzellen) zu erzeugen. Die DNA-Codierungssequenz wird synthetisch durch sequentielle Addition von Oligonucleotiden, gemäß den im Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert. Clonierte Oligonucleotide werden unter Verwendung der üblichen Restriktionsspaltungen und Ligierungen zu einem einzelnen Polynucleotid vereinigt.
Zur Expression des rekombinanten HG-1 kann diese synthetische Codierungssequenz in jeden von etlichen bakteriellen Expressionsvektoren platziert werden: zum Beispiel Lambda gt11-(Promega, Madison WI); pGEX-(Smith et al., 1985); pGEMEX (Promega); und pBS-(Stratagene, La Jolla CA) Vektoren. Andere bakterielle Expressionsvektoren, die geeignete Promotoren, wie den T7 RNA-Polymerasepromotor oder den tac-Promotor enthalten, können auch verwendet werden. Zur Expression in Insektenzellen (Spodoptera frugiperda) wird die Codierungssequenz in einen geeigneten baculoviralen Vektor inseriert, wie er von Invitrogen (San Diego, CA) erhältlich ist. Andere geeignete Expressionssysteme schließen Säugerzellen (Clontech, Palo Alto, CA; Gibco-BRL, Gaitersburg, MD), und Pflanzenzellen ein, sind aber nicht auf sie begrenzt.
Rekombinante Polypeptide können als Fusionsproteine oder als native Proteine exprimiert werden. Etliche Merkmale können in den Expressionsvektor hinein konstruiert werden, wie zum Beispiel Leadersequenzen, die die Sekretion der exprimierten Sequenzen in das Kulturmedium fördern. Die rekombinant erzeugten Polypeptide werden typischerweise von lysierten Zellen oder von Kulturmedien isoliert. Die Reinigung kann durch im Fachgebiet bekannte Verfahren durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Salzfraktionierung, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitätschromatographie. Immunaffinitätschromatographie kann unter Verwendung von Antikörpern eingesetzt werden, die wie in Abschnitt B nachstehend erörtert, basierend auf dem HG-1-Peptid und besonders auf dem konservierten Bereich des Peptids erzeugt wurden.
B. Strukturelle Merkmale von Klasse E-spannungsabhängiqen Calciumkanal-blockierenden Pegtiden.
Es ist die Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass HG-Peptide ein pharmakologisches Profil gemeinsam haben, welches sie als selektive Antagonisten („Blocker") von Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanälen besonders nützlich macht. Dieser Abschnitt beschreibt was durch die Begriffe „Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanal-blockierende Peptide", „HG-Peptide" und „HG-1-Derivate oder -Analoge" eingeschlossen wird. Der Begriff „selektiver Antagonist", wie er im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird nachstehend in Abschnitt II beschrieben und erläutert.
Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanal-blockierende Peptide werden, wie in 2A gezeigt, durch HG-1 (SEQ ID NR: 1) beispielhaft erläutert. Wie nachstehend erörtert, kann ein zusammengesetztes HG-Peptid durch Vergleich der verschiedenen in den 2A–2F dargestellten Strukturen gebildet werden, die als SEQ ID NR: 1 bis SEQ ID NR: 15 bezeichnet werden, wobei sie im Zusammenhang mit einem Vergleich verwandter Strukturen verwendet werden, die das gewünschte pharmakologische Profil nicht zeigen, bilden sie die Basis für die strukturellen Einschränkungen der HG-Peptide.
3 zeigt einen Vergleich der Sequenz von HG-1 zu der von anderen Calcium- und Kalium-antagonistischen Peptiden aus Spinnen, welche die gleichen oder ähnliche Muster an Cysteinresten (C-C-CC-C-C) aufweisen. Wie gezeigt weist die Primärsequenz von HG-1 manche Homologien zu den Peptiden Grammatoxin S1A (Lampe et al. 1993) und Hanatoxin (Swartz und MacKinnon, 1995) auf, beide werden vom Gift der Tarantel Grammostola spatulata isoliert. Grammatoxin S1A ist ein ziemlich unselektiver Blocker von N- und P-/Q-, aber nicht von L-Calciumkanal-Subtypen (Lampe et al., 1993; Piser et al. 1995). Hanatoxin ist ein Kaliumkanal-Antagonist (Swartz und MacKinnon 1995). Es ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beachtenswert, dass keines dieser Peptide Klasse E-Calciumkanaf-Antagonistenaktivität zeigt.
Vom Vorangegangenen kann abgeleitet werden, dass die Cysteinrest-Muster von HG-1 und verwandten Peptiden notwendig, aber nicht ausreichend sind, um die Selektivität des Klasse E-Calciumkanals bereitzustellen, der das Kennzeichen der HG-Peptide ist. Die Strukturen dieser Peptide stellen daher Peptidsequenzen dar, welche nicht innerhalb die Definition von „HG-Peptiden" wie sie hier definiert sind fallen würden und sie stellen daher eine Anleitung für „negative Selektionen" in des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung bereit.
Als Beispiel zeigt 2E einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von HG-1 (SEQ ID NR: 1) und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von HG-2 (SEQ ID NR: 2) und HG-3 (SEQ ID NR: 3). Durch Angleichung von HG-1 und HG-2, so dass ihre Cysteinreste übereinander gelagert sind, werden die sechs Cysteine auf den Positionen 7, 14, 20, 21, 26 und 34 gefunden. Um diese Angleichung durchzuführen, wurden Zwischenräume auf den in der Figur als Striche gezeigten Positionen eingeführt. In der nachstehenden Analyse behalten diese Zwischenräume die in 2E gezeigte, festgesetzte Nummer bei, auch wenn sie Aminosäuredeletionen in den entsprechenden Gruppen von aktiven HG-1-Peptiden darstellen. Mit „aktiv" ist gemeint, dass die Peptidverbindung höchstens 1,5 log-Einheiten (etwa 30mal) und vorzugsweise höchstens 1 Log-Einheit (10mal) weniger potent in der Blockierung des Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanals ist als HG-1.
Unter Verwendung der angeglichenen Sequenzen als ein Richtwert, können HG-1-Peptidanaloge oder -Derivate unter Verwendung der folgenden Einschränkungen gebildet werden:

1. Das Peptide schließt Cys-Reste ein, entsprechend den Positionen 7, 14, 20, 21, 26 und 34, wie im Bezug auf HG-1, HG-2 und HG-3 in 2E dargestellt ist.
2. Das Peptid ist bei neutralem pH-Wert sauer und ist allgemein von hydrophobem Charakter. Die Einschränkungen 1 und 2 bewahren die grundlegende Konformation der Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal-blockierenden Peptide, die durch die physicochemischen Eigenschaften und die Disulfidbrückenmuster, die für diese Klasse an Verbindungen kennzeichnend sind, auferlegt werden. In Verbindung mit diesen Regeln 1 und 2 werden die in 2A–2D gezeigten konservativen Derivate der beispielhaften Peptide unter Berücksichtigung der nachstehenden Regeln 3 und 4 gebildet und die landläufigeren HG-Peptide werden unter Berücksichtigung der vorstehenden Regeln 1 und 2, in Verbindung mit den nachstehenden Regeln 3 und 5, gebildet.
3. Aminosäurepositionen, welche unter den Peptiden HG-1, HG-2 und HG-3 (2E) identisch sind, oder die unter den Peptiden HG-1, R9, R11, HG-8 und SNX-629 (2F) identisch sind, sind konserviert. So werden zum Beispiel zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Cys-Resten, für das aus HG-1/HG-2/HG-3 zusammengesetzte Peptid, die Aminosäuren, die den Positionen 1–9 entsprechen (SEQ ID NR: 16) konserviert.
4. Ferner wird, im Bezug auf die zusammengesetzten Peptide HG-1/HG-2/HG-3 durch Bildung konservativer HG-1-Peptidderviate den Aminosäurevariationen, die an den elf nicht konservierten Resten (Positionen 10, 15–17, 27–32 und 38) vorkommen, ermöglicht, zwischen den in den Elternpeptiden HG-1, HG-2 und HG-3 vorhandenen Aminosäuresubstitutionen zu variieren. Nämlich, nachdem zu den vorstehend aufgeführten konservierten Positionen die Bezeichnungen X₁–X₁₁ gegeben wurden; schließt diese Gruppe an Verbindungen Peptidstrukturen ein, welche die Form haben: SEQ ID NR: 16-X₁-FGGC-X₂X₃X₄-SEQ ID NR: 17-X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀-SEQ ID NR: 18-X₁₁-TFSD, wobei X₁ = M oder L; X₂ = S oder T; X₃ = V, K oder R; X₄ = N oder D; X₅ = K, Q oder eine Deletion; X₆ = H, R oder L; X₇ = S oder K; X₈ = L oder G; X₉ = F oder Y; X₁₀ = S oder N; X₁₁ = L, F oder G; und SEQ ID NR: 16 GVDKAGCRY ist; SEQ ID NR: 17 DDCCPRLGC ist und SEQ ID NR: 18 YCAWD ist, wie in 2E angezeigt.
5. Weitere Derivate werden unter Berücksichtigung von verfügbaren Substitutionen, basierend auf Standard-Substitutionsklassen (d.h. die sechs Klassen basierend auf gemeinsamen Seitenketten-Eigenschaften und größter Häufigkeit von Substitutionen in homologen Proteinen in der Natur, wie zum Beispiel bestimmt durch eine Standard-Dayhoff-Frequenz-Austauschmatrix (Dayhoff)) gebildet. Diese Klassen sind Klasse 1: Cys; Klasse II: Ser, Thr, Pro, 4Hyp, Ala und Gly, welche kleine aliphatische Seitenketten und OH-Gruppen-Seitenketten darstellen; Klasse III: Asn, Asp, Glu und Gln, welche neutrale und negativ geladene Seitenketten darstellen, die in der Lage sind Wasserstoffbindungen einzugehen; Klasse IV: His, Arg und Lys, die grundlegende polare Seitenketten darstellen; Klasse V: Ile, Val und Leu, die verzweigte aliphatische Seitenketten darstellen und Met; und Klasse VI: Phe, Tyr und Trp, welche aromatische Seitenketten darstellen. Zusätzlich kann jede Gruppe verwandte Aminosäureanaloge einschließen, wie zum Beispiel Ornithin, Homoarginin, N-Methyl-Lysin, Dimethyl-Lysin oder Trimethyl-Lysin in Klasse IV und Cyclohexylalanin oder ein halogeniertes Tyrosin in Gruppe VI. Weiter können die Klassen sowohl L- als auch D-Stereoisomere einschließen, obwohl L-Aminosäuren für Substitutionen bevorzugt werden. Basierend auf den vorstehend gelisteten Klassen können Substitutionen an den variablen Positionen in der vorstehenden Sequenz SEQ ID NR: 16-X₁-FGGC-X₂X₃X₄-SEQ ID NR: 17-X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀-SEQ ID NR: 18-X₁₁-TFSD aus den folgenden Klassen ausgewählt werden: X₁ = Klasse V; X₂ = Klasse II; X₃ = Klasse IV oder V; X₄ = Klasse III; X₅ = Klasse III oder Klasse IV oder eine Deletion; X₆ = Klasse IV oder V; X₇ = Klasse II oder IV; X₈ = Klasse II oder V; X₉ = Klasse VI; X₁₀ = Klasse II oder III; X₁₁ = Klasse II, V oder VI.

Als weiteres Beispiel und auch einen Teil der vorliegenden Erfindung bildend zeigt 2F die Angleichung der ausgewählten Sequenzen HG-1, R9, R11, HG-8, HG-10 und SNX-629. Diese Sequenzen können wie vorstehend erörtert kombiniert werden, um eine zusammengesetzte Sequenz zu bilden, welche die Form aufweist: V₁-SEQ ID NR: 19-X₁₂X₁₃X₁₄-SEQ ID NR: 20-X₁₅-LGC-X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉-S-X₂₀-SEQ ID NR: 10-X₂₁X₂₂-T-X₂₃X₂₄X₂₅, wobei V₁ GVDKX₂₆G oder eine Deletion ist, wobei X₂₆ A oder P ist; SEQ ID NR: 19 CRYMFGGC ist; X₁₂ S oder E ist, X₁₃ V oder K ist, X₁₄ D oder N ist, SEQ ID NR: 20 DDCCP ist; X₁₅ R oder K ist, X₁₆ H oder K ist, X₁₇ S oder D ist, X₁₈ I oder L ist, X₁₉ F oder L ist, X₂₀ Y oder eine Deletion ist, SEQ ID NR: 10 YCAW ist, X₂₁ D oder E ist, X₂₂ L oder V ist, X₂₃ F oder G ist, X₂₄ S oder E oder eine Deletion ist, und X₂₅ F oder D oder eine Deletion ist. Diese Sequenz kann weiter verallgemeinert werden, um auf den Positionen X₁₂–X₂₆ die vorstehend besprochenen Dayhoff-Klasse-Substitutionen einzuschließen.
In einem allgemeineren Sinn wird es ferner anerkannt, dass Klasse E-blockierende Peptide durch die Bildung von Aminosäuresubstitutionen aus den vorstehend bezeichneten, geeigneten Substitutionsklassen gebildet werden können. Darüber hinaus wird es begrüßt, dass C- und/oder N-terminale Verlängerungen der Peptide akzeptabel sind, solange die vorher erwähnte räumliche Beziehung zwischen den Cysteinresten intakt bleibt. Die vorstehenden Aminosäure-Substitutionsregeln sind als eine Anleitung für erlaubte Aminosäuresubstitutionen innerhalb der Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal-blockierenden Peptide beabsichtigt. Sobald eine Aminosäuresubstitution oder Modifikation gemacht wurde, wird das Peptid weiter auf seine Fähigkeit hin durchmustert, Klasse E-Calciumkanäle selektiv zu blockieren, wie es im Abschnitt II hierin beschrieben ist.
Die in Abschnitt II erörterten Verbindungs-Testverfahren können auch gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Calciumkanal-Antagonistenverbindungen zu identifizieren, die Klasse E Blockierungsaktivität aufweisen. In dem Durchmusterungsverfahren wird das Testpeptid auf seine Fähigkeit durchmustert, Klasse E-Calciumkanäle selektiv zu inhibieren. Die Testverbindung wird für die Verwendung in der Blockierung von Klasse E-Kanälen gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählt, wenn die Verbindung: (i) in der Blockierung der Calcium-Leitfähigkeit durch Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanäle bei einer Konzentration wirksam ist, die nicht mehr als etwa 10–50 mal der Konzentration von HG-1 entspricht, die benötigt wird, solche Kanäle zu einem äquivalenten Grad zu blockieren, und (ii) nicht im Stande ist, L-Typ-, T-Typ-, P/Q-Typ- oder N-Typ-Calciumkanäle, bei molaren Konzentrationen, die von etwa 10 mal der molaren Konzentration entsprechen, die benötigt wird Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanäle halbmaximal zu blockieren, um mindestens 50% zu blockieren.
Bevorzugte Durchmusterungsverfahren werden in Abschnitt II nachstehend beschrieben und werden in den Beispielen 5–9 genau ausgeführt.
II. Pharmakologisches Profil von Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanälen
Dieser Abschnitt beschreibt die pharmakologischen Eigenschaften von Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal-blockierenden Peptiden. Dieses pharmakologische Profil stellt einen Leitfaden für die Auswahl der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung bereit und spezifischer für die Auswahl von Peptiden zur Verwendung in der Behandlung der in Abschnitt III nachstehend erörterten Indikationen.
In Abschnitt I sind HG-Peptide und von HG-1 abgeleitete Peptide als übereinstimmend mit bestimmten strukturellen Kriterien definiert worden. Zusätzlich erkennt die vorliegende Erfindung, dass nützliche Peptide in ihrer Fähigkeit Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanäle zu blockieren selektiv sind, wie konstruiert in rekombinanten Zellen oder isoliert von natürlichen Quellen, wie nachstehend erörtert.
A. Blockade von Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanälen
Klasse E-Calciumströme können in irgendeiner von etlichen im Fachgebiet bekannten Arten gemessen werden, um die Calciumbewegung über erregbare Membranen zu bewerten, wie zum Beispiel durch Depolarisierungs-induzierten Calcium-Influx in Zellen festzustellen, oder ganze Zellen oder terminate „Patch clamp" (elektrophysiologische Techniken, siehe Beispiel 6). Im Allgemeinen wirken diese Klasse E-antogonistischen HG-Peptide gegen diese Ströme, vorzugsweise bei einer molaren Konzentration, die höchstens 10–50mal höher ist als die molare Konzentration, bei der HG-1 die Wirkungen auf andere Ströme ausübt.
Um zu bestimmen, ob eine bestimmte Testverbindung selektiv für Klasse-E-Kanäle ist, kann Calciumkanalaktivtät in mehreren Zelltypen gemessen werden, von welchen jeder für seine relative Einförmigkeit an spannungsabhängigen Ionenkanälen ausgewählt wird: die Zelllinie des Hypophysenvorderlappens, GH3, hat sowohl L-Typ- als auch T-Typ-Calciumströme; von der IMR-32 Neuroblastoma-Zelllinie wird berichtet, dass sie einen erheblichen Anteil an N-Typ-Calciumkanälen aufweist (Carbone et al. 1990); die 192C-Zelllinie wurde wie hierin erörtert stabil transformiert, um den Klasse E-Kanal zu exprimieren; ferner exprimiert eine Präparation von neurohypophysären Ende vom Hypophysenhinterlappen einen vorher Arzneistoff-resistenten Calciumstrom, von dem jetzt, in Übereinstimmung mit als Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführten Untersuchungen angenommen wird, dass er ein Klasse E-Kanal ist. Außerdem wurden Natrium- und Kalium-Kanalaktivitäten in IMR-32-Zellen gemessen und ausgewählte Kanäle (Klasse A Calcium- und Kaliumkanäle) wurden für zusätzliche Kanalaktivitätsmessungen, wie nachstehend erörtert, transient in Xenopus-Oocyten exprimiert.
1. Elektrophysiologische Messungen. Calciumkanal-Aktivtät wird herkömmlicher weise unter Verwendung des „Whole-Cell Patch Clamp" gemessen, der Calciumströme aufzeichnet. Ein oder mehrere Präparate, von denen gezeigt wurde, dass sie Klasse E-Kanäle aufweisen, können für diesen Zweck verwendet werden. In einem Präparat, dem Präparat von neurohypophysären Enden, das in Beispiel 6B genau beschrieben und nachstehend erörtert ist, wird ein pharmakologischer Cocktail eingesetzt, um andere Typen von Calciumkanälen (z.B. P/Q-Typ und L-Typ-Kanäle) sowie auch im Präparat anwesende Natriumkanäle zu blockieren. Der verbleibende hochspannungsabhängige Strom ist empfindlich auf HG-1 und wird daher als ein Klasse E-Kanal definiert. Dieses Präparat ist empfänglich für Standard-„patch clamp"-Verfahren, wie beschrieben in Beispiel 6B.
Alternativ können Säugerzellen durch Zugabe der codierenden Sequenzen für verschiedene Untereinheiten dieses Kanals zur Zelle dazu gebracht werden, einen Klasse E-Kanal stabil zu co-exprimieren. Als ein Beispiel können die menschliche Alpha 1E-(WO 95/04144), Ratten-α₂-(U.S. Patent 5.407.820) und β-Calciumkanal-Untereinheiten sich innerhalb eines Klasse E-Kanals bilden, wenn codierende Sequenzen für diese Untereinheiten auch in Zellen co-transfiziert werden. Alternativ kann die menschliche Alpha-1E-Untereinheit mit den α₂- und β-Untereinheiten von anderen Quellen kombiniert werden, um zum Testen gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren einen elektrophysiologisch funktionsfähigen Kanal zu bilden.
a. Gesamtzell-Experimente. 5 zeigt eine Wellenform des Calciumstroms, gemessen in der Anwesenheit und Abwesenheit von 33 nM HG-1 durch „Whole patch-clamp" von 192C-Zellen (HEK-Zelle, die mit der Alpha-1E-Untereinheit stabil transformiert ist (Horne et al. 1995)). Der Strom wurde durch einen Impuls zu 0 mV von einem Ausgangs-Potential von –90 mV gemäß den in Beispiel 6A beschriebenen Verfahren ausgelöst. Die Analyse des Abfalls des Stroms zeigte einen einzelnen exponentiellen Abfall des Calciumstroms hervorgerufen in den 192C-Zellen (Geschwindigkeitskonstante = 12,5 sek-1) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 33 nM HG-1 (kinetische Analyse nach Subtraktion der vermuteten Stromwerte des stabilen Zustands, gemessen bei 400 mSek.).
Um Konzentrationseffekt-Parameter zu bestimmen, wurden Aufzeichnungen bei unterschiedlichen Konzentrationen von HG-1 erhalten, wobei die Peptideffekte, wie vorstehend bestimmt, auf dem Peak des Einwärtsstroms ausgewertet wurden. 6 zeigt die Effekte von verschiedenen Konzentrationen von HG-1 und Aga-IIIA auf den Peak des Einwärts-Calciumstroms in 192C-Zellen. Ebenfalls in 6 gezeigt wird der Effekt von verschiedenen Konzentrationen von HG-1 auf S-3-Zellen, welche die Klasse B-Typ Alpha-1-Untereinheiten (S-3) stabil exprimieren, wobei jeder Datenpunkt die mittlere und Standardabweichung von 3–5 unabhängigen Messungen bei jeder Konzentrationen darstellt, wobei eine Zelle bei 1 oder 2 Konzentrationen verwendet wird.
Wie gezeigt, blockiert HG-1 die in 192C-Zellen exprimierten Klasse E-Ströme mit einem IC₅₀-Wert von 25 nM, während die für die Klasse B-Ströme bei etwa 800 nM bestimmt wird. Diese beiden Werte stimmen gut mit den offensichtlichen IC₅₀ Werten überein, die in den durch Depolarisierung hervorgerufenen Kanalexperimenten unter Verwendung von INDO-1, wie nachstehend erörtert, erhalten wurden. Aga-IIIA blockiert den Klasse E Calciumstrom in den 192C-Zellen mit einem IC₅₀-Wert von 4 nM. Dieser Wert stimmt auch mit den Ergebnissen des nachstehend beschriebenen INDO-1-Experiments überein.
Die Selektivität von HG-1 für Klasse E Ströme wurde ferner in einem Xenopus-Oocyten-System demonstriert, wobei die Oocyten dazu gebracht wurden, Klasse A-Alpha1-Untereinheiten zu exprimieren. Aga-IIIA und Cadmium wurden für den Effekt auf P/Q-Calciumkanäle gemessen. In diesen Experimenten wurden aus technischen Gründen, gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren, Bariumstöme (4 mM Barium, kein hinzugefügtes Calcium, in Medium) durch die Calciumkanäle gemessen. Bei einer Konzentration von bis zu 280 nM hatte HG-1 keinen Effekt auf den Strom. Im Gegensatz dazu wurde dieser Strom durch Aga-IIIA teilweise und durch Cadmium vollständig blockiert.
b. Untersuchungen des Endes des Hypophysenhinterlappens. In zusätzlichen Experimenten, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, ist herausgefunden worden, dass Klasse E-blockierenden HG-Peptide eine Population an in neuroendokrinem Gewebe vorhandenen spannungsabhängigen Calciumkanälen blockieren, von welchen zuvor festgestellt wurde, dass sie gegen Cocktails von anderen bekannten Calciumblockern resistent sind. Beispiel 6B stellt Details der Erzeugung einer elektrophysiologischen Untersuchung von Verbindungen in neurohypophysären Enden bereit. Von diesen Enden wurde vor kurzem gezeigt, dass sie gewisse Peptidhormone (Oxytocin, Vasopressin) in einer Weise freisetzten, die von den verschiedenen in Neuronen (Wang) identifizierten Calciumkanälen unterschiedlich reguliert werden. Studien, die versuchen elektrophysiologische Parameter und Peptidfreisetzung zu korrelieren haben daher gezeigt, dass Vasopressin (AVP)-Freisetzung in einer Weise gehemmt werden kann, die mit der Regulation durch eine Kombination aus L-Typ-, N-Typ- und P/Q-Typ-Calciumkanälen übereinstimmt; im Gegensatz dazu bleibt in der Anwesenheit von pharmakologischen Blockern der vorangehenden Kanaltypen eine restliche stimulierte Oxytocinfreisetzung bestehen (Wang).
In der gleichen Präparation des Endes des Hypophysenhinterlappen wurde, wie in 7 gezeigt, Nicardipin verwendet, um L-Typ-Ströme in Nervenenden bei einer Konzentration von 2,5 μM zu blockieren. Hinzufügen einer Kombination aus hohen Konzentrationen der N- und P/Q-Typ-Blocker SNX-111 (3 μM) und SNX-230 (144 nM) blockierte einen Teil aber nicht den Gesamten verbleibenden Strom. Weiteres Hinzufügen des HG-1 Peptids (SNX-482) bei einer Konzentration von 40 nM resultierte in einer vollständigen Blockade des restlichen Stroms.
Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um die Potenz von zusätzlichen Klasse E-blockierenden Peptidkandidaten gemäß der vorliegenden Erfindung zu untersuchen.
2. Durch Depolarisierung hervorgerufener Calciuminflux. Spannungsempfindliche Kanalaktivität kann auch in erregbaren Zellen durch Messung des Calciuminflux als Antwort auf ein Depolarisierungsereignis, wie zum Beispiel einer elektrischen Stimulierung, einem stimulatorischen Neurotransmitter, oder einer hohen Konzentration an extrazellulärem Kalium, gemessen werden. Die Fähigkeit einer Verbindung den durch Depolarisierung stimulierten Calciuminflux zu blockieren, ist ein Indikator seiner Kanalblockierungsaktivität.
Diese Technik ist besonders für die Bestimmung der Kanalspezifität wirksam, wenn die verwendeten Präparate einen einzelnen Kanaltyp oder überwiegend einen einzelnen Kanaltyp aufweisen. In manchen wie nachstehend erörterten Fällen kann der Ioneninflux durch einen sekundären Kanal mit einem bekannten Antagonisten dieses Kanals blockiert werden, sodass die Messung durch den primären Kanal von Interesse erfolgt.
Um N-Typ-Calciumkanalaktivität in IMR-32-Zellen zu überwachen wurde auch eine sättigende Konzentration von Nitrendipin (einem Dihydropyridin) hinzugefügt, um L-Typ-Calciumkanale in den Zellen zu blockieren. Gleichermaßen wurden GH-3-Zellen einer sättigenden Konzentration von Nitrendipin ausgesetzt, um nur T-Typ-Calciumkanalaktivtät zu messen.
Ausführliche Verfahren zur Messung von Calciumströmen in den drei Zelllinien werden in Beispiel 5 beschrieben. Kurz gesagt wurden Zellen mit der Calcium-Indikatorfarbe INDO-1-Acetoxymethylester (Molecular Probes) gemäß herkömmlichen Verfahren beladen. Die Testverbindungen wurden, wie vorstehend erörtert, in der Anwesenheit von irgendeinem sekundären Kanalblocker zu den Zellen hinzugefügt. Diese Zellen werden dann einer depolarisierenden Konzentration von Kaliumionen ausgesetzt. Der Calciuminflux wird durch die Veränderung der Fluoreszenz der in den Zellen anwesenden INDO-1-Farbe gemessen. Nach Stimulierung mit Kalium erhöht sich das intrazelluläre Calcium in den Zellen typischerweise von einer Basislinie von 100–150 nM auf einen stimulierten Wert von nahezu 1 μM. Konzentrations-Wirkungs-Kurven können von diesen Daten wie in Beispiel 5 beschrieben berechnet werden. Unabhängige Experimente mit Calciumantagonisten, die spezifisch sind für L-Typ-Ströme (Nitrendipin), N-Typ-Ströme (SNX-111 = synthetisches Omega-Conopeptid MVIIA), sowie mit weniger selektiven Calciumantagonisten (SNX-230 = synthetisches Omega-Conopeptid MVIIC und Omega-Aga-IIIA und Felodipin) wurden verwendet, um die pharmakologische Spezifität der unterschiedlichen Testsignale zu bestätigen.
Fluoreszenzstudien wurden auf ganzen Zellen durchgeführt, die gentechnisch verändert sind, um die Calciumkanal-Alpha-1E-Untereinheit zu exprimieren, wie zum Beispiel in den vorstehend beschriebenen 192C-Zellen; alternativ können solche Studien an Präparationen von neurohypophysären Enden gemäß den im Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt werden. Der durch Depolarisierung hervorgerufene Anstieg an internem Calcium in den gentechnisch veränderten Zellen ist gegen die Omega-Conopeptide MVIIC und MVIIA resistent, welche P/Q-Kanäle bzw. N-Typ-Calciumkanäle blockieren und gegen das Dihydropyridin (L-Kanalblocker) Nitrendipin. In solchen Experimenten steht der Zeitverlauf der hervorgerufenen Veränderungen in der Rate der INDO-1-Fluoreszenz bei 400 nm bis zu der bei 490 nm mit der Calciumkonzentration in Zusammenhang, wie beschrieben von Grynkiewicz et al. (1985).
8A zeigt Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Art der vorstehend beschriebnen INDO-Experimente. Die Daten sind als Prozent Fluoreszenzrate ausgedrückt, welche eine Schätzung des in den Zellen vorhandenen Calciums unter Kontrollbedingungen bereitstellt (z.B. Prozent des Calciumgehalts der Zellen, stimuliert durch Kalium in Abwesenheit eines Kanalblockers). Wie gezeigt blockierte HG-1 den durch Kalium stimulierten Calciuminflux in diese Zellen mit einem offensichtlichen IC₅₀-Wert von 15 nM (8A, volle Quadrate).
Auch Aga-IIIA blockiert den durch Depolarisierung hervorgerufenen Calciuminflux in die Zellen (offensichtlicher IC₅₀-Wert 5 nM, 8A, volle Kreise). Diese Ergebnisse stimmen mit der Pharmakologie der Klasse E-Ca⁺⁺-Kanäle (Palma et al. 1994) überein. Im Gegensatz dazu blockierte HG-1, wie nachstehend erörtert, den Calciuminflux in GH-3-Zellen oder IMR-32-Zellen nicht. Von der Zelllinie GH-3 des Hypophysenvorderlappens wird berichtet, dass sie sowohl L-Typ- als auch T-Typ-Calciumströme durch „Whole patch clamp"-Aufzeichnungen von Barium-Strömen (Lievano et al., 1994) zeigte. In Übereinstimmung damit blockierte das Dihydropyridin Nitrendipin nur eine erhaltene Komponente des durch Depolarisierung hervorgerufenen Anstiegs an internem Calcium, welche über 60 Sekunden (offensichtlicher IC₅₀-Wert 400 nM) nicht inaktivierte und sogar bei Konzentrationen über 5 μM den transienten Anstieg an internem Calcium nicht vollständig blockierten (8B und Einfügung). Der verbleibende transiente Anstieg an internem Calcium wurde durch das Dihydropyridin Felodipin (offensichtliche IC₅₀ 60 nM) vollständig blockiert. Dieses Dihydropyridin blockiert den T-Typ-Calciumkanal in Myokardzellen bei Konzentrationen von 4 μM und darunter vollständig (Cohen et al., 1994). HG-1 hatte bei Konzentrationen von 500–600 nM keinen Effekt auf den gesamten internen Calciumanstieg, der 40 Sekunden nach der Depolarisierung ausgewertet wurde und hatte auch auf den Peak an internem Calcium (bei 10 Sekunden nach Depolarisierung) in der Anwesenheit von 5 μM Nitrendipin (8B, Einfügung) keinen Effekt, was darauf hindeutet, dass HG-1 weder L-Typ- noch T-Typ-Ströme inhibiert. Im Gegensatz dazu erzeugt Aga-IIIA eine starke aber teilweise Blockierung des in diesen Zellen durch Depolarisierung hervorgerufenen Signals (8B, offensichtlicher IC₅₀-Wert = 1,5 nM, ausgewertet bei 60 Sekunden nach der Depolarisierung), was mit seiner berichteten Blockierung des L-Typ Stroms in Myocyten übereinstimmt (Cohen et al., 1994).
Wie auch vorstehend erörtert, hat die IMR-32-Neuroblastoma-Zelllinie einen Calcium (Barium)-Strom, der auf das N-Kanal-selektive Omega-Conopeptid GVIA (Carbone et al. 1990) empfindlich reagiert. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung inhibierte SNX (ein N-Kanal-blockierendes Omega-Conopeptid, das das met-12 bis nle-12-Derivat des Omega-Conopeptids MVIIA ist) in einem Präparat dieser Zellen, das Nitrendipin zur Blockierung der L-Kanalaktivität einschloss, den verbleibenden transienten durch Depolarisierung hervorgerufenen Anstieg an internem Calcium fast vollständig, mit einem offensichtlichen IC₅₀-Wert von 0,1 nM (8C). Aga-IIIA hatte einen ähnlichen Effekt auf den hervorgerufenen Effekt an internen Calciumkonzentrationen in IMR-32-Zellen (offensichtlicher IC₅₀-Wert = 0,1 nM). HG-1 hatte einen geringen Effekt auf diesen Strom aber nur bei relativ hohen Konzentrationen (IC₅₀ > 400 nM).
Wenn es bei 140 nM perfundiert wurde, hatte HG-1 in IMR-32-Neuroblastomazellen keinen Effekt auf Natrium- oder Kaliumströme, gemessen gemäß den in Beispiel 7 ausführlich beschriebenen Verfahren. HG-1 hatte auch auf die einzelnen clonierten Kaliumkanäle Kv1.1, Kv1.2 und Kv1.4 im Xenopus-Oocyten-Expressionssytem keinen Effekt, gemessen wie in Beispiel 9 ausführlich beschrieben.
B. Selektivität für Klasse E-Calciumkanäle
Die vorstehend in Teil A besprochenen Studien, weisen auf ein zweites wichtiges Merkmal von HG-Peptiden hin, nämlich ihre Selektivität für die Blockierung von Klasse E-Calciumkanalströmen in Bezug auf andere Typen von Calciumströmen. Zum Beispiel wird das Spinnenpeptid Omega-Aga-IIIA, obwohl es dem Klasse E Calciumkanal entgegenwirkt (Palma et al. 1995) nicht als ein selektiver Ligand betrachtet, da es möglicherweise auch N- und L-Typ Calciumströme blockiert (Cohen et al. 1993, Ertel et al. 1994). Im Gegensatz dazu, wie durch die vorstehend beschriebenen Studien gezeigt, hat das beispielhafte HG-Peptid HG-1 so gut wie keinen Effekt auf N-Typ-, L-Typ-, P/Q-Typ-Calciumströme oder auf Kalium- oder Natriumströme, wenn es an solchen Kanäle bei Konzentrationen untersucht wird, die mindestens 10mal den Konzentrationen entsprechen, bei welchen Klasse E-spannungsabhängige Calciumkanäle halbmaximal inhibiert werden.
C. Selektion von Klasse E-Calciumkanal-Antagonisten
Von den vorhergehenden Experimenten, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, kann man sehen, dass HG-Peptide (z.B. Peptide, welche die in Abschnitt IB beschriebenen, strukturelle Merkmale und die in Abschnitt II erörterten pharmakologischen Merkmale aufweisen) Klasse E-Calciumkanäle spezifisch blockieren, wie durch die relativ niedrigen Konzentrationen, bei welchen die HG-Peptide den Strom durch solche Kanäle blockieren (IC₅₀'s 15–25 nM), verglichen mit den relativ hohen Konzentrationen, bei welchen die Verbindungen den Strom durch andere bekannte Klassen an Calciumkanälen blockieren (z.B. die N-Typ-(IC₅₀ ungefähr 800 nM), P/Q-Typ-, T-Typ- und L-Typ-Calciumkanäle), offensichtlich wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Peptide, die für Calciumkanäle selektiv sind, beiden vorstehend in Abschnitt I besprochenen strukturellen Einschränkungen entsprechen sowie dem vorstehend beschriebenen Aktivitätsprofil. Ein Klasse E-selektives Blockierungspeptid ist daher eines, das den vorstehend in Abschnitt I beschriebenen grundlegenden strukturellen Einschränkungen entspricht: es schließt Cys-Reste auf den in 2E gezeigten Positionen 7, 14, 20, 21, 26 und 34 ein und hat vorzugsweise drei Disulfidbrücken innerhalb der Kette. In einer allgemeinen Ausführungsform wird das HG-Peptid der allgemeinen Form der Zusammensetzung der dargestellten HG-1/HG-2/HG-3- oder der HG-1/HG-8/R9/R11/SNX-629-Peptide entsprechen, kann aber Substitutionen von innerhalb der Dayhoff-Substitutionsgruppen einschließen, die für jede der zusätzlichen Positionen in der Kette beschrieben sind. In einer anderen Ausführungsform werden Klasse E Calciumkanal-blockierende HG-Peptide die konservierten Bereiche beinhalten, die für ein oder mehrere der hierin beschriebenen zusammengesetzten Peptide beschrieben sind und die variablen Bereiche werden Substitutionen von den Klassen einschließen, die durch jede der variablen Positionen definiert sind. Zum Beispiel, im Falle des HG-1/HG-2/HG-3-Peptids wird das Peptid die Form annehmen: SEQ ID NR: 16-X₁-FGGC-X₂X₃X₄-SEQ ID NR: 17-X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀-SEQ ID NR: 18-X₁₁-TFSD, wobei die variablen Positionen X₁-X₁₁ X_1-X11 von den Dayhoff-Substitutionsklassen wie folgt ausgewählt werden: X₁ = Klasse V; X₂ = Klasse II; X₃ = Klasse IV oder V; X₄ = Klasse III; X₅ = Klasse III oder Klasse IV oder eine Deletion; X₆ = Klasse IV oder V; X₇ = Klasse II oder IV; X₈ = Klasse II oder V; X₉ = Klasse VI; X₁₀ = Klasse II oder III; X₁₁ = Klasse II, V oder VI;
In noch einer anderen Ausführungsform wird Aminosäurevariationen, die an den elf nicht konservierten Resten (Positionen 10, 15–17, 27–32 und 38) vorkommen ermöglicht, zwischen den in den Elternpeptiden vorhandenen Aminosäuresubstitutionen zu variieren. In diesem letzteren, mehr eingeschränktem Sinn, unter Verwendung des HG-1/HG-2/HG-3-Peptids als einem Beispiel, werden die Peptide die Form annehmen: SEQ ID NR: 16-X₁-FGGC-X₂X₃X₄-SEQ ID NR: 17- X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀-SEQ ID NR: 18-X₁₁-TFSD, wobei X₁ = M oder L; X₂ = S oder T; X₃ = V, K oder R; X₄ = N oder D; X₅ = K, Q oder eine Deletion; X₆ = H, R oder L; X₇ = S oder K; X₈ = L oder G; X₉ = F oder Y; X₁₀ = S oder N; X₁₁ = L, F oder G; und SEQ ID NR: 16 GVDKAGCRY ist; SEQ ID NR: 17 DDCCPRLGC ist und SEQ ID NR: 18 YCAWD ist, wie in 2E angezeigt. Die vorangehenden substituierten Peptide werden hierin als „HG-1/HG-2/HG-3-zusammengesetzte Peptide" bezeichnet.
Ein gemäß den vorstehenden Kriterien ausgewähltes Peptid ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich, wenn sie für Klasse E-Calciumkanäle selektiv ist. Teil B von diesem Abschnitt beschreibt eine Reihe an Tests, die verwendet werden können, um eine solche Selektivität zu messen. Im Besonderen wird eine Verbindung als selektiv für Klasse E-Kanäle erachtet, wenn sie die Fähigkeit aufweist, Klasse E-Kanäle bei viel niedrigeren Konzentrationen zu blockieren, als es andere bekannte Calciumkanäle blockiert (z.B., N-Typ-, L-Typ-, T-Typ- und P/Q-Typ-Kanäle) oder andere Ionenkanäle, die in elektrisch erregbaren Zellen (z.B. Natrium- oder Kalium-Kanälen) wichtig sind. Mit „viel niedrigeren Konzentrationen" ist gemeint, dass es einen mindestens 10–50-fachen Unterschied in der effektiven molaren Konzentration (gemessen als IC₅₀, oder stärker bevorzugt K_i) für die Hemmung des Klasse E-Typ-Calciumkanals, im Gegensatz zu anderen Ionenkanälen, besonders L-Typ-, N-Typ- und T-Typ-spannungsabhängigen Calciumkanälen gibt.
Unter Verwendung des Peptids HG-1 (SEQ ID NR: 1) als ein Beispiel: stimmt HG-1 daher mit den konservativsten der strukturellen Einschränkungen überein, die vorstehend in Abschnitt 1 definiert sind (z.B. Regeln 1–4). Wenn auf Klasse E Calciumkanal-Selektivität hin untersucht, zeigt das Peptid IC₅₀-Werte im Bereich von 15–25 nM in der Blockierung der Klasse E-Kanäle, durch zwei getrennte Messungen der Kanalblockierungsaktivtät. HG-1 zeigte keine Evidenz der Blockierung von L-Typ-, T-Typ- oder P/O-Typ-Kanälen und blockierte N-Typ Kanäle mit einer IC₅₀ im Bereich von > 400–800 nM. Die Verbindung zeigte bei relativ hohen Konzentrationen keinen Hinweis auf Blockierung von Kalium- oder Natriumkanälen. HG-1 zeigte daher Selektivität für die Blockade von Klasse E-Calciumkanälen.
Gleichermaßen wurde in Experimenten, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, gezeigt, dass das verkürzte HG-1-Peptid SNX-629 (SEQ ID NR: 15) die Inhibierung der Klasse E-Calciumkanäle bei einer Konzentration durchführte, die weniger als 20mal der im gleichen Test von HG-1 gezeigten Konzentration entspricht (Hemmung der Calciumaufnahme); demgemäß ist SNX-629 ein Kandidat für ein HG-1-Derivatpeptid, das gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Blockierung von Klasse E-Kanälen wirksam ist.
Als ein Gegenbeispiel zeigt das Peptid Aga-IIIA Aktivität als ein Klasse E Kanalblocker, wie bewiesen durch einen IC₅₀-Wert von 0,1 nM (elektrophysiologische Messung) bis 15 nM (Calciuminflux) in der Blockierung der Kanäle. Aga-IIIA würde jedoch nicht, wie vorstehend in den 5 und 6 erörtert und besprochen, innerhalb die für Klasse E Calciumkanal-blockierende Peptide definierte Struktur fallen. Darüber hinaus ist das Peptid nicht R-Kanal-selektiv, da es auch N-Typ-Calciumkanäle mit einen IC₅₀-Wert von etwa 0,1 nM blockiert.
III. Nützlichkeit
HG-Peptide und HG-Peptidderivate, die selektive Antagonisten von Klasse E-Calciumkanälen sind, können in der Behandlung etlicher Erkrankungen des Nervensystems nützlich sein, im Besonderen von jenen, die, wie nachstehend dargestellt, die abnormale Übertragung von Signalen über die Medianbereiche des Gehirns (Caudate-Putamen, Thalamus, Hypothalamus, Amygdala, Cerebellum) und in den Nuclei des ventralen Mittelhirns und Hirnstamms, einschließlich Projektionen in die Hypophyse, besonders vom Hypothalamus, wie nachstehend beschrieben, einschließen. Der Eintritt von Calcium durch den Klasse E Calciumkanal kann auch als ein intrazellulärer Bote agieren, der an der Modulation von anderen Ionenkanälen und zellulären Proteinen beteiligt ist. Peptide können daher die Signalwirkung sowohl auf dem zellulären als auch dem Netzwerkniveau beeinflussen. Nervenerkrankungen, die von einer Blockade der Klasse E Kanäle profitieren könnten, können ischemische und traumatische Gehirnverletzungen, Epilepsie, akute oder chronische Schmerzen sowie psychische Erkrankungen einschließen, sind aber nicht auf sie beschränkt. Zwei beispielhafte Anwendungen der Beobachtungen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend erörtert.
A. Krampfhemmende Aktivität
In Experimenten, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, werden HG-Peptide in einem Standard-experimentellen Tier- Anfallmodell (Krampfanfall) getestet, und zwar dem DBA/2 audiogenen Anfallmodell, das verwendet wird, um Verbindungen auf krampfhemmende Aktivität für die mögliche Verwendung in Epilepsie und anderen Gehirnkrampfmodellen zu bewerten. Die Testverfahren in diesem Modell werden in Beispiel 11 genau beschrieben. Kurz gesagt weist ein genetisch zu Anfällen neigender Mausstamm, DBA/2-Mäuse (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine), ein wiederholbares Muster von Anfallverhalten auf, wenn er einer bestimmten Frequenz und Intensität von Geräusch ausgesetzt wird. Verbindungen mit einer umfangreichen Auswahl an Strukturen, sind in diesem Modell, das auch unabhängig von der Temperatur ist, als aktiv erachtet worden. Dieser letztere Punkt ist im Zusammenhang von Calciumkanalblockern, die Hypothermie induzieren, die in vielen Tieren auch krampflösend ist, besonders wichtig.
Die 9A und 9B zeigen die Ergebnisse von Untersuchungen, in welchen Mäusen (18–21 Tage, ungefähr 7–10 g), über einen intracerebroventricularen (i.c.v) Weg 30 Minuten vor dem Geräuschreiz Dosen verabreicht wurden, die sich von 0,5 bis 5 μg HG-1 (SNX-482) erstreckten. In 9A wird der Prozentsatz der getesteten Mäuse (N = 10/Dosis) gezeigt, die jedes der vier während einem Geräuschreiz gezeigten vorherrschenden Verhalten aufwiesen: wildes Laufen, klonische Anfälle, tonische Anfälle und Atemstillstand. 9B zeigt die gesamte Anfallauswertung der verschiedenen Tiere, wobei Anfälle in ihrer Intensität in einer Skala von 0–4 eingereiht wurden, 0 = keine Anfallsaktivität; 1 = nur wildes Laufen; 2 = wildes Laufen + klonische Anfälle; 3 = wildes Laufen, klonische Anfälle und tonische Anfälle; 4 = wilde Laufen, klonische Anfälle, tonische Anfälle und Atemstillstand. Der ED₅₀-Wert für den krampfhemmenden Effekt im DBA/2-Modell ist ungefähr 0,8 μg/Maus i.c.v. 10 zeigt kumulative dosis-abhängige Kurven für Krämpfe, die in Mäusen als Reaktion auf zunehmende elektrische Reize, in der Anwesenheit oder Abwesenheit von SNX-482, erzeugt wurden.
Gleichermaßen zeigen die 11A und 11B die Ergebnisse von Studien, in welchen DBA/2-Mäusen, bevor sie den Geräuschreizen ausgesetzt wurden, SNX-629 i.c.v. verabreicht wurde. Hier wurde ein ungefährer ED₅₀-Wert von etwa 5 μg/Maus festgestellt. In den vorangegangenen Studien werden die Werte im Allgemeinen von den hierin gezeigten graphischen Darstellungen und basierend auf 2–3 Durchgängen von jeweils 10 Mäusen abgeleitet. 12 zeigt den Effekt der Behandlung der Mäuse mit SNX-629 (1 oder 5 μg) auf elektrisch stimulierte Krämpfe.
B. Neuroendokrin-Therapie
In Experimenten, die wie vorstehend erörtert zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, ist gezeigt worden, dass R-Typ-Calciumkanäle an der Ausscheidung von Oxytocin beteiligt sind. Oxytocin ist an der Induzierung von Wehen in schwangeren Frauen und am Milchspende-Reflex in stillenden Müttern beteiligt. HG-Peptide können verwendet werden, um die Oxytocin-Freisetzung von der Hypophyse zu verhindern, zur: (i) Verhinderung von frühzeitigen Wehen, und/oder (ii) Hemmung des Milchspende-Reflexes in Fällen, wo stillende Frauen entweder nicht zu stillen wünschen oder das Stillen beenden möchten.
Für beide der vorangegangenen Verfahren kann das Peptid durch irgendeinen Weg verabreicht werden, der eine ausreichende Blutkonzentration bewirkt, um die Calciumkanäle an der Stelle von Interesse zu blockieren. Zum Beispiel sind, da die hintere Hypophyse neben einem reichhaltigen Kapillarbett liegt (dem portalen kapillaren Nervengeflecht), in welches es Hormone freisetzt, Verabreichungsverfahren die den Arzneistoff auf dieses Kapillarbett abzielen, besonders vorteilhaft zur Hemmung der Oxytocinfreisetzung vom Hypophysenhinterlappen. In ähnlicher Weise sind Verabreichungsmethoden, welche die Peptide ins Gehirn liefern, für die Bereitstellung von krampfhemmender Aktivität vorteilhaft. Angemessene Dosierungen können von den geeigneten Tiermodellen, wie jenen, die hierin beschrieben sind, extrapoliert werden.
Beispielhafte Verabreichungsmethoden schließen intravenöse Verabreichung, Verabreichung in die Lunge (Insufflation der Nase), Verwendung eines transdermalen Pflasters und ähnliches ein. Annehmbare Arzneistoffträger, die für die Peptidverabreichung durch diese Verfahren geeignet sind, sind im Fachgebiet bekannt (Banga). Oral (Magen oder vorzugsweise Wange) sowie rektale Verabreichungsverfahren sind für Peptide (Banga) auch annehmbar und können im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Nasale Verabreichung von Peptiden hat den Vorteil, dass es den Leberkreislauf in ihrem ersten Durchlauf vermeidet und daher einen relativ schnellen Beginn einer minimal verminderten Konzentration des Peptids bereitstellt. Das Peptid kann als Spray formuliert werden. in der Anwesenheit eines geeigneten Salzes oder Puffers, um Isotonie und einen stabilen pH-Wert bereitzustellen. Während dieses Verfahren im Allgemeinen am besten für kleinere Peptide geeignet ist, kann die Verwendung von bestimmten Penetrationsverstärkern, wie zum Beispiel Lysophophatidylchlorin oder nicht-ionische Detergentien, den Transport eines HG-Peptids über die Nasenschleimhaut erleichtern helfen.
Die Verabreichung über die Lunge vermeidet den hepatischen Erstdurchlauf-Effekt ebenso. Diese Art der Verabreichung, sowie die Vorsichtsmaßnahmen, an welchen bei der Benutzung festgehalten werden sollte, sind im Fachgebiet gut bekannt. Im Allgemeinen werden die Peptide in einem Aerosol-Präparat formuliert, das durch ein Gerät, wie zum Beispiel ein Dosieraerosol, einen Zerstäuber oder ein Trockenpulver-Inhalator, erzeugt wird. Das Aerosol wird erzeugt, um einen ausgewählten Massenmeridian-aerodynamischen Durchmesser (MMAD) aufzuweisen, der eine Funktion der Partikelgröße, Form und Dichte zur Ablagerung im Lungentrakt ist. Im Allgemeinen sind Partikel zur Verabreichung in die Lungen optimal, die einen MMAD-Wert von zwischen 1 und 6 μm aufweisen. Hinzufügen von Permeationsverstärkern und/oder Protease-Inhibitoren zur Rezeptur können auch wünschenswert sein.
Während orale Verabreichung von Peptiden auf enteralen (Magen) Standardwegen möglich ist, mag besonders im Fall, wo die vermutete Wirkungsstelle der Peptide die Hypophyse ist, eine Verabreichung des Arzneistoffs über die Wange oder unter die Zunge wünschenswert sein. Die Wangenschleimhaut ist jener Teil der Mundschleimhaut, die das Innere der Wange auskleidet. Für Peptide kann die Verwendung einer oralen, an der Schleimhaut haftenden Dosierungsform, wie zum Beispiel einer Tablette mit einer klebrigen Oberfläche (Hydroxypropylcellulose, Carbopol), die Absorption des Arzneistoffs über verlängerten Kontakt erleichtern. Penetrationsverstärker, wie zum Beispiel nicht-ionische und ionische Tenside, können, zusätzlich zu Peptidaseinhibitoren, die Absorption von Peptiden über diesen Weg auch erleichtern. (Banga)
Durch Auswahl eines Verabreichungsverfahrens wird der Arzt in der Lage sein die Menge an benötigtem Hemmstoff durch die Reaktion des Patienten zu titrieren; zum Beispiel kann der Arzt bei der Behandlung von frühzeitigen Wehen die Kontraktionen überwachen und die Menge des Arzneistoffs entsprechend verändern. Für diese Verwendung wird eine intravenöse Verabreichung willkommen sein; jedes der vorstehend erörterten Verfahren ist jedoch auch verwendbar. Vorzugsweise wird die verabreichte Menge des HG-Peptids effektiv sein, um eine Konzentration von etwa 1–200 nM des HG-1-Peptids (oder eine biologisch äquivalente Menge an verwandten HG-Peptiden) zu erzeugen; wie jedoch vorstehend erwähnt, wird die eigentlich verabreichte Menge von der Beurteilung des Arztes und der Reaktion des Patienten abhängen, in Zusammenhang mit anderen Standard-Erwägungen bezüglich des Gewichts des Patienten, Kreislaufstatus und ähnlichem. Solche Bestimmungen liegen innerhalb des Wissens des Fachmannes.
Im Allgemeinen wird die Verbindung in der Behandlung solcher Nervenerkrankungen effektiv sein, wenn sie in einer Dosis verabreicht wird, die eine Konzentration von etwa 10–100 nM oder mehr an der Wirkungsstelle erzeugt. Dosierungen der Verabreichungswege, die benötigt werden, um eine solche Konzentration zu erreichen, werden durch Fachleute routinemäßig, basierend auf Erwägungen wie der Größe der zu behandelnden Testperson, der Wirkungsstelle und der Pharmakokinetik der Verbindung, bestimmt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen, die vorliegende Erfindung sollten sie aber in keiner Weise einschränken.
Material und Methoden
A. Hysterocrates gigas-Gift
Das Gift von männlichen Exemplaren wurde durch Stimulation mit elektrischem Feld geerntet und wurde Schock-gefroren (Invertebrate Biologics, Los Gatos, CA).
B. Agelenopsis aperta-Gift
Lyophilisiertes Gift wurde von Spider Pharm (Feasterville, PA) erhalten. Das lyophilisierte Gift (äquivalent zu 0,5 ml des ursprünglichen Giftvolumens) wurde nach Suspendieren in 0,5 ml 0,1 N HCl direkt auf eine Sephadex G-50-Säule(Pharmacia, Piscataway, NJ)-Größenausschlußsäule aufgetragen.
C. Zelllinien
Die menschliche Neuroblastoma-Zelllinie IMR-32, die Ratten-Hypophysenlinie GH-3 und die menschliche embryonische Nierenzelllinie 293 (HEK) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC-Zugangsnummer CRL1573; Rockville, MD) erhalten und wurden in einem RPMI 1640-Medium (Gibco-BRL), ergänzt mit 2 mM Glutamin und 10% fötalem Rinderserum, erhalten. S3- und 192C-Zellen sind HEK-Zellen, welche, wie nachstehend beschrieben, die Klasse B- bzw. Klasse E-Calciumkanäle stabil exprimieren.
D. Transfektion von HEK 293-Zellen
Ein Vektor, der einen codierenden Bereich für die Untereinheit des menschliche alpha-1E (hα-1E)-Calciumkanals trägt, wurde in pcDNAIII konstruiert wie in der PCT-Veröffentlichung WO 95/04144 beschrieben, beide sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. HEK-Zellen wurde durch im Fachgebiet bekannte Standardverfahren (Calciumphosphat- oder Lipofektamin-vermittelte Transfektion) transfiziert, um 192C-Zellen zu bilden, die den Klasse E-spannungsempfindlichen Calciumkanal exprimierten.
Auf ähnliche Weise wurden, wie beschrieben von Ellinor et al. (1994), S3-Zellen durch Transfektion von HEK-Zellen mit der menschlichen Alpha-1B-Caliumkanal-Untereinheit gebildet.
E. Zellkulturverfahren
S3- und 192C-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 0,4 mg/ml Hygromycin B und 0,6 mg/ml Geneticin G418 (beide von Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), erhalten und 2 Tage nach dem Ausplattieren auf Glas-Deckgläser verwendet.
Für elektrophysiologische Studien wurden IMR-32-Zellen in Dulbecco's minimalem essentiellem Medium (DMEM, Gibco-BRL) gezüchtet, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, und wurden ohne Differenzierung verwendet. Für den Test der internen Calciumkonzentrationen wurden die Zellen in Eagle's minimalem essentiellem Medium mit Earle-Salzen gezüchtet, das mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin und einem Antibiotikum/Antimykotikum-Gemisch (Gibco-BRL) ergänzt war. Diese Zellen wurden durch die Zugabe von 1 mM Dibutyryl-cAMP und 2,5 μM Bromdesoxyuridin (beide von Sigma, St. Louis, MO) differenziert und wurden 7–15 Tage nach der Differenzierung verwendet.
GH-3-Zellen wurden in Ham-F-10-Medium mit 15% Pferdeserum, 2,5% fötalem Rinderserum und einem Antibiotikum/Antimykontikum-Gemisch gezüchtet.
Beispiel 1
Reinigung von HG-1
Die Isolierung von HG-1 aus Hysterocrates gigas wurde auf einer Gilson-HPLC unter Verwendung von allgemeinen in Newcomb et al. (1989) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das Gift (20 bis 150 μl) wurde aufgetaut und sofort danach auf eine 4,5 × 250 mm „weite Poren" Octadecyl-Kieselgel-Säule (Vydac), bepackt mit 5 μm Teilchen, aufgetragen. Die Elution wurde durch Absorption bei 220 nm mit einem Gilson-Holochromdetektor überwacht, sowie durch endogene Fluoreszenz mit einem Hewlett-Packard Fluoreszenzdetektor Modell 1046A (Erregung 260 nm, Emission 340 nm, 280 nm Emissions-Cutoff-Filter). Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten aus Methanol in 12 nM Natriumphosphat (ph 6,2) von 0–100% über 125 Minuten bei 1 ml/Min durchgeführt. (Vor der Wiederverwendung wurde die Säule mit einem Gradienten aus 0,1% TFA zu Methanol gewaschen, um die Komponenten zu entfernen, die nicht mit dem pH 6,2-Puffer eluierten).
Die Komponenten, die dem Klasse E-Calciumkanal entgegenwirkten, wurden in den 1 ml-Fraktionen durch das in Beispiel 8 nachstehend beschriebene „patch clamp"-elektrophysiologische Verfahren lokalisiert und Methanol wurde von der aktiven Fraktion (die HG-1 enthält) in einer Vakuumzentrifuge entfernt. Die weitere Fraktionierung verwendete einen linearen Gradienten von 0–25% Methanol in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) über 5 Minuten, gefolgt von einem Gradienten von 25–80% Methanol über 50 Minuten.
Der Edman-Abbau sowie die Aminosäureanalyse jener Aminosäuren, die nicht in HG-1 vorhanden sind (Glu und Ile), zeigte, dass das TFA-gereinigte Material 95–99% rein war (wobei der früher eluierende Teil des Peaks größere Reinheit besaß). Zur Bestätigung der Aktivität von HG-1 wurde das aktive Material dieser Trennung unter Verwendung eines wässrigen Puffer aus 0,05% Heptafluorbuttersäure (0–65% Methanol über 5 Minuten, gefolgt von 65–85% über 50 Minuten) rechromatographiert. Dieses Material war, wie durch den Edman-Abbau und die Aminosäure-Analyse festgestellt, von 99% oder größerer Reinheit.
Beispiel 2
Reinigung von Omega-Aga-IIIA
Omega-Aga-IIIA (Venema et al. 1992) wurde durch Größenausschluß-Chromatographie vom A. aperta-Gift auf Sephadex G-50 isoliert, gefolgt von zwei Schritten an Phasenumkehrchromatographie (mit der gleichen Vydac-Säule wie in Beispiel 1 beschrieben); der Erste verwendete einen Gradienten bestehend aus 20 mM Kaliumphosphat pH 2,8 zu Acetonitril und der Zweite verwendete einen Gradienten bestehend aus 0,1% TFA zu Acetonitril (beide Gradienten bei 0,75% Acetonitril pro Minute). Charakterisiertes Omega-Aga-IIIA wurde freundlicherweise von Dr. Mike Adams (University of California, Riverside) bereitgestellt und wurde als ein Standard verwendet, um die Elutionsposition der Peptide zu überwachen. Der Edman-Abbau des nativen Peptids durch 20–30 Zyklen wurde verwendet, um zu bestätigen, dass die Fraktionen hauptsächlich die Aga-IIIA-Sequenz (typischerweise > 95%) enthielten, und eine Massenspektrumanalyse mit dem Elektrospray-Verfahren wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Proben aus Aga-IIIA (im Gegensatz zu den von Ertel et al. 1993 beschriebenen Varianten) bestanden. Wenn das nicht der Fall war, wurde Aga-IIIA weiter unter Verwendung eines Gradienten aus von 0,05% Hepatofluorbuttersäure zu Methanol (1,675% Methanol pro Minute) gereinigt, resultierend in einer Peptidpräparation von 99% oder größerer Reinheit.
Beispiel 3
Struktur und Sequenzbestimmungen
A. Aminosäureanalyse
Gereinigte Peptidproben wurden vor der Aminosäureanalyse einer Säurehydrolyse oder einem enzymatischen Abbau unterzogen. Säurehydrolyse wurde an Proben (50–70 pmol an gereinigtem HG-1 pro Röhrchen) in 6 N HCL in TEFLON- verschlossenen Autosampler-Röhrchen bei 110°C für 20 und 48 Stunden durchgeführt. Der Aminosäuregehalt der Säurehydrolysate wurde durch Vergleich zu Standards bestimmt (100 pmol von jeder L-Aminosäure), die auch das Hydrolyseverfahren durchgemacht hatten.
Zusammensetzungs- und C-terminate-Analysen wurden durch Phasenumkehr-Chromatographie und fluorometrischen Nachweis, nach der Derivatisierung der Säure- oder enzymatischen Hydrolysaten mit N-Acetyl-L-Cystein und O-Phthaldialdehyde (OPA) (Bruckner et al. 1989) durchgeführt. Verdünnte Hydrolysate wurden in Autosampler-Röhrchen in 40 μl Dimethylformamid:Wasser 1:9 gegeben, und ein Gibson 231–401-Autosampler wurde programmiert, um 25 μl von 1 mg/ml des OPA, gefolgt von 50 μl von 1 mg/ml an Thiol, beide in 0,5 M Kaliumborat pH 10, hinzuzufügen. Nach dem Mischen (ungefähr 1 Minute) wurden die Derivate in eine 4,5 × 250 Phenomonex Primesphere „HC"-Octadecylsilicasäule (5 μM Partikel, Torrance, CA) injiziert, die mit 15 mM Natriumphosphat pH 6,2 äquilibriert war, und mit einem Gradienten zu 65% Methanol über 87 Minuten eluiert. Der Nachweis wurde mit dem Hewlett-Packard 1064A Fluoreszenzdetektor durchgeführt, der auf Erregung bei 340 nm und Emission bei 408 nm (408 nm Emissions-Cutoff-Filter) eingestellt war. Dieses System trennte die D und L-Enantiomere von allen primären Aminosäuren des Proteins, mit der Ausnahme von Histidin (Prolin und Cystein werden nicht nachgewiesen).
Die Raten der Aminosäuren wurden durch Vergleich zu L-Aminosäurestandards bestimmt, die den gleichen Hydrolyseverfahren unterzogen worden sind (20 oder 48 Stunden bei 110°C in 6 N HCl). Die Chiralität wurde durch Vergleich der L- und DL-Standards bestimmt und die Racemisierung war in den 20-Stunden Hydrolysaten weniger als 5%. Die in Tabelle 1 gezeigte Analyse stellt 10 unabhängige Hydrolysate von 50–70 pmol dar, sowohl vom TFA (Zwei System) als auch vom Hepatofluorbuttersäure (Drei-System)-gereinigten Material. Nicht aufgelistete Aminosäuren (Glu und Ile) waren in der Zusammensetzungen zu 0,05 oder weniger vorhanden. Die Chiralität von Met und Trp war von der Analyse von Carboxypeptidase-Spaltungen des nativen und alkylierten Peptids. Die Quantifizierung von Tryptophan basiert auf dem Anteil an Threonin, der in Carboxypeptidase Y-Spaltungen von nativem HG-1 erzielt wurde.
B. Enzymatische Spaltung der Peptide
Sowohl natives als auch alkyliertes HG-1 (250–500 pmol) wurden mit 0,3 μg Carboxypeptidase Y (Pierce, Rockford, IL) in 100 μl 0,1 M Natriumphosphat pH 6,2 getrocknet und gespalten. Aliquots (10 μl) wurden zu verschiedenen Zeiten entfernt und die Aminosäureanalyse wurde verwendet, um die Anwesenheit eines einzelnen Tryptophanrests in HG-1 zu bestätigen sowie um zu bestätigen, dass die vorhandenen Aminosäuren L-Enantiomere waren. Da die Carboxypeptidase Y-Spaltung keine klare Sequenzinformation am Carboxy-Terminus von HG-1 lieferte, wurde die Spaltung des nativen HG-1 mit an Agaorse-gebundener Carboxypeptidase A (Sigma) unter Verwendung der gleichen Spaltungsbedingungen wie mit Carboxypeptidase Y wiederholt.
Um die Ergebnisse des Edman-Abbaus an den enzymatisch behandelten Proben zu bestätigen, wurden 1–2 nmol HG-1 getrocknet und mit 1 μg Trypsin (Pierce oder Worthington, Freehold, NJ) in 50 μl 0,1 M Kaliumphosphat pH 7,4 (4 Stunden bei 37°C) gespalten. Die Fragmente wurden wie vorstehend unter Verwendung von 0–100% Methanol in 0,1% TFA über 1 Stunde gtrennt.
C. Peptidreduktion und Alkylierung
HG-1 (2 oder 4 nmol des TFA-gereinigten Materials) wurden getrocknet und mit 4-Vinylpyridin gemäß den im Fachgebiet gut bekannten Verfahren derivatisiert (siehe z.B., Tarr et al., 1983, Hawke und Yuan 1987).
D. Edman-Abbau
Edman-Abbau wurde an alkylierten intakten und gespaltenen Peptiden durchgeführt, mit einem Applied Biosystems Model 477A Sequenziergerät mit einem Model 120A Analysis System (Perkin Elmer, Foster City, CA) unter Verwendung von Verfahren, die vom Hersteller für Chemie und Identifizierung empfohlen wurden.
E. Massenspektrumanalyse der Peptide
Positive-Ionen-Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS)-Analyse wurde mit einem Finnigan MAT 900Q-Vorwärts-Geometrie-Hybrid-Massenspektrometer durchgeführt. Massenspektren wurden bei vollem Beschleunigungspotential (5 kV) und einer Scanrate von 10 s Dekade^–1 ermittelt. Der verwendete Elektrospray-Ionisierungs-Anschluss basiert auf einem erhitzten Glaskapillaren-Einlass. Probenlösungen wurden in 80:15:5 Acetonitril/Wasser/Essigsäure (Vol/Vol/Vol) erzeugt und durch die ESI-Quelle bei einer Durchflussrate von 1 μl min^–1 infundiert. Die Analyse verwendete 1 nmol TFA-gereinigtes HG-1.
Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisierung (MALDI) Massenspektren wurden auf einem PerSeptive-Vestec-Laser-Tec-Research „time-of-flight"-Massenspektrometer ermittelt, das im linearen Modus betrieben wurde. Die Strahlung eines Stickstoff-Lasers (337 nm) wurde im Desorptionsprozess verwendet. Proben wurden in einer Standardart durch Aufbringen von 1 μl einer wässrigen Lösung von HG-1 (1–10 pMol/μl in 0,1% TFA) und 1 μl der entsprechenden Matrixlösung [etwa 5 mg/ml von entweder 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure (Senfsäure) oder Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (4-HCCA) in 1:2 Acetonitril/0,1% TFA (wässrig) (Vol/Vol)] auf das Probenziel erzeugt. Der Proben/Matrixlösung wurde dann vor der Analyse bei Raumtemperatur an der Luft trocknen gelassen.
Beispiel 4
Herstellung von Proben für den Biotest
Die Konzentrationen von HG-1 und Aga-IIIA in Proben, die bei in vitro-Tests verwendet wurden, wurde durch Aminosäureanalysen bestimmt. Typischerweise enthielten die Endfraktionen gereinigte Peptide in einer Endkonzentration von etwa 15–30 μM. Fraktionen wurden, vor 100-facher Verdünnung oder mehr, in den verschiedenen Puffersystemen bei –80°C gelagert. Wenn höhere Konzentrationen der Peptide untersucht wurden, wurde Methanol von den Proben entfernt, indem die Aliquots der HPLC-Fraktionen (etwa 100 μl) für 10–15 Minuten in eine Vakuumzentrifuge gestellt wurden.
Beispiel 5
Messungen von Calciuminflux in Zellen und Nervenpräparationen
INDO-1-Test von internen Calciumkonzentrationen in Zellen
Zellen wurden in einer Kultur, wie vorstehend unter Material und Methoden beschrieben, gezüchtet und gehalten. Die Zellen wurden durch Inkubation mit 0,5 mM EDTA abgelöst und mit 5 μM Indo-1-Acetoxymethylester (Molecular Probes, Eugene, OR) in 1% BSA-enthaltendem Testpuffer (10 mM HEPES pH 7,4 in Hank's ausgewogener Salzlösung ohne Bicarbonat oder Phenolrot) für 60 Minuten bei 30°C beladen. Beladene Zellen wurden zweimal gewaschen und in Testpuffer resuspendiert (10⁷ Zellen/ml), der 0,5% BSA enthielt, und auf Eis bis zur Verwendung (< 3 Stunden) gelagert. Unterschiedliche Konzentrationen von Testverbindungen oder Kontroll-Trägersubstanzen wurden zu 6 ml 0,5% BSA in Testpuffer hinzugefügt, der etwa 3 × 10⁶ beladene Zellen enthielt. Außerdem wurde auch 5 μM Nitrendipin zu IMR-32-Zellen hinzugefügt, um L-Typ-Calciumkanäle zu blockieren und 30–45 μM Valinomycin wurde zu 192C-Zellen hinzugefügt, um das Ruhe-Membranpotential zu senken und eine rasche Depolarisierung durch hinzugefügtes extrazelluläres Kalium zu ermöglichen. Die Proben wurden für 10 Minuten bei 30°C inkubiert und dann in drei Wegwert-Küvetten aliquotiert. Fluoreszenzmessungen wurden in dreifacher Ausführung bei 30°C mit einem Photon-Technology-International Modell RF-F3004 Spektofluorometer mit Anregung bei 350 nm und doppelten Emissions-Monochromometern, die auf 400 und 490 nm eingestellt waren, durchgeführt. Basale Emissionssignale wurden für 20 Sekunden ermittelt, gefolgt vom Hinzufügen mit einer computergesteuerten Pumpe von 180 μl einer Stimulationslösung (1 M Kaliumchlorid und 68 mM Calciumchlorid) zu 1,86 ml Inkubationsgemisch in den gerührten Küvetten. Die Emissionssignale wurden für zusätzliche 30–50 Sekunden nach der Depolarisierung ermittelt.
Basale und Peak-Emissionsverhältnisse (400 nm/490 nm) wurden, wie von Grynkiewicz et al. (1985) (d.h. gemäß der Formel: [Ca++]i = Kd·((R – Rmin)/(Rmax – R))·Sf, wobei R das gemessene 400 nm/490 nm-Verhältnis ist und die verbleibenden Begriffe Konstanten sind, welche die spektralen Eigenschaften von INDO-1 und seine Interaktion mit freiem Calcium beschreiben) für INDO-1 beschrieben, in interne Calciumkonzentrationen umgewandelt. Die Werte für Rmin, Rmax und Sf wurden in einer 2-Punkt-Kalibrierung, wie beschrieben in Premack et al. 1995, bestimmt.
Für 192C- und IMR-32-Zellen wurden die Calciumkonzentrationen am Peak des Anstiegs an internem Calcium (ungefähr 10 Sekunden nach der Kaliumzugabe) berechnet, während die Werte für die GH-3-Zellen entweder am Peak der Antwort in der Anwesenheit von 5 μM Nitrendipine (T-Ströme), oder bei 40 Sekunden nach der Kaliumzugabe ohne hinzugefügtes Dihydropyridin (vereinigte L- und T-Ströme) bestimmt wurden. Typische Anstiege an internem Calcium waren von einer Basislinie von 100–150 nM zu stimulierten Werten von nahezu 1 μM. Konzentrations-Wirkungs kurven wurden vom Anteil des Anstiegs an internem Calcium mit hinzugefügten Agenzien zu dem, der ohne Testverbindungen beobachtet wurde, berechnet. Diese Daten wurden unter Verwendung der Methode der kleinsten Annäherung an eine logistische Funktion mit vier Parametern angepasst, um die IC₅₀-Werte zu bestimmen.
Unabhängige Experimente mit Calciumantagonisten, die für L-Typ-Ströme (Nitrendipin), N-Typ-Ströme (SNX-111 = synthetisches Omega-Conopeptid MVIIA) spezifisch sind, sowie mit weniger selektiven Calciumantagonisten (SNX-230 = synthetisches MVIIC und Omega-Aga-IIIA und Felodipin) wurden verwendet, um die pharmakologische Spezifität der verschiedenen Testsignale zu bestätigen.
Beispiel 6
Elektrophysiologische Messungen
A. „Whole-Cell patch clamp" von stabil transfizierten Zellen
Ströme wurden durch das „patch clamp"-Verfahren in der Gesamtzell-Konfiguration gemessen (Hamill et al. 1981). Der Elektrodenwiderstand reichte von 2–6 MΩ. Aufzeichnungen wurden entweder mit einem Axopatch 1 C oder Axopatch 200 A-Amplifier (Axon Instruments, Foster City, CA) durchgeführt, der zur Datenakquisition und -Analyse an eine PCLMP6-Software (Axon Instruments) gekoppelt war.
Calciumströme wurden unter Nutzung einer externen Badlösung aufgezeichnet, bestehend aus (in mM): 100 Tetraethylammoniumchlorid, 52 Cholinchlorid, 15 Natriumchlorid, 2 Calciumchlorid, 0,8 Magnesiumchlorid, 10 HEPES und 7 Glucose; eingestellt auf pH 7,4 mit Chlorwasserstoffsäure und 325 mOsM. Cytochrom C wurde bei 0,1 mg/ml, als ein Trägerstoff zu den Peptid enthaltenden Lösung hinzugefügt. Die interne Pipettenlösung bestand aus (in mM): 140 Cäsiummethansulphat 5 EGTA, 10 HEPES und 4 Magnesium-adenosintriphosphat; eingestellt auf einen pH-Wert von 7,2 mit Cäsiumhydroxid und 310 mOsM. Die Peptideffekte wurden auf Strömen getestet, die durch Veränderung der Spannung von einem Ruhepotential von –90 mV auf 0 mV hervorgerufen wurden, wie einem Schrittimpuls von 30 mSek. Dauer, alle 15 sek. Die Daten wurden bei 5 KHz abgefragt und bei 1 KHz gefiltert. Kriech- und Kapazitätsströme wurden nach der Messung von Strömen abgezogen, die durch 22 mV hyperpolarisierende Impulse („P/4"-Protokoll) hervorgerufen wurden.
Im Allgemeinen werden HG-1-Ergebnisse als der Effekt auf den Peak der Stromamplitude angezeigt, die ohne die Verwendung des Serienwiderstands-Abgleichsschaltkreises erhalten wurde. Zusätzliche Experimente (siehe Ergebnisse), die mit 80% Serienwiderstandsabgleich durchgeführt wurden, zeigten, dass HG-1 den Zeitablauf des Stromabfalls nicht beeinflusste: Werte der Hemmung waren, innerhalb eines Fehlbereichs, gleich wie ohne den Serienwiderstandsabgleich, sowie mit Peptideffekten, die zu unterschiedlichen Zeiten nach dem Spannungsschritt gemessen wurden. Für Konzentrationseffekt-Studien wurden Peptidlösungen durch Badaustausch durch Durchflussperfusion verabreicht. Der Austausch der Perfusionslösung wurde durch Perfusion von Lösungen mit verschiedenen externen Kaliumkonzentrationen bestätigt und dem Test der Wirkungen auf das Membranpotential.
B. Elektrophysiologie von Klasse E-Kanälen in neurohypophysären Enden.
Männliche Ratten wurden mit Kohlendioxid sediert und dann durch ein Fallbeil enthauptet. Der Hypophysenhinterlappen wurde dann herausgeschnitten und in einer Lösung homogenisiert, die 270 mM Saccharose, 10 mM HEPES-Puffer, 0,01 mM Kalium-EDTA, pH 7 enthielt. Die isolierten hypophysären Nervenenden konnten unter Verwendung eines invertierten Mikroskops oder durch Immunblotting gefolgt von „patch clamp"-Aufzeichnungen identifiziert werden. Die Enden wurden dann mit normaler Locke-Salzlösung (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM NaCO₃, 2,2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 0,1% Rinderserumalbumin, pH 7,2) perfundiert. Vor der Aufzeichnung wurden die Enden (im Allgemeinen 5–8 μm im Durchmesser) mit 5 mM Ba²⁺-LS enthaltend: 145 mM NaCl, 5 mM BaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 15 mM Glucose, 0,02% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin und 1 μM Tetrodotoxin (TTX), pH 7,3 erhalten. Um perforierte „whole-terminal"-Patch-Aufzeichnungen zu erhalten (Rae et al. 1991; Hamil, et al. 1981) wurde frisch zubereitetes Amphotericin B (240 μg/ml) in eine Pipettenlösung appliziert, die 135 mM Cäsiumglutamat, 10 mM HEPES, 5 mM Glucose, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ und 20 mM Triethylamin (TEA), pH 7,3 enthielt.
Nur perforierte Enden mit Eingangswiderständen von 3–5 megaOhms (mΩ) wurden für die Aufzeichnungen verwendet, um „run-down" zu vermeiden. Der Ba²⁺-Strom (I_Ba), der durch Depolarisierung von –80 auf +10 mV aktiviert wurde und sowohl transiente als auch lang anhaltende Komponenten zeigte, konnte für mehr als 1 Stunde erhalten werden, ohne jeglichen „run-down" bei diesen Bedingungen. I_Ba wurde bei 3 kHz gefiltert und bei 10 kHz geprüft. pCLAMP (Axon Instruments) wurde zur Akquisition und Analyse der Daten verwendet.
Beispiel 7
Messungen von Natrium- und Kaliumströmen in IMR-32-Zellen
Natrium- und Kaliumströme in IMR-32-Zellen wurden unter Verwendung der in Beispiel 6 und vorher beschriebenen (Newcomb et al. 1995) „Whole-Cell Patch"-Technik, aber mit den folgenden Veränderungen, gemessen. Das externe Bad bestand aus (in mM) 140 Natriumchlorid, 5 Kaliumchlorid, 10 HEPES, 2 Calciumchlorid, 1 Magnesiumchlorid und 12 Glucose, eingestellt mit Natriumhydroxid auf pH-Wert 7,4 und 305 mOsM. Die interne Pipettenlösung bestand aus (in mM): 15 Natriumchlorid, 125 Kaliummethansulphat, 10 HEPES, 11 EGTA, 1 Calciumchlorid, 2 Magnesiumchlorid und 59 Glucose, eingestellt mit Kaluimhydroxyd auf pH-Wert 7,4 und 295 mOsM. Zur Peptidapplikation wurden die Zellen in eine Durchflusskammer (0,5–1 ml/min) gegeben. HG-1 wurde in Salzlösung mit 0,1 mg/ml Cytochrom C eingebracht und durch eine kleine Röhre direkt neben der Zelle platziert.
Beispiel 8
Messungen von Strömen durch Klasse A-Calciumkanäle in Xenopus-Oocyten
Die in Mori et al. (1991) beschriebene cRNA für die Alpha-1-Untereinheit, wurde in Xenopus-Oocyten durch Standardverfahren exprimiert (Goldin, 1992). Zur Expression wurde die cRNA für die Alpha-1-Untereinheit mit der cRNA für die Kaninchen-Alpha2- und Delta-(Ellis et al. 1988) und die menschlichen Beta-(Williams et al. 1992)-Untereinheiten in äquimolaren Mengen co-injiziert. Ungefähr 50 nL wurden pro Oocyte injiziert, mit einer Gesamt-cRNA-Konzentration von 0,8 μ9/μl.
Die Ströme wurden unter Verwendung einer Lösung aus 4 mM Bariumchlorid, 38 mM Kaliumchlorid, 36 mM Tetraethylammoniumchlorid, 5 mM 4-Aminopyridin, 0,4 mM Nifluminsäure, 5 mM HEPES (pH 7,5) und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin durch eine Spannungsklemme mit zwei Elektroden aufgezeichnet. Die Daten wurden unter Nutzung eines OC-725B Spannungsklemmen-Ampflifiziergeräts (Warner Instrument), das mit einer pCLAMP-Software (Axon Instruments, Foster City, CA) gekoppelt war zur Akquisition und Analyse, bei 5 kHz geprüft und bei 1 kHz gefiltert. Kriech- und Kapazitätsströme wurden unter Verwendung eines P/4-Protkolls online subtrahiert. Spannungsimpulse auf 0 mV von einem Ausgangspotential von –80 mV wurden verwendet, um alle 10 Sekunden Ströme hervorzurufen.
Beispiel 9
Messungen von Strömen durch Kaliumkanäle in Xenopus-Oocyten
Die cRNAs von den Kaliumkanal-Alpha-Untereinheit-cDNAs, die in Tempel et al. (1988) (MKv1.1) und Ramaswami et al. (1990) (hKv1.2, hKv1.4) beschrieben wurden, wurden in den folgenden Konzentrationen in Oocyten injiziert: mKv1.1, 0,2 μg/μl; hKv1.2, 0,3 ng/μl; und hKv1.4, 0,02 μg/μl.
Die externe Lösung, die verwendet wurde um Kaliumströme aufzuzeichnen, war 115 mM Natriumchlorid, 2,5 mM Kaliumchlorid, 1,8 mM Calciumchlorid, 10 mM HEPES pH 7,2, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin. Alle anderen Verfahren waren die Gleichen wie bei den in Beispiel 8 beschrieben Calciumkanälen außer, dass die Testimpulse alle 5 Sekunden von einem Ruhepotential von –70 mV auf +50 mV waren.
Beispiel 10
Isolierung der codierenden Sequenz für HG-2 durch Polymerase-Kettenreaktion
Sequenzspezifische degenerierte Primer wurden gemäß Standardprotokollen, basierend auf der in 2A gezeigten N-terminalen 6-Aminosäuresequenz von HG-1 und unter Verwendung der Codonpräferenz von D. melanogaster synthetisiert. Die genspezifischen Nucleotide waren daher: GGC/T GTC/G GAT/C AAG GCC/T GGC/T TGC: Ein 3'-Primer wurde unter Verwendung der Ergebnisse vorheriger PCR-Experimente unter Verwendung der 5'-Primer erhalten.
Falls nicht anders angegeben, sind alle in diesem Beispiel beschriebenen Puffer und Reagenzien wie beschrieben und/oder wie im 3'RACE-System für schnelle Amplifikation von cDNA-Enden bereitgestellt, welches als Kit von Gibco-BRL (Katalognr. 18373-019) erhältlich ist.
A. Isolierung von Gesamt-RNA aus Hysterocrates gigas
Die von 3 Hysterocrates gigas-Spinnen erhaltenen Giftsäcke wurden in 8 ml TRIzol^TM-Lösung homogenisiert und dann, vor dem Transferieren von 1 ml Aliquots in Eppendorf-Röhrchen, für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zu jeder 1 ml-Probe wurden 0,2 ml Chloroform hinzugefügt. Die Probe wurde dann energisch für 15 Sekunden geschüttelt und für 2–3 Minuten vor der Zentrifugation bei 10–12.000 × g bei 4°C für 15 Minuten inkubiert. Die resultierende wässrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen transferiert, 2-Propanol wurden pro ml an Trizol gemäß dem durch den Hersteller (BRL) bereitgestellten Verhältnis hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert und bei nicht mehr als 12000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das RNA-Pellet wurde in 75% Ethanol resuspendiert (Hinzufügen von mindestens 1 ml 75% Ethanol zu 1 ml der TRIzol^TM-Lösung). Die Probe wurde auf einem Vortex-Mixer gemischt, dann bei nicht mehr als 7500 × g für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die RNA wurde dann luftgetrocknet und dann in 100 μl DEPC-behandeltem Wasser aufgelöst.
B. Reinigung von poly-A-mRNA von Gesamt-RNA (OLIGOTEX Spin-Säulen-Protokoll von Quiagen).
Die Menge an Gesamt-RNA in der RNA-Probe wurde durch herkömmliche Mittel bestimmt. Wenn die Menge unter 250 μg lag, wurde die Gesamt-RNA in 250 μl DEPC-Wasser aufgelöst. 250 μl 2× Bindungspuffer und 15 μl OLIGOTEX-Lösung, auf 37°C vorgewärmt, wurden dann zur RNA hinzugefügt. Das Röhrchen wurde durch behutsames Klopfen am Boden des Röhrchens gemischt, dann für 3 Minuten bei 65°C inkubiert, um die Sekundärstruktur zu zerstören. Das Röhrchen wurde dann weiter für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation für 2 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit (ungefähr 12.000 × g). Der Überstand wurde dann abgesaugt und das Pellet wurde in 400 μl Waschpuffer resuspendiert. Die resultierende Suspension wurde oben auf eine Quiagen OLIGOTEX-Spinsäule aufgetragen. Die Säule wurde für 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert und die Durchflussfraktion wurde verworfen.
Die Spinsäule wurde in ein neues RNase-freies Röhrchen transferiert und die Lade- und Zentrifugationsschritte wiederholt. Die Säule wurde dann zweimal mit 100 μl vorgeheiztem (70°C) Elutionspuffer, gemäß den Ausführungen des Herstellers, eluiert.
C. cDNA-Synthese des ersten Stranges von Poly-A-mRNA
Das verwendete Protokoll ist das Standardprotokoll, bereitgestellt im 3'RACE-Kit Gibco-BRL. Bis zu 50 ng an Poly(A)-ausgewählter RNA vom vorstehenden Teil B wurde mit DEPC-behandeltem Wasser auf ein Endvolumen von 11 μl in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vereint. Zum Röhrchen wurde 1 μl der 10 μM Adaptor-Primerlösung (3'RACE-Kit) hinzugefügt. Das Röhrchen wurde gemischt und die Reaktion wurde durch kurze Zentrifugation gesammelt. Das Gemisch wurde dann für 10 Minuten auf 70°C erhitzt, gefolgt von Abkühlen auf Eis für mindestens 1 Minute. Der Röhrcheninhalt wurde durch eine kurze Zentrifugation gesammelt und die folgenden Komponenten wurden hinzugefügt:

10 × PCR-Puffer 2 μl

25 mM MgCl₂ 2 μl

10 mM dNTP-Mix 1 μl

0,1 M DTT 2 μl
Das Röhrchen wurde sanft gemischt und die Reaktion wurde durch kurze Zentrifugation gesammelt. Das Gemisch wurde dann auf 42°C für 2 bis 5 Minuten äquilibriert. 1 μl SuperScript II RT (reverse Transkriptase) wurde dann hinzugefügt, gefolgt von Inkubation bei 42°C für 50 Minuten. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 70°C für 15 Minuten inkubiert und auf Eis abgekühlt. Die Reaktion wurde durch eine kurze Zentrifugation gesammelt und 1 μl RNase H wurde zum Röhrchen hinzugefügt, welches dann gemischt und für 20 Minuten inkubiert wurde.
D. 3'RACE-PCR
Folgendes wurde in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hinzugefügt:

10 × PCR-Puffer (GIBCO-Kit) 5 μl

25 mM MgCl₂ 3 μl

Destilliertes Wasser 36,5 μl

10 mM dNTP-Mix 1 μl

GSP1·10 μM 1 μl

UAP #19 μM 1 μl

Taq DNA-Polymerase (5 E/μl) 0,5 μl
Zwei μl der cDNA-Synthesereaktion wurden zum Röhrchen hinzugefügt, gefolgt von sanftem Mischen. 75 μl Mineralöl wurden über das Reaktionsgemisch geschichtet, das dann durch kurze Zentrifugation gesammelt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei 94°C für 3 Minuten inkubiert. 35 Zyklen PCR wurden dann unter Verwendung des folgenden Protokolls ausgeführt:
Denaturieren 94°C für 45 Sekunden
Anlagern 55°C für 45 Sekunden
Verlängern 72°C für 1 Minuten und 30 Sekunden
Das Gemisch wurde für zusätzliche 10 Minuten bei 72°C inkubiert und bei 4°C erhalten. 10 μl der Amplifikationsprodukte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert und der Rest wurde bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
E. 5'RACE Glass MAX-Isolierung Spin-Patrone-Reinigung von cDNA
Zur Reinigung jeder Probe wurden 100 μl sterilisiertes destilliertes Wasser bei 65°C äquilibriert und die Bindungslösung wurde bei Raumtemperatur äquilibriert. 120 μl der Bindungslösung (6 M NaI) wurden zu der Reaktion des ersten Stranges (4,5 Volumen an Bindungslösung pro Volumen DNA-Lösung) hinzugefügt. Die cDNA/NaI-Lösung wurde in eine Glas-MAX-Spinpatrone transferiert und bei maximaler Geschwindigkeit für 20 Sekunden zentrifugiert. Das Patroneninsert wurde vom Röhrchen entfernt und der Durchfluss wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen transferiert. Das Patroneninsert wurde in das Röhrchen zurückgegeben und 0,4 ml kalter 1 × Waschpuffer wurde zur Spin-Patrone hinzugefügt. Die Patrone wurde dann bei maximaler Geschwindigkeit für 20 Sekunden zentrifugiert und der Durchfluss wurde verworfen. Dieser Waschschritt wurde zwei weitere Male wiederholt und die Patrone wurde zweimal mit 400 μl kalten 70% Ethanol wie vorstehend beschrieben gewaschen. Nach Entfernen der letzten 70% Ethanolspülung vom Röhrchen, wurde das Röhrchen bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute zentrifugiert. Das Spin-Patroneninsert wurde in ein frisches Probenwiedergewinnungsröhrchen transferiert und 50 μl sterilisiertes, destilliertes Wasser (vorgeheizt auf 65°C) wurde zu der Spin- Patrone hinzugefügt, gefolgt von Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 20 Sekunden, um die cDNA zu eluieren.
F. TdT-Tailing der cDNA
5 × Tailing-Puffer enthält die folgenden Komponenten:

DEPC-behandeltes Wasser 55 μl

10 × Reaktionspuffer 25 μl

25 mM MgCl₂ 20 μl
5 × Puffer weist die folgende Endzusammensetzung auf:
50 mM Tris-HCl (pH 8,4)
125 mM KCl
5 mM MgCl₂
Die folgenden Komponenten wurden in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gegeben:

DEPC-behandeltes Wasser 6,5 μl

5 × Tailing-Puffer 5 μl

2 mM dCTP 2,5 μl

cDNA-Probe 10 μl
Das Röhrchen wurde für 1 bis 2 Minuten bei 94°C inkubiert, dann wurde es 1 Minute auf Eis abgekühlt. Der Inhalt des Röhrchens wurde durch kurze Zentrifugation gesammelt und auf Eis gestellt. 1 μl TdT wurde hinzugefügt, gefolgt von sanftem Mischen und Inkubation für 10 Minuten bei 37°C. Die endgültige Zusammensetzung der Reaktion war wie folgt:
10 mM Tris-HCl (pH 8,4)
25 mM KCl
1,0 mM MgCl₂
200 μM dCTP
0,4 Einheiten/μl TdT
Das TdT-Gemisch wurde für 10 Minuten bei 65°C bis 70°C Hitze-inaktiviert.
G. PCR-Amplifikation von dC-tailed-cDNA
Die folgenden Komponenten wurden zu einem frischen 0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis hinzugefügt:
29 sterilisiertes, destilliertes Wasser
4 μl 10 × Reaktionspuffer
3 μl 25 mM MgCl₂
1 μl 10 mM dNTP
1 μl verschachteltes („nested") GSP2 (10 μM)
1 μl Ankerprimer (10 μM)
5 μl dC-tailed cDNA
(GSP1 und GSP2 sind beide degenerierte Primer, die in Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz von HG-1 entworfen wurden.
wobei A, T, G und C Standard-Desoxyribonucletide darstellen und wobei Y = C oder T, R = A oder G und S = C oder G ist.
„U" stellt Desoxyuracil dar, das am C-Terminus vorhanden ist.
Sowohl der UAP als auch der Anker-Primer sind universelle Primer, bereitgestellt im vorstehend beschriebenen GIBCO-BRL 3'RACE-Kit.
Der Inhalt des Röhrchens wurde gemischt und dann mit 75 μl Mineralöl überlagert. Das Röhrchen wurde kurz zentrifugiert, um die Reaktionskomponenten am Boden des Röhrchens zu sammeln, dann bei 94°C für 5 Minuten inkubiert und bei 80°C gehalten. Die Taq-Polymerase wurde mit 1 × Reaktionspuffer auf 0,4 Einheiten/μl verdünnt. 5 μl verdünntes Enzym wurden dann zu jeder Reaktion hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann unter Verwendung des gleichen Protokolls wie vorstehend für 3'RACE beschrieben, 35 Zyklen an PCR-Amplifikationen unterzogen. 10 μl der amplifizierten Probe wurden durch Agarosegelektrophorese, Ethidiumbromid-Färbung und die geeigneten molekularen Größen-Standards analysiert.
H. Clonierung des PCR-Produkts in den pAMP1-Vektor (GIBCO-BRL)
Die folgenden Komponenten wurden zu einem 0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen hinzugefügt:
2 μl PCR-Produkt (10–50 ng)
2 μl pAMP1-Vektor-DNA (25 ng/μl)
15 μl 1 × Anlagerungspuffer
1 μl Uracil-DNA-Glycosylase (1 E/μl)
Die Komponenten wurden gemischt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsröhrchen auf Eis gestellt. Nach der Anlagerung wurde ein Teil des Anlagerungsreaktionsgemisches (1–5 μl) verwendet, um zu transformieren.
I. Transformation
100 μl DHSα-Zellen (kompetente Bakterienzellen; GIBCO-BRL) wurden auf Eis in ein Röhrchen gegeben. Zu den Zellen wurde 1 μl des Anlagerungsproduktes hinzugefügt, gefolgt von Mischen und Inkubation auf Eis für 30 Minuten. Das Gemisch wurde dann bei 42°C für 45 Sekunden einem Hitzeschock unterzogen, gefolgt von Inkubation auf Eis für 2 Minuten. SOB+-Medium (0,9 ml) wurde dann zu dem Röhrchen hinzugefügt, welches dann bei 37°C für 1 Stunde geschüttelt wurde. Das Röhrchen wurde dann bei 4°C und nicht mehr als 4000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert. 0,9 ml der Überstands wurden dann entfernt und der Rest der Zellen wurde auf eine LB-Platte + Carbenicillin + IPTG + X-Gal (als Substrat für beta-Galactosidase) ausplattiert. Die Platten wurden dann bei 37°C über Nacht inkubiert.
J. Herstellung von Miniscale-DNA
Miniscale-DNA wurde hergestellt, um den Erfolg der Clonierung zu bestätigen und die positiven Clone zu sequenzieren. Weiße Kolonien wurden von der Platte gepickt. Einzelne Kolonien wurden in einem 37°C-Schüttler in unterschiedlichen Röhrchen inkubiert, die 5 ml LB-Medium mit Carbenicillin enthielten. Die DNA wurde dann gemäß Standardverfahren erzeugt und sequenziert (z.B. Maniatis et al. 1982).
Beispiel 11
Krampfhemmende Aktivität: DBA/2-Mäuse-Anfallmodell
DBA/2-Mäuse (18–21 Tage alt; ungefähr 7–10 g) wurden von Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine erhalten und für ein Minimum von 3 Tagen gehalten, um sie an die Laborbedingungen zu gewöhnen. Am Testtag wurden die Mäuse i.c.v. gemäß Standardverfahren (Jackson) 30 Minuten bevor sie den Geräuschreizen ausgesetzt wurden, mit Trägersubstanz oder der Testverbindung in den lateralen Ventrikel injiziert (Gesamtvolumen: 5 μl). Nach der Injektion wurden die Mäuse individuell in Beobachtungskammern gehalten und wurden über die kommenden 30 Minuten auf Anzeichen von Zitterverhalten (anhaltendes Zittern des ganzen Körpers) oder anderen abnormalen Verhalten hin beobachtet. Die Tiere wurden einem Geräuschreiz von hoher Intensität (100–110 dB sinusoidaler Ton bei 14 Hz für 30 Sekunden) ausgesetzt. Die Mäuse wurden auf die Anwesenheit von klonischen und tonischen Krämpfen hin beobachtet, mit voller Hintergliedmaßen-Ausdehnung während sie für 30 Sekunden dem Geräusch ausgesetzt wurden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes HG-Peptid, welches einen Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal selektiv blockieren kann, wobei das HG-Peptid eine Sequenz hat, welche definiert ist durch: (a) SEQ ID NO: 16-X₁-FGGC-X₂X₃X₄-SEQ ID NO: 17-X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀-SEQ ID NO: 18-X₁₁-TFSD, wobei X₁ ausgewählt ist aus der Klasse V; X₂ ausgewählt ist aus der Klasse II; X₃ ausgewählt ist aus der Klasse IV oder V; X₄ ausgewählt ist aus der Klasse III; X₅ ausgewählt ist aus der Klasse III oder IV oder eine Deletion ist; X₆ ausgewählt ist aus der Klasse IV oder V; X₇ ausgewählt ist aus der Klasse II oder IV; X₈ ausgewählt ist aus der Klasse II oder V; X₉ ausgewählt ist aus der Klasse VI; X₁₀ ausgewählt ist aus der Klasse II oder III; und X₁₁ ausgewählt ist aus der Klasse II, V oder VI; oder (b) V₁-SEQ ID NO: 19-X₁₂X₁₃X₁₄-SEQ ID NO: 20-X₁₅-LGC-X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉-S-X₂₀-SEQ ID NO: 10-X₂₁X₂₂-T-X₂₃X₂₄X₂₅, wobei V₁ GVDKX₂₆G oder eine Deletion ist, wobei X₂₆ ausgewählt ist aus der Klasse II; X₁₂ ausgewählt ist aus der Klasse II oder III; X₁₃ ausgewählt ist aus der Klasse V oder IV; X₁₄ ausgewählt ist aus der Klasse III; X₁₅ ausgewählt ist aus der Klasse IV; X₁₆ ausgewählt ist aus der Klasse IV; X₁₇ ausgewählt ist aus der Klasse II oder III; X₁₈ ausgewählt ist aus der Klasse V; X₁₉ ausgewählt ist aus der Klasse VI oder V; X₂₀ ausgewählt ist aus der Klasse VI oder eine Deletion ist; X₂₁ ausgewählt ist aus der Klasse III; X₂₂ ausgewählt ist aus der Klasse V; X₂₃ ausgewählt ist aus der Klasse VI oder II; X₂₄ ausgewählt ist aus der Klasse II oder III oder eine Deletion ist; und X₂₅ ausgewählt ist aus der Klasse VI oder III oder eine Deletion ist; oder (c) SEQ ID NO: 8 (GVDKP GCRYM FGGCE KDDDC CPKLG CKDIL YYCAW TGEF); wobei die Klasse I Cys repräsentiert; die Klasse II Ser, Thr, Pro, 4-Hydrox-Pro, Ala und Gly repräsentiert; die Klasse III Asn, Asp, Glu und Gln repräsentiert; die Klasse IV His, Arg, Lys, Ornithin, Homoarginin, N-Methyllysin, Dimethyllysin und Trimethyllysin repräsentiert, die Klasse V Ile, Val, Leu und Met repräsentiert und die Klasse VI Phe, Tyr, Trp, Cyclohexyl-Ala und halogeniertes Tyr repräsentiert; wobei das Peptid in der Lage ist, einen Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal bei einer Konzentration zu blockieren, welche höchstens dem 50-fachen der Konzentration des HG-1 Peptids (SEQ ID NO: 1) entspricht, welche benötigt wird, um den Kanal zu blockieren und welches weiterhin dadurch charakterisiert ist, L-Typ, T-Typ, P/Q-Typ, oder N-Typ Calciumkanäle bei einer Konzentration, die etwa 10mal der Konzentration entspricht, die benötigt wird, um den Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal halbmaximal zu blockieren, nicht zu wenigstens 50% blockieren zu können.
Peptid nach Anspruch 1, welches eine Sequenz hat, die durch V₁-SEQ ID NO: 19-X₁₂X₁₃X₁₄-SEQ ID NO: 20-X₁₅-LGC-X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉-S-X₂₀-SEQ ID NO: 10-X₂₁X₂₂-T-X₂₃X₂₄X₂₅ definiert ist, wobei V₁ GCDKX₂₆G oder eine Deletion ist, wobei X₂₆ A oder P ist; X₁₂ S oder E ist; X₁₃ V oder K ist; X₁₄ D oder N ist; X₁₅ R oder K ist; X₁₆ H oder K ist; X₁₇ S oder D ist; X₁₈ I oder L ist; X₁₉ F oder L ist; X₂₀ Y oder eine Deletion ist; X₂₁ D oder E ist; X₂₂ L oder V ist; X₂₃ F oder G ist; X₂₄ S oder E oder eine Deletion ist; und X₂₅ F oder D oder eine Deletion ist.
Peptid nach Anspruch 1, welches eine Sequenz besitzt, die durch SEQ ID NO: 16-X₁-FGGC-X₂X₃X₄-SEQ ID NO: 17-X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀-SEQ ID NO: 18-X₁₁-TFSD definiert ist.
Peptid nach Anspruch 3, wobei X₁ = M oder L; X₂ = S oder T; X₃ = V, K oder R; X₄ = N oder D; X₅ = K, Q oder eine Deletion; X₆ = H, R oder L; X₇ = S oder K; X₈ = L oder G; X₉ = F oder Y; X₁₀ = S oder N; und X₁₁ = L, F oder G ist.
Isoliertes Peptid wie in Anspruch 1 definiert, welches eine Sequenz besitzt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 (HG-1), SEQ ID NO: 8 (HG-8), SEQ ID NO: 13 (R9), SEQ ID NO: 14 (R11), und SEQ ID NO: 15 (SNX-629).
Isoliertes Peptid nach Anspruch 5, welches die Sequenz SEQ ID NO: 1 besitzt.
Isoliertes Polynucleotid, umfassend eine Sequenz von Nucleotiden, welche ein Peptid codiert, wie in Anspruch 1 definiert, ausgewählt aus den Peptiden, welche die Sequenzen, wie in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, und SEQ ID NO: 15 definiert, besitzen.
Polynucleotid nach Anspruch 7, ausgewählt aus den Polynucleotiden, welche die Sequenzen, wie in SEQ ID NOs: 24–25, 27–28, 30–31, 33–34, 36–37, 39–40, und 42–43 definiert, besitzen.
Verwendung eines Peptids wie in Anspruch 1 definiert oder eines Peptids, welches eine Sequenz besitzt ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 15, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Unterbindung von Anfällen in einem Patienten.
Verwendung eines Peptids wie in Anspruch 1 definiert zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung der Oxytocinausschüttung in einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Inhibierung der Oxytocinausschüttung dazu geeignet ist, frühzeitige Wehen bei einer schwangeren menschlichen Patientin zu verhindern oder den Milchspende-Reflex in einer menschlichen Patientin zu verhindern.
Verfahren zur Auswahl eines Stoffes zur Blockierung der Oxytocinausschüttung aus den Hypophysenhinterlappen, umfassend das Testen des Stoffes auf seine Fähigkeit zur selektiven Blockierung von Klasse E Calciumkanälen in neuronalem Gewebe, sowie die Auswahl des Stoffes, wenn er (a) Calciumströme durch die Klasse E Calciumkanäle blockiert bei einer Konzentration, welche nicht das 50-fache der Konzentration des HG1-Peptids (GVDKA GCRYM FGGCS VNDDC CPRLG CHSLF SYCAW DLTFS D) übersteigt, die dazu geeignet ist, die Ströme zu blockieren, und (b) L-Typ, T-Typ, P/Q-Typ, oder N-Typ Calciumkanäle bei einer Konzentration, die etwa 10mal der Konzentration entspricht, die benötigt wird, um den Klasse E-spannungsabhängigen Calciumkanal halbmaximal zu blockieren, nicht zu wenigstens 50% blockiert.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid von einem Polynucleotid codiert wird, welches mittels der Isolierung von Poly-A mRNA aus giftproduzierenden Zellen von H.gigas und der Synthese von cDNA aus der mRNA hergestellt wird.
Peptid nach Anspruch 13, wobei die Herstellung des Polynucleotids weiterhin die Ausführung einer PCR-RACE Amplifikation auf der cDNA, unter Verwendung von wenigstens einem degenerierten Primer, basierend auf der Aminosäuresequenz des HG-1 Peptids, umfasst.
Peptid nach Anspruch 14, wobei der degenerierte Primer in der Amplifikation auf der N-terminalen Sequenz des HG-1 Peptids (GVDKAGC) basiert.
Peptid nach Anspruch 14, wobei der degenerierte Primer in der Amplifikation die Sequenz 5' CAU CAU CAU CAU GGY GTS GAY AAG GCT GGY TGC 3' besitzt, wobei Y = C oder T, R = A oder G und S = C oder G ist.
Peptid nach Anspruch 14, wobei der degenerierte Primer in der Amplifikation die Sequenz 5' CUA CUA CUA CUA GAA RGT SAR RTC CCA RGC 3' besitzt, wobei Y = C oder T, R = A oder G und S = C oder G ist.